JPS61502725A - 外来性ｄｎａを含む全植物の生産方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 外来性ＤＮＡｆ含む全植物の生産方法 発明の分野 本発明は一般に遺伝子工学的に処理された植物の生産方法に関する。より詳細に は、本発明は外来性または異種ＤＮＡを含むようにｉｎτｉυ０において遺伝子 工学的に処理された全植物（ｕｙｈｏｌｅ　ｐｌａｎｔ）の生産方法に関する。

発明の背景 クラウンゴール（ｃｒｏｗｎ　ｇａｌｌ、植物腫瘍）は細菌病ぶ腫瘍性の病気で ある。多数の双子葉植物、若干の裸子植物および少数の単子葉植物はこの病気に かかりやすい〔デクリーン（Ｄｅｃｌｅｅｎｅ　）およびプレイ（Ｄｇ（ｇ３’ ）、１９７６）。感染力の強いアグロバクテリウム菌株に含まれる大きなプラス ミドが感染植物の腫瘍形底にとって不可欠であることが知られている。この種の プラスミドはＴｉ　（ｔｕｍｏｒ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ　の略）プラスミ、ドまた は腫瘍誘発性プラスミドと呼ばれている〔シンプソン（ＳｊｒｒＬ−ｐｓｏｎ） ら、１９８３）。

この細菌病原体が傷ついた宿主植物をどのように形質転換してそれらがクラウン ゴール腫瘍を生ずるかは今だ正確に解明されていない。しかしながら、Ｔｉプラ スミド〔およびアグロバクテリウム・リゾゲネス？ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉ ｚｏｇｅｎｅｓ　）に由来するＲｉ（ｒｏ６ｔ−ｉｎｄｕｃｉｎｇの略）プラス ミドまたは根−誘発性プラスミド〕は、野生型細胞が腫瘍細胞に形質転換される とぎに機能的であるにちがいないυｉｒ領域またはビルレンス（か性）領域と呼 ばれるＤＮＡ領域を含むことがわかっている。また、このような形質転換の最終 結果が形質転換細胞の核ゲノム内へのＴ−ＤＮＡまたはトランスファーＤＮＡと 呼ばれる別のプラスミド部分の組込みをもたらすことも仰られている。ｖｉｒ遺 伝子領域は植物ゲノム内に組込−１：れない。しかしながら、この遺伝子はＴ− ＤＮＡの転移または組込み、あるいはその両方にとって必要な物質をコードする と考えられている〔シェル（５ｃｈｅｌｌ）およびファン・モンタギ−Ｌ　−（ Ｖａｎ　Ｍｏｎｔａｇｒｂ）、１９８３）。

機能的υｉｒ遺伝子はＴ−ＤＮＡの転移にとって欠くことのできないものである が、Ｔ−’ＤＮＡの転移および組込み全起こすためには、υｉｒ遺伝子とＴ−Ｄ ＮＡとが同じＴｉ　プラスミド上に保有される必要はない。υｉｒ遺伝子とＴ− ＤＮＡとは同一のアグロバクテリウム内に含まれる別々のプラスミド上に保有さ れつる（シェルおよびファン・モンタギュー、１９８３）。実際に、オクトピン 型Ｔ−ＤＮＡセグメントは、それがツバリン型Ｔｉプラスミド（限られた宿主範 囲のＴｉプラスミド）はまたはＥｉプラスミド由来のｖｉｒ遺伝子を含むアグロ バクテリウムによって保有される場合、植物細胞へ転移される〔ホーケ？　（Ｉ ｌｏｅｋｅｍｔｘ）ら、１９８４：）。

ヒトにより“遺伝子操作”されたかまたは自然に突然変異を起こしたＴ−ＤＮＡ に対して、天然Ｔ−ＤＮＡは通常その横側に位置する特異的ＤＮＡ隣接配列：す なわちｆｉｌ　がん遺伝子または腫瘍遺伝子（腫瘍形成にとって必要）および（ ２）　オピンとして仰られる特殊な代謝産物をコードする遺伝子を含む。数種の 型のオピン類が存在し、それらはどれも正常な、すなわち形質転換されていない 植物細胞からは生産されない。腫瘍組織から生産されるオピンの型ならびにその 生殖株式は感染性アグロバクテリウム内に保有されるＴｉプラスミドの型によっ て決定される〔バンホツフ（Ｂｏｍｈｏｆｆ）ら、１９７６）。

従って、植物１厘瘍細胞で生産されるオピンに基づいて、Ｔｉプラスミドはオク トピン、ツバリン２よびアグロビンの型に分類された〔オームス（Ｏｏｍｓ）ら 、１９８２’ｌ。

これらのオピン類は腫瘍組織によって合成されるが、この感染性細菌により異化 作用を受ける〔バンホツフら、１９７６］。

クラウンゴール腫瘍は、ｉｎ　ｖｉｖｏで増殖されようとｉｎ　ｖｉｔｒｏで単 純培地上に維持されようと、生殖能力のある成熟した植物へ分化しない。その代 わりにこの腫瘍はカル＊　（ｃａｌｌｕｓ　）と呼ばれる未分化の形で増殖する 。

野生型植物細胞と相違して、カルスからの形質転換細胞は培養増殖の際に増殖培 地に植物ホルモン（オーキシン２よびサイトカイニン）を添加する必要がない。

むしろ、カルスは外生の生長物質を欠く単純培地上で培養維持さｎうる。他動ホ ルモンは植物の細胞増殖および細胞分化に主要な役割を果たすことが知られてい るので、クラウンゴール腫瘍におけるこの分化の欠乏は形質転換を起こすＴｉプ ラスミドによって生じる生長ホルモンの不均衡が原因であると考えられる（シン プソンら、１９８３）。

Ｔｉ　プラスミドは、それらが原核生物のＴ−ＤＮＡを真核植物細胞内へ転移さ せることができるので、天然の植物ベクターである。さらに、外米性の異種ＤＮ ＡはＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡに挿入することにより植物細胞のゲノム内に遺 伝子工学的に組み込まれる。その結果、外来性遺伝子を植物細胞へ移すための最 近の努力はこのＴｉ　プラスミドに集中している〔デフラモンド（ＤｅＦｒａｍ ｏｎｄ）ら、１９８３）。

不都合なことに、Ｔｉプラスミドは外米性Ｄ　Ｎ　Ａ　ＩＰＪ　Ｔ−ｎｓＡ頌域 に直接に挿入さぞるた°めには余り大き過ぎる。（Ｔ−ＤＮＡ領域に特異的な制 限酵素切断部位がこれらの犬ぎなプラスミド上に存在しないので、異種ＤＮＡを 挿入するための特異的部位を利用することが極めて困難である。）その結果、よ り少数の制限酵素切断部位を有する比較的小さな“遺伝子操作”さ九たＴｉ型ベ クターを利用しなければならない。

外米性ＤＮＡがひとたびこれらの小さなベクターのＴ”ＤＮＡ内に挿入されると 、これらのベクターは遺伝子操作されたＴ−ＤＮＡを植物細胞ゲノム内へ転移さ せるために使用される。また別の方法として、ｖｉｒ領域とＴ−ＤＮＡ領域とが 分離している二取分植物ベクター系金使用することができる。この二成分ベクタ ー系は２つのプラスミド（一方はｖｉｒ領域を含み、他方は宿主範囲が広いレプ リコン上にＴ−ＤＮＡ領域を含む）の相互作用を利用する。（どちらのプラスミ ドも単独では機能的でないが、これらの両プラスミドを含むアグロバクテリウム ・ツメファシェンス菌株は正常の腫瘍誘発能力を有する。）この方法によれば、 一方のプラスミド上のＴ−ＤＮＡは、そのサイズが小さいために、大腸菌のよう な細菌を宿主として使用する場合に容易に遺伝子操作され、それにより異種ＤＮ Ａｆ組み込むことができる。この遺伝子操作されたプラスミド金、υｉｒ領域金 もつプラスミド全保有するアグロバクテリウム・ツメファシェンス内へその後移 入すると、遺伝子操作されたＴ−ＤＮＡの植物細胞ゲノム内への導入が可能にな る（ホーケマら、１９８３ａ）。

Ｔｉプラスミドは植物遺伝子ベクターとして非常に有望視°されているが、それ らの一般的利用に対する主な障害は形質転換腫瘍細胞から全植物を再生すること の困難性にあった。大部分の開示された再生法はｉｎυ１ｔｒｏ組織培養技術を 必要とする。一般にはホーケマらの文献（１９８３６）を参照されたい。これら の方法のいくつかは最初のｉｎ　ｖｉτＯ感染段階、その後のクラウンゴールカ ルスから得られる形質転換細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏ再生を利用する。その他の方 法は植物細胞プロトプラストの感染およびこの形質転換プロトプラストからの全 植物の再生という２つのｉｎ　’ｕｉｔｒｏ技術を利用する。しかしながら、こ れらの方法はｉｎ　ｖｉｔｒｏ植物組織培養技術に依存するので時間がかかり、 ！た実施するのが厄介である。さらに、プロトプラストＪたはカルスからの再生 は単に少数の植物に対して可能であるに過ぎないことが見出された（シンプソン ら、１９８３　）。

植物細胞を形質転換および再生する一層有利な方法は、形質転換のためのｉｎ　 ｖｉｖｏ感染法全染法するが、１ｎｖｉｔｒｏ再生法の必要性を排除するもので ある。その代わりに、これらの方法は腫瘍からの全植物のｉｎ　ｖｉτｏ古生法 を利用する。不幸にも、この種の方法全開発する試みはあまり成功していない。

その結果、当技術分野は現在までのところ形質転換植物を腫瘍から再生する二三 の成功報告例を含むのみである。

報告例の少なくとも１つ〔デグリーブ（ＤｇＧｒｇｖｇ）ら、１９８２］は明ら かに、Ｔｉ　プラスミドに保有される腫瘍遺伝子の偶発的な欠失を含んでいた。

（Ｈ￥！瘍遺伝子の不在は形質転換植物細胞全表現型の正常な全植物へ分化させ た。）別の報告例では、腫瘍遺伝子の１つを前もって不活性化すると感染植物が 再生された。バートン（Ｅａｒｔｏｎ）らの文献（１９８３）を参照されたい。

不都合なことに、腫瘍遺伝子を弱めるかまたは失活するこの方法および他の方法 は、腫瘍遺伝子が無力にされるが依然として植物中に存在するので、植物を形質 転換し且つ再生するための一般的１更用に対しては不満足なものである。これら の遺伝子は形質転換植物またはその子孫の生存期間内の未来のある時点で活性化 される可能性がある。

“無力”にされた腫瘍遺伝子の活性化は植物に望ましくない表現型の変化奮起こ すので、それらの存在は作物の改良品種を捜しめる植物育種家に望ましくない危 険を与える。さらに、欠失法における低い欠失頻度ならびに予卸できない自然現 象は、腫瘍からの全植物の一般的再生方法としてこの方法を不満足なものにして いる。

こうして、腫瘍から全植物を形質転換し且つ再生するためのｉｎ　ｖｉｖｏ方法 （この場合植物は外米性ＤＮＡ’（含むが失活腫瘍遺伝子を含まないように形！ 転換される）を提供するための過去の努力は失敗であった。

発明の目的 本発明の目的は、形質転換を行い、そして核ゲノム内に異種ＤＮＡが組込まれた 細胞を含む全植物（ｗｈｏｌｅｐｌａｎｔ　）を再生するためのｉｎ　ｖｉｖｏ 方法全提供することである。

本発明の目的はさらに、形質転換を行い、そして腫瘍遺伝子（たとえ無力にされ た腫瘍遺伝子さえも）を含まないが、核ゲノム内に異種ＤＮＡが組込まれた細胞 を含む全植物を腫瘍から再生するためのｉｎ　ｖｉｖｏ方法を提供することであ る。

本発明の目的はさらに、植物細胞の核ゲノム内に組込まれるべき形質転換用異種 ＤＮＡのためのキャリアーベクターとして、遺伝子操作されたアグロバクテリウ ム・ツメファシェンスＴｉ型プラスミドを利用する、植物細手 本発明の目的はさらに、遺ｍ作されたＴｉ型キャリアーベクターと共にアグロバ クテリウムのｖｉｒ機能をさらに利用する、植物細胞のｉｎ　ｖｉｖｏ形質転換 方法を提供することである。

本発明の目的はさらに、腫瘍から全植物を再生する手段としてクラウンゴールの 新芽ｃｔ瘍Ｃ５ｈｏｏｔｙ　ｔｕｍｏｒ　）を利用する、全植物のｉｎ　ｖｉｖ ｏ形質耘換／再生方法を提供することである。

本発明の目的はさらに、アグロバクテリウムｖｉｒ機能およびＴｉ型キャリアー ベクターと共にアグロバクテリウム・ツメファシェンス新芽突然変異株をさらに 利用する、全植物のｉｎ　ｖｉｖｏ形質転換／再生方法を提供することである。

本発明のその他の目的は当技術分野において習熟した者には次の説明および図面 より明らかになるであろう。

ここにおいて、第１図はＴｉ型キャリアーベクターｐＡＲｃ２の作製を示す模式 図であり；そして第２図はＴｉ型キャリアーベクターｐＡＥＣ４，の作製を示す 模式図である。

発明の要約 一般に、本発明は全植物を形質転換および再生するためのｉｎ　ｖｉｖｏ方法を 開示する。本発明方法によれば、植物ＣＦ）　カ（１）　ヒ＃　Ｌ／　７　、ｒ 、　機能；（２）　植＊（Ｐ）Ｋ新芽を有する新芽腫瘍（ｓｈｏｏｔ−ｂｅａｒ ｉｎｇ　ｓんｏｏｔ’ｌ　ｔｕｒｎｏｒ）を誘発し得る腫瘍因子：および（３） 　植物（Ｐ）細胞の核ＤＮＡ内に組込まれ得る遺伝子操作された異種トランスフ ァーＤＮＡを含むキャリアベクター：を有する感染性微生物媒介物により感染さ れる。感染植物（Ｐ）は感染部位またはその付近に新芽を有する新芽＋１ｆｉ瘍 が発生するまで維持される。その後、異種トランスファーＤＮＡがゲノム内に組 込まれた形質転換細胞を含む新芽またはその子孫を選択し、これを利用して異種 トランスファーＤＮＡがゲノム内に組込まれた細胞を含む全植物を生産する。

本発明によれば、新芽を腫瘍から切り離丁ことなしに生殖能力のある成熟植物へ と発育させることができる。

これとは別に、新芽を切り離して“ポット内”で発育および成熟させることもで きる。また、本発明によれば、新芽またはその子孫を形質転換されたものである として同定することができる。より詳細には、本発明の１つの面によると、異種 トランスファーＤＮＡがゲノム内に組込まれた細胞を含む生殖能力のある新芽を 同定し、その後それを有性生殖により増殖させて形質転換された全植物を生産す る。本発明の他の面によると、植物（Ｐ）の新芽腫瘍上の自家受精した新芽から Ｆ、子孫が得られる。

遺伝子操作された異種トランスファーＤＮＡがゲノム内に組込まれた形質転換細 胞を含むこのＦＩ子孫を同定し、その後有性生殖により増殖させる。

本発明は植物細胞の形質転換に使用する新規なキャリアーベクターを開示する。

本発明はまたここに記載の新規方法によって形質転換および再生された植物（個 々の植物細胞およびその種子を含む）を包含する。

発明の詳細な説明 本発明は腫瘍から全植物を形質転換および再生するためのｉｎ　ｖｉｖｏ方法を 開示する。本発明方法は”遺伝子操作された異種ＤＮＡを有するＴ−ＤＮＡを植 物細胞ゲノム内に転移するＺ’７Ｌ　ｖｉｖｏ手段として゛遺伝子操作”された アグロバクテリウムＴｉ型キャリアーベクターを利用するものである。本発明は さらに腫瘍から全植物を再生するｉｎ　ｖｉｖｏ手段として”新芽突然変異機構 ”を利用する。

本発明のｉｎ　ｖｉυＯ方法は、植物がアグロバクテリウム・ツメファシェンス の新芽突然変異株に感染後新芽１１ｉ１瘍を形成する限り、どのような植物（Ｐ ）の形質転換に対しても使用することができる。〔タバコの新芽腫瘍については デクレープ（Ｄ６Ｇｒｅυｅ）らの文献（１９８２）、ジャガイモの新芽腫瘍に ついてはオームス（ＯＯｒｒＬ８）うの文献（１９８３）、およびペチュニアの 新芽腫瘍についてはリーマ／ス（Ｌｅｅｍａｎｓ）らの文献（１９８２）を参照 されたい。〕多数の双子葉植物、若干の裸子植物および少数の単子葉植物（ユリ 目およびサトイモ目）はクラウンゴールの病気にかかりやすいことが知られてい る（デクリーンおよびプレイ、１９７６）。また、１つのＴ−ＤＮＡ腫瘍遺伝子 位置（ｔｍｓ位置と呼ばれる）で突然変異を起こしたツバリン型またはオクトピ ン型Ｔｉプラスミドを保有するアグロバクテリウム・ツメファシェンス菌株は“ 腫瘍形成性”であるが、“正常”のクラウンゴール腫瘍よりむしろ“新芽腫瘍” を生ずることも知られている〔オームスら、１９８１およびジョーク（ＪｏｏＳ ）ら、１９８３）。新芽を有するｌ１ｌｔ瘍を形成するアグロバクテリウム菌株 は“新芽“突然変異株と呼ばれる。この新芽突然変異株はどれも、それが形質転 換しようとする植物に新芽腫瘍を形成する限り、本発明方法において使用できる 。

本発明は新芽突然変異株を本発明方法で使用する前にそれらを“遺伝子レベル” で同定または理解する必要がない。その代わりに、有用な突然変異株は新芽腫瘍 を形成するそれらの能力によって単に”全体レベル”で同定される。より詳細に は、遺伝子講成が未知である菌株を便って、形質転換しようとする植物に感染さ せることができる。未知の菌株が感染植物に新芽腫瘍を形成する場合、その菌株 は感染植物に対して新芽を有する新芽腫瘍の誘発原因となり得る゛腫瘍因子”の 源として適する突然変異株であると推定される。本発明において“腫瘍因子”と いう用語は機能的に定義され、すなわちそれは感染植物に対して新芽を有する新 芽腫瘍の誘発原因となり得るアグロバクテリウムの新芽突然変異株により寄与さ れる因子を意味する。

本発明は、新芽ｊ産婆におけるまだ未知のある種の機構〔本明細書では”新芽突 然変異機構（５ｈｏｏｔｙ　ｒｎｕｔａｎｔｍｅｃｈａｎｉｓｒｎ）”と呼ぶ〕 が新芽の形成へと導くという事実に基づいている。この新芽突然変異機構はｔｒ ｒＬ８位置の突然変異によって生じるホルモンの不均衡であり得る（ホームスら 、１９８１）。しかしながら、本発明においては“新芽突然変異機構”を理解す る必要がない。重要なことは、所定の新芽突然変異株が形質転換しようとする植 物ＣＰ）に対して新芽を有する新芽腫瘍を形成し得るということである。

本発明はまた、いくつかの新芽突然変異株のＴ−ＤＮＡにおける偶発的な欠失が 生殖能力のある正常植物へと根付いて生長する形質転換新芽をもたらすという発 見に基づいている。オツテン（０ｔｔｅｎ　）　ラの文献（１９ｓ１）を参照さ れたい。しかしながら、イに発的欠失方法が予知しえないこと、ならびに形質転 換植物中にフ腫瘍遺伝子（たとえ無力にされたものでさえも）が存在することの 不都合を避けるために、本発明は初めに、新芽突然変異株の腫瘍因子を遺伝子操 作されたＴ−ＤＮＡから分離する感染性媒介物により植物を感染させることを教 示する。

より詳細には、新芽腫瘍上の新芽がそれらのゲノム内に組込まれた異種ＤＮＡを 有する細胞を含むべく予定どおりにそれらを形質転換する手段として、本発明方 法は、形質転換しようとする植物（Ｐ）に新芽を有する新芽腫瘍を誘発し得る“ 腫瘍因子”；植物細胞ゲノム内への゛遺伝子操作”された異種Ｔ−ＤＮＡの転写 および／！たは組込みにとって必要な”ビルレ／ス因子”：および植物細胞ゲノ ムへ転移されるべき異種Ｔ−ＤＮＡを有する一遺伝子操作”されたＴｉ型キャリ アーベクター；を含む感染性微生物媒介物を利用す゛る。ここに開示される特異 な感染性微生物媒介物を構成する諸要素の組合せの結果として、腫瘍因子は従来 通り新芽腫瘍を誘発するために使用され、また”新芽腫瘍機構”は従来通り新芽 の形成のために使用できる。新芽腫瘍から生長する新芽の大部分は形質転換され ないであろう（デクレープら、１９８２）が、また一方では前記の感染性微生物 媒介物における諸要素の特異な組合せのために、若干の新芽が形質転換されて、 遺伝子操作された異種Ｔ−ＤＮＡをゲノム内に組込んだ細胞を含むであろう。こ の種の細胞は、異種Ｔ−ＤＮＡが腫瘍遺伝子を含むように遺伝子操作されていな いので、腫瘍遺伝子（たとえ失活されたものでさえも）を何も含まないであろう 。

本発明において“ビルレンス因子”は、失活された場合に、植物細胞ゲノム内へ のＴ−ＤＮＡの転移および／または組込みを妨げるアグロバクテリウムＴｉ　ま たはＲｉプラスミド上の機能的部分と定義される。従って、本発明において、ビ ルレントとは定義により高度に感染性であり且つ腫瘍を形放し得ることを意味す るので、新芽を有する新芽腫瘍を誘発し得る突然変異株はどれも必ず“ビルレン ス機能”を有するであろう。換言すれば、突然変異株が新芽を有する新芽肺Ｓを 誘発する場合、その閑株はそれが１産婆形成を引き起こすので定義によりビルレ ントであるだろう。その結果、”遺伝子操作”されたＴ−ＤＮＡの転移および組 込みにとって必要となるビルレンス機能は、新芽腫瘍を誘発するために使用する 新芽突然変異株によって生来的に供給されるであろう。これとは別に、必要なビ ルレ／ス機能の補充源として、ベクター自体のυｉｒ部分を有するキャリアーベ クターを利用することもできるだろう。

υｉｒ機能および腫瘍因子のほかに、前記の感染性微生物媒介物は異種トランス ファーＤＮＡ（ん／Ｔ−ＤＮＡ　）を有する遺伝子操作されたキャリアーベクタ ーを含む。

より詳細には、キャリアーベクターはＴ−ＤＮＡ隣接配列および植物細胞の核ゲ ノム内に組込まれる異種ＤＮＡ断片から構成される“遺伝子操作″されたトラン スファーＤＮＡを含む。さらに、キャリアーベクターは好ましくはベクター内へ の異種ＤＮＡの挿入を促進するために宿主範囲の広いレプリコンを含むだろう。

この宿主範囲には好ましくは大腸菌およびアグロバクテリウム・ツメファシェン ス株が含まれるだろう。好適な形態において、キャリアーベクターは腫瘍遺伝子 （失活されたものまたは無力にされたものでさえも）を何も含まない。Ｔ−ＤＮ Ａを植物細胞ゲノムへ転移し得るキャリアーベクターはどれも本発明方法におい て利用できる。開示されたキャリアーベクターｐＡＲｃ２およびｐＡＩｌｃ４（ 失活された腫瘍遺伝子さえも含まない）が好適である。

植物細胞ゲノム内へ転移されるべき異種ＤＮＡの横側にはＴ−ＤＮＡ隣接配列が 存在するだろう。本発明において、その隣接配列はＴ−ＤＮＡを植物細胞ゲノム 内へ組込むように機能する限り、天然または合成のいずれのＴｉ隣接配列も異種 ＤＮＡの横に配置するために使用できる。Ｔｉ　プラスミドｐＴｉＴ３７（ヤン グおよびシンプソン、１９８１）由来のＴｉ隣接配列が好適である。

Ｔ−ＤＮＡ隣接配列内の異種ＤＮＡはキャリアーベクターへ挿入し得るいずれの ＤＮＡであってもよい。この種のＤＮＡは長さが１〜５００００塩基対であり、 且つ２つまたはそれ以上の遺伝子を含むのが好ましい。これらの遺伝子の１つは 好適には形質転換の選択基準を与える物質をコードするだろう（例えばマーカー 遺伝子）。

その他の遺伝子または遺伝子類は好適には選択方法に無関係な機能または特徴を コードするだろう。このような機能には害虫３よび病原蕗に対する強められた抵 抗性、天候および貧土壌に対する改良された耐性、種子タンパク質の生産増加な どが含まれる。

本発明方法によれば、植物（Ｐ）を感染性微生物媒介物に感染させ、その後感染 部位またはその付近に新芽を有する新芽腫瘍が発生するまでその植物（Ｐ）を維 持する。

新芽腫瘍を形成し得る植物はどれも使用できる。好適な形態において、植物は傷 をつけることにより感染させ、次にその傷つけた部位を使って植物の中に感染性 微生物媒介物を導入する。別の方法として、感染性微生物媒介物は微量注射法の ような技術を使っても導入できるだろう。

植物（Ｐ）は当技術分野で仰られた方法により傷をつけることができる。このよ うな方法には、切り傷、削り傷、すり傷および切断が含まれる。葉、幹および根 を含めた植物のどの部分に傷をつけてもよい。好適な形態では、植物（ｐ）の幹 に切り傷をつけるかまたは幹を切断し、次いで感染性微生物媒介物に感染さぜる 。植物に傷をつけて感染させる好適な方法は以下の調製方法のところで述べる。

感染植物は新芽を有する新芽腫瘍が発生するまで制御された環境条件下で温室内 に維持するのが好ましい。好適な維持方法もまた以下の調製方法のところで述べ る。

形質転換された新芽および形質転換されていない新芽の両方が新芽腫瘍上で生育 する。本発明においては、”新芽突然変異株”に由来するＴ−ＤＮＡを含む新芽 もあれば、遺伝子操作されたトランスファーベクターに由来するＴ−ＤＮＡを含 む新芽もあると考えられる。遺伝子操作されたトランスファーベクターに由来す るＴ−ＤＮＡをここでは”ｈ／Ｔ−ＤＮＡ”と呼ぶことにする。

ｈ／Ｔ−ＤＮＡにより形質転換された新芽は、遺伝子操作された異種Ｔ−ＤＮＡ がゲノム内に組込まれた細胞を含むであろう。ｈ／Ｔ−ＤＮＡにより形質転換さ れた新芽は、遺伝子操作された異種Ｔ−ＤＮＡの有無を分析することにより直接 同定す゛ることができ、る。また、ｈ／Ｔ−ＤＮＡにより形質転換された新芽は 、例えば遺伝子操作されたＴ−ＤＮＡが抗生物質耐性遺伝子を保有する場合は抗 生物質耐性を、あるいは遺伝子操作されたＴ−ＤＮＡが形質転換新芽に特異的な 酵素をコードする場合はその酵素を、分析することによるマーカー遺伝子産物の 有無を試験する間接的方法を使って同定することができる。ここに開示した新規 キャリアーベクターｐＡＲｃｚおよびｐＡＲＣ＋、は、ノパリ／シンターゼをコ ードする遺伝子操作されたｈ／Ｔ−ＤＮＡを含有する。これらのキャリアーベク ターは好ましくはオクトピ／を生産する新芽突然変異株に対して利用され、こう して遺伝子操作されたｈ／Ｔ−ＤＮＡにより形質転換された新芽はツバリンの存 在により内定できる。ツバリンの検出方法は以下の調製方法のところで述べる。

本発明の１つの面によれば、遺伝子操作された異種トランスファーＤＮＡ（ｈ／ 、Ｔ−ＤＮＡ）を細胞ゲノム内に組込んだ細胞を有する生殖能力のある新芽を同 定し、その後有性生殖によりそれを増殖させる。本発明のこの面において、形質 転換された新芽は増殖に先立って腫瘍から切り離されない。その代わり、遺伝子 操作されたｈ／Ｔ−ＤＮＡを含む新芽は、まだ腫瘍の上にあるうちに、花を咲か せる。これらの花を自家受粉し、得られた種子を戸紙上または標準土壌混合物中 で発芽させる。その後、さらに生長および増殖させるために苗をポット（植木鉢 ）に移植する。

本発明のもう１つの面において、新芽を新芽ＩＩＩ瘍から切除し、無菌の砂に根 付かせ、その後標準土壌混合物を入れたポットに移植する。ポットに植えたこれ らの新芽は成熟させて花を咲かせた後、それらも自家受粉させる。

自家受粉させた植物からの種子を植え付けて発芽させ、それによりＦ、子孫また は苗（これらのうちのいくつかはｈ／Ｔ−ＤＮＡを含むであろう）を生産する。

ｈ／Ｔ−ＤＮＡを含むＦｌ　植物はその後自家受粉させてＦ２　植物を得る。挿 入されたＴ−ＤＮＡは形質転換植物により安定して保持され、発現され、生殖能 力を有して伝達されるというオツテン（０ｔｔｅｎ）ら（１９８１）の発見に基 づくと、Ｆ２　苗の何本かはまたｈ／Ｔ−ＤＮＡをゲノム内に組込んだ細胞を含 むであろうと予測される。

本発咀方法の有効性は、タバコおよびｐＡＲＣ２キャリアーベクターとアグロバ クテリウム・ツメファシェンスのオクトピン型新芽突然変異株とから成る゛混合 ”感染性微生物媒介物を利用する実施例において例示される。

タバコは比較的感染しやすいので、本発明方法の有用性を立証するために用いら れた。さらに、大きな新芽ｊ産湯は”新芽突然変異株”による感染後に傷つけた タバコの幹で増殖させる。本発明方法は新芽を有する“新芽腫瘍”を形成し得る 全ての植物に適用できると理解されるべきである。タバコの実施例は例示目的で のみ示されたものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。

ここで利用する調製方法を以下に説明する。

本発明で使用する細菌菌株およびプラスミドを下記の第１表に記載した。

プラスミドｐＢｓｔ　Ｅ　［１９，１４はＴｉ　プラスミドｐＴｉＴ３７に由来 するＥｃｏＲ［フラグメント２９を保有する。

ＥｃｏＲ１フラグメント２９は該フラグメントの右端から約１００塩基対の所に 位置するＴ−ＤＮＡ領域の左末端または隣接配列を７ラグメント上に有している 〔ヤダプ（Ｙａｄａｖ）ら、１９８２：ザムプリスキー（Ｉｌａｍｂｒｙｓｋｉ ）ら、１９８０．１９８２）。プラｘ　ミ）’　ｐＢｓｔＥ　ＩＩ　９．１４は ｐＴｔＴ３７ＤＮＡをＢ８ｔＥＵで部分切断し、生じたフラグメントをベクター ｐＭＥ９にライゲーションして得られ〔ヤン（Ｙａｎｇ）およびシンプソン（５ ｉｒｎｐｓｏｎ　）、１９８１）、この挿入物は近接するＥｓ　ｔＥＩｌフラグ メント９および１４からなる。

プラスミドｐＵＣ８〔ヴイエイラ（Ｖｉｅｉｒａ　）およびメツ７ング（Ｍｅｓ ｓｉｎｇ）、１９８２）はメリーランド州２０８７７、ガイゼルスバーにあるベ セスダ・リサーチ・ラボラトリーズから得た。

プラスミドｐＴ３’１Ｈ２３はＴｉプラスミドｐＴｉＴ３’１に由来するＨｉｎ ｄｍフラグメント２３を保有する。Ｈｉｎｄ■フラグメント２３は左から右に向 かって、トランスクリプト６ｂをコードするＤＮＡの５′部分〔ウィルミツツア ー（Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ　）ら、１９８３）、全ツバリンシンターゼまたはＨ ＯＥ遺伝子〔ベバン（Ｂｅｖａｎ　）ら、１９８３　；デピツカ−（Ｄｅｐｉｃ ｋｔｒ　）ら、１９８２：）、Ｔ−ＤＮＡの右末端配列〔ヤデブ（Ｙａｄｇｖ　 ）ら、１９８２；ザムブリスキー（Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ）ら、１９８０．１９８ ２：１および植物細胞に形質転換されないＴｉプラスミドの部分を有している。

プラスミドｐＴ３７Ｈ２３〔デピツカ−（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ　）ら、１９８２］ はスコツト・スタチェル（５ｃｏｔｔ　５ｔａｃｈｅｌ　）から恵与された。

ベクターの構築 本発明で使用する制限酵素もベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズから入手し、 製造者の指示に従って使用した。大腸菌（Ｅｓｃｈｔｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　 ）をプラスミドＤＮＡで形質転換する方法はアレクサンダー（Ａｌｅｘａｎｄｅ ｒ　）ら（１９８４）に記載されている。核“酸に関するその他の操作は、特別 に記載しない限り本質的にはマニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ　）ら（１９８２ ）に記載の方法に従った。

遺伝子操作した広い宿主範囲をもつプラスミドｐＡＲＣ２およびｐＡＲｃ４は中 間プラスミドｐＵｃ８−２２−２１、ｐＡＲｃｌおよびｐＡＲＣ３を順次構築す る工程を経て構築された。この工程を第１図および第２図に系統的に図示した。

Ｔ−ＤＮＡの左右の末端配列を図中に旗印で示した。

中間プラスミドｐＵｃ８−２２−２１はｐＵｃ８に挿入されたｔ　ｐＴ　ｉＴ　 ３７由来の１．５キロベース（Ｋｂ　）のＥｃ。

Ｒ■フラグメントを有している。ｐＵｃ８−２２−１１を作製するには、Ｅｃｏ Ｒ１フラグメントｚ９を以下の方法でｐＵｃ８のＥｃｏＲｌ　制限部位にクロー ンした。ｐＢｔｔｔＥ■９　、１４（ヤン（Ｙａｎｇ）およびシンプソン（ｆ； ｉｍｐｓｏｎ）、１９８１）のＥｃｏＲＴ切断物から得られるＤＮＡフラグメン トをｐ、Ｕ　Ｃ８のＥｃｏＲ１切断物と混合した。リガーゼで処理したのち、該 混合物を大腸菌株ＪＭ８３に形質転換した。無色のコロニー〔ヴイエイラ（Ｖｉ ｇｉｒａ　）およびメツシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）、１９８ｚ参照のこと〕を、 ４０μｇ／ゴのアンピシリンと３５μＥｌ／ｒｕｔのＸ−σαｌを補充したルリ ア寒天培地〔マニアテイス０ｂｒａｎｉａｔｉｓ）ら、１９８２）を含むプレー ト上で選択した。コロニーのうちの１つはｐＵｃ８−２２−２１と命名したプラ スミドを有する細胞を含んでいた。

ｐＵｃ８−２２−２１中（ＤＥｃｏＲ■７ラグメｙ）２．’Ｈ；！左末端配列が ｐＵｃ８のＨｉｎｄ　［［［制限部位から離れるように位置付けられる。フラグ メントの同定および方向付けは、ＥｃｏＲ■フラグメン）２９の右末端から約４ ８０塩基対に位置するザムブリスキー（ＺａｍｂｒＪｓｋｙ）ら（１９８０）に よって位置決めされたＨｉｎｃＵ制限部位に基づいて行った。フラグメントの同 定はＤＮＡ配列分析によって実証した。

中間プ；ｙスミドｐＡＲＣ１はｐＵＣ８−２２−２１のＨｉｎｄ　［［制限部位 に挿入した、ｐＴｉＴ３７　由来のＨｉｎｄ■フラグメント２３を有している。

ｐＡＲＣｌは以下の方法で構築した。Ｔ−ＤＮＡ右末端配列を有するＨｉｎｄＩ ｆｆフラグメント２３を、プラスミドｐＴ３７Ｈ２３をＨｉｎｄ＠　で切断する ことによって単離した。この制限酵素切断フラグメントを次いでアガロースゲル の電気泳動にかけてマニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ　）ら（１９８２）が記載 する方法によってニトロセルロース上に電気溶出した〔プラスミドｐＴ３７Ｈ２ ３は、ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄｆｆｌ制限部位に挿入されたｐＴｉＴ３７由来の Ｈｉｎｄｍ　フラグメント２３を有している。デピツカ−（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ　 ）　ラ（１９８２）を参照のこと〕。次いで、精製したＨ４ｎｄ■フ２グメント ｚ３をＨｉｎｄｍで切断したｐＵｃ８−２２−２１にライゲーションした。該混 合物を大腸菌株ＨＢ１０１に形質転換し、アンピシリン耐性コロニーを選択した 。これらのコロニーのうちの１つから得た細胞はｐＡＲｃｌと命名したプラスミ ドを有していた。プラスミドｐＡＲｃ１は、ｐＵｃ８−２２−２１のＨ４ｎｄｍ 制限部位に挿入したＨｉｎｄｍフラグメン）２３を有しており、このフラグメン トは右末端配列がＥｃｏＲｌ　挿入部位の近くとなるように位置付けられる。第 １図を参照されたい。

プラスミドｐＡＲＣ？！、はｐＡＲＣｌの誘導体である。このプラスミドはｐＡ ＲＣｌをＢｇｔｙ、で線状化し、次いでこの線状化フラグメントを広い宿主範囲 を有するベクターｐＲＫ２９０のＥｇｌＵ制限部位に挿入することによって作製 された。ｐＡＲＣ２の剖造は、Ｔ−ＤＮＡの左右の末端配列の相互関係が、Ｔｉ プラスミドｐＴｉＴ３７中におけるこれらの相互関係と同じ方向と位置を有して いるが、ｐＡＲｃｚでは全ての腫瘍遺伝子を含むＴ−領域の主要部分がｐＵｃ８ 　で置き換えられている。ｐＲＫ２９０に由来するこの広い宿主範囲のレプリコ ／は、大腸菌中におけるのと同様にアグロバクテリウム中においてｐＡＲＣ２が 複製するのを許容する。ｐＲＫ２９０と同様に〔ディツタ（Ｄｉｔｔａ）ら、１ ９８０）、ｐＡＲＣ２はヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３によって可動化され る。〔この能力はある場合にはベクターをアグロバクテリウム菌株に転移するた めに用いられた。あるいはアグロバクテリウム菌株をｐＡＲＣ２ＤＮＡで形質転 換した。ホルスターズ（Ｈｏ１ｓｔｅｒｓ　）ら、（１９７８））プラスミドｐ ＡＥＣ２を構築するには、ｐＡＲｃｌ、をＥＱＩＵで切断して得られる生成物と 広い宿主範囲を有するベクターｐＥ８９０をＥＱＩＭで切断した生成物とを混合 し、ライゲーションし、次いで大腸菌株ＨＢ１０１に形質転換した。この大腸菌 株からｐＡＲＣ２プラスミドＤＮＡを単離したのち、これを精製し、次いでホル スターズ（Ｈｏ１ｓｔｅｒｓ　）ら（１９７８）が記載した方法でアグロバクテ リウム菌株Ａ１３６およびＡ３２８に形質転換してそれぞれＡ１３６（ｐＡＲＣ ２）株およびＡ３２８（ｐＡＲＣ２）株を作製した。ガーフインケル（Ｇａｒｆ ｉｎ−ｋｅｌ）ら（１９８１）が記載した方法を用いてＬＥＡ４４０４、ＨＢｌ ｏｌ　ＣｐＲＫ２０１３）およびＨＢｌｏｌ（ｐ　Ａ　ＲＣ２，Ｘ−含む交配（ ｍａｔｉｎｇ）混合物からＬＥＡ４．４０＋（ｐＡＲＣ２）株を単離した。

プラスミドｐＡＲＣ４，は、プラスミドｐＡＲｃ４　が遺伝子操作したＴ−ＤＮ Ａ領域中に外米ＤＮＡフラグメントのｉｎυ１ｔｒｏの挿入を容易にする特異的 なＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ　ｌ［制ル部位を有しているという点を除いて、ｐ ＡＲｃ’１．に似ている。ｐＡＲＣ＋を構築する第１工程はｐＡＲｃｌをＢｓｔ ｌｆ：■で切断することであった。次いでこの切断生成物をＤＮＡポリメ多−ゼ クレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメントと４種のデオキシヌクレオシド三リン酸 と共に「修復（フィルイン）」シた。ＢＱＩ■リンカ−〔マサチューセッツ州０ １９１５、ペバーリ−（Ｂｅｖｅｒｌ’／　）にあるニューイングランド・バイ オラボ社製〕を１４ＤＮＡ！７ガーゼを用いて添加し、次いで生成物をＥＱｌｆ ｌで切断した。ライゲーション工程および大腸菌株ＨＥ１０１を形質転換した後 、プラスミドｐＡＲｃ３　を単離した。第２図を参照されたい。

プラスミドｐＡＲＣ４，はプラスミドｐＡＲＣ３とｐＲＫＭｌと称されるプラス ミドとの誘導体である。プラスミドｐＡＲｃ４は以下の方法で構築した。プラス ミドｐＲＫＭｌ　およびｐＡＲＣ３を夫々別個にＢＱＩＴｉで切断した。〔プラ スミドｐＲＫＭ１は、Ｔ、Ｄ、マツフナイト（ＭｃＫｎｉｇｈｔ　）　（私信〕 の方法に従い、広い宿主範囲を有するベクターｐＲＫ２９０をＥｃｏＲＩで切断 し、ＤＮＡポリメラーゼ！クレノー７ラグメントとデオギ・ンリボヌクレオシド 三リン酸で「修復」し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼで再閉環することによって構築し た。このプラスミドにはＥｃｏＲＴ制限部位がない。：ｌｐＲＫＭｌおよびｐＡ ＲＣ３の切断生成物を次いでライゲーションしてｐＡＲＣ４゜を生成した。第２ 図を参照されたい。アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４（ｐＡＲＣ４）株および Ａ３２Ｂ（ｐＡＲＣ４）株は上述した交配方法を用いて作製した。

ビルレンス（毒性）試験 ガーフインケル（Ｇａｒｆｉｎｋｅ　ｌ　）およびネスター（Ａ／ｇｇ−ｔｇｒ ）（１９８０）に記載の方法を用いて、二／ジ／／ダウクス・キャロツタ（Ｄａ ｕｃｔｔｓ　ｃａｒｏｔａ　）のディスク、タバコ／ニコチアナ・タバカム（Ｎ ｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ）およびカランコニ・ディアグラモンタニア （Ｋａｌａｎｃｈｏｇｄｉａｇｒａｒｎｏｎｔａｎｉａ）上でビルレフＸ試験を 行った。

植物の播種 アグロバクテリウムの菌株をＬＢ液体培地〔マニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ　 ）ら、１９８２）に播種し、後期定常期（グリーンフィルターナ５４を付けたク ンットーサムエルシン型分光光度計で測定した）に至るまで２８’Ｃで　振どう 培養した。２種の異なる菌株を混合する場合には、高濃度の懸濁液を低濃度な懸 濁液と同じ濃度となるように（１ｍｇ当り５〜ｚｏｘ１ｏＥｓ細菌）希釈した。

このように希釈した後、指示する比率で混合物を作製した。

次いで細菌混合物は個々の培養物と同様に４レツト化した。

１８〜２４インチの高さの植物（タバコ）の幹を、政菌した木の棒またはカミソ リの刃で幹にスリットを入ｒすることによって傷つけた。幹の先を切る場合には カミソリの刃を用いた。この傷に、折った棒あるいはつまようじをスパーチルと して用いて細菌イレットをつけた。次いで傷をパラフィルム（ＰＡＥＡＦＩＬＭ ）（商標名、コネチカソト州０６８３３、グリーンウィッチにあるアメリカン・ カン社製）でおおい湿気に′保った。

植物の維持 植物を温室内で成育させ、１５０　ｐｐｍ窒素となるようにヴ７−ディ７ｈ（Ｖ ＥＲＤＩＳＱＬ）２０−２０−２０（商標名、カリフォルニア州９３７１０、フ レスノにあるモイヤー・ケミカル社製）で施肥した。いくつかの場合においては 腫瘍から生じる新芽をカミノリの刃で切除し、ルートン（ＲＯＯＴＯＮｇ）（商 標名、Ｋ／シルベニア州１９００２、アンブラーにあるユニオン・カーバイド・ アグリカルチュラル・プロダクツ社製）に浸漬し、滅菌砂に植え、ミズゴケピー ト３３％、バーミキュライト３３％、スーパーソイル（ＳＵＰＥＲ８ＯＩＬ）（ 商標名、カリフォルニア州、サンフランシスコにあるロンド・プロダクツ社製） ３３％からなる標準土壌混合物を入れたポットに移植した。切除した新芽および 切除しない新芽の両方から得られる花を自家受粉し１１種子をデ紙上または標準 土壌混合物中で発芽させた。得られる苗をビート、砂、軽石（カリフォルニア州 、サン・ジョーズにあるジェルトン・トランスファー社製）からなる土壌混合物 を入れたポットに移植した。

ツバリンの検定 ０１〜０．５ｇの重量の葉を液体窒素中で凍結し、乳鉢と乳棒ですりつぶし、１ ．５ｍｌのエツー！′７ドルフ管に移し、組織０．１７当り５０ｐＨのエタノー ルを混合した。室温中１５分後、破砕物をエラ４ンドルフ遠心管中で更に］、５ 分間イレットした。上清５０μｌを穴あけパンチとワットマン＋３Ｐ紙で炸裂し た７紙ディスク上に滴下した。ディスクを乾燥させた後、本質的にはオツテン（ Ｏｌｔｅｎ　）およびシルバーロート（５ｃｈｉｌｐｅｒｏｏυが記載する方法 によって高電圧ｐ紙電気＃動および染色を行うために該ディスクを原点においた 。

ＤＮＡの検定 少量の植物ＤＮＡを以下のようにして単離した。即ち、約１９の洗滌した葉を液 体窒素中で凍結し、乳鉢と乳棒ですりつぶし、管に移して４ゴの溶菌バッファー （７＆塩酸グアニジン、２％サルコシル、２０　ｍｕ　ＥＤＴＡ。

ｚＯｒｒＬＭトリス塩酸、ｐＨ８，０）［サルコシル（’；ＡＲＫＯ８ＹＬ）： ミズーリ州６３１７８．セントルイスにあるシグマケミカル社製の商標名〕の存 在下で融解した。５５℃で約１時間保持した後、水０．８　ｍｌを加え、ツルパ ル容量を水１容量で希釈したもの）を加えて５ｍｌとし、塩化セシウムの２段階 密度勾配（ｊ：ｗｏ　５ｔｅｐ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　）上にのぞた。塩化セシウ ムの段階は各３ｍｌであった。その中には２０ｒｒＬＭトリスー塩酸、ｐＨ８， ０および０３ｍ９７Ｍエチジウムプロミドを含んでおり、１．３５１／ＣＱＩた は１．６ｙ／Ｃｒ、のいずれかの密度を有していた。このグラジェントをベック マン（Ｂｅｃｋｍａｎ　）　ＳＷ　４１型遠心器を用いて２０℃、３　＆　ＯＯ Ｏｒｐｍで少なくとも１６時間遠心した。２つの段階の界面に位置するＵＶ光で 観察しつるＤＮＡのバンドを回収した。エチジウムプロミドを除去するためにＤ ＮＡをインアミルアルコールで数回抽出した。インプロパツールおよびエタノー ルで沈殿させ、次いで１　ｍＭＦ：ＤＴＡ　５０１１１と１０ｍＭトリス−塩酸 、ｐＨ８，０に再懸濁した。大部分のＤＮＡの単離はホワイト（Ｗ屓ｔｅ）ら、 １９８２の記載に従って行った。

スロット・プロットツテイ／グ分析を“ミニホルト■“型機器を用いて製造者の 指示に従って行った〔≧ニホールド（ＭＩＮＩＦＯＥＤ）、ニューハンプシャ州 ０３４３１、キーンにあるシュリーテヤー°アンド・シュエル社製の商職名〕。

サザン・プロッティング分析〔サザン（Ｓｏｕ−ｔｈｅｒｎ）、１９７５〕は本 質的にはトマショー（Ｔｈｏｔｒｕｘ−ｓｈｏｗ　）ら（１９８０）の記載に従 って行った。３２Ｐで標識したＲＮＡプローブはりボブローブ（ＲＩＢＯＰＲＯ ＢＥ）ＳＰ６由来の転写系を用いて製造者の指示に従って調製した（リボプロー ブはＷＺ５３７１１、マジソンにあるプロメガ−バイオチク社製の商標名）。

以下の実施例で、１ｎｖｉｖｏの形質転換および異和ＮＡを含む全植物の再生を 説明する。

本発明の方法に従ってｉｎ　ｖｉｖｏでタバコ全植物を形質転換し再生した。形 質転換および再生されたタバコ植物体はその核ゲノムに組込まれた、ツバリンシ ンターゼをコードする異種ＤＮＡを含有する細胞を有している。タバコを形質転 換し、再生するのに用いた各種手段を以下に記載する。

ｖｉｒ機能はアグロバクテリウム９３４４４０４株から供給された。［Ｌ　Ｂ　 Ａ、　４４０４株はＴ−ＤＮＡ領域を有しない厳密に削除されたＴｉプラスミド を有している。

オームス（Ｏｏｍｓ）ら、１９８０を参照のこと］し力）しながらこのような削 除にもかかわらず、ＬＩＡ４４０４株は異なるプラスミド上に゛天然”Ｔ−ＤＮ Ａを有している場合には腫瘍を誘発しつる〔ホーケマ（Ｈａ　ｅ　ｋ　ｅｒｒｕ ｘ　）ら、１９８３；デフラモンド（ｄｅ　Ｆｒａｍｏｎｄ）ら、１９８３］。

腫瘍因子 腫瘍因子はアグロバクテリウムＡ３２Ｂ株によって供給された。（Ａ３２８株は タバコの幹にｔｍ８または”新芽”腫瘍表現型を生じさせる。ガーフインケル（ Ｇａｒ−ｆｉｎｋｅｌ）ら、１９８１：］。

操作された異種Ｔ−ＤＮＡ（ｈ／Ｔ−ＤＮＡ）を転移するためのキャリアーベク ターとしてｐＡＲｃ２　を用いた。

ｐＡＲｃＺ　中の゛遺伝子操作されたｈ／Ｔ−ＤＮＡ”はいかなる腫瘍遺伝子も 有しておらず、全ツバリンシンターゼ（またはＮ０８）遺伝子を有している。第 １図を参照されたい。ツバリンシンターゼは“ＮＯ３”形質転換された細胞内で ツバリンの合成を触媒する酵素であるから、ｈ／７−ＤＮＡを有する形質転換さ れた植物はツバリンを生産する。

感染 本研究のためにプラスミドｐＡＲｃ２　をＬ　Ｂ　Ａ　４４０４に挿入してＺ、 ＢＡ４４Ｑ４（ＩＡＲＣ２）株を生成した。

これとは別の実験において、ｒ、ｓＡ＋４ｏ＋ｃｐＡＲｃｚ）株をタバコ、ニン ジンディスクおよびカランコニを感染すルノＫ　用１／１７’、：。ＬＢＡ４４ ０４（ｐＡＡ’ｃ２）株には腫瘍遺伝子が存在しないので、予期した通り試験し たどの植物にも腫瘍を誘発しなかった。そのかわりこの菌株はアビルレント（無 毒性）菌株であるＬＢＡ４４０４およびＡ１３６と似た反応を示した。

本研究においてはアグロバクテリウムＬＥＡ　４４０牛（ｐＡＲｃ”２）株を“ 新芽”突然変異株Ａ３２８と混合し、゛混合感染”型の感染性媒介物を作製した 。“混合感染”型の媒介物の作製では、ビルレン）、４３２８ｍ菌に対するアビ ルレントＬＢＡ４４０４．ＣｐＡＲＣ２）細菌の割合は約＞１００　：　１〜１ ：１の間で変更した。〔アビルレントＬＥＡ４．＋０４（ｐＡＲｃ”２．）細菌 の数が増加すると”遺伝子操作されたｈ／Ｔ−ＤＮＡ”を受け取る植物細胞の数 が増加すると推定された。しかしながら、あまりに少ないビルレン）７３２８の 存在下にあまりに多いアビルＶントＬＢＡ４４．０壬（ｐＡＲｃ２）を接種する と、極めて少数の植物細胞がＡ３２８で形質転換されることとなるので腫瘍形成 に至らないことがわかった。このようなアビルレント細菌による競合によってビ ルレンスが減少することが今までに報告されている。グツ−２／コツト（Ｌｉｐ ｐｅｎｃｏｔｔ）およびリクイ／コツト、１９６９）。

本研究ではタバコ植物体（１８〜２４インチの高さの植物の幹）を上記”調製方 法”の部で記載した方法によって傷つけ“混合感染”型の感染性媒介物で感染し た。

感染した植物を分析したところ、１のビルレントＡ３２Ｂに対して１００または それ以上のアビルレ／トＬＢＡ４４０４（ｐＡＲｃ２）を有する媒介物で感染し たタバコの幹は何ら腫瘍を生じず、従って新芽も生じなかった。

しかし、１（７）７３２８に対して１０程度のＬＢＡ４４０４Ｉ（ｐＡＲｃ２） の媒介物で感染すると、タバコの幹に”新芽”腫瘍を生じた。従って、本発明の 目的のためにはアビルレントベクターを有する細菌とビルレント細菌との比は約 １０：１〜約１：１が好ましい。

更に別の１単感染”実験ではｐＡＲｃ２をビルレントなアグロバクテリウ゛ムＡ ３２８株に導入しＡ３２８ＣｐＡＲＣ’２）を作製した。、４３２８　（ｐＡＲ ｃ’２）で感染１．ｆ、−傷つけられたタバコの幹は“新芽”腫瘍を生じ、これ は“単感染”法の有効性を示すものである。他の“単感染”実験では、Ａ３２８ 　ＣｐＡＲＣ２）をニンジンディスクおよびカランコニを感染するのに用いた。

Ａ３２Ｂ（ｐＡＲ（１”２）株には腫瘍遺伝子が存在するので、予期したように 実験した全植物に腫瘍を誘発した。いくつかの腫瘍組織でツバリンが検出された ことは少なくともｐＡＲｃ２ＤＮＡの一部分が植物細胞に形質転換されたことを 示唆感染した植物は制御した環境条件下に温室内で成育させた。はとんどの場合 、新芽は有性増殖前に腫瘍から切り離さなかった。そしていくつかの場合におい ては、腫瘍から成育する新芽を切り離し上記調製方法の部で記載したように有性 増殖に先立って砂に根付かせた。これらは本明細書では“ポット化新芽”と呼ぶ 。

Ｔ−ＤＮＡの検定 ｐＡＲｃ’２中の“遺伝子操作されたｈ／Ｔ−ＤＮＡ”は完全なツバリンシンタ ーゼ（−！たはＮ０３）遺伝子を有している。従って、ｐＡＲｃ２．Ｔ−ＤＮＡ で形質転換した新芽はツバリンを含有するであろう（一方、ビルレント７３２８ ａｌ菌はオクトピン−含有腫瘍を生産する）。

ｐＡＲｃ２　由来の”遺伝子操作された／Ｔ−ＤＮＡ”を有する植物を同定する には、新芽腫瘍上の新芽に由来する植物の葉の中のツバリンの存在を分析した。

いくつかの葉はツバリンを含有しており、こ−れは植物のうちのいくつかはｈ／ Ｔ−ＤＮＡを有するように形質転換されていたことを意味する。ツバリンを含有 する葉を有する植物を本明細書では”ツバリン陽性植物”と呼ぶ。

ツバリンの検定はｐＡＲｃ２　由来の”遺伝子操作されたｈ／Ｔ−ＤＮＡ”の存 在を試験する間接的方法である。その存在を直接的に試験するには、ツバリン陽 性植物および対照の新芽から得たＤＮＡサンプル（上記調製方法の部で記載した 迅速な単離方法によって単離したもの）をスロット・ブロッティング法でスクリ ー二／りした（上記調製方法の部を参照せよ）。スロット・プロッティング分析 のためには、ＤＮＡを変性し次いでペーキ／グ（ｂａｋｉｎｇ）で固定したニト ロセルロース上にスロットを通して集めた。

ｐＵｃ８　に相同な放射能活性なＲＮＡプローブとハイブリダイゼーションする ことによって、ｐＡＥＣ２由来の１遺伝子操作されたｈ／Ｔ−ＤＮＡ”の少なく とも一部を有するＤＮＡ標本（即ち植物）を同定した。対照群に対するハイブリ ダイゼーションの頻度は、形質転換された細胞中における単数ゲノム当りの゛遺 伝子操作されたん／Ｔ−ＤＮＡ”コピー数が１以下〜約５の間であることを示唆 している。

°０ 文　献 本明細書は次の刊行物を引用しているが、これらは各々特別の目的で参考のため にここに引用されている。

■、アレクサンダーＣＡＬｅｚａｒｓｄａｒ、　Ｄ、Ｃ，）、マツフナイトＣＭ ｃＫｎｉｇｈｔ　、　Ｔ’、Ｄ、　）およびウィリアムス（ＪＶ＜　Ｌ　Ｌ　− ４ａｍｓ、　Ｂ、Ｇ、＞ＣＩ　９８４　）　”　Ａ　Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ　ａ ｎｄＥｆｆｉｃｉｅ％ｔ　Ｖｅｃｔｏｒ−Ｐｒｉｔｎａｒ　ｃＤＮＡ　Ｃｒａｎ ｉｎｇＳｙ　ｓ　ｔ　ｅｘ”に発表。

２、バートン（Ｂａｒｔｏ％、　Ｋ−Ａ、）、ビア　ス（Ｂｔｎｎｓ　、　Ａ、 Ｎ、）、マツグＣＭａｔ　ｔｋｇ　、　Ａ、Ｊ、Ｍ、　）およびチルトン（Ｃｈ ｉ−３、ベーバン（Ｂｇ　ｖａｎ　、　Ｍ、Ｗ、　）およびチルトン（ＣＡ　ｉ 　Ｌ　ｔｏｎ。

Ｍ、−Ｄ、）、Ａｒ？Ｌｗ、　Ｒｇｖ、　Ｇａｎｅｔ、、　１６　：　３５７− ３８４（１９８２）。

４、ベーバン（Ｅｅｖａｎ、　Ｍ、　）、バーネ、ｘ、　（Ｂａｒｎｅｓ　、　 Ｗ、Ｍ、　）およびチルトン（ＣｈｉＬｔｏｎ、Ｍ、−Ｄ、）、＃ｓｃ　ｔ　ｌ 　ｇ　ｉ　ｃＡｃｉｄｓ　Ｒａｓ、、１１：３６９−３８５（１９８３）。

５、バンホツフ（Ｂｏｍｈｏｆｆ、　Ｇ、）、クラビックＣＫｌａｐｗｉ−ゴに 、Ｐ、Ｍ、）、ケスター（Ｋｅｓｔｅｒ、Ｈ，Ｃ，Ｍ、）、’／にパーロー）　 （ＳｃｈｉＬｐａｒｏｏｒｔ、　Ｒ，Ａ、）、　ハーナルステーンスＣＨｇｒｎ ａｌｓｔｇｅｎｓ、　Ｊ、Ｐ、）およびシェル−１８１（１９７６）。

６　ボイヤーＣＢｏｙｅｒ、　Ｈ，Ｗ、　）　およびローランドードウソイ（Ｒ ｏｕＨａｎｄ−Ｄｕｓｓｏｉｘ、　Ｄ、）、Ｊ、　Ｍｏ１．　ＢｉｏＬ、　。

４１：４５９−４７２（１９６９）。

７、　デクリーフ　（ＤｅＣｌｅｅｎｅ、　Ｍ、）およびプレイＣＤａＬｅｙ。

Ｊ、）、Ｂｏｔ、Ｒｅｖ−，４２：　３８９−４６６（１９７６）。

８、デフラモンドＣｄｅＦｒａｍｏｎｄ、　Ａ、Ｊ、）、バートン（Ｂａｒｔｏ ｎ、　Ｋ、Ａ、）　”＞よびチルトンＣＣｈｉＬｔｏｎ、　Ａｆ、−Ｄ、）、Ｅ ｉｏ＜ｅｃｈ、、Ａｐｒｉｌ＋　１９８３、ｐｐ、２６２−２６９゜ ９、デクレープ（ＩｈＧｒｅｖｓ、　Ｈ，）、リーマンＣＬｅ　ｅｍａｓｓ　。

Ｊ、）、ハーナルステーンス（Ｈａｒｔ＞ａｌｓｔｅｇｎｇ、　Ｊ、Ｐ、）、チ ア−トング（Ｔｈｉａ−Ｔｏｏｎｃｔ＋　Ｌ−）　ｓデブエツケラ−（ＤａＢｓ ｅｃｋｅｌｅａｒ、　Ｍ、）、ウィルミツツアー（Ｗｉ　ｌ　１ｔｎ−４ｔｚａ ｒ、　Ｌ、）、オツテン（Ｏｔｔｅｎ、　Ｌ、）、ファンモンタギューＣＶａｎ Ｍｏｎｔａｇｕ、　Ｍ、　）およびシェルＣ３ｃｈｅ　ｌ　ｌ　。

Ｊ、）、Ｎａｔｕｒｅ　３００ニア５２−７５５（１９８２）。

１０、デピツカーＣＤｇｐｔｃｋｇｒ、　Ａ、）、スタシエル（Ｓｔａｃｈ−ｅ Ｌ、Ｓ、）、ダーエスＣＤｈａａｓｅ、　Ｐ、）、サンプリスキーＣＺａｍｂｒ ｙｓｋｉ　、　Ｐ、）およびグツドマン（Ｇｏｏｄｍａｘ、　Ｈ。

Ｍ、）、Ｊ、拾二匠、Ｇｅｎ５ｔ、、１：５６１　５７３（１９８２）。

１１、ディツタ（Ｄ＜　ｔ　ｔａ　、　Ｇ−）、スタンフィールド（Ｅｔａ％− ｆｉｅｌｄ、Ｓ、）、コービｙ　（Ｃｏｒｂｉｎ、　Ｄ、）およびヘリン１２、 ガーフインケルＣＧａｒｆｉｎＪｔｒ１．　Ｄ、Ｊ、）およびネスタ−（＃ｇ　 ｓ　ｔ　ｇ　ｒ　＋　Ｅ　ＪＰ、）、Ｊ、　ＢａｃｔｅｒｉｏＬ−、１４４：　 ７３１−７４３（１９８０）。

１３、ガーフイ／ケルＣＧａｒ　ｆｉｎｋｇ　ｌ　、　Ｄ、Ｊ　、）、　シンプ ソン（Ｓｉｍｐｓｏｎ、　Ｒ，Ｅ、）、リームＣＲｔａｍ、　Ｌ、Ｗ、）、ホワ イ）　（Ｗｈｉｔｅ　、　Ｆ、Ｆ−）、ゴートンＣＧｏｒｄｏｎ、　Ｍ、Ｐ−） およびネヌター（Ｈｅ　ｓ　ｔ　ｅ　ｒ　、　Ｅ、Ｗ、）、Ｃ’ｇＮ、２７：１ ４３−１５３（１９８１）。

１４、ホーケマＣＨｏ　ｅ　ｋｍａ　、　Ａ　、）、バーシュ（Ｈｉｒｓｅん、 　Ｐ、Ｒｏ）、ホーイカースＣＨｏｏｙｋａａｓ、　Ｐ、Ｊ、Ｊ−）およびシル バーロート（Ｓｅｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ　、　Ｒ，Ａ−）、Ｈａ　ｔｌＬｒｓ　 、　ＣＬｏｎＪ３０３：１７９−１８０（１９８３Ｇ）。

１５、ホーケマ（Ｈｏ　ｇ　ｋ　ｅｍａ　、　Ａ　、）、バフ　バーレア（ｖａ ｎＨａａｒｅ？！、　Ｍ、Ｊ、Ｊ、）、ヒレＣＨｉ　ｌ　Ｌ　ｅ　、　Ｊ、）、 ホーゲＣＨｏ　ｇ　ｅ　、　Ｊ　、ＨｌＣ−）、ホーイカースＣＨｏｏｙｋａａ ｓ、　Ｐ。

Ｊ、）、クレンメ（Ｋｒｇｎｓ　、　Ｆ　、Ａ−）、ウルムス（ＷｌＬｌｔ−ｚ ｍｓ、　Ｇ、Ｊ、）およびシルバーロート（Ｓｃｈｉｌｐｅｒ−ａｘｄ　ｉｔｓ 　Ｔｉ−ｐｌａｓｔｎｉｄ　ａｓ　Ｔｏｏｌｓ　ｉｎ　Ｔｒａｎｓｆｏｒ−１６ 、ホーケマＣＨｏｅｋｅｍａ、　Ａ、）、ホーイカース（Ｈｏｏｙｋａ−ａｍ、 　Ｐ−Ｊ−）、およびシルバーロート（ＳｃｈｉＬｐａｒｒｏ　−ｏｒｔ、Ｒ− Ａ−）、Ｊ、Ｂａｃ、ｔａｒｉｏＬ、、１５８：３８３　３８５（１９８４）。

１７、ホルスタース（Ｈｏｌｓｔｅｒｓ、　＆、）、デワーレ（ｄａＷａａ−１ ｅ、Ｄ、）、デビッカ−（Ｄｇｐｉｃｋｅｒ、　Ａ、）、メツセンスＣＭｇ５ｓ ｅｎｓ　、　Ｅ−）、ファンモンタギュー　（ｖａｎ　Ｗｏｎｔ　−１８、ブロ ーク（Ｊｏｏｓ、Ｈ８）、インゼ（１？Ｉｚａ、　Ｄ、）、カブラン（Ｋａｐｌ ａｔ＜、　Ａ、）、ソーマンＣ８ｏｒｍＣＬｎｎ、　Ａｆ、）、ファンモンタギ ュ（ＶａｎＭｏｎｔａｇｒｂ、　Ｍ、）およびシェル１９、リーマンスＣＬｅａ ｔｎａｆＬｓ、　Ｊ、）、チャタＣ８ｈａｗ、　Ｃｈ、）、デブラーレ（Ｄｅｂ ｌａｓｒｅｒ　Ｒ，）、デクレープ（ＤｇＧｒｇ−ｖＢＨ，）、ハーナルステー ンスＣＨｇｒ％ａｔｓｔｇｔｒｎｓ。

Ｊ、Ｐ、）、マエス（Ｍａ　ｇ　ｓ　＋　Ｍ、）　、ファンモンタギューＣＶａ ｎ　Ｍｏｎｔａｇｘ、　Ｍ、）およびシ、エルＣ３ｃｈｇ　ｌ　ｌ　、　Ｊ、） 、２０、グツド７コツト（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ　ｔ　、　Ｂ、Ｂ、）およびグツ ド９７：６２０−６２８（１９６９）。

２１、マ＝アチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、）、フリッシュ（Ｆｒｉｔ８−ｃ ｈ、　Ｅ、Ｆ、）およびサンブローク（ｓａｔｎｂｒｏｏｋ、　Ｊ、）、Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ａ？ｌｉ？Ｌｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ ｌ　。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋　（１９８２ ）。

（１９８２）。

２３、オームス（Ｏｏｍｓ、　Ｇ、）、ホーイカウスＣＨｏｏｙｋａｕｓ。

Ｐ、Ｊ、Ｊ、）、モーレナー／’　（Ａｆｏｏ　ｌ　ｇｎａａｒ、　Ｇ、）　お よび１４：３３−５０（１９８１）。

２４、オームスＣＯｏｍｓ　、　Ｇ、）、カーブ（Ｋａｒｐ、　Ａ、）およびロ バーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ、　Ｊ−）、Ｔｈｅｏｒ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎａｔ、 。

６６：１６９−１７２（１９８３）。

２５、オームスＣＯｏｍｓ、　Ｇ、）、タラビック（Ｋｌａｐｗｉｊｋ）、ボー リスＣＰｏｗｌ　ｉｓ　、　Ｊ、Ａ、）およびシルバーロート８２−９１（１９ ８０）。

２６、オツテン（Ｏｔ　！ｇ？Ｌ、　Ｌ、Ａ、Ｂ、Ｍ−）およびシルバーロー２ ７、オツテンＣＯｔｔｇｎ、　Ｚ、、）、デクレープ（ＤｇＧｒｅｖｇ。

Ｈ，）、ハーナルステーンス（Ｈｅｒｎａｌｓｔｅｅｎｓ、　Ｊ、Ｐ、）、ファ ンモンタギュー（ＶａｒＪｔｏｎｔａｇｕ、　Ｍ、）、シュナイダ−（Ｓｃｈｎ ｅｉｄｇｒ、　Ｏ，）、ストラツプ（Ｓｔｒａｕｂ　、Ｊ、）、２０９−２１３ （１９８１）。

２８、シェル（ＳｃＡｇ　ｌ　ｌ　、　Ｊ、）およびファンモンタギュー、ｐ、 １７５−１８０゜ ２９・シンプソン（Ｓｉｍｐｓｏ？Ｌ、　Ｒ，Ｅ、）、リリス（Ｌｉｌｔｉｓ。

Ｍ、）、マーゴシ了ノ（Ｍａτｇｏｓｓｉａｎ、　Ｚｌ、）およびマツフナイト （ＭｃＫｎｉｇ五ｔ　、　Ｔ、Ｄ、）、”　ＤＮＡ　Ｔｒａｎｓ　ｆ　ｅｒｔｏ 　Ｐｌａｎｔ　Ｃｔｒｌｌｓ　Ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｔｉ　Ｐｌａｓｒｎｉｄ　 Ｖｅ−ｃｔｏｒ　”、　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　 Ｒ，Ｌｉ５ｓ。

Ｉｎｃ、、Ｎｅｗ　ＹｏｒｋＣ１９８３）、　ｐｐ−２３−３４゜３０６サザー ン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｅ−Ｍ、）、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、。

９８：５０３−５１７（１９７５）。

３１、トマショウＣＴｈｏｍａｓｈｏｗ、　Ｍ、Ｆ　、）、ナツタ−（ＮｕＬｔ −ｅｒ、Ｒ，）、モントーヤ（Ｍｏｎｔｏｙａ、　Ａ−Ｌ−）、ゴートンＣＧａ ｒｄｏｎ、　Ｍ、Ｐ、）およびネスター（＃＃　ｓ　ｔ　ｓ　ｒ　、　Ｅ、Ｗ、 　）、Ｃｇｌｊ、１９ニア２９　７３９（１９８０）。

３２、ビエイラ（Ｖｉ　ｅ　ｉデα、Ｊ、）およびメツシング（Ｍε８８８−１ ｎ、　Ｊ、）、Ｇｇｎｅ、１９：２５９−２６８（１９８２）。

３３、ホワイト（Ｗｌｔｔｇ、　Ｆ、Ｆ−）、ギドツシー（Ｇｈｉｄｏｓａｉ。

Ｇ、）、ゴートンＣＧｏｒｄｏｎ、　Ｍ、Ｐ、）　およびネスター（＃ｇ　ｓ　 ｔ　ｅ　ｒ　、Ｅ、Ｗ、）、　Ｐｒｏａ、Ｎａｔｔ、Ａｃａｄ−Ｓｃｉ、ＵＳＡ 。

７９：３１９３−３１９７（１９８２）。

３４、ウィルミツツアー（Ｗｉ　ｌ　１ｍｉ　ｔ　ｚ　ｅｒ　、　Ｌ、）、ダー エスＣＤｈａａｓＢ　Ｆ、）、シュライア−（Ｓｃｈｒａｉｇテ、　Ｐ、Ｈ，） 、シュマレンバーク（ＳｔｈｍａＬ　ａｎｂａｃｈ　、　Ｗ−）、ファンモンタ ギ：ｚ　（？ｌ（！？！　Ｍｏｎｔａｇ１＆、　Ｍ、）およびシェル３５、ヤー ダＣＹａｄａｖ　、　Ｎ、Ｓ−）、バンダーライデフ　（Ｖａｎｄ−ｅｒｌｅｙ ｄｅｎ、　Ｊ、）、ベネット（ＢａｆＬｆＬｅ　ｔ　ｔ　、　Ｄ、Ｒ，）−バー 坏スＣＢｔｙｎｅｓ　、　Ｗ、Ｍ、）およびチルトノＣＣｈｉＨｏｎ、Ｍ。

−り、）、Ｐｒｏｃ、　Ｈａｔｅ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｔ、　ＵＳ　Ａ、　７９ 　：６３２２−６３２６（１９８２）。

３６、ヤング（ＹｃＬｎｇ、　Ｆ、）およびソンプンン（Ｓｉｍｐｓｏｎ。

Ｒ，Ｅ、）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７８：４１５１− ４１５５（１９８１）。

３７、サンブリスキー（Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ、　Ｐ−）、デピツカ−（Ｄｇｐ４ Ｃ＆ｇｒ、　Ａ、）、クルーガー（Ｋｒｕｇｇｒ、　Ｋ、）およびグツドマンＣ Ｇｏ　ｏ　ｄｍａｎ　、　Ｈ，Ｍ、）、Ｊ、ＭｏＬ、Ａｐｐｌ。

ＧｇｎｇＬ、１：３６１−３７０（１９８２）。

３８、サンプリスキー（Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ、　Ｐ、）、ホルスタースＣＨｏＬ ｓｔａｒ８２Ｍ−）、クルーガ＝（Ｋｒｓｇｅｒ、　Ｋ、）　、デピツカーＣＤ ｅｐｉｔｋｇｒ、　Ａ、）、シェルＣ８ｃｈｇ　ｌ　ｌ　、　Ｊ、）、ファンモ ンタギュー（Ｖａｎ　Ｍｏ？Ｌｔａｇｕ、　Ｍ−）　およびグツドマンＣＧｏｏ ｄｍａｘ、　Ｈ，Ｍ、）、５ｃｉｅ％ｃｅ、　２０９　：１３８５−１３９１（ １９８０）。

要約 こプして、本発明は全植物を形質転換および再生するための有用なｉ％ｖｉτＯ 方法を提供することが理解できる。本発明方法によって形質転換／再生された植 物は、遺伝子はたとえ失活されたものでさえも含まない。この種の形質転換植物 は生殖能力を有し且つ有性生殖後にそれらの子孫に異種ＤＮＡを伝えることがで きる。

前記内容および添付の図面から、当技術分野において習熟した者にはここに開示 したもの以外の本発明の各種の修飾が明らかになるであろう。これらの修飾もま た添付の請求の範囲に含１れるものである。

ＦＩＧＵＲＥ　／ ＦＩＧＵＲＥ　２ 国際調査報告

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）植物（Ｐ）に（１）ビルレンス機能；（２）植物（Ｐ）に新芽を有す る新芽腫瘍を誘発し得る腫瘍因子；および（３）植物（Ｐ）細胞の核ゲノム内に 組込まれ得る異種トランスフアーＤＮＡを含むキヤリアーベクター；を有する感 染性微生物媒介物を感染させ； （ｂ）植物（Ｐ）に新芽を有する新芽腫瘍が発生するまで前記の感染植物（Ｐ） を維持し； （ｃ）異種トランスフアーＤＮＡがゲノム内に組込まれた形質転換細胞を含む新 芽またはそれらの子孫を選択し；（ｄ）選択した新芽またはそれらの子孫を利用 して、異種トランスフアーＤＮＡがゲノム内に組込まれた細胞を含む全植物を生 産する； ことから成る全植物を形質転換および再生するためのｉｎｖｉｖｏ方法。
2. ２．植物（Ｐ）はアグロバクテリウム・ツメフアシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅ ｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）新芽突然変異株を感染させた後に新芽を有 する新芽腫瘍を形成し得る植物である、請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．感染性微生物媒介物を植物の傷つけた部位から侵入させることにより植物（ Ｐ）に感染させる、請求の範囲第１項記載の方法。
4. ４．ビルレンス機能はアグロバクテリウム・ツメフアシエンスの腫瘍誘発性（Ｔ ｉ）プラスミドに由来するビルレンス機能である、請求の範囲第１項記載の方法 。
5. ５．ビルレンス機能はアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｃｎｅｓ）の根誘発性（Ｒｉ）プラスミドに由来するビル レンス機能である、請求の範囲第１項記載の方法。
6. ６．腫瘍因子はｔｍｓ位置に突然変異を有するアグロバクテリウム・ツメフアシ エンス腫瘍誘発性（Ｔｉ）プラスミドに由来する腫瘍因子である、請求の範囲第 １項記載の方法。
7. ７．ｔｍｓ位置に突然変異を有するＴｉプラスミドはノパリン型Ｔｉプラスミド である、請求の範囲第６項記載の方法。
8. ８．ｔｍｓ位置に突然変異を有するＴｉプラスミドはオクトピン型Ｔｉプラスミ ドである、請求の範囲第６項記載の方法。
9. ９．キヤリアーベクターはさらに宿主範囲の広いレプリコンおよび異種ＤＮＡの 横に位置するＴ−ＤＮＡ末端配列を含む、請求の範囲第１項記載の方法。
10. １０．異種ＤＮＡは長さが約１〜約５００００塩基対である、請求の範囲第９項 記載の方法。
11. １１．異種ＤＮＡは２つまたはそれ以上の遺伝子をコードする、請求の範囲第１ ０項記載の方法。
12. １２．キヤリアーベクターはｐＡＲＣ２またはｐＡＲＣ４より成る群から選択さ れる、請求の範囲第１項記載の方法。
13. １３．感染性微生物媒介物は（１）ビルレンス機能および腫瘍因子を有するプラ スミドを含む第一のアグロバクテリウム株；および（２）植物（Ｐ）細胞の核ゲ ノム内に組込まれ得る異種トランスフアーＤＮＡを有するキヤリアーベクター、 ならびにビルレンス機能を有するが活動性腫瘍因子をもたない別個のプラスミド ：を含む第二のアグロバクテリウム株；から成る“混合感染”型である、請求の 範囲第１項記載の方法。
14. １４．感染性微生物媒介物は（１）ビルレンス機能および腫瘍因子を有するプラ スミドを含む第一のアグロバクテリウム株；および（２）植物（Ｐ）細胞の核ゲ ノム内に組込まれ得る異種トランスフアーＤＮＡを有するキヤリアーベクター、 ならびにビルレンス機能を有するが腫瘍因子を何ももたない別個のプラスミド： を含む第二のアグロバクテリウム株；から成る“混合感染”型である、請求の範 囲第１項記載の方法。
15. １５．感染植物（Ｐ）は新芽を有する新芽腫瘍が感染部位またはその付近に発生 するまで制御された環境条件下で温室内に維持される、請求の範囲第１項記載の 方法。
16. １６．新芽またはそれらの子孫はそれらの中に異種トランスフアーＤＮＡ（ｈ／ Ｔ−ＤＮＡ）が存在することを証明する直接分析の結果として選択する、請求の 範囲第１項記載の方法。
17. １７．新芽またはそれらの子孫は異種トランスフアーＤＮＡ（ｈ／Ｔ−ＤＮＡ） によりコードされる遺伝子産物がそれらの中に存在することを証明する間接分析 の結果として選択する、請求の範囲第１項記載の方法。
18. １８．選択した新芽は花を咲かせ、自家受粉させてＦ１種子を生産し、このＦ１ 種子を植え付けて発芽させた後にＦ１苗を得る、請求の範囲第１項記載の方法。
19. １９．選択した新芽は新芽腫瘍から切り離すことなしに花を咲かせ、自家受粉さ せてＦ１種子を生産する、請求の範囲第１７項記載の方法。
20. ２０．新芽腫瘍から新芽を切り取り、次に切り取つた新芽を適当な根付き用培地 で根付かせ、その後花を咲かせ、自家受粉させてＦ１種子を得ることにより新芽 からそれらの子孫を生産する、請求の範囲第１７項記載の方法。
21. ２１．ｈ／Ｔ−ＤＮＡが核ゲノム内に組込まれた細胞を含む新芽またはそれらの 子孫は有性生殖によつて増殖させる、請求の範囲第１項記載の方法。
22. ２２．（ａ）腫瘍誘発性（Ｔｉ）プラスミドを有し且つ植物（Ｐ）に新芽を有す る新芽腫瘍を形成し得るビルレントアグロバクテリウム・ツメフアシエンス株を 選択し；（ｂ）植物（Ｐ）を傷つけて、その傷つけた部位に（１）腫瘍誘発性（ Ｔｉ）プラスミドを有し且つ植物（Ｐ）に新芽を有する新芽腫瘍を形成し得るビ ルレントアグロバクテリウム・ツメフアシエンス株；および（２）植物（Ｐ）細 胞の核ＤＮＡ内に組込まれ得る異種トランスフアーＤＮＡを含むキヤリアーベク ター；を有する細菌媒介物を感染させ；（ｃ）その傷つけた部位またはその付近 に新芽が発生するまで前記の感染植物を維持し； （ｄ）異種トランスフアーＤＮＡがゲノム内に組込まれた形質転換細胞を含む新 芽またはそれらの子孫を選択し；（ｅ）選択した新芽またはそれらの子孫を利用 して、異種トランスフアーＤＮＡがゲノム内に組込まれた細胞を含む全植物を生 産する； ことから成る全植物を形質転換および再生するためのｉｎｖｉｖｏ方法。
23. ２３．請求の範囲第１〜２２項のいずれか１項に記載の方法により形質転換およ び再生された植物。
24. ２４．ｐＡＲＣ２の同定特性を有するキヤリアーベクター。
25. ２５．ｐＡＲＣ４の同定特性を有するキヤリアーベクター。