CN105473720A

CN105473720A - 用于高效摄取和利用尿素以提高作物产量的工程改造植物

Info

Publication number: CN105473720A
Application number: CN201380060448.6A
Authority: CN
Inventors: 拉杰夫·格普塔; 侯正林; 戴尔·F·洛萨尔特; 沈波; L·肯特·伍德
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2012-11-20
Filing date: 2013-11-18
Publication date: 2016-04-06
Also published as: US20140351998A1; WO2014081673A3; CA2889557A1; WO2014081673A2; US20150299718A1

Abstract

本公开提供了多核苷酸和与尿素摄取相关的多肽。本公开提供了尿素转运蛋白、尿素酶和谷氨酰胺合成酶基因的基因组序列。尿素转运蛋白、尿素酶和谷氨酰胺合成酶负责控制植物中的氮利用效率。提供了用于提高谷物产量和增强植物生长的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶序列。本公开还提供了重组表达盒、宿主细胞和转基因植物。

Description

用于高效摄取和利用尿素以提高作物产量的工程改造植物

技术领域

本公开整体涉及分子生物学领域。

背景技术

目前全球对用于农业生产的氮(N)肥的需求达到大约2亿吨，并且预期该数字将在2050年变为现在的三倍(“CurrentWorldFertilizerTrendsandOutlook2011/12”FoodandAgricultureOrganizationoftheUnitedNations，2008(《当前世界肥料趋势与展望2011/12》，联合国粮食和农业组织，2008年)；Good，etal.，2004TrendsinPlantScience9：597-605(Good等人，2004年，《植物科学趋势》，第9卷，第597-605页))。通常以经济学最佳水平施加氮肥，并且该实践已导致被农作物实际吸收的N的百分比降低(Firbank，(2005)AnnalsofAppliedBiology146：163-175(Firbank，2005年，《应用生物学年鉴》，第146卷，第163-175页))。据估计，施加到土壤中的氮肥的大约60％通过各种过程损失，所述过程包括沥滤和地表径流、反硝化作用、挥发以及微生物消耗(RaunandJohnson，(1999)AgronomyJournal91(3)：357-363(Raun和Johnson，1999年，《农学杂志》，第91卷，第3期，第357-363页))。考虑到氮肥的成本占美国玉米生产的总农场经营成本的大约20-30％，土壤中的N损失表示严重的经济损失。

尿素是目前施加到农业土壤的氮肥的主要形式。尿素占美国所用的氮肥总量的40％以上，并且在世界其他地方显著更多(Kojima，etal.，2006JMembrBiol212：83-91(Kojima等人，2006年，《膜生物学杂志》，第212卷，第83-91页))。尿素的广泛使用是由于多个因素，包括其高N百分比(46.7％)、相对较低的成本，并且易于存储、运输和应用。然而，植物在直接摄取和使用尿素作为氮源方面效率较低。施加到土壤的尿素N的大部分被分解成氨气(NH₃)，并且随后在称为硝化作用的土壤N循环过程中转化成硝酸盐(NO₃)。该过程依赖于土壤中存在的微生物和酶，并且通常不仅导致N转化成可被植物利用的形式，而且产生通过挥发和沥滤而损失的其他N中间体。对许多植物而言，NO₃为优选的根从土壤摄入的底物，并且一旦进入细胞内部，NO₃被还原为亚硝酸盐(NO₂)，并且然后再次转化成NH₃。该NH₃最终被同化成可被植物细胞利用的氨基酸，并且该还原和同化的整个过程对于发育中的植物而言是耗能巨大的。

本公开包括鉴定参与尿素的摄取和同化的多个基因。

发明内容

本公开提供了多核苷酸、相关的多肽和尿素利用序列的所有适当改性的变体。本公开提供了DUR基因的序列。表1列出了这些基因和它们的序列ID号。

表1

因此，在一个方面，本公开涉及分离的核酸，该分离的核酸包含编码尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶多肽的分离的多核苷酸序列。本公开的一个实施例为分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列：(a)包含SEQIDNO：224-250、300、302和321的核苷酸序列；(b)编码包含SEQIDNO：1-223、251-299、301和322的氨基酸序列的核苷酸序列，以及(c)与SEQIDNO：224-250、300、302和321具有至少70％序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有尿素转运、尿素分解或氨同化活性的多肽。

本公开的组合物包含分离的多肽，该分离的多肽包含选自以下的氨基酸序列：(a)包含SEQIDNO：1-223、251-299、301和322的氨基酸序列，以及(b)与SEQIDNO：1-223、251-299、301和322具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有尿素转运、尿素分解或氨同化活性。

在另一方面，本公开涉及包含所描述的核酸的重组表达盒。另外，本公开涉及含有该重组表达盒的载体。此外，含有该重组表达盒的载体可有利于该核酸在宿主细胞中的转录和翻译。本公开还涉及能够表达本公开的多核苷酸的宿主细胞。可以使用多种宿主细胞，诸如但不限于微生物、哺乳动物、植物或昆虫细胞。

在另一个实施例中，本公开涉及含有本公开的核酸的转基因植物或植物细胞。优选的含有本公开多核苷酸的植物包括但不限于玉蜀黍、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、西红柿、柳枝稷、芒草(myscanthus)、黑小麦和粟。在另一个实施例中，转基因植物为玉蜀黍植物或植物细胞。另一个实施例为来自转基因植物的转基因种子。本公开的另一个实施例包括包含与启动子有效连接的本公开的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶多肽的植物，所述启动子驱动在所述植物中的表达。与对照植物相比，本公开的植物可具有改变的氮利用效率。在一些植物中，氮利用在营养组织、生殖组织、或营养组织和生殖组织中发生改变。本公开的植物可具有至少一种如下表型，包括但不限于：增加的叶片大小、增加的穗大小、增加的种子大小、增加的胚乳大小、导致种子中蛋白质、油和/或淀粉的相对水平变化的胚和胚乳的相对大小的改变、雄穗的缺失、具有功能性花粉的雄穗的缺失、或增加的植物大小。

本公开的另一个实施例可为在基因座中经过基因修饰的植物，其中该基因座编码本公开的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶多肽。

提供了提高植物中的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶多肽的活性的方法。该方法可包括将本公开的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶多核苷酸引入所述植物中。提供的多肽可以减少植物组织中细胞的数量，调节组织生长和大小。

组合物还包括具有DNA构建体的植物和种子，该DNA构建体包含有效连接至本公开的启动子的所关注的核苷酸序列。在具体实施例中，将DNA构建体稳定地整合至植物的基因组中。该方法包括将有效连接至本公开的启动子的所关注的核苷酸序列引入植物中。

增加尿素摄取和同化的方法包括单独地或组合地重组表达异源尿素转运蛋白、尿素酶和谷氨酰胺合成酶。堆叠的构建体或育种叠堆允许生成具有不止一个如本文所述的所关注的转基因性状的转基因植物。

附图说明

图1：施加到土壤的尿素N的大部分被分解成氨气(NH₃)，并且随后在称为硝化作用的土壤N循环过程中转化成硝酸盐(NO₃)。该过程依赖于土壤中存在的微生物和酶，并且通常不仅导致N转化成可被植物利用的形式，而且产生通过挥发和沥滤而损失的其他N中间体。对许多植物而言，NO₃为优选的根从土壤摄入的底物，并且一旦进入细胞内部，NO₃被还原为亚硝酸盐(NO₂)，并且然后再次转化成NH₃。该NH₃最终被同化成可被植物细胞利用的氨基酸，并且该还原和同化的整个过程对于发育中的植物而言是耗能巨大的。能够有效地直接从土壤吸收尿素的转基因植物的产生将防止微生物转化过程中的N的损失，并且消除了在植物细胞内将硝酸盐还原成氨气的必要。

图2：来自细胞外环境的尿素通过特异性高亲和力尿素转运蛋白(诸如Dur3)或通过较低特异性低亲和力通道(诸如水通道蛋白相关的NIP蛋白)进入细胞。据推测，液泡局部蛋白质的相关基团TIP用于使细胞内储存的尿素发生移动。还通过内源性过程(诸如蛋白质和核酸降解)来制备尿素。在细胞内部，尿素被尿素酶(一种将尿素水解为氨气和碳酸的专用酶)降解。一旦尿素被尿素酶分解为其组成部分，则释放的氨气主要通过谷氨酰胺合成酶(GS)的作用，但也可能通过另外的NH₃代谢酶的作用被同化为氨基酸。

图3：可能的DUR3同系物的序列得自多种来源(主要集中于微生物、真菌和低级光合作用植物)，并且进行进化分析以检测转运蛋白之间的关系。已在先前研究中证实能够转运尿素的蛋白质以绿色示出。被选择用于基因合成和后续的功能表征的来自不同分化枝的转运蛋白以蓝色示出。

图4：B73玉蜀黍幼苗在含有5mMNO₃作为氮源的完全合成营养混合物中水培生长，直至大约V4生长期。然后将植物转移到不含氮的培养基或使其保持在5mMNO₃(图中标记为NO₃)中。在无氮培养基中生长3天后，将植物转移到含有5mM尿素的生长培养基中培养1小时、3小时、6小时或24小时。在每个时间点以及在用尿素(无氮)诱导之前收集植物并收获组织。来自这些玉蜀黍幼苗的根组织的qPCR分析显示，当与在无氮环境下生长或在恒量氮环境下生长的植物(图2)相比时，通过转移到含有5mM尿素作为唯一氮源的生长培养基来诱导ZmDur3。

图5：已经鉴定出编码可能的尿素酶蛋白质的多个基因(SEQIDNO：251-298)。48种已知或推定的尿素酶得自多种来源，主要是真菌或植物来源。进行进化分析以检测已知和推定的尿素酶蛋白质之间的关系，并且在图3中以进化分枝图示出这些结果。

图6：使用来自拟南芥、构巢曲霉、汉逊德巴利酵母、粳稻(Oryzasativa-Japonica)、三角褐指藻、安格斯毕赤酵母、酿酒酵母、江南卷柏和聚球藻属物种WH7805的DUR3同系物的蛋白质序列来形成比对并鉴定保守区。将这些区段模制到使用ClustalW2多序列比对程序创建的比对文件上，并鉴定最初用于限定所述区段的所有序列中完全保守的氨基酸残基。使用这些保守残基作为模板，在电脑中进行二次筛选，以鉴定嗜热地芽胞杆菌(Geobacilluskaustophilus)或耻垢分枝杆菌序列的任一者中的非保守的氨基子集(两者均表明在互补测定中几乎没有或没有转运尿素的能力)。已验证的转运蛋白中的完全保守的以及两种非功能性尿素转运蛋白的任一者中的非保守的残基以红色示出，并且使用这些残基以形成“尿素特异性”基序，据预测该基序对体内转运尿素的能力具有较大的积极影响。

图7：尿素转运蛋白核心结构域的三维拓扑结构和火箭开关机制。(a)和(b)：基于来自副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的钠/半乳糖转运蛋白(vSGLT、PDB：2xq2)的尿素转运蛋白核心结构域的示意性3D图。5个螺旋的N端半部以黑色圆柱体表示，而C端为灰色圆柱体。为了清楚地描绘关键螺旋拓扑结构，省略了许多螺旋间元件。螺旋TM1及其对称配对物TM6在中间退绕。这些卷绕残基与TM3和TM8的中间部分结合构成尿素结合位点。该模型表示面向外部的构象。(a)是来自细胞外侧的视图，而(b)是沿着平行于双分子层的伪二重旋转轴观察的。(c)：火箭开关或交替进入机制的动画演示。虽然序列为缠绕的，但可将其3D结构视为两个子单元A和B。由质子结合驱动的子单元间的旋转使构象循环成为可能。

图8：使用序列/结构比对和TM螺旋预测来鉴定10个核心跨膜螺旋和推定的尿素结合序列基序。构成对称核心蛋白的一半的前5个TM结构域在比对中示出为蛋白质序列上方的虚线。3D模型显示，推定的结合位点在蛋白质的中心，这表明TM1、TM3、TM6和TM8的中间部分的蛋白质基序对于尿素识别非常重要，而TM2、TM4、TM5、TM7、TM9和TM10可能具有结构性作用。图中还以虚线椭圆示出了经突变以测试该模型的残基。I180残基位于TM4中间并且可能与质膜相互作用。在已验证的Dur3型尿素转运蛋白中，该位置为保守的并且被诸如I、L和V的疏水性残基占据。I180到天冬氨酸(D)的突变引入了可能彻底破坏转运蛋白的结构完整性的亲水性带电残基。W72靠近TM1的退绕区域并且可能参与尿素结合。突变的残基均落在前述尿素转运蛋白的N端半部中的保守区1和2(分别由实线和虚线矩形表示)中或附近。

图9：在表达在筛选过程中鉴定的若干尿素转运蛋白之一的dur3Δ酵母细胞中进行[¹⁴C]-尿素的摄取分析，基本上如前文所述，略有修改(Morel，etal.，FungalGeneticsandBiology2008(Morel等人，《真菌遗传学与生物学》，2008年))。在收获并重悬于摄取缓冲液中之前使dur3Δ酵母细胞生长到对数期中期。然后用0μM至200μM[¹⁴C]加标尿素温育细胞，并在存在底物的情况下温育四分钟。然后洗涤细胞并且使用液体闪烁计数器来确定细胞摄入的尿素的量。从图5看出，即使在低至10μM的细胞外浓度下并且在相对较短的时间内，许多转运蛋白仍显著增加细胞摄入的标记尿素的量。

图10：在表达在筛选过程中鉴定的若干尿素转运蛋白的转基因拟南芥属(Arabidopsis)中进行[14C]-尿素的摄取分析。根据转基因表达的水平选择三个独立的转化事件(在图10中由SeqID224-事件#或242-事件#表示)，并且使用类似于针对酵母中的摄取分析所述的改性方案对分离的植物根进行分析。使植物与空白对照一起在琼脂板上生长大约两周，然后分离根并重悬于摄取缓冲液中。然后用1mM[¹⁴C]加标尿素温育植物根，并在存在底物的情况下温育九十分钟。然后洗涤根并且使用液体闪烁计数器来确定细胞摄入的尿素的量。如图10所示，卷柏属(Selaginella)DUR3(SeqIDNo.224)和青霉菌属(Penicillium)DUR3(SeqIDNo.242)两者均显著增加转基因植物的尿素摄取。过表达稻属(Oryza)DUR3基因(SeqIDNo.241；数据未示出)的植物中无明显的显著摄取差异。

图11：在表达块菌属(Tuber)DUR3(SeqIDNo.244)或稻属DUR3(SeqIDNo.241)转运蛋白的转基因玉蜀黍中进行[14C]-尿素的摄取分析。根据转基因表达的水平和T₀植物的生殖参数选择六个独立的转化事件，并且使用类似于针对拟南芥属中的摄取分析所述的改性方案对分离的植物根进行分析。使植物与空白对照一起在温室条件下生长到成熟，然后分离根并重悬于摄取缓冲液中。然后用1mM[¹⁴C]加标尿素温育植物根，并在存在底物的情况下温育九十分钟。然后洗涤根并且使用液体闪烁计数器来确定细胞摄入的尿素的量。如图11所示，块菌属DUR3(SeqIDNo.244)的过表达显著增加了转基因植物中的尿素摄取。过表达稻属DUR3基因(SeqIDNo.241)的植物中无明显的显著摄取差异。

图12：对过表达编码卷柏属DUR3或青霉菌属DUR3的基因的转基因拟南芥属植物进行生长分析(在图10中分别由SeqID224-事件#或242-事件#表示)。通过黄色荧光蛋白(YFP)的存在选择表达转基因的T₀植物，该黄色荧光蛋白也由转化载体编码，并且使用不表达YFP的幼苗作为空白对照。为评估拟南芥属植物在作为氮源的尿素上生长的过程中的性能，使来自三个独立的转化事件的转基因和空白T₁种子在基于琼脂糖的无菌无土系统中生长，并用如Murashige和Skoog所述的半强度盐、Gambourg维生素混合物、NiSO₄补充至1μM的最终浓度并且尿素处于1μM或5μM的最终浓度。在接种后两周通过计算总叶面积分析植物生长速率的改变，并将转基因平均参数与非转基因空白对照的相应平均参数进行比较。从图12可以看出，与空白对照相比，编码卷柏属DUR3(SeqIDNo.224)的基因的过表达显著地增强转基因植物的生长。尽管尿素摄取有所增加，但青霉菌属DUR3(SeqID242)的过表达不增强植物的生长，这表明这些转基因植物中的尿素摄取的绝对水平可能与在这些条件下增强拟南芥属的生长相关。

图13：已设计并形成被设计用于共表达来自组成型启动子和根优选的启动子两者的两种尿素转运蛋白的构建体。使用先前确定的农杆菌(Agrobacterium)介导的转化方案将这些构建体转化到拟南芥属和玉蜀黍Gaspé种质中。将评估阳性转基因事件的一般生长和生殖参数，并且筛选增强的使用尿素作为氮源的能力。将评估转基因植物在低和高细胞外尿素水平下增强尿素摄取的潜能，并且预期有意义事件将增加摄取以及在如图所示生长培养基中的广泛尿素范围内的细胞的N状态。

图14：为了示出在转基因玉米中操纵这些基因的影响，已进行田间测试。将单个转化载体PHP45645的多个转基因事件的子代种子播种到田地中，以评价与非转基因对照植物(BN)相比转基因在正常(NN)和降低的土壤氮(LN)下提高产量/NUE的能力。该载体含有在根优选的RM2启动子的控制下编码天然玉蜀黍DUR3多肽(SEQIDNO：3)以及在PEPC启动子的控制下编码玉蜀黍GS1-3(SEQIDNO：301)和尿素酶(SEQIDNO：322)多肽的序列。在多个位置用多个复制品进行这些实验，并用收集的数据测量植物产量。以平均每英亩产量蒲式耳示出的实验数据显示，在低N条件下转基因玉米植物与非转基因对照植物相当，然而，在正常N田地条件下，转基因植物的产量与非转基因对照物相比略微降低。这些结果表明，玉蜀黍Dur3蛋白(早前用酵母摄取分析表征为相对较差的尿素转运蛋白)的过表达可能不足以增强田地环境中的尿素摄取。还将使用含有本文所述的更有效的尿素转运蛋白的类似叠堆构建体进行另外的产量试验。

具体实施方式

已鉴定出大约200种可能的尿素转运蛋白，并且已在基于细胞的分析中对许多尿素转运蛋白将尿素转运到细胞溶质中的能力进行了测试。如通过本文提供的实验数据确定，还概述了有助于限定通过Dur3同系物进行高效和特异性易位所需的许多蛋白质结构的“尿素特异性”基序。还鉴定出多个推定的尿素酶蛋白质和谷氨酰胺合成酶蛋白质。已从多种来源(从已测序的真菌和植物基因组)鉴定出了大约48种可能的尿素酶基因。在转基因叠堆中对这些基因(假设用于细胞中的尿素的分解)进行评价，以便产生更有效地从环境获得和利用天然存在的或以土壤或叶面肥料补充剂形式施加的尿素的植物。

还产生了表达单个或多个尿素转运蛋白或与用于尿素分解的尿素酶基因和用于将尿素衍生的N同化为氨基酸的谷氨酰胺合成酶基因堆叠的尿素转运蛋白的转基因植物。这样，在农业系统中可能向植物优先地递送尿素衍生的N，并从而避免N到环境中的损失。

一种通过在生殖期或在生殖期期间向植物提供氮源来增加产量的方法，所述方法包括：

(a)使植物生长到生殖期；以及

(b)以叶面施肥或土壤施肥向植物提供尿素形式的氮源，其中该植物能够通过在植物中表达一种或多种尿素转运蛋白来利用叶面施加或土壤施加的尿素，从而增加植物的产量。土壤施肥可以是缓释制剂形式，使得氮源(例如，尿素)还可以在生殖期期间用于植物。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。除非另外提出，否则本文所采用或所考虑的技术是本领域普通技术人员所熟知的标准方法。材料、方法和实例仅为示例性的而不是限制性的。以下内容以举例说明的方式给出，而非意在限制本公开的范围。

下文将参照附图更完整地描述本公开，其中示出了本公开的一些但并非全部实施例。事实上，这些公开内容可以多种不同形式呈现，不应理解为受限于本文所述的实施例；更确切地说，提供这些实施例以使得本公开将满足适用的法律要求。类似的编号在全文中是指类似的要素。

借助前面的描述和随附的附图中给出的教导，这些公开内容所属领域的技术人员将会想到本文所述公开内容的许多修改形式和其他实施例。因此，应当了解，这些公开内容不限于所公开的特定实施例，并旨在将修改形式和其他实施例包括在本文末尾所附权利要求的范围内。虽然本文中采用特定术语，但所述术语仅在一般性和描述性意义上使用而并非用于限制目的。

除非另外指明，否则本公开的实施将采用植物学、微生物学、组织培养、分子生物学、化学、生物化学和重组DNA技术的常规技术，这些技术处于本领域技能范围内。这类技术在文献中有完全的解释。参见例如LangenheimandThimann，BOTANY：PLANTBIOLOGYANDITSRELATIONTOHUMANAFFAIRS，JohnWiley(1982)(Langenheim和Thimann，《植物学：植物生物学及其与人类事务的关系》，约翰威立出版社，1982年)；CELLCULTUREANDSOMATICCELLGENETICSOFPLANTS，vol.1，Vasil，ed.(1984)(《植物细胞培养与体细胞遗传学》，第1卷，Vasil编辑，1984年)；Stanier，etal.，THEMICROBIALWORLD，5^thed.，Prentice-Hall(1986)(Stanier等人，《微生物世界》，第5版，普伦蒂斯·霍尔出版社，1986年)；DhringraandSinclair，BASICPLANTPATHOLOGYMETHODS，CRCPress(1985)(Dhringra和Sinclair，《植物病理学基本方法》，CRC出版社，1985年)；Maniatis，etal.，MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL(1982)(Maniatis等人，《分子克隆实验指南》，1982年)；DNACLONING，vols.IandII，Glover，ed.(1985)(《DNA克隆》，第I卷和II卷，Glover编辑，1985年)；OLIGONUCLEOTIDESYNTHESIS，Gait，ed.(1984)(《寡核苷酸合成》，Gait编辑，1984年)；NUCLEICACIDHYBRIDIZATION，HamesandHiggins，eds.(1984)(《核酸杂交》，Hames和Higgins编辑，1984年)和丛书METHODSINENZYMOLOGY，ColowickandKaplan，eds，AcademicPress，Inc.，SanDiego，CA(《酶学方法》，Colowick和Kaplan编辑，学术出版社，加州圣地亚哥)。

单位、前缀和符号可以其国际单位制(Si)接受的形式表示。除非另外指明，否则分别地，核酸以5’到3’的取向从左向右书写；而氨基酸序列以氨基到羧基的取向从左向右书写。数值范围包括限定该范围的数字。氨基酸在本文中可通过它们通常知道的三字母符号表示或通过IUPAC-IUB生化命名委员会(IUPAC-IUBBiochemicalNomenclatureCommission)推荐的单字母符号表示。同样，核苷酸可通过它们通常接受的单字母密码表示。下面定义的术语通过参考本说明书整体进行更完整的定义。

在描述本公开时，将采用下面的术语，并且旨在如下文所指出的进行定义。

所谓“微生物”意指任何微生物(包括真核微生物和原核微生物)，诸如真菌、酵母、细菌、放线菌、藻类和原生动物以及其他单细胞结构。

所谓“扩增”意指构建核酸序列的多个拷贝或与该核酸序列互补的多个拷贝，该构建是利用所述核酸序列中的至少一者作为模板进行。扩增系统包括聚合酶链反应(PCR)系统、连接酶链反应(LCR)系统、基于核酸序列的扩增(NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)、Q-β复制酶系统、基于转录的扩增系统(TAS)和链置换扩增(SDA)。参见例如DIAGNOSTICMOLECULARMICROBIOLOGY：PRINCIPLESANDAPPLICATIONS，Persing，etal.，eds.，AmericanSocietyforMicrobiology，Washington，DC(1993)(《诊断分子微生物学：原理和应用》，Persing等人编辑，《美国微生物学会》，华盛顿，1993年)。扩增的产物称为扩增子。

术语“保守修饰的变体”同时适用于氨基酸序列和核酸序列二者。就特定核酸序列而言，保守修饰的变体指编码氨基酸序列的相同的或保守修饰的变体的那些核酸。由于遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任何给定蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU全部编码丙氨酸这种氨基酸。因而，在每个由密码子规定丙氨酸的位置，可将该密码子变更为所描述的相应密码子的任一种而不会改变所编码的多肽。这种核酸变异为“沉默变异”，代表保守修饰变异的一种。编码多肽的本文每种核酸序列还描述了该核酸的每种可能的沉默变异。普通技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(除了AUG，它通常是甲硫氨酸的唯一密码子；一个例外是红色微球菌(Micrococcusrubens)，对于它来说GTG是甲硫氨酸密码子(Ishizuka，etal.，(1993)J.Gen.Microbiol.139：425-32(Ishizuka等人，1993年，《普通微生物学杂志》，第139卷，第425-432页))可进行修饰以产生功能上相同的分子。因此，编码本公开多肽的核酸的每种沉默变异均隐含在每种所描述的多肽序列中并以引用的方式并入本文。

对于氨基酸序列，技术人员将认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白质序列作出的会改变、添加或缺失所编码的序列中的单个氨基酸或一小部分氨基酸的各个置换、缺失或添加，在该变更导致氨基酸被化学类似的氨基酸置换时，为“保守修饰的变体”。因而，还可变更选自1至15的整数的任何数目的氨基酸残基。因而，例如，可作出1、2、3、4、5、7或10个变更。保守修饰的变体通常提供与它们所源自的未经修饰的多肽序列类似的生物活性。例如，对于其天然底物而言，底物特异性、酶活性或配体/受体结合通常为天然蛋白质的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，优选60-90％。提供功能上相似的氨基酸的保守置换表是本领域所熟知的。

下面的六个组各含有对彼此而言是保守置换的氨基酸：

1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；

2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和

6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

还可参见Creighton，PROTEINS，W.H.FreemanandCo.(1984)(Creighton，《蛋白质》，W.H.弗里曼公司，1984年)。

如本文所用，“基本上由...组成”意指在如下情况下目标多核苷酸可包括额外的序列：该额外的序列在严格杂交条件下不会选择性地杂交至与该多核苷酸所杂交的cDNA相同的cDNA，且该杂交条件包括在0.1XSSC和0.1％十二烷基硫酸钠中在65℃下进行的洗涤步骤。“基本上由...组成”通常不包括将实质影响受权利要求书保护的序列的序列或组分。

就指定的核酸而言，所谓“编码”意指包含翻译成指定蛋白质的信息。编码蛋白质的核酸可在该核酸的翻译区内包含非翻译序列(例如，内含子)，或可缺少这种居间的非翻译序列(例如，如在cDNA中)。据以编码蛋白质的信息是通过使用密码子来确定的。通常，氨基酸序列由核酸利用“通用”遗传密码来编码。然而，当使用这些生物体表达该核酸时，可以使用诸如在某些植物、动物和真菌线粒体、细菌山羊支原体(Mycoplasmacapricolum)(Yamao，etal.，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：2306-9(Yamao等人，1985年，《美国国家科学院院刊》，第82卷，第2306-2309页))或纤毛虫大核(ciliateMacronucleus)中存在的通用密码的变体。

当通过合成法制备或改变核酸时，可利用将在其中表达核酸的预期宿主的已知密码子偏好性。例如，尽管本公开的核酸序列在单子叶植物物种和双子叶植物物种中都可表达，但可对序列进行修饰以解决单子叶植物或双子叶植物的特定密码子偏好性和GC含量偏好性，因为这些偏好性已被证实不同(Murray，etal.，(1989)NucleicAcidsRes.17：477-98(Murray等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第477-498页)，将其以引用的方式并入本文)。因而，具体氨基酸的玉蜀黍优选密码子可由来自玉蜀黍的已知基因序列得出。关于来自玉蜀黍植物的28种基因的玉蜀黍密码子使用在Murray等人(出处同上)的表4中列出。

如本文所用，针对核酸的“异源”为起源于外来物种的核酸，或者，如果起源于相同物种的话，则为通过蓄意的人为干预对其天然形式在组成和/或基因组基因座方面进行了实质性修饰的核酸。例如，有效连接至异源结构基因的启动子是来自不同于衍生该结构基因的物种的物种，或者如果是来自相同的物种，则对一者或二者由其初始形式进行了实质性的修饰。异源蛋白质可起源于外来物种，或者，如果起源于相同物种，则通过蓄意的人为干预对其天然形式进行了实质修饰。

所谓“宿主细胞”意指包含本公开的异源核酸序列、含有载体并能支持该表达载体的复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞诸如大肠杆菌(E.coli)，或真核细胞诸如酵母、昆虫、植物、两栖动物或哺乳动物细胞。优选地，宿主细胞是单子叶植物或双子叶植物细胞，包括但不限于玉蜀黍、高粱、向日葵、大豆、小麦、苜蓿、水稻、棉花、卡诺拉油菜、大麦、粟、柳枝稷、芒草、黑小麦和番茄。特别优选的单子叶宿主细胞是玉蜀黍宿主细胞。

术语“杂交复合体”包括指由两条相互选择性杂交的单链核酸序列形成的双链核酸结构。

在将核酸插入细胞的语境中，术语“引入”意指“转染”或“转化”或“转导”，并包括指涉将核酸并入真核或原核细胞中，其中该核酸可并入细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转化成自主复制子或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。

术语“分离的”指诸如核酸或蛋白质之类的物质，该物质实质上或基本上不含在其天然存在的环境中发现的通常与其相伴随或与其相互作用的组分。分离的物质任选包含未发现在其天然环境中与其一起的物质。如本文所定义，“分离的”核酸也称为“异源”核酸。除非另有规定，否则术语“GS核酸”意指包含编码完全长度或部分长度谷氨酰胺合成酶多肽的多核苷酸(“GS多核苷酸”)的核酸。

如本文所用，“核酸”包括指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，否则涵盖在以下方面具有天然核苷酸的基本性质的已知类似物：其以与天然存在的核苷酸(例如肽核酸)相似的方式杂交至单链核酸。

所谓“核酸文库”意指分离的DNA或RNA分子的集合，其包含且实质上代表指定生物体的基因组的整个被转录的部分。示例性的核酸文库诸如基因组文库和cDNA文库的构建在标准的分子生物学参考书有教导，诸如BergerandKimmel，GUIDETOMOLECULARCLONINGTECHNIQUES(Berger和Kimmel，《分子克隆技术指南》)，选自丛书METHODSINENZYMOLOGY，vol.152，AcademicPress，Inc.，SanDiego，CA(1987)(《酶学方法》，第152卷，学术出版社，加利福尼亚州圣地亚哥，1987年)；Sambrook，etal.，MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL，2^nded.，vols.1-3(1989)(Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》，第二版，第1-3卷，1989年)以及CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，Ausubel，etal.，eds，CurrentProtocols，ajointventurebetweenGreenePublishingAssociates，Inc.andJohnWiley&Sons，Inc.(1994Supplement)(《最新分子生物学实验方法汇编》，Ausubel等人编辑，选自《实验室指南》，格林出版联合公司与约翰威立父子出版公司的合资公司，1994年增补本)。

如本文所用，“有效连接”包括指涉第一序列(诸如启动子)和第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列起始并介导对应第二序列的DNA的转录。一般来讲，有效连接意指被连接的核酸序列是连续的，并且如果有必要连接两个蛋白质编码区的话，是连续的且在相同的阅读框内。

如本文所用，术语“植物”包括指整个植株、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子和植物细胞和它们的子代。如本文所用，植物细胞包括但不限于种子、悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、孢子体、花粉和小孢子。可用于本公开方法的植物种类通常与适用于转化技术的高等植物种类一样宽泛，包括单子叶植物和双子叶植物，包括以下属的种：南瓜属(Cucurbita)、蔷薇属(Rosa)、葡萄属(Vitis)、胡桃属(Juglans)、草莓属(Fragaria)、百脉根属(Lotus)、苜蓿属(Medicago)、驴食草属(Onobrychis)、三叶草属(Trifolium)、胡芦巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、柑桔属(Citrus)、亚麻属(Linum)、老鹳草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡萝卜属(Daucus)、拟南芥属、芸苔属(Brassica)、萝卜属(Raphanus)、白芥属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、辣椒属(Capsicum)、曼陀罗属(Datura)、天仙子属(Hyoscyamus)、番茄属(Lycopersicon)、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、碧冬茄属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、马珠草属(Majorana)、菊苣属(Ciahorium)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属(Antirrhinum)、萱草属(Heterocallis)、Nemesis、天竺葵属(Pelargonium)、黍属(Panieum)、狼尾草属(Pennisetum)、毛茛属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、蛾蝶花属(Salpiglossis)、黄瓜属(Cucumis)、布洛华丽属(Browaalia)、大豆属(Glycine)、豌豆属(Pisum)、菜豆属(Phaseolus)、黑麦草属(Lolium)、稻属、燕麦属(Avena)、大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、葱属(Allium)和小麦属(Triticum)。特别优选的植物是玉米。

如本文所用，“产量”可包括在收获时每英亩谷类作物的蒲式耳数，其可针对谷粒水分进行调整(例如，对于玉蜀黍通常为15％)。谷粒水分是在收获时的谷粒中测量。谷粒的经调整的测试重量确定为针对收获时的谷粒水分水平进行了调整的重量，单位磅/蒲式耳。

如本文所用，“多核苷酸”包括指脱氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸或其类似物，所述类似物在如下方面具有天然核糖核苷酸的基本性质：在严格杂交条件下其所杂交的核苷酸序列与天然存在的核苷酸所杂交的核苷酸序列基本上相同，和/或可翻译成与天然存在的核苷酸所翻译的氨基酸相同的氨基酸。多核苷酸可以是天然或异源结构基因或调控基因的全长序列或其亚序列。除非另外指明，否则该术语包括指指定的序列及其互补序列。因而，为了稳定性或为了其他原因对主链进行了修饰的DNA或RNA是如该术语在本文所意指的“多核苷酸”。此外，包含稀有碱基(诸如次黄嘌呤核苷)或修饰碱基(诸如三苯甲基化的碱基)(仅举两个实例)的DNA或RNA是多核苷酸(如该术语在本文所用的)。应当理解，已对DNA和RNA进行了很多种修饰，这些修饰起到本领域技术人员已知的许多有用目的。本文所用的术语多核苷酸涵盖多核苷酸的这类经化学修饰、酶修饰或代谢修饰的形式，以及病毒和细胞(包括特别是简单细胞和复杂细胞)特征性的DNA和RNA的化学形式。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。

本文所用的“启动子”包括指DNA的在转录起始的上游并涉及RNA聚合酶和其他蛋白质的识别和结合以起始转录的区域。“植物启动子”是能够引发在植物细胞中的转录的启动子。示例性的植物启动子包括但不限于从植物、植物病毒和包含在植物细胞中表达的基因的细菌获得的那些启动子，所述细菌诸如农杆菌或根瘤菌(Rhizobium)。例子为优先起始在某些组织，例如叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞或厚壁组织中的转录的启动子。这种启动子被称为“组织优选的”。“细胞类型”特异性启动子主要驱动在一个或多个器官中某些细胞类型中的表达，例如根或叶中的维管细胞。“诱导型”或“调控型”启动子是处于环境控制下的启动子。可通过诱导型启动子影响转录的环境条件的例子包括无氧条件或光的存在。另一类型的启动子是发育调节启动子，例如在花粉发育过程中驱动表达的启动子。组织优选的、细胞类型特异性的、发育调节的和诱导型的启动子构成了“非组成型”启动子类别。“组成型”启动子是在大多数环境条件下活跃的启动子。

术语“GS多肽”是指一个或多个氨基酸序列。该术语还包括其片段、变体、同源物、等位基因或前体(例如，原前蛋白或前蛋白)。“GS蛋白质”包括谷氨酰胺合成酶多肽。除非另有规定，否则术语“GS核酸”意指包含编码谷氨酰胺合成酶多肽的多核苷酸(“GS多核苷酸”)的核酸。

如本文所用，“重组的”包括指已通过引入异源核酸进行修饰的细胞或载体，或者源于经这样修饰过的细胞的细胞。因而，例如，重组细胞表达不以天然(非重组)形式的细胞内的相同形式存在的基因，或因为蓄意人为干预而表达原本异常表达、表达不足或根本不表达的天然基因；或者可以具有简化的或消除的天然基因表达。本文所用的术语“重组的”不涵盖通过天然发生的事件(例如自发突变、天然转化/转导/转座)进行的细胞或载体的变更，所述事件为例如在没有蓄意人为干预的情况下发生的那些。

如本文所用，“重组表达盒”是具有一系列规定核酸元件的通过重组法或合成法产生的核酸构建体，其允许特定核酸在靶细胞中转录。可将重组表达盒掺入到质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，表达载体的重组表达盒部分包括待转录的核酸和启动子等序列。

术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”在本文中可互换使用，指并入蛋白质、多肽或肽(统称为“蛋白质”)中的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，除非另外进行限制，否则可涵盖可以以与天然存在的氨基酸类似的方式发挥功能的天然氨基酸已知类似物。

术语“选择性杂交”包括指在严格杂交条件下核酸序列与指定的核酸靶序列杂交的程度比其与非靶序列杂交的程度可检测地更高(例如，至少2倍于背景)，并且基本上排除非靶核酸。选择性杂交的序列通常相互具有约至少40％的序列同一性，优选60-90％的序列同一性，并且最优选地100％的序列同一性(即互补性)。

术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括指探针与其靶序列杂交的程度将比它与其他序列杂交的程度可检测地更高(例如，至少2倍于背景)的条件。严格条件是序列依赖性的，并且将在不同环境下不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可鉴别与探针可最高达100％互补的靶序列(同源探测)。或者，可以调节严格性条件以允许序列中的一些错配，从而检测到较低程度的相似性(异源探测)。优选地，探针长为大约500个核苷酸，但长度可变化很大，从小于500个核苷酸到等于靶序列的整个长度。

通常，严格条件将为其中盐浓度低于约1.5M钠离子，通常为约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)，pH为7.0至8.3，对短探针(例如，10至50个核苷酸)而言温度为至少30℃，对长探针(例如，超过50个核苷酸)而言温度为至少约60℃的那些条件。严格条件还可通过添加去稳定剂诸如甲酰胺或Denhardt’s来实现。示例性的低严格性条件包括在37℃下用30-35％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液杂交，并在50-55℃下在1X至2XSSC(20XSSC＝3.0MNaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性的中等严格性条件包括在37℃下在40-45％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS中杂交，并在55-60℃下在0.5X至1XSSC中洗涤。示例性的高严格条件包括在50％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS中于37℃下杂交，并在0.1XSSC中于60-65℃下洗涤。特异性通常决定于杂交后的洗涤，关键因素为最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，T_m可根据MeinkothandWahl，(1984)，Anal.Biochem.，138：267-84(Meinkoth和Wahl，1984年，《分析生物化学》，第138卷，第267-284页)：的方程T_m＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L估计；其中M为单价阳离子的摩尔浓度，％GC为DNA中鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分数，％form为杂交溶液中甲酰胺的百分数，L为杂交体的长度(单位为碱基对)。T_m为50％的互补靶标序列与完美匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。每1％的错配，T_m降低约1℃；因此，可调节T_m、杂交和/或洗涤条件以杂交至所需同一性的序列。例如，如果寻求具有390％同一性的序列，则可将T_m降低10℃。通常，将严格条件选择为比特定序列及其互补序列在确定的离子强度和pH下的热解链温度(T_m)低约5℃。然而，极端严格条件可以采用比热解链温度(T_m)低1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤；适度严格条件可以采用比热解链温度(T_m)低6、7、8、9或10℃的杂交和/或洗涤；低严格条件可以采用比热解链温度(T_m)低11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或洗涤；利用该公式，杂交和洗涤组成以及所需的T_m，普通技术人员将认识到，杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化固有地得到了描述。如果所需的错配程度导致T_m低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选增加SSC浓度以使得可使用较高的温度。有关核酸的杂交的详尽指南见于以下文献：Tijssen，LABORATORYTECHNIQUESINBIOCHEMISTRYANDMOLECULARBIOLOGY--HYBRIDIZATIONWITHNUCLEICACIDPROBES，partI，chapter2，“Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays，”Elsevier，NewYork(1993)(Tijssen，《生物化学和分子生物学实验室技术——核酸探针杂交》，第I部分，第2章，“核酸探针测定法的杂交原理和策略概览”，爱思唯尔出版社，纽约，1993年)；以及CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，chapter2，Ausubel，etal.，eds，GreenePublishingandWiley-Interscience，NewYork(1995)(《最新分子生物学实验方法汇编》，第2章，Ausubel等人编辑，格林出版公司与约翰威立出版公司，纽约，1995年)。除非另有规定，否则在本申请中，高严格性定义为在4XSSC、5XDenhardt’s(5gFicoll、5g聚乙烯吡咯烷酮、5g牛血清白蛋白于500ml水中)、0.1mg/ml煮沸的鲑精DNA和25mM磷酸钠中在65℃下杂交，和在0.1XSSC、0.1％SDS在65℃下洗涤。

如本文所用，“转基因植物”包括指在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。一般来讲，异源多核苷酸稳定地整合在基因组内使得该多核苷酸得以传递到连续世代。异源多核苷酸可单独整合进基因组中，或者作为重组表达盒的一部分整合进基因组中。“转基因”在本文中用来包括任何其基因型已因异源核酸的存在而被变更的细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初如此变更的转基因以及那些通过从最初的转基因进行有性杂交或无性繁殖而产生的转基因在内。本文所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)的改变。

如本文所用，“载体”包括指用于转染宿主细胞并可在其中插入多核苷酸的核酸。载体常常是复制子。表达载体允许插入其中的核酸转录。

以下术语用于说明两个或更多个核酸或多核苷酸或多肽之间的序列关系：(a)“参考序列”、(b)“比较窗口”、(c)“序列同一性”、(d)“序列同一性百分数”和(e)“实质同一性”。

如本文所用，“参考序列”是用作序列比较基准的确定的序列。参考序列可以是指定序列的子集或全部；例如全长cDNA或基因序列的片段或完整的cDNA或基因序列。

如本文所用，“比较窗口”意指包括指多核苷酸序列的连续和指定的区段，其中该比较窗口中的该多核苷酸序列相比于参考序列(不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即空位)，以便两个多核苷酸的最佳比对。通常，比较窗口长度为至少20个连续的核苷酸，任选可为30、40、50、100个或更长。本领域技术人员认识到，为避免由于在多核苷酸序列中纳入空位所致的与参考序列的高度相似性，通常引入空位罚分并从匹配数扣除空位罚分。

将核苷酸和氨基酸序列进行比对以作比较的方法是本领域公知的。局部同源性算法(BESTFIT)(SmithandWaterman，(1981)Adv.Appl.Math2：482(Smith和Waterman，1981年，《应用数学进展》，第2卷，第482页))可以对用于比较的序列进行最佳比对；NeedlemanandWunsch，(1970)J.Mol.Biol.48：443-53(Needleman和Wunsch，1970年，《分子生物学杂志》，第48卷，第443-453页)的同源性比对算法(GAP)；相似性搜索方法(Tfasta和Fasta)(PearsonandLipman，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：2444(Pearson和Lipman，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第2444页))；这些算法的计算机化实施包括，但不限于：加利福尼亚州山景城Intelligenetics公司(Intelligenetics，MountainView，California)的PC/Gene程序中的CLUSTAL，威斯康星遗传学软件包(WisconsinGeneticsSoftware)第8版(可得自遗传学计算机组，程序，加利福尼亚州圣地亚哥Accelrys公司(GeneticsComputerGroup，programs，Accelrys，Inc.，SanDiego，CA))中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。CLUSTAL程序由以下文献详细说明：HigginshandSharp，(1988)Gene73：237-44(Higgins和Sharp，1988年，《基因》，第73卷，第237-244页)；HigginsandSharp，(1989)CABIOS5：151-3(Higgins和Sharp，1989年，《计算机在生物科学中的应用》，第5卷，第151-153页)；Corpet，etal.，(1988)NucleicAcidsRes.16：10881-90(Corpet等人，1988年，《核酸研究》，第16卷，第10881-10890页)；Huang，etal.，(1994)ComputerApplicationsintheBiosciences8：155-65(Huang等人，1994年，《计算机在生物科学中的应用》，第8卷，第155-165页)和Pearson，etal.，(1994)Meth.Mol.Biol.，24：307-31(Pearson等人，1994年，《分子生物学方法》，第24卷，第307-331页)。用于多个序列的最佳全局比对的优选程序是PileUp(FengandDoolittle，(1987)J.Mol.Evol.，25：351-60(Feng和Doolittle，1987年，《分子进化学杂志》，第25卷，第351-360页)，其类似于HigginsandSharp，(1989)CABIOS5：151-53(Higgins和Sharp，1989年，《计算机在生物科学中的应用》，第5卷，第151-153页)中描述的方法，将文献以引用方式并入本文。可用于数据库相似性搜索的BLAST家族程序包括：BLASTN，用于核苷酸查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询；BLASTX，用于核苷酸查询序列针对蛋白质数据库序列进行查询；BLASTP，用于蛋白质查询序列针对蛋白质数据库序列进行查询；TBLASTN，用于蛋白质查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询；和TBLASTX，用于核苷酸查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询。参见CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，Chapter19，Ausubel，etal.，eds.，GreenePublishingandWiley-Interscience，NewYork(1995)(《最新分子生物学实验方法汇编》，第19章，Ausubel等人编辑，格林出版和威利-英特科学出版公司，纽约，1995年)。

GAP利用Needleman和Wunsch(出处同上)的算法来寻找两个完整序列的比对，该比对使匹配数最大而使空位数最小。GAP考虑所有可能的比对和空位位置，并产生具有最大数目的匹配碱基和最少的空位的比对。它允许提供以匹配碱基数为单位的空位产生罚分和空位延伸罚分。GAP对于其插入的每个空位，必须利用匹配的空位产生罚分数。如果选择大于零的空位延伸罚分，GAP对于每个插入的空位必须另外利用空位长度乘以空位延伸罚分。威斯康星遗传学软件包(WisconsinGeneticsSoftware)第10版中的默认空位产生罚分值和空位延伸罚分值分别为8和2。空位产生和空位延伸罚分可以以选自0-100的整数来表示。因而，例如，空位产生和空位延伸罚分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更大。

GAP给出具有最佳比对的家族中的一个成员。可能存在这个家族的许多成员，但其他成员没有更好的品质。GAP显示用于比对的四个优值因子：品质、比率、同一性和相似性。品质是为了比对序列而最大化的指标(metric)。比率是品质除以较短区段中的碱基数。同一性百分数是实际匹配的符号的百分数。相似性百分数是相似的符号的百分数。将对应于空位的符号忽略。当一对符号的评分矩阵值大于或等于0.50(相似性阈值)时，评定为相似性。威斯康星遗传学软件包(WisconsinGeneticsSoftware)第10版中所用的评分矩阵为BLOSUM62(参见HenikoffandHenikoff，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915(Henikoff和Henikoff，1989年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第10915页))。

除非另有规定，否则本文所提供的序列同一性/相似性值指用BLAST2.0程序包，采用默认参数获得的值(Altschul，etal.，(1997)NucleicAcidsRes.25：3389-402(Altschul等人，1997年，《核酸研究》，第25卷，第3389-3402页))。

如本领域普通技术人员将会理解的，BLAST搜索假定蛋白质可以随机序列建模。然而，许多真实蛋白质包含非随机序列区，该非随机序列可为同聚段、短周期重复或富含一种或多种氨基酸的区域。这种低复杂性区域可在不相关的蛋白质之间比对，尽管该蛋白质的其他区域完全不相似。可采用多种低复杂性过滤程序来减少这种低复杂性比对。例如，可单独使用或联合使用SEG(WootenandFederhen，(1993)Comput.Chem.17：149-63(Wooten和Federhen，1993年，《计算化学》，第17卷，第149-163页))和XNU(ClaverieandStates，(1993)Comput.Chem.17：191-201(Claverie和States，1993年，《计算化学》，第17卷，第191-201页))低复杂性过滤程序。

在两条多核苷酸或多肽序列的情形中，本文所用的“序列同一性”或“同一性”是指当在指定的比较窗口上进行比对以获得最大对应时两个序列中相同的残基。当序列同一性百分数针对蛋白质使用时，认识到不相同的残基位置往往差别在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基由具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基置换，因此不会改变分子的功能性质。如果序列差别在于保守置换，则可上调百分比序列同一性以校正置换的保守性质。差别在于这种保守置换的序列被说成具有“序列相似性”或“相似性”。作出这个调节的方法是本领域技术人员所熟知的。通常，这涉及将保守置换评定为部分错配而不是完全错配，从而增加序列同一性百分数。因而，例如，如果相同的氨基酸给予1分，非保守置换给予0分，则保守置换给予0至1之间的分数。例如，根据MeyersandMiller，(1988)ComputerApplic.Biol.Sci.4：11-17(Meyers和Miller，1988年，《计算机在生物科学中的应用》，第4卷，第11-17页)的算法计算保守置换的分数，例如如在程序PC/GENE(美国加利福尼亚州山景城Intelligenetics公司(Intelligenetics，MountainView，California，USA))中所实现的。

如本文所用，“序列同一性百分数”意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列所确定的数值，其中多核苷酸序列在比较窗口中的部分与参考序列(不包含添加或缺失)相比包含添加或缺失(即空位)，以便两个序列的最佳比对。该百分数是这样计算的：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分数。

术语多核苷酸序列的“基本上相同”意指利用所描述的比对程序之一采用标准参数与参考序列比较时，多核苷酸包含具有50-100％之间的序列同一性，优选至少50％的序列同一性，优选至少60％的序列同一性，优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％且最优选至少95％序列同一性的序列。技术人员将会认识到，可通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等等适当调整这些值以确定两个核苷酸序列所编码的蛋白质的相应同一性。用于这些目的的氨基酸序列的实质同一性通常意指55-100％之间的序列同一性，优选至少55％，优选至少60％，更优选至少70％、80％、90％，最优选至少95％。

核苷酸序列基本上相同的另一种指示是两个分子在严格条件下是否彼此杂交。遗传密码的简并性允许许多氨基酸置换，这种氨基酸置换在编码相同氨基酸的核苷酸序列中导致多样化，因而有可能该DNA序列可编码相同多肽但在严格条件下不彼此杂交。例如，当利用遗传密码所允许的最大密码子简并性产生一个核酸拷贝时，这可能会发生。两条核酸序列是基本上相同的一个指示是，第一核酸编码的多肽与第二核酸所编码的多肽发生免疫交叉反应。

在肽的情形中，术语“实质相同”指肽包含在指定比较窗口上与参考序列具有55-100％之间的序列同一性；优选与参考序列具有至少55％的序列同一性，优选60％，优选70％，更优选80％，最优选至少90％或95％的序列同一性。优选地，利用Needleman和Wunsch(出处同上)的同源比对算法进行最佳比对。两条肽序列是基本上相同的指示是，一种肽可与针对第二种肽产生的抗体发生免疫反应。因而，例如，如果某种肽与第二种肽差别仅在于保守置换的话，则这两种肽实质上相同。此外，当某种肽与第二种肽差别在于非保守变化时，如果抗体识别的表位实质上相同，则它们实质上相同。“实质上相似的”肽共有如上所述的序列，例外的是不相同的残基位置差别可在于保守氨基酸变化。

本公开公开了尿素转运蛋白、尿素酶和谷氨酰胺合成酶多核苷酸以及多肽。本公开的新型核苷酸和蛋白质具有表明它们能够调控氮转运并因而在植物发育中起重要作用的表达模式。该多核苷酸在多种植物组织中表达。该多核苷酸和多肽因而提供了操纵植物发育来改变种子和营养组织发育、时间安排或组成的机会。这可以用于产生在来源和储存中(insouceandsink)具有改变的N组成的植物。

核酸

本公开提供了特别是包含尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶多核苷酸的RNA、DNA的分离核酸以及其类似物和/或嵌合体。

本公开还包括为在不同生物体中表达而经优化的多核苷酸。例如，对于多核苷酸在玉蜀黍植物中的表达，可以改变该序列以解决特定的密码子偏好性和改变GC含量，如根据Murray等人(出处同上)所述。来自玉蜀黍植物的28种基因的玉蜀黍密码子使用在Murray等人(出处同上)的表4中列出。

本公开的尿素转运蛋白、尿素酶和谷氨酰胺合成酶核酸包含分离的尿素转运蛋白、尿素酶和谷氨酰胺合成酶多核苷酸，其包括：

(a)编码尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶多肽的多核苷酸及其保守性修饰变体和多态性变体；

(b)与(a)或(b)的多核苷酸具有至少70％序列同一性的多核苷酸；

(c)(a)或(b)的多核苷酸的互补序列。

核酸的构建

可用(a)标准的重组方法、(b)合成技术或二者的组合产生分离的本公开核酸。在一些实施例中，本公开的多核苷酸将从真菌或细菌克隆、扩增或以别的方式构建。

所述核酸可便利地包含除本公开的多核苷酸之外的序列。例如，可将包含一个或多个内切核酸酶限制性位点的多克隆位点插入核酸中以帮助分离该多核苷酸。另外，可插入可翻译序列以助于分离翻译了的本公开的多核苷酸。例如，六组氨酸标记序列提供了便利的手段来纯化本公开的蛋白质。本公开的核酸(排除所述多核苷酸序列)任选地为用于本公开的多核苷酸的克隆和/或表达的载体、衔接子或接头。可将另外的序列添加至这种克隆和/或表达序列来优化它们在克隆和/或表达中的功能，以助于分离所述多核苷酸，或改善所述多核苷酸向细胞内的引入。通常，本公开核酸的长度减去其本公开多核苷酸的长度为小于20千碱基对，往往小于15kb，常常小于10kb。克隆载体、表达载体、衔接子和接头的使用是本领域已知的。示例性核酸包括诸如以下的载体：M13、λZAPExpress、λZAPII、λgt10、λgt11、pBK-CMV、pBK-RSV、pBluescriptII、λDASHII、λEMBL3、λEMBL4、pWE15、SuperCos1、SurfZap、Uni-ZAP、pBC、pBS+/-、pSG5、pBK、pCR-Script、pET、pSPUTK、p3’SS、pGEM、pSK+/-、pGEX、pSPORTI和II、pOPRSVICAT、pOPI3CAT、pXT1、pSG5、pPbac、pMbac、pMC1neo、pOG44、pOG45、pFRTbGAL、pNEObGAL、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pRS413、pRS414、pRS415、pRS416、λMOSSlox和λMOSElox。任选用于本公开的载体包括但不限于λZAPII和pGEX。有关各种核酸的描述，参见例如StratageneCloningSystems，目录1995、1996、1997(加利福尼亚州拉荷亚(LaJolla，CA))；和安玛西亚生命科学公司(AmershamLifeSciences，Inc)，目录’97(伊利诺伊州阿灵顿高地(ArlingtonHeights，IL))。

构建核酸的合成方法

分离的本公开的核酸也可以通过直接化学合成制备，例如用磷酸三酯方法(Narang，etal.，(1979)Meth.Enzymol.68：90-9(Narang等人，1979年，《酶学方法》，第68卷，第90-99页))；磷酸二酯方法(Brown，etal.，(1979)Meth.Enzymol.68：109-51(Brown等人，1979年，《酶学方法》，第68卷，第109-151页))；二乙基亚磷酰胺方法(Beaucage，etal.，(1981)Tetra.Letts.22(20)：1859-62(Beaucage等人，1981年，《四面体通讯》，第22卷，第20期，第1859-1862页))；Beaucage等人(出处同上)描述的固相亚磷酰胺三酯方法，例如使用自动化合成仪，例如Needham-VanDevanter，etal.，(1984)NucleicAcidsRes.12：6159-68(Needham-VanDevanter等人，1984年，《核酸研究》，第12卷，第6159-6168页)中所述，以及美国专利No.4,458,066的固相支持体方法。化学合成通常产生单链寡核苷酸。这可通过与互补序列杂交或通过将该单链作为模板用DNA聚合酶进行聚合来转变为双链DNA。技术人员将会认识到，虽然DNA的化学合成局限于约100个碱基的序列，但可通过连接较短的序列来获得较长的序列。

UTR和密码子偏好性

一般而言，已发现翻译效率受RNA的5′非编码区或非翻译区(5′UTR)中的特定序列元件的调控。正序列基序包括翻译起始共有序列(Kozak，(1987)NucleicAcidsRes.15：8125(Kozak，1987年，《核酸研究》，第15卷，第8125页))和5<G>7甲基GpppGRNA帽结构(Drummond，etal.，(1985)NucleicAcidsRes.13：7375(Drummond等人，1985年，《核酸研究》，第13卷，第7375页))。负元件包括稳定的分子内5′UTR茎-环结构(Muesing，etal.，(1987)Cell48：691(Muesing等人，1987年，《细胞》，第48卷，第691页))和5′UTR中的AUG序列或前面有适当AUG的短开放阅读框(Kozak(出处同上)、Rao，etal.，(1988)Mol.andCell.Biol.8：284(Rao等人，1988年，《分子细胞生物学》，第8卷，第284页))。因此，本公开提供了用于调节异源编码序列的翻译的5′和/或3′UTR区。

另外，可修饰本公开多核苷酸的多肽编码区段以改变密码子使用。可采用改变了的密码子使用，来改变翻译效率和/或优化编码序列在所需宿主中的表达或为了在玉蜀黍中表达而优化异源序列中的密码子使用。本公开的多核苷酸的编码区中的密码子使用可用可商购获得的软件包(诸如可得自威斯康星大学遗传学计算机小组(UniversityofWisconsinGeneticsComputerGroup)的“CodonPreference”)进行统计分析。参见Devereaux，etal.，(1984)NucleicAcidsRes.12：387-395(Devereaux等人，1984年，《核酸研究》，第12卷，第387-395页)或MacVector4.1(美国康涅狄格州纽黑文市伊斯曼柯达公司(EastmanKodakCo.，NewHaven，Conn.))。因而，本公开提供了本公开多核苷酸中的至少一者的编码区的密码子使用频率特性。可用于确定密码子使用频率的多核苷酸的数目(每个氨基酸3个核苷酸)可以为从3至本文所提供的本公开多核苷酸的数目的任何整数。任选地，多核苷酸将为全长序列。用于统计分析的序列的示例性数目可以为至少1、5、10、20、50或100。

序列改组

本公开提供了使用本公开多核苷酸进行序列改组的方法以及由此得到的组合物。序列改组在PCT公开No.1996/19256中有描述。也可参见Zhang，etal.，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：4504-9(Zhang等人，1997年，《美国国家科学院院刊》，第94卷，第4504-4509页)和Zhao，etal.，(1998)NatureBiotech16：258-61(Zhao等人，1998年，《自然生物技术》，第16卷，第258-261页)。一般来讲，序列改组提供出用于产生具有所需特性的多核苷酸的文库的手段，可对该文库进行选择或筛选。从一群包含具有实质序列同一性并可在体外或体内进行同源重组的序列区的相关序列多核苷酸产生重组多核苷酸的文库。序列重组的多核苷酸的群体包含具有所需的或有利的特性并且可通过合适的选择或筛选方法来选择的多核苷酸的亚群。所述特性可以是能用筛选系统选择或检测的任何性质或属性，可以包括如下性质：所编码的蛋白质、转录元件、控制转录的序列、RNA加工、RNA稳定性、染色质构象、基因或转基因的翻译或其他表达性质、复制元件、蛋白质结合元件等等的性质，诸如赋予可选择或可检测性质的任何特征。在一些实施例中，选择的特性将为相对于本文所提供的野生型蛋白质而言改变了的K_m和/或K_cat。在其他实施例中，序列改组所产生的蛋白质或多核苷酸具有的配体结合亲和力将比非改组的野生型多核苷酸的高。在另外其他实施例中，与非改组的野生型多核苷酸相比，序列改组所产生的蛋白质或多核苷酸将具有改变了的最佳pH。这类性质的提高可占野生型值的至少110％、120％、130％、140％或高于150％。

重组表达盒

本公开还提供包含本公开的核酸的重组表达盒。可将编码所需的本公开多核苷酸的核酸序列，例如编码长度足以编码本公开的活性蛋白质的多肽的cDNA或基因组序列用于构建重组表达盒，可将该表达盒引入所需的宿主细胞。重组表达盒将通常包含有效连接至转录起始调控序列的本公开多核苷酸，所述转录起始调控序列将引导所述多核苷酸在预期的宿主细胞(诸如转化植物的组织)中的转录。

例如，植物表达载体可包含(1)处于5′和3′调控序列的转录控制下的克隆植物基因和(2)显性选择性标志物。如果需要，这种植物表达载体还可含有启动子调控区(例如，赋予诱导型表达或组成型表达，由环境或发育调节的表达，或细胞或组织特异性/选择性表达的启动子调控区)、转录起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或多腺苷酸化信号。

可采用会引导本公开多核苷酸在再生植物的所有组织中表达的植物启动子片段。这种启动子在本文中称为“组成型”启动子并且在大多数环境条件和发育或细胞分化状态下是活跃的。组成型启动子的例子包括源于根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的T-DNA的1′或2′启动子、Smas启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(美国专利No.5,683,439)、Nos启动子、rubisco启动子、GRP1-8启动子、来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子，如Odell，etal.，(1985)Nature313：810-2(Odell等人，1985年，《自然》，第313卷，第810-812页)中所述；水稻肌动蛋白(McElroy，etal.，(1990)PlantCell163-171(McElrov等人，1990年，《植物细胞》，第163-171页))；泛素(Christensen，etal.，(1992)PlantMol.Biol.12：619-632(Christensen等人，1992年，《植物分子生物学》，第12卷，第619-632页)和Christensen，etal.，(1992)PlantMol.Biol.，18：675-89(Christensen等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第675-689页))；pEMU(Last，etal.，(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-8(Last等人，1991年，《理论和应用遗传学》，第81卷，第581-588页))；MAS(Velten，etal.，(1984)EMBOJ.3：2723-30(Velten等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2723-2730页))以及玉蜀黍H3组蛋白(Lepetit，etal.，(1992)Mol.Gen.Genet.231：276-85(Lepetit等人，1992年，《分子遗传学和基因组学》，第231卷，第276-285页)和Atanassvoaetal.，(1992)PlantJournal2(3)：291-300(Atanassvoa等人，1992年，《植物杂志》，第2卷，第3期，第291-300页))；ALS启动子，如PCT申请号WO1996/30530中所描述，以及其他来自技术人员知道的各种植物基因的转录起始区。对于本公开而言，泛素启动子是用于单子叶植物中表达的优选启动子。

或者，植物启动子可指导本公开的多核苷酸在特定组织中的表达或者可另外在更精确的环境或发育控制下的表达。这种启动子在本文中称为“诱导型”启动子。可实现通过诱导型启动子进行的转录的环境条件包括病原体攻击、无氧条件或光的存在。诱导型启动子的例子是Adh1启动子(其可通过低氧或寒冷胁迫诱导)、Hsp70启动子(其可通过热胁迫诱导)和PPDK启动子(其可通过光诱导)。

在发育控制下的启动子的例子包括仅仅或优先在某些组织(诸如叶、根、果实、种子或花)中起始转录的启动子。取决于启动子在基因组的位置，启动子的操作也可以变化。因而，诱导型启动子在某些位置可变为完全或部分组成型的。

如果多肽表达是所需的，则通常期望在多核苷酸编码区的3′-端包括多腺苷酸化区。聚腺苷酸化区域可衍生自多种植物基因或衍生自T-DNA。待添加的3′端序列可源于(例如)胭脂氨酸合酶或章鱼氨酸合酶基因，或者源于另一植物基因，或较不优选地，源于任何其他真核基因。这种调控元件的例子包括但不限于3’末端和/或多腺苷酸化区，诸如根瘤农杆菌胭脂氨酸合酶(nos)基因的那些(Bevan，etal.，(1983)NucleicAcidsRes.12：369-85(Bevan等人，1983年，《核酸研究》，第12卷，第369-385页))；马铃薯蛋白酶抑制剂II(PINII)基因(Keil，etal.，(1986)NucleicAcidsRes.14：5641-50(Keil等人，1986年，《核酸研究》，第14卷，第5641-5650页)以及An，etal.，(1989)PlantCell1：115-22(An等人，1989年，《植物细胞》，第1卷，第115-122页))和CaMV19S基因(Mogen，etal.，(1990)PlantCell2：1261-72(Mogen等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第1261-1272页))。

可将内含子序列添加至部分编码序列的5′非翻译区或编码序列以增加在胞质溶胶中积聚的成熟信息的量。在植物和动物表达构建体中的转录单位中包含可剪接的内含子，已证实在mRNA水平上和蛋白水平上都能增加基因表达最高达1000倍(BuchmanandBerg，(1988)Mol.CellBiol.8：4395-4405(Buchman和Berg，1988年，《分子细胞生物学》，第8卷，第4395-4405页)；Callis，etal.，(1987)GenesDev.1：1183-200(Callis等人，1987年，《基因与发育》，第1卷，第1183-1200页))。当设置在接近转录单位的5′端时，这种基因表达的内含子增强通常是最大的。玉蜀黍内含子Adh1-S内含子1、2和6、Bronze-1内含子的使用是本领域已知的。一般参见THEMAIZEHANDBOOK，Chapter116，FreelingandWalbot，eds.，Springer，NewYork(1994)(《玉蜀黍手册》，第116章，Freeling和Walbot编辑，施普林格出版，纽约，1994年)。

植物信号序列包括但不限于：编码将蛋白靶向植物细胞的胞外基质的信号肽的DNA/RNA序列(Dratewka-Kos，etal.，(1989)J.Biol.Chem.264：4896-900(Dratewka-Kos等人，1989年，《生物化学杂志》，第264卷，第4896-4900页))，诸如皱叶烟草(Nicotianaplumbaginifolia)延伸基因(DeLooseetal.，(1991)Gene99：95-100(DeLoose等人，1991年，《基因》，第99卷，第95-100页))；将蛋白靶向液泡的信号肽，诸如甘薯贮藏蛋白基因(Matsuka，etal.，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：834(Matsuka等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第834页))和大麦凝集素基因(Wilkins，etal.，(1990)PlantCell，2：301-13(Wilkins等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第301-313页))；导致蛋白被分泌的信号肽，诸如PRIb信号肽(Lind，etal.，(1992)PlantMol.Biol.18：47-53(Lind等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第47-53页))或大麦α淀粉酶(BAA)(Rahmatullah，etal.，(1989)PlantMol.Biol.12：119(Rahmatullah等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第119页)，并据此以引用方式并入本文)或者将蛋白质靶向质体的信号肽，诸如油菜烯脂酰Acp还原酶(Verwaert，etal.，(1994)PlantMol.Biol.26：189-202(Verwaert等人，1994年，《植物分子生物学》，第26卷，第189-202页))可用于本公开中。融合至尿素酶多核苷酸的大麦α淀粉酶信号序列是本公开的用于在玉蜀黍中表达的优选构建体。

包含来自本公开多核苷酸的序列的载体将通常包含标记基因，该标记基因可在植物细胞上赋予选择性表型。通常，选择性标志基因将编码抗生素抗性，合适的基因包括编码对壮观霉素这种抗生素的抗性的基因(例如aada基因)、编码链霉素抗性的链霉素磷酸转移酶(SPT)基因、编码卡那霉素或遗传霉素抗性的新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因、编码潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因、编码对起到抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的作用的除草剂，特别是磺酰脲类除草剂的抗性的基因(例如含有导致这种抗性的突变特别是S4和/或Hra突变的乙酰乳酸合酶(ALS)基因)、编码对起到抑制谷氨酰胺合酶的作用的除草剂诸如草胺膦或basta的抗性的基因(例如bar基因)，或本领域已知的其他这种基因。bar基因编码对除草剂basta的抗性，ALS基因编码对除草剂氯磺隆的抗性。

可用于在高等植物中表达基因的典型载体是本领域熟知的，包括衍生自根瘤农杆菌的肿瘤诱导(Ti)质粒的载体，如Rogers，etal.，(1987)Meth.Enzymol.153：253-77(Rogers等人，1987年，《酶学方法》，第153卷，第253-277页)所描述。这些载体是植物整合型载体，因为在转化时，这些载体将载体DNA的一部分整合进宿主植物的基因组中。可用于本公开的示例性的根瘤农杆菌载体是Schardl，etal.，(1987)Gene61：1-11(Schardl等人，1987年，《基因》，第61卷，第1-11页)和Berger，etal.，(1989)Proc.Nail.Acad.Sci.USA，86：8402-6(Berger等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第8402-8406页)的质粒pKYLX6和pKYLX7。本公开中可用的另一种载体是质粒pBI101.2，其可得自加利福尼亚州帕罗奥多的科隆达生物技术实验室有限公司(CLONTECHLaboratories，Inc.，PaloAlto，CA)。

蛋白质在宿主细胞中的表达

使用本公开的核酸，可以在重组工程改造的细胞诸如细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞或优选植物细胞中表达本公开的蛋白质。这类细胞在非天然条件下(例如，在数量、组成、位置和/或时间方面)产生蛋白质，因为它们已通过人为干预被遗传改变成在非天然条件下产生蛋白质。

可以预期，本领域的技术人员知晓多种可用于表达编码本公开的蛋白质的核酸的表达体系。无意于详细描述已知用于在原核生物或真核生物中表达蛋白质的各种方法。

简单概括而言，编码本公开蛋白质的分离核酸的表达通常可、通过使例如DNA或cDNA有效连接至启动子(组成型或诱导型)、然后整合进表达载体中来实现。该载体可适合于在原核生物或真核生物中复制和整合。典型的表达载体含有可用于调控编码本公开蛋白质的DNA的表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。为了获得克隆基因的高水平表达，期望构建表达载体，该表达载体在最低程度上含有用以指导转录的强启动子(诸如泛素启动子)、用于翻译起始的核糖体结合位点和转录/翻译终止子。组成型启动子被分类为可提供一系列组成型表达。因而，某些是弱组成型启动子，而另一些是强组成型启动子。一般来讲，所谓“弱启动子”意指驱动编码序列以低水平表达的启动子。所谓“低水平”意指处于约1/10,000个转录物至约1/100,000个转录物至约1/500,000个转录物的水平。相反，“强启动子”以“高水平”或者约1/10个转录物至约1/100个转录物至约1/1,000个转录物来驱动编码序列的表达。

技术人员将认识到，可对本公开的蛋白质进行修饰而不减低其生物活性。可进行某些修饰以有利于目标分子的克隆、表达或掺入进融合蛋白中。这种修饰是本领域技术人员所熟知的，包括例如在氨基末端添加甲硫氨酸以提供起始位点，或在任一端设置额外的氨基酸(例如多聚His)以产生便利地定位的限制性位点或终止密码子或纯化序列。

在原核生物中的表达

原核细胞可用作表达的宿主。原核生物最通常由大肠杆菌的各种菌株代表；然而，也可使用其他微生物菌株。在本文中定义为包括用于转录起始的启动子(任选具有操纵子)以及核糖体结合位点序列的常用原核生物控制序列，包括诸如以下的常用启动子：β-内酰胺酶(青霉素酶)启动子系统和乳糖(lac)启动子系统(Chang，etal.，(1977)Nature198：1056(Chang等人，1977年，《自然》，第198卷，第1056页))、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel，etal.，(1980)NucleicAcidsRes.8：4057(Goeddel等人，1980年，《核酸研究》，第8卷，第4057页))和λ衍生PL启动子之类的常用启动子和N-基因核糖体结合位点(Shimatake，etal.，(1981)Nature292：128(Shimatake等人，1981年，《自然》，第292卷，第128页))。在转染进大肠杆菌中的DNA载体中包含选择标志物也是有用的。这种标志物的例子包括规定对氨苄青霉素、四环素或氯霉素的抗性的基因。

选择载体以使得将所关注基因引入到适当的宿主细胞中。细菌载体通常是质粒或噬菌体起源的。将适当的细菌细胞用噬菌体载体颗粒转染或用裸噬菌体载体DNA转染。如果使用质粒载体，则将细菌细胞用质粒载体DNA转染。用于表达本公开的蛋白的表达系统可用芽孢杆菌属物种和沙门氏菌属(Salmonella)(Palva，etal.，(1983)Gene22：229-35(Palva等人，1983年，《基因》，第22卷，第229-235页)；Mosbach，etal.，(1983)Nature302：543-5(Mosbach等人，1983年，《自然》，第302卷，第543-545页))。得自法玛西亚(Pharmacia)的pGEX-4T-1质粒载体是本公开的优选大肠杆菌表达载体。

在真核生物中的表达

多种真核表达系统如酵母、昆虫细胞系、植物和哺乳动物细胞是本领域技术人员已知的。如下面简单解释的，本公开可在这些真核系统中表达。在一些实施例中，将转化的/转染的植物细胞(如下文所论述的)用作表达系统，用于产生本公开的蛋白。

异源蛋白质在酵母中的合成是众所周知的。Sherman，etal.，METHODSINYEASTGENETICS，ColdSpringHarborLaboratory(1982)(Sherman等人，1982年，《酵母遗传学方法》，冷泉港实验室)是描述多种可用于在酵母中产生蛋白质的方法的广泛认可的著作。两种广泛采用的用于产生真核蛋白质的酵母是酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母。用于在酵母属(Saccharomyces)和毕赤酵母属(Pichia)中表达的载体、菌株和方案是本领域已知的并可从商业供应商(例如英杰公司(Invitrogen))获得。根据需要，合适的载体通常具有表达控制序列，例如启动子(包括3-磷酸甘油酸激酶或醇氧化酶启动子)和复制起始区、终止序列等等。

本公开的蛋白质，一旦表达，可通过裂解细胞并向溶胞产物或离心沉淀物应用标准蛋白质分离技术来从酵母分离。可通过使用蛋白质印迹技术或其他标准免疫测定技术的放射免疫测定法来完成对纯化过程的监测。

还可将编码本公开的蛋白质的序列连接到多种用于转染例如哺乳动物、昆虫或植物来源的细胞培养物的表达载体。哺乳动物细胞系统通常会是单层细胞的形式，但也可使用哺乳动物细胞悬浮液。本领域已开发了多种能够表达完整蛋白质的合适宿主细胞系，包括HEK293、BHK21和CHO细胞系。用于这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，诸如复制起点、启动子(例如CMV启动子、HSVtk启动子或pgk(磷酸甘油酸激酶)启动子)、增强子(Queen，etal.，(1986)Immunol.Rev.89：49(Queen等人，1986年，《免疫学评论》，第89卷，第49页))和必要的加工信息位点诸如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点(例如SV40大TAg多聚A添加位点)和转录终止子序列。可用于产生本公开的蛋白质的其他动物细胞可从例如美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)CatalogueofCellLinesandHybridomas(《细胞系和杂交瘤目录》)(第7版，1992)获得。

用于在昆虫细胞中表达本公开的蛋白质的适当载体通常源于SF9杆状病毒。合适的昆虫细胞系包括蚊幼虫、蚕、行军虫、蛾和果蝇(Drosophila)细胞系，诸如Schneider细胞系(参见例如Schneider，(1987)J.Embryol.Exp.Morphol.27：353-65(Schneider，1987年，《胚胎学和实验形态学杂志》，第27卷，第353-365页))。

如使用酵母一样，当采用高等动物或植物宿主细胞时，通常将多腺苷酸化或转录终止子序列整合进载体中。终止子序列的例子是来自牛生长激素基因的多聚腺苷酸化序列。还可包括用于转录物的精确剪接的序列。剪接序列的例子是来自SV40的VP1内含子(Sprague，etal.，(1983)J.Virol.45：773-81(Sprague等人，1983年，《病毒学杂志》，第45卷，第773-781页))。另外，可将控制在宿主细胞中的复制的基因序列整合进载体，诸如牛乳头瘤病毒类型的载体中存在的那些(Saveria-Campo，“BovinePapillomaVirusDNAaEukaryoticCloningVector”(牛乳头瘤病毒DNA：一种真核克隆载体)，载于DNACLONING：APRACTICALAPPROACH，vol.II，Glover，ed.，IRLPress，Arlington，VA，pp.213-38(1985)(《DNA克隆：一种实用方法》，第II卷，Glover编辑，IRL出版社，弗吉尼亚州阿灵顿，第213-238页，1985年))。

另外，可将位于适当植物表达载体中的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶的基因用于转化植物细胞。然后可从植物愈伤组织分离多肽或可将转化的细胞用于再生转基因植物。可收获这种转基因植物，将适当的组织(例如，种子或叶)进行大规模蛋白质提取和纯化技术。

植物转化方法

用于将外源基因引入植物中的许多方法是已知的，并且可用于将尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶多核苷酸插入植物宿主中，所述方法包括生物和物理植物转化方案。参见例如Mikietal.，“ProcedureforIntroducingForeignDNAintoPlants，”inMETHODSINPLANTMOLECULARBIOLOGYANDBIOTECHNOLOGY，GlickandThompson，eds.，CRCPress，Inc.，BocaRaton，pp.67-88(1993)(Miki等人，“外源DNA引入植物的方法”，载于《植物分子生物学和生物技术方法》，Glick和Thompson编辑，CRC出版社，博卡拉顿，第67-88页，1993年)。所选择的方法随宿主植物而变化，包括化学转染方法诸如磷酸钙介导的基因转移、微生物介导的基因转移诸如农杆菌介导的基因转移(Horsch，etal.，(1985)Science227：1229-31(Horsch等人，1985年，《科学》，第227卷，第1229-1231页))、电穿孔、显微注射和基因枪轰击。

用于植物细胞或组织转化和植物再生的表达盒和载体以及体外培养方法是已知的并可获得。参见例如Gruber，etal.，“VectorsforPlantTransformation，”inMETHODSINPLANTMOLECULARBIOLOGYANDBIOTECHNOLOGY，supra，pp.89-119(Gruber等人，“植物转化的载体”，载于《植物分子生物学和生物技术方法》(出处同上)，第89-119页)。

可通过一种或多种通常用于直接递送进细胞的技术将分离的多核苷酸或多肽引入植物中。取决于要进行基因修饰的生物体、细胞、植物或植物细胞的类型(即单子叶植物或双子叶植物)，这种方案可不同。转化植物细胞的合适方法包括显微注射(Crossway，etal.，(1986)Biotechniques4：320-334(Crossway等人，1986年，《生物技术》，第4卷，第320-334页)和美国专利No.6,300,543)、电穿孔(Riggs，etal.，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：5602-5606(Riggs等人，《美国国家科学院院刊》，第83卷，第5602-5606页))、直接基因转移(Paszkowski，etal.，(1984)EMBOJ.3：2717-2722(Paszkowski等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2717-2722页))以及弹道粒子加速(参见例如Sanford等人的美国专利No.4,945,050、WO1991/10725和McCabe，etal.，(1988)Biotechnology6：923-926(McCabe等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第923-926页))。还可参见Tomes，etal.，DirectDNATransferintoIntactPlantCellsViaMicroprojectileBombardment.pp.197-213(Tomes等人，“通过微粒轰击直接将DNA转移到完整植物细胞中”)，载于PlantCell，TissueandOrganCulture，FundamentalMethods.eds.GamborgandPhillips，Springer-VerlagBerlinHeidelbergNewYork，1995(《植物细胞、组织和器官培养：基本方法》，Gamborg和Phillips编辑，施普林格出版社柏林海德堡，纽约，1995年)第197-213页；美国专利No.5,736,369(分生组织)；Weissinger，etal.，(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477(Weissinger等人，1988年，《遗传学年鉴》，第22卷，第421-477页)；Sanford，etal.，(1987)ParticulateScienceandTechnology5：27-37(Sanford等人，1987年，《颗粒科学与技术》，第5卷，第27-37页)(洋葱)；Christou，etal.，(1988)PlantPhysiol.87：671-674(Christou等人，1988年，《植物生理学》，第87卷，第67l-674页)(大豆)；Datta，etal.，(1990)Biotechnology8：736-740(Datta等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第736-740页)(水稻)；Klein，etal.，(1988)Proc.Natl.Acad.SCi.USA85：4305-4309(Klein等人，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第4305-4309页)(玉蜀黍)；Klein，etal.，(1988)Biotechnology6：559-563(Klein等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第559-563页)(玉蜀黍)；WO1991/10725(玉蜀黍)；Klein，etal.，(1988)PlantPhystol.91：440-444(Klein等人，1988年，《植物生理学》，第91卷，第440-444页)(玉蜀黍)；Fromm，etal.，(1990)Biotechnology8：833-839(Fromm等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第833-839页)和Gordon-Kamm，etal.，(1990)PlantCell2：603-618(Gordon-Kamm等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第603-618页)(玉蜀黍)；Hooydaas-VanSlogterenandHooykaas，(1984)Nature(London)311：763-764(Hooydaas-VanSlogteren和Hooykaas，1984年，《自然》(伦敦)，第311卷，第763-764页)；Bytebier，etal.，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：5345-5349(Bytebier等人，1987年，《美国国家科学院院刊》，第84卷，第5345-5349页)(百合科)；DeWet，etal.，(1985)InTheExperimentalManipulationofOvuleTissues，ed.Chapman，etal.，pp.197-209Longman，NY(DeWet等人，1985年，载于《胚珠组织的实验操作》，Chapman等人编辑，第197-209页，Longman出版社，纽约)(花粉)；Kaeppler，etal.，(1990)PlantCellReports9：415-418(Kaeppler等人，1990年，《植物细胞报道》，第9卷，第415-418页)和Kaeppler，etal.，(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(Kaeppler等人，1992年，《理论和应用遗传学》，第84卷，第560-566页)(触须介导的转化)；美国专利No.5,693,512(超声波降解)；D’Halluin，etal.，(1992)PlantCell4：1495-1505(D’Halluin等人，1992年，《植物细胞》，第4卷，第1495-1505页)(电穿孔)；Li，etal.，(1993)PlantCellReports12：250-255(Li等人，1993年，《植物细胞报道》，第12卷，第250-255页)；以及ChristouandFord(1995)AnnalsofBotany75：407-413(Christou和Ford，1995年，《植物学年鉴》，第75卷，第407-413页)(水稻)；Osjoda，etal.，(1996)NatureBiotech.14：745-750(Osjoda等人，1996年，《自然生0技术》，第14卷，第745-750页)；农杆菌介导的玉蜀黍转化(美国专利No.5,981,840)；碳化硅晶须方法(Frame，etal.，(1994)PlantJ.6：941-948(Frame等人，1994年，《植物杂志》，第6卷，第941-948页))；激光方法(Guo，etal.，(1995)PhysiologiaPlantarum93：19-24(Guo等人，1995年，《植物生理学》，第93卷，第19-24页))；超声处理方法(Bao，etal.，(1997)UltrasoundinMedicine&Biology23：953-959(Bao等人，1997年，《医学与生物学超声》，第23卷，第953-959页)；FinerandFiner，(2000)LettApplMicrobiol.30：406-10(Finer和Finer，2000年，《应用微生物学通讯》，第30卷，第406-410页)；Amoah，etal.，(2001)JExpBot52：1135-42(Amoah等人，2001年，《实验植物学杂志》，第52卷，第1135-1142页))；聚乙二醇方法(Krens，etal.，(1982)Nature296：72-77(Krens等人，1982年，《自然》，第296卷，第72-77页))；单子叶和双子叶植物细胞的原生质可以用电穿孔(Fromm，etal.，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：5824-5828(Fromm等人，1985年，《美国国家科学院院刊》，第82卷，第5824-5828页))和显微注射(Crossway，etal.，(1986)Mol.Gen.Genet.202：179-185(Crossway等人，1986年，《分子遗传学和基因组学》，第202卷，第179-185页)进行转化；将这些文献全部以引用方式并入本文。

农杆菌介导的转化

将表达载体引入植物中的最广泛使用的方法是基于农杆菌的天然转化系统。根瘤农杆菌和毛根农杆菌(A.rhizogenes)是植物病原性土壤细菌，其能遗传转化植物细胞。根瘤农杆菌和毛根农杆菌各自的Ti和Ri质粒携带负责植物的遗传转化的基因。参见例如Kado，(1991)Crit.Rev.PlantSci.10：1(Kado，1991年，《植物科学评论》，第10卷，第1页)。有关农杆菌介导的基因转移的农杆菌载体系统和方法的描述在以下文献中提供：Gruber等人(出处同上)；Miki等人(出处同上)和Moloney，etal.，(1989)PlantCellReports8：238(Moloney等人，1989年，《植物细胞报道》，第8卷，第238页)。

相似地，可将基因插入源于根瘤农杆菌或毛根农杆菌各自的Ti或Ri质粒的T-DNA区。因而，可使用这些质粒，如上构建表达盒。已知有许多控制序列，其在偶联至异源编码序列并转化进宿主生物体中时，在初始编码序列的组织/器官特异性方面显示出基因表达的保真性。参见例如BenfeyandChua，(1989)Science244：174-81(Benfey和Chua，1989年，《科学》，第244卷，第174-181页)。用于这些质粒中的特别合适的控制序列是用于基因在各种靶植物中的组成型叶特异性表达的启动子。其他可用的控制序列包括来自胭脂氨酸合酶基因(NOS)的启动子和终止子。NOS启动子和终止子存在于质粒pARC2中，该质粒可得自美国典型培养物保藏中心，指定的ATCC存放号为67238。如果使用这种系统，则来自Ti或Ri质粒的毒力(vir)基因必须也存在，要么与T-DNA部分一起存在，要么通过双元系统存在，在该系统中该vir基因存在于一另外的载体上。这类系统、其中所用的载体、以及转化植物细胞的方法在美国专利No.4,658,082；1986年10月1日提交的美国专利申请No.913,914，如公布于1993年11月16日的美国专利No.5,262,306引用，和Simpson，etal.，(1986)PlantMol.Biol.6：403-15(Simpson等人，1986年，《植物分子生物学》，第6卷，第403-415页)(也在‘306专利中引用)，所有文献均全文以引用方式并入。

一旦构建，可将这些质粒置于毛根农杆菌或根瘤农杆菌中并将这些载体用于转化植物物种的细胞，所述植物物种的细胞通常对镰孢属(Fusarium)或链格孢属(Alternaria)感染而言是易感的。本公开还可以想到若干其他转基因植物，包括但不限于大豆、玉米、高粱、苜蓿、水稻、三叶草、卷心菜、香蕉、咖啡、芹菜、烟草、豇豆、棉花、甜瓜、柳枝稷、芒草、黑小麦和胡椒。根瘤农杆菌或者毛根农杆菌的选择将取决于用其转化的植物。通常，根瘤农杆菌是用于转化的优选生物体。多大数双子叶植物、一些裸子植物和少数单子叶植物(例如百合目(Liliales)和天南星目(Arales)的某些成员)对根瘤农杆菌感染是易感的。毛根农杆菌也具有广泛的宿主范围，涵盖大多数双子叶植物和一些裸子植物，其包括豆科(Leguminosae)、菊科(Compositae)和藜科(Chenopodiaceae)的成员。单子叶植物现在可以一定的成功率进行转化。欧洲专利申请No.604662A1公开了使用农杆菌转化单子叶植物的方法。欧洲专利申请No.672752A1公开了使用未成熟胚的盾片用农杆菌转化单子叶植物的方法。Ishida等人论述了通过使未成熟胚暴露于根瘤农杆菌来转化玉蜀黍的方法(NatureBiotechnology14：745-50(1996)(《自然生物技术》，第14卷，第745-750页，1996年))。

一旦转化，可将这些细胞用于再生转基因植物。例如，整个植株可通过使该植株产生伤口，然后将载体引入该伤口位点来用这些载体进行感染。可使植株的任何部分产生伤口，包括叶、茎和根。或者，可将外植体形式的植物组织如子叶组织或叶圆片用这些载体接种，并在可促进植物再生的条件下培养。可将通过用毛根农杆菌或根瘤农杆菌(含有编码伏马毒素降解酶的基因)接种植物组织而转化的根或苗用作植物来源，以通过体细胞胚胎发生或器官发生来再生伏马毒素抗性转基因植物。再生植物组织的此类方法的例子公开于Shahin，(1985)Theor.Appl.Genet.69：235-40(Shahin，1985年，《理论和应用遗传学》，第69卷，第235-240页)；美国专利No.4,658,082；Simpson等人(出处同上)和均于1986年10月1日提交的美国专利申请序列号913,913和913,914，如公布于1993年11月16日的美国专利No.5,262,306所引用，将上述文献的全部公开内容以引用方式并入本文。

直接基因转移

尽管农杆菌介导的转化的宿主范围广泛，但一些主要的谷类作物物种和裸子植物总体上对该基因转移模式而言是顽拗的，尽管最近已在稻中获得了一定的成功(Hiei，etal.，(1994)ThePlantJournal6：271-82(Hiei等人，1994年，《植物杂志》，第6卷，第271-282页))。已开发了几种植物转化的方法(统称为直接基因转移)作为对农杆菌介导的转化的替代方案。

一般适用的植物转化方法是微抛射体(microprojectile)介导的转化，其中DNA携带在约1至4μm的微抛射体的表面上。用基因枪装置(biolisticdevice)将表达载体引入植物组织中，该基因枪装置将微抛射体加速至300-600m/s的速度，该速度足以穿透植物细胞壁和膜(Sanford，etal.，(1987)PartSci.Technol.5：27(Sanford等人，1987年，《粒子科学与技术》，第5卷，第27页)；Sanford，(1988)TrendsBiotech6：299(Sanford，1988年，《生物技术趋势》，第6卷，第299页)；Sanford，(1990)Physiol.Plant79：206(Sanford，1990年，《植物生理学》，第79卷，第206页)和Klein，etal.，(1992)Biotechnology10：268(Klein等人，1992年，《生物技术》，第10卷，第268页))。

物理递送DNA至植物的另一种方法是如Zang，etal.，(1991)BioTechnology9：996(Zang等人，1991年，《生物技术》，第9卷，第996页)中所述的对靶细胞的超声处理。或者，脂质体或原生质球融合已用于将表达载体引入植物中。参见例如Deshayes，etal.，(1985)EMBOJ.4：2731(Deshayes等人，1985年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第4卷，第2731页)和Christou，etal.，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：3962(Christou等人，1987年，《美国国家科学院院刊》，第84卷，第3962页)。利用CaCl₂沉淀、聚乙烯醇或聚-L-鸟氨酸直接将DNA摄入原生质体中也已有报道。参见例如Hain，etal.，(1985)Mol.Gen.Genet.199：161(Hain等人，1985年，《分子遗传学和基因组学》，第199卷，第161页)和Draper，etal.，(1982)PlantCellPhysiol.23：451(Draper等人，1982年，《植物细胞生理学》，第23卷，第451页)。

原生质体和完整细胞和组织的电穿孔也已有描述。参见例如Donn，etal.，(1990)inAbstractsoftheVIIthInt’l.CongressonPlantCellandTissueCultureIAPTC，A2-38，p.53(Donn等人，1990年，载于《第VII届植物细胞与组织培养IAPTC会议摘要》，A2-38，第53页)；D’Halluin，etal.，(1992)PlantCell4：1495-505(D’Halluin等人，1992年，《植物细胞》，第4卷，第1495-1505页)和Spencer，etal.，(1994)PlantMol.Biol.24：51-61(Spencer等人，1994年，《植物分子生物学》，第24卷，第51-61页)。

增加尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶多肽的活性和/或水平

提供了增加本公开的尿素转运蛋白、尿素酶和谷氨酰胺合成酶多肽的活性和/或水平的方法。可以通过向植物提供尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶多肽来实现本公开的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶多肽的水平和/或活性的增加。可以通过将编码尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶多肽的氨基酸序列引入植物中，将编码尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶多肽的核苷酸序列引入植物中，或者通过修饰编码本公开的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶多肽的基因座来提供尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶多肽。

如本文别处所论述的，本领域已知有多种方法用于将多肽提供给植物，包括但不限于将多肽直接引入植物中，将编码具有尿素转运、尿素分解或氨同化活性的多肽的多核苷酸构建体引入植物中(暂时引入或稳定引入)。还认识到，本公开的方法可采用不能够在转化的植物中引导蛋白质或RNA的表达的多核苷酸。因此，可以通过改变编码尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶多肽的基因或其启动子来增加尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶多肽的水平和/或活性。参见例如，Kmiec，美国专利No.5,565,350；Zarling等人，PCT/US93/03868。因此，提供了在尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶基因中带有突变的诱变植物，其中所述突变增加尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶基因的表达或增加所编码的多肽的尿素转运、尿素分解或氨同化活性。

调节根发育

提供了用于调节植物中的根发育的方法。所谓“调节根发育”意指在与对照植物比较时植物根的发育的任何改变。根发育的这种改变包括但不限于：初生根的生长速率的改变、根鲜重、侧根和不定根形成的程度、维管系统、分生组织发育或径向扩张。

提供了用于调节植物中的根发育的方法。该方法包括调节植物中的尿素转运蛋白、尿素酶和谷氨酰胺合成酶多肽的水平和/或活性。在一种方法中，向植物提供本公开的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶序列。在另一种方法中，通过将包含本公开的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶核苷酸序列的多核苷酸引入植物中，表达尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶序列并从而修饰根发育，来提供尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶核苷酸序列。在其他方法中，引入植物中的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶核苷酸构建体被稳定掺入到植物的基因组中。

在其他方法中，通过改变植物中的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶多肽的水平或活性，来调节根发育。当与对照植物比较时，尿素转运、尿素分解或氨同化活性的改变可导致至少一种或多种如下对根发育的变更，包括但不限于：较大的根分生组织、根生长增加、增强的径向扩张、增强的维管系统、增加的根分支、更多的不定根和/或鲜根重的增加。

本文所用的“根生长”涵盖单子叶植物和双子叶植物中构成根系的不同部分在根系发育的不同阶段的生长的所有方面。应当理解，根生长增强可由其各部分(包括初生根、侧根、不定根等)中的一者或多者的生长增强引起。

测量根系中的这种发育改变的方法是本领域已知的。参见例如美国专利申请公布No.2003/0074698和Werner，etal.，(2001)PNAS18：10487-10492(Werner等人，2001年，《美国国家科学院院刊》，第18卷，第10487-10492页)，将这两篇文献以引用方式并入本文。

如上面所论述的，技术人员将会认识用于调节植物中的根发育的适当启动子。用于这个实施例的示例性启动子包括组成型启动子和根优选的启动子。示例性的根优选的启动子已在本文别处公开。

通过调节尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶多肽的活性和/或水平来刺激根生长并增加根质量，这也可用于改善植物的抗倒伏性。术语“耐倒伏性”或“抗倒伏性”指植物使其自身固定至土壤的能力。对于具有竖立或半竖立生长习性的植物，该术语还指在不利(环境)条件下保持直立位置的能力。该性状涉及根系的尺寸、深度和形态。此外，通过调节尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶多肽的水平和/或活性来刺激根生长和增加根质量，这也可用于促进外植体的体外繁殖。

此外，由于增加的尿素转运、尿素分解或氨同化活性的水平和/或活性引起的较高的根生物量产量对产量具有直接的影响以及对由根细胞或转基因根细胞或所述转基因根细胞的细胞培养物产生的化合物的产生具有间接的影响。在根培养物中产生的关注化合物的一个实例是紫草素(shikonin)，其产量可通过所述方法有利地增强。

因此，本公开还提供了与对照植物的根发育相比较时具有受调节的根发育的植物。在一些实施例中，本公开的植物具有增加的本公开的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶多肽的水平/活性，并且具有增加的根生长和/或根生物量。在其他实施例中，这种植物在其基因组中稳定掺入了包含本公开的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶核苷酸序列的核酸分子，该序列有效连接至能驱动在该植物细胞中的表达的启动子。

调节苗和叶发育

还提供了用于调节植物中的苗和叶发育的方法。所谓“调节苗和/或叶发育”其意指植物苗和/或叶的发育的任何改变。苗和/或叶发育中的这种改变包括但不限于在苗分生组织发育方面、在叶数目、叶尺寸、叶和茎维管系统、节间长度和叶衰老方面的改变。本文所用的“叶发育”和“苗发育”涵盖在单子叶植物和双子叶植物中分别构成叶系统和苗系统的不同部分在这些系统发育的不同阶段中的生长的所有方面。测量苗和叶系统中的这种发育改变的方法是本领域已知的。参见例如Werner，atal.，(2001)PNAS98：10487-10492(Werner等人，2001年，《美国国家科学院院刊》，第98卷，第10487-10492页)和美国专利申请公布No.2003/0074698，将这两篇文献中的每一个以引用方式并入本文。

用于调节植物中的苗和/或叶发育的方法包括调节本公开的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶多肽的活性和/或水平。在一个实施例中，提供了本公开的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶序列。在其他实施例中，可通过将包含本公开的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶核苷酸序列的多核苷酸引入植物中，表达尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶序列并从而修饰苗和/或叶发育，来提供尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶核苷酸序列。在其他实施例中，引入植物中的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶核苷酸构建体被稳定掺入到植物的基因组中。

在具体实施例中，通过增加植物中的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶多肽的水平和/或活性来调节苗或叶发育。当与对照植物比较时，尿素转运、尿素分解或氨同化活性的增加可导致至少一种或多种如下苗和/或叶发育的改变，包括但不限于叶数目、叶表面、维管、节间长度和叶衰老的改变。

如上面所论述的，技术人员将会认识到用于调节植物的苗和叶发育的适当启动子。用于这个实施例的示例性启动子包括组成型启动子、苗优选的启动子、苗分生组织优选的启动子和叶优选的启动子。示例性的启动子已在本文别处公开。

如上所述，调节植物中的尿素转运、尿素分解或氨同化活性能够调节根生长和苗生长两者。因而，本公开还提供了用于改变根/苗比的方法。

因此，本公开还提供了与对照植物相比较时具有受调节的苗和/或叶发育的植物。在一些实施例中，本公开的植物具有增加的本公开的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶多肽的水平/活性。在其他实施例中，本公开的植物具有减小的本公开的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶多肽的水平/活性。

调节生殖组织发育

提供了用于调节生殖组织发育的方法。在一个实施例中，提供了用于调节植物中的花发育的方法。所谓“调节花发育”意指与其中尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶多肽的活性或水平还未受调节的对照植物相比，植物的生殖组织的结构的任何改变。“调节花发育”还包括与其中尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶多肽的活性或水平还未受调节的对照植物相比，植物的生殖组织的发育的时间安排的任何改变(即花发育的时间安排的延迟或加速)。宏观改变可包括在环境胁迫时的如下变化：生殖器官的大小、形状、数目或位置，这些结构形成的发育时间周期，或者维持或发展经过开花过程的能力。微观改变可包括构成生殖器官的细胞的类型或形状的改变。

用于调节植物中的花发育的方法包括调节植物中的尿素转运、尿素分解或氨同化活性。在一种方法中，提供了本公开的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶序列。可通过将包含本公开的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶核苷酸序列的多核苷酸引入植物中，表达尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶序列并从而修饰花发育，来提供尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶核苷酸序列。在其他实施例中，引入植物中的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶核苷酸构建体被稳定掺入到植物的基因组中。

在具体方法中，通过增加植物中的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶多肽的水平或活性，来调节花发育。当与对照植物比较时，尿素转运、尿素分解或氨同化活性的增加可导致至少一种或多种如下的花发育改变，包括但不限于：开花延迟、花数目减少、部分雄性不育和种组减少。诱导开花延迟或抑制开花可用于增强诸如苜蓿之类的饲料作物的产量。用于测量花发育的这种发育改变的方法是本领域已知的。参见例如Mouradov，etal.，(2002)ThePlantCellS111-S130(Mouradov等人，2002年，《植物细胞》，第S111-S130页)，将该献以引用的方式并入本文。

如上面所论述的，技术人员将会认识用于调节植物中的花发育的适当启动子。用于该实施例的示例性启动子包括组成型启动子、诱导型启动子、苗优选的启动子、花序优选的启动子。

还提供了使用本公开的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶序列来提高氮利用效率的方法。该方法包括减小或增加植物或植物部分(诸如根、苗、表皮细胞等)中的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶序列的活性。

如上所述，技术人员将认识到用于调节GS表达的适当启动子。该实施例的示例性启动子包括组成型启动子、诱导型启动子以及根或苗或叶优选的启动子。

尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶启动子多核苷酸的使用方法

当与DNA构建体装配使得启动子序列有效连接至包含所关注的多核苷酸的核苷酸序列时，包含本公开中所公开的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶启动子的多核苷酸以及其变体和片段可用于任何宿主细胞(优选植物细胞)的遗传操作。这样，在表达盒中提供了本公开的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶启动子多核苷酸，以及用于在所关注的宿主细胞中表达的所关注的多核苷酸序列。本公开的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶启动子序列在多种组织中表达，因此该启动子序列可用于调节所关注的多核苷酸的时间和/或空间表达。

合成的杂合启动子区是本领域已知的。这种区域包含有效连接至另一多核苷酸的启动子元件的一多核苷酸的上游启动子元件。在本公开的实施例中，通过合成的杂合启动子来控制异源序列表达，该合成的杂合启动子包含有效连接至来自异源启动子的上游启动子元件的本公开的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶启动子序列或其变体或片段。涉及植物防御系统的上游启动子元件已被鉴定并可用于产生合成启动子。参见例如Rushton，etal.，(1998)Curr.Opin.PlantBiol.1：311-315(Rushton等人，1998年，《植物生物学当代进展》，第1卷，第311-315页)。或者，合成的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶启动子序列可以包含存在于尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶启动子序列中的上游启动子元件的副本。

已经认识到，本公开的启动子序列可以与其天然的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶编码序列一起使用。可以使用包含与其天然的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶基因有效连接的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶启动子的DNA构建体来转化任何所关注的植物，从而提供所需的表型改变，诸如调节根、苗、叶、花和胚发育、胁迫耐受性以及本文别处所述的任何其他表型。

本文所公开的启动子核苷酸序列和方法可用于调控任何异源核苷酸序列在宿主植物中的表达以便改变植物表型。有多种表型变化是值得关注的，包括修饰植物中的脂肪酸组成、变更植物的氨基酸含量、变更植物的病原体防御机制等等。这些结果可通过在植物中表达异源产物或增加内源产物的表达来实现。或者，这些结果可通过在植物中减少一种或多种内源产物(特别是酶或辅因子)的表达来实现。这些改变导致转化植物的表型变化。

所关注的基因反映了作物开发的参与者的商业市场和利益。所关注的作物和市场在变化，并且随着发展中国家面向世界市场，也将出现新的作物和技术。此外，随着对诸如产量和杂种优势的农学性状和特征的理解的增加，对用于转化的基因的选择将会相应变化。所关注的基因的大体类别包括例如涉及信息的那些基因(诸如GS)、涉及通信的那些基因(诸如激酶)和涉及看家的那些基因(诸如热休克蛋白)。转基因的更具体类别例如包括编码对农学、昆虫抗性、病害抗性、除草剂抗性、不育性、谷粒特征和商业产品重要的性状的基因。一般而言，所关注基因包括涉及油脂、淀粉、碳水化合物或营养物质代谢的那些以及影响仁大小、蔗糖载量等的那些。

在某些实施例中，可将本公开的核酸序列与所关注的其他多核苷酸序列联合(“堆叠”)使用，以便产生具有所需表型的植物。生成的组合可包括所关注的多核苷酸中的任何一者或多者的多个拷贝。本公开的多核苷酸可以与任何基因或基因的组合堆叠以产生具有多种所需的性状组合的植物，所述性状包括但不限于动物饲料所需的性状诸如高油基因(例如美国专利No.6,232,529)；平衡的氨基酸(例如hordothionins(美国专利No.5,990,389、5,885,801、5,885,802和5,703,409))；大麦高赖氨酸(Williamson，etal.，(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106(Williamson等人，1987年，《欧洲生物化学杂志》，第165卷，第99-106页)和WO1998/20122)以及高甲硫氨酸蛋白(Pedersen，etal.，(1986)J.Biol.Chem.261：6279(Pedersen等人，1986年，《生物化学杂志》，第261卷，第6279页)；Kirihara，etal.，(1988)Gene71：359(Kirihara等人，1988年，《(基因》，第71卷，第359页)和Musumura，etal.，(1989)PlantMol.Biol.12：123(Musumura等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第123页))、提高了的消化性(例如经修饰贮藏蛋白(于2001年11月7日提交的美国专利申请No.10/053,410)和硫氧还蛋白(于2001年12月3日提交的美国专利申请No.10/005,429))，将上述公开内容以引用的方式并入本文。本公开的多核苷酸也可与抗虫、抗病或抗除草剂所需的性状堆叠(例如苏云金芽孢杆菌毒性蛋白(美国专利No.5,366,892、5,747,450、5,737,514、5723,756、5,593,881；Geiser，etal.，(1986)Gene48：109(Geiser等人，1986年，《基因》，第48卷，第109页))；凝集素(VanDamme，etal.，(1994)PlantMol.Biol.24：825(VanDamme等人，1994年，《植物分子生物学》，第24卷，第825页))；伏马毒素解毒基因(美国专利No.5,792,931)；无毒基因和抗病基因(Jones，etal.，(1994)Science266：789(Jones等人，1994年，《科学》，第266卷，第789页)；Martin，etal.，(1993)Science262：1432(Martin等人，1993年，《科学》，第262卷，第1432页)；Mindrinos，etal.，(1994)Cell78：1089(Mindrinos等人，1994年，《细胞》，第78卷，第1089页))；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合成酶(ALS)突变体，例如S4和/或Hra突变；谷氨酰胺合成酶抑制剂诸如草胺膦或basta(例如bar基因)和草甘磷抗性(EPSPS基因))以及加工或处理产品所需的性状诸如高油(例如美国专利No.6,232,529)；改性油(例如脂肪酸去饱和酶基因(美国专利No.5,952,544；WO1994/11516))；改性淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合成酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉去分支酶(SDBE))和聚合物或生物塑料(例如美国专利No.5,602,321；β-酮基硫解酶、聚羟基丁酸合酶和乙酰乙酰基-CoA还原酶(Schubert，etal.，(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847(Schubert等人，1988年，《细菌学杂志》，第170卷，第5837-5847页))有利于聚羟基链烷酸酯(PHA)的表达)，上述公开内容以引用的方式并入本文。还可以将本公开的多核苷酸与影响诸如雄性不育(例如参见美国专利No.5,583,210)、茎秆强度、开花时间之类的农艺性状或者诸如细胞周期调控或基因靶向(例如WO1999/61619、WO2000/17364、WO1999/25821)之类的转化技术性状的多核苷酸组合，以上公开内容以引用方式并入本文。

在一个实施例中，所关注的序列可改善植物生长和/或作物产量。例如，所关注的序列包括可导致初生根系或侧根系改善的农学上重要的基因。这类基因包括但不限于营养物质/水转运蛋白和生长诱导。这类基因的例子包括但不限于玉蜀黍质膜H⁺ATP酶(MHA2)(Frias，etal.，(1996)PlantCell8：1533-44(Frias等人，1996年，《植物细胞》，第8卷，第1533-1544页))；AKT1，即拟南芥中钾吸收组织的组分(Spalding，etal.，(1999)JGenPhysiol113：909-18(Spalding等人，1999年，《普通生理学杂志》，第113卷，第909-918页))；RML基因，其在根尖细胞中激活细胞分裂周期(Cheng，etal.，(1995)PlantPhysiol108：881(Cheng等人，1995年，《植物生理学》，第108卷，第881页))；玉蜀黍谷氨酰胺合成酶基因(Sukanya，etal.，(1994)PlantMolBiol26：1935-46(Sukanya等人，1994年，《植物分子生物学》，第26卷，第1935-1946页))和血红蛋白(Duff，etal.，(1997)J.Biol.Chem27：16749-16752(Duff等人，1997年，《生物化学杂志》，第27卷，第16749-16752页)；Arredondo-Peter，etal.，(1997)PlantPhysiol.115：1259-1266(Arredondo-Peter等人，1997年，《植物生理学》，第115卷，第1259-1266页)；Arredondo-Peter，etal.，(1997)PlantPhysiol114：493-500(Arredondo-Peter等人，1997年，《植物生理学》，第114卷，第493-500页)以及其中引用的参考文献)。所关注的序列还可用于表达负面影响根发育的基因的有义核苷酸序列。

另外，除了使用传统的育种方法之外，还可用遗传法对农艺上重要的性状诸如油含量、淀粉含量和蛋白质含量进行改变。修饰包括提高油酸、饱和油和不饱和油的含量，提高赖氨酸和硫的水平，提供必需氨基酸以及修饰淀粉。美国专利No.5,703,049、5,885,801、5,885,802和5,990,389中描述了Hordothionin蛋白修饰，将这些文献以引用的方式并入本文。另一个例子是美国专利No.5,850,016中所描述的由大豆2S白蛋白编码的富赖氨酸和/或富硫种子蛋白，以及Williamson，etal.，(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106(Williamson等人，1987年，《欧洲生物化学杂志》，第165卷，第99-106页)中所述的来自大麦的胰凝乳蛋白酶抑制剂，将所述专利和文献的公开内容以引用方式并入本文。

可通过定点诱变产生编码序列的衍生物来增加预选氨基酸在所编码的多肽中的水平。例如，编码大麦高赖氨酸多肽的基因(BHL)源于大麦胰凝乳蛋白酶抑制剂，参见于1996年11月1日提交的美国专利申请No.08/740,682和WO1998/20133，这两篇文献的公开内容以引用的方式并入本文。其他蛋白质包括富含甲硫氨酸的植物蛋白，诸如来自葵花籽(Lilley，etal.，(1989)ProceedingsoftheWorldCongressonVegetableProteinUtilizationinHumanFoodsandAnimalFeedstuffs，ed.Applewhite(AmericanOilChemistsSociety，Champaign，Illinois)，pp.497-502(Lilley等人，1989年，植物蛋白在人类食品和动物饲料中的利用世界大会会议录，Applewhite编辑(美国油类化学家学会，伊利诺伊州香巴尼市)，第497-502页))；以引用方式并入本文)；玉米(Pedersen，etal.，(1986)J.Biol.Chem.261：6279(Pedersen等人，1986年，《生物化学杂志》，第261卷，第6279页)；Kirihara，etal.，(1988)Gene71：359(Kirihara等人，1988年，《基因》，第71卷，第359页)；这两篇文献均以引用方式并入本文)和水稻(Musumura，etal.，(1989)PlantMol.Biol.12：123(Musumura等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第123页)，将其以引用方式并入本文)。其他农学上重要的基因编码胶乳、Floury2、生长因子、种子贮藏因子和转录因子。

昆虫抗性基因可编码针对会导致产量大跌的害虫(诸如根虫、切根虫、欧洲玉米螟等)的抗性。这类基因包括例如苏云金芽孢杆菌毒性蛋白基因(美国专利No.5,366,892、5,747,450、5,736,514、5,723,756、5,593,881和Geiser，etal.，(1986)Gene48：109(Geiser等人，1986年，《基因》，第48卷，第109页))等等。

编码抗病性状的基因包括解毒基因，例如对抗伏马毒素的基因(美国专利No.5,792,931)；无毒(avr)和抗病性(R)基因(Jones，etal.，(1994)Science266：789(Jones等人，1994年，《科学》，第266卷，第789页)；Martin，etal.，(1993)Science262：1432(Martin等人，1993年，《科学》，第262卷，第1432页)以及Mindrinos，etal.，(1994)Cell78：1089(Mindrinos等人，1994年，《细胞》，第78卷，第1089页))等等。

除草剂抗性性状可包括编码针对起到抑制乙酰乳酸合酶(ALS)作用的除草剂(特别是磺酰脲类除草剂)的抗性的基因(例如含有导致这种抗性的突变，特别是S4和/或Hra突变的乙酰乳酸合酶(ALS)基因)、编码针对起到抑制谷氨酰胺合酶作用的除草剂诸如草胺膦或basta的抗性的基因(例如bar基因)，或本领域已知的其他这类基因。bar基因编码针对除草剂basta的抗性，nptII基因编码针对抗生素卡那霉素和遗传霉素的抗性，ALS基因突变编码针对除草剂氯磺隆的抗性。

不育基因也可编码在表达盒中，为物理去雄提供另选方案。可以这类方式使用的基因的例子包括雄性组织优选的基因和具有雄性不育表型的基因诸如QM，其在美国专利No.5,583,210中进行了描述。其他基因包括激酶和编码对雄性或雌性配子体发育有毒的化合物的那些。

谷粒的质量反映在诸如以下的性状：饱和及不饱和油的含量和类型、必需氨基酸的质量和数量、纤维素的含量。在玉米中，修饰的hordothionin蛋白在美国专利No.5,703,049、5,885,801、5,885,802和5,990,389中进行了描述。

还可在(一种或多种)基因上编码商业性状，所述基因可增加例如用于乙醇生产的淀粉，或提供蛋白质的表达。转化植物的另一重要的商业用途是生产聚合物和生物塑料，诸如在美国专利No.5,602,321中描述的。诸如β-酮硫解酶、PHB酶(聚羟基丁酸酯合酶)和乙酰乙酰辅酶A还原酶之类的基因(参见Schubert，etal.，(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847(Schubert等人，1988年，《细菌学杂志》，第170卷，第5837-5847页))可促进聚羟基链烷酸酯(PHA)的表达。

外源产物包括植物酶和产物以及来自包括原核生物和其他真核生物在内的其他来源的那些。这类产物包括酶、辅因子、激素等等。可增加蛋白质，特别是具有改善的氨基酸分布以改善植物营养价值的修饰蛋白质的水平。这可通过表达具有提高的氨基酸含量的这类蛋白质来实现。

参考如下非限制性实例可更好地理解本公开。本领域技术人员将会理解，可以在不脱离本文所公开的并受权利要求书保护的发明的精神和范围的情况下实施本公开的其他实施例。

实例

实例1：来自玉蜀黍和来自不同微生物和低级植物来源的可能的尿素转运蛋白的鉴定和进化分析

已在从细菌到高级真核生物(诸如植物)的多个物种中鉴定出具有使尿素在整个生物膜上易位的能力的若干种类的蛋白质。鉴定出编码真核DUR3高亲和力尿素转运蛋白(SEQIDNO：1-187)、原核UREI尿素通道(SEQIDNO：188-193)，以及水通道蛋白样NIP/TIP/PIP蛋白质(SEQIDNO：194-223)的可能同系物的多个基因。可能的DUR3同系物的序列得自多种来源(主要集中于微生物、真菌和低级光合作用植物)，并且进行进化分析以检测转运蛋白之间的关系(图3)。还根据与尿素转运蛋白(诸如拟南芥和酿酒酵母Dur3蛋白质)的序列同源性鉴定出可能的玉蜀黍Dur3同系物(表2)。

表2

如对于尿素导入所涉及的转运蛋白期望的那样，对来自玉蜀黍幼苗的根组织的qPCR分析显示，当与在无氮环境中生长或在恒量硝酸盐环境中生长的植物进行比较时，通过转移到含有10mM尿素作为唯一氮源的生长培养基来诱导ZmDur3(图4)。

还使用公共可用数据库的BLAST搜索鉴定编码高度类似于幽门螺旋杆菌UREI尿素通道的蛋白质的基因，因为先前已证实该基因高效地转运尿素。还根据与幽门螺旋杆菌UreI蛋白质的同一性百分数生成一系列可能的UREI同系物(SEQIDNO：190-193，表3)以用于后续测试。

表3

已经证实，属于通道蛋白的水通道蛋白超级族的多个基因NIP、TIP和MIP具有在整个生物膜上转运尿素的能力。据信，这些相对低亲和力的尿素转运蛋白将定位于细胞的细胞质膜以及内部存储结构的膜(诸如液泡膜)两者，并且可能参与尿素摄取和从存储储存(storagesinks)中释放尿素。还使用专用和公共可用数据库的BLAST搜索鉴定编码高度类似于NIP、TIP和MIP低亲和力尿素通道的蛋白质的基因。还基于与玉蜀黍直系同源物的同一性百分数生成显示能够转运尿素的一系列蛋白质以及可能的同系物(SEQIDNO：194-223)以用于在酵母互补测定中测试以及用于生成转基因植物。

实例2：来自多种植物和微生物来源的可能的尿素酶基因的鉴定

尿素酶是尿素分解为可被细胞利用的氨所必需的酶。通过生物信息学方法鉴定出编码可能的尿素酶蛋白的多个基因(SEQIDNO：251-298)。分析主要集中于仅由一个转录物编码的单个子单元尿素酶蛋白，并且通过多种来源(主要是真菌或植物来源)获得48种已知或推定的尿素酶的序列。进行进化分析以检测已知和推定的尿素酶蛋白之间的关系(图4)。虽然预期尿素酶蛋白的单独表达足以增强植物中的尿素酶活性，但尿素酶与其相应的尿素酶辅助蛋白的共表达可以增强这种酶活性。在细菌中，这些蛋白质易于鉴定，因为它们落在作为尿素酶蛋白的相同操纵子内，并且据信它们参与适当的折叠、定位和到尿素酶中的金属结合。

实例3：来自玉蜀黍和其他来源的可能的GS基因的鉴定

一旦尿素被尿素酶分解为其组成部分，则释放的氨气主要通过谷氨酰胺合成酶的作用被同化为氨基酸。先前已鉴定出编码可能的谷氨酰胺合成酶蛋白的多个基因(参见2010年5月6日公布的美国专利申请No.12/607,089)。还可使用两种已知谷氨酰胺合成酶的序列：来自玉米和来自拟南芥的GS1-3亚型。还可使用来自植物或其他来源的其他GS1、GS2或GS3型谷氨酰胺合成酶蛋白以形成具有增强的利用尿素作为氮源的能力的转基因植物。

实例4：使用酵母dur3Δ突变体测试可能的尿素转运蛋白在体内的尿素转运能力的互补测定

将选自不同进化分化枝的编码多个DUR3同系物的基因(图3中以蓝色标记)以及已知的尿素转运蛋白拟南芥DUR3和幽门螺旋杆菌UREI合成到酵母表达载体中。将载体转化到dur3Δ酵母菌株中，该酵母菌株靶向缺失编码其高亲和力尿素转运蛋白的基因，并且通过组成型GPD启动子表达转基因。通过测定每种蛋白质在补充有1mM至20mM尿素作为唯一氮源的基本培养基上补足dur3Δ生长表型的能力，来测量每种蛋白质转运尿素的能力。至少两个生长互补测定的平均结果以及每种蛋白质作为尿素转运蛋白的功能的定性评估在下表4中列出。出于定性目的，得分“非常好”对应于在小于1mM尿素时互补，“好”对应于在1-3mM尿素时互补，“一般”对应于在3-5mM尿素时互补，“差”对应于在5-10mM尿素时互补，并且“无”对应于在浓度高于10mM尿素时无明显的互补。

表4

在最后一列中在后续的生物信息学分析中包括的转运蛋白(例如已验证的尿素转运蛋白，实验验证或通过文献综述确定)被进一步赋值为“是：功能性”，并且被选择作为具有极少或没有转运尿素能力的转运蛋白被赋值为“是：非功能性”。

虽然使用缺乏尿素转运蛋白的dur3Δ酵母细胞的生长测定来进行尿素转运蛋白的筛选，但还可以利用本领域已知的其他筛选方法。这包括但不限于，使用其他基因柔韧生物体(诸如细菌或培养的哺乳动物细胞)筛选在作为氮源的尿素上的生长。筛选多个体系(包括酵母、细菌、培养的哺乳动物细胞、爪蟾属(Xenopus)卵母细胞、膜囊)中的任一者中的尿素摄取(可能经反射性标记)，或以任何等同方式。

实例5：与DUR3同系物在整个细胞膜上转运尿素的能力相关的结构域、基序和残基

酵母中的初步筛选鉴定出若干具有将尿素转运到细胞中的能力的Dur3型蛋白质，并且对参与尿素转运的残基和结构域进行这些蛋白质以及先前表征的其他蛋白质的序列分析。然后将该理论应用于更严格的数据库分析，以发现具有提高的尿素转运能力的蛋白质。使用在万维网上以blocks.fhcrc.org存在的Block服务器的MOTIF程序来形成比对并鉴定来自多种DUR3同系物的先前在已公布的文献中示出或在筛选过程中鉴定为能够在整个生物膜上转运尿素的保守区。使用来自拟南芥、构巢曲霉、汉逊德巴利酵母、粳稻、三角褐指藻、安格斯毕赤酵母、酿酒酵母、江南卷柏和聚球藻属物种WH7805的DUR3同系物的蛋白质序列来形成比对并鉴定保守区(表5)。

表5

将这些区段模制到使用ClustalW2多序列比对程序创建的比对文件上，并鉴定最初用于限定所述区段的所有序列中完全保守的氨基酸残基。使用这些保守残基作为模板，在电脑中进行二次筛选，以鉴定嗜热地芽胞杆菌或耻垢分枝杆菌序列的任一者中的非保守的氨基酸残基的子集(两者均表明在互补测定中几乎没有或没有转运尿素的能力)。已验证的转运蛋白中的高度保守的以及两种非功能性尿素转运蛋白的任一者中的非保守的残基用于形成“尿素特异性”基序，据预测该基序对体内转运尿素的能力具有较大的积极影响。图6示出了对于区段1和区段2的这种分析的例子，其中转运蛋白的比对以ClustalW格式示出，并且图出了用于限定尿素特异性基序的残基，该残基在功能性转运蛋白中为保守的并且在至少一种非功能性转运蛋白中为非保守的。鉴定出的六个尿素特异性基序示于该应用中(SEQIDNO)。使用尿素特异性基序重新分析图3所示推定的DUR3型尿素转运蛋白的初始列表，并且选择在所有这些残基中保守的蛋白质以用于合成并进一步筛选(SEQIDNO：315-321)。

X射线结晶学证实，蛋白质的SSF家族共有显著保守的转运蛋白核心，该核心含有5个跨膜(TM)螺旋的反向重复序列(图7A和图7B)。TM1-5和6-10的伪二重对称关系允许转运蛋白经历从面向外到封闭最后到面向内的构象循环，即在转运蛋白的中心处具有单个底物结合位点的典型的火箭开关或交替进入机制(图7C)。这些转运蛋白结构中的另一个不常见但保守的特征是，TM1螺旋及其对称配对物TM6在跨膜结构域的中部是退绕的或“扭结的”。因此，破坏的螺旋提供足够的主链羰基和酰胺基，以有利于识别通过氢键进入的底物。TM1和TM6中的这些卷绕残基与TM3和TM8的中间部分结合构成底物结合位点。

在具有已知3D结构的蛋白质中，酿酒酵母Dur3(Sc_Dur3)序列与来自副溶血性弧菌的钠/半乳糖转运蛋白(vSGLT、PDB：2xq2，文献2)最佳匹配，其边缘序列同一性为约22％。为了证实该匹配的重要性，采用PSI-Blast(位置特异性迭代或分布Blast)搜索包含具有已知结构的swiss-prot和SSF转运蛋白序列的新数据集。第二轮搜索中的Sc_Dur3和vSGLT比对产生了约1e-69的显著e值。TMHMM和其他跨膜螺旋预测工具显示，Sc-Dur3具有15个跨膜螺旋，所述螺旋对于形成同向转运体核心结构域绰绰有余，其中可能形成外围结构的额外螺旋对于转运活性无关紧要，但在蛋白质调控方面可能发挥功能作用。使用序列/结构比对和TM螺旋预测，我们已经鉴定了10个核心跨膜螺旋和推定的尿素结合序列基序。还通过使Sc-Dur3序列螺旋穿过vSGLT结构构建10个TM核心结构域的3D膜嵌入拓扑结构(图7)。该模型显示，推定的结合位点在蛋白质的中心，这表明TM1、TM3、TM6和TM8的中间部分的蛋白质基序对于尿素识别是重要的，而TM2、TM4、TM5、TM7、TM9和TM10在形成支架时可能发挥结构作用，从而在尿素摄取过程中实现构象循环。表6中限定了模制到青霉菌属Dur3蛋白质上的这些跨膜结构域的近似位置。限定了所有15个TM螺旋以及10个核心跨膜结构域(标记为cTM1-cTM10)。每个跨膜结构域的建议功能也在表中给出。

表6

如图8和表6所示，该模型的有效性还通过产黄青霉Dur3上的定点诱变得以支撑。I180残基位于cTM4中间并且可能与质膜相互作用。在已验证的Dur3型尿素转运蛋白中，该位置为保守的并且被疏水性残基(诸如I、L和V)(在图8中以虚线椭圆标记)占据。I180到天冬氨酸(D)的突变引入亲水性带电残基，这可能彻底破坏转运蛋白的结构完整性。与该假设一致，I180-＞D突变体在其转运尿素的能力方面显示出明显的缺陷(表7)。W72(在图8中以虚线椭圆标记)靠近cTM1的退绕区域，并且可能参与尿素结合。W72到丙氨酸(A)的突变导致使尿素进入细胞的能力变弱。突变的残基均落在前述尿素转运蛋白的N端半部中的保守区1和2中或附近。第一区段覆盖TM2和TM3之间的蛋白质基序。已经显示，该螺旋间基序形成螺旋并将其自身从细胞外侧插入到中心底物结合腔中，从而可能用作调节底物进入的入口门。第二区段主要由TM4和TM5组成(图8)。根据3D模型，其可能发挥结构作用并支持转运蛋白的构象灵活性。

表7

突变类型	氨基酸变化	对尿素摄取的影响
			尿素结合位点	W(72)→A	中等
结构性	I(180)→D	剧烈

实例6：测试新型尿素转运蛋白以高亲和力转运低水平尿素的能力

当土壤中的尿素水平因微生物和土壤固有尿素酶蛋白对肥料的分解而显著降低时，在某些条件下有效竞争低水平的尿素的能力将尤为重要。合成了通过生物信息学鉴定出的类似于高亲和力DUR3转运蛋白并且具有完全保守的所有尿素特异性残基的六种另外的新型尿素转运蛋白，并且测试了其补足dur3Δ酵母突变体的能力。在该分析中包括稻属DUR3作为阳性对照，因为先前已证实，其可救援酵母以及拟南芥属DUR3缺失突变体。来自多个互补测定的结果的汇总示于下表8中，并且定性得分类似于实例4中所述的那些。

表8

转运蛋白	得分(2次测定的平均值)	[尿素]支持的生长
			野生型/载体	非常好	＜1mM
dur3Δ/载体	无	＞10mM
			dur3Δ/阿舒囊霉属(Ashbya)DUR3	非常好	＜1mM
dur3Δ/Lachancea DUR3	非常好	＜1mM
			dur3Δ/稻属DUR3	一般	4-5mM
dur3Δ/青霉菌属DUR3	非常好	＜1mM
			dur3Δ/藓属(Physcomitrella)DUR3	差/无	＞10mM
dur3Δ/柄孢壳菌属(Podospora)DUR3	非常好	＜1mM
			dur3Δ/块菌属DUR3	好	1-2mM

随后在小于或等于500μM的相对较低的底物水平下筛选若干可能的尿素转运蛋白(在酵母生长测定中对于补足dur3Δ表型测试呈阳性)的调节尿素摄取的能力。与前述类似，在补充有50μM和500μM之间的尿素作为唯一氮源的培养基中进行酵母生长测定，并且在下表9中示出在所测试浓度中支持生长的尿素最低量的结果的汇总。

表9

转运蛋白	支持生长的最低[尿素]浓度
		dur3Δ/Lachancea DUR3	50μM
dur3Δ/青霉菌属DUR3	50μM
		dur3Δ/柄孢壳菌属DUR3	50μM
dur3Δ/卷柏属DUR3	50μM
		dur3Δ/块菌属DUR3	50μM
dur3Δ/乳杆菌属UREI	500μM

在表达在筛选过程中鉴定的若干尿素转运蛋白之一的dur3Δ酵母细胞中进行[¹⁴C]-尿素的摄取分析，基本上如前文所述，略有修改(Morel，etal.，FungalGeneticsandBiology，2008(Morel等人，《真菌遗传学与生物学》，2008年))。从图9看出，即使在低至10μM的细胞外浓度下并且在相对较短的4分钟时间内，许多转运蛋白仍显著增加细胞摄入的标记尿素的量。

实例7：拟南芥属和玉蜀黍转基因植物的表达/表型

使用模式生物体拟南芥来测试非天然尿素转运蛋白在植物中发挥作用的能力。使用最佳化以在拟南芥属中表达的多核苷酸来形成驱动在酵母筛选过程中鉴定的多种尿素转运蛋白的表达的载体，该载体含有多种启动子，包括内源性AtDur3(SEQIDNO：303)启动子或组成型35S启动子(SEQIDNO：304)。通过qPCR对来自这些转基因株系的RNA制剂进行分子表征，以确定每个转基因相对于eIF4g对照基因的表达，并且在分子分析之后鉴定出若干具有显著的转基因表达水平的株系。进行表达早前鉴定的多种尿素转运蛋白的实验，并且鉴定显著增强¹⁴C-标记的尿素的摄取以及在含有尿素作为唯一氮源的基本培养基上的生长的转运蛋白(图10和图12)。制备被设计用于ZmUBI、ZmRM2或ZmRCC3启动子(SEQIDNO：308、306和309)的转基因表达的构建体，并且使用先前确定的农杆菌介导的转化方案将所述构建体转化到Gaspé种质中。来自T₀的转基因表达已用于事件选择，并且对这些事件的一般生长和生殖参数进行评估。与空白对照相比，这些新鉴定出的尿素转运蛋白中的若干的过表达提高了多个生殖参数，包括穗体积和核仁数。将筛选增强的使用尿素作为氮源的能力的转基因植物。

为了测试转基因表达对拟南芥属植物在作为氮源的尿素上生长的过程中的性能的影响，使植物在基于琼脂糖的无菌无土系统中生长，并用如Murashige和Skoog所述的半强度盐、Gambourg维生素混合物、NiSO₄补充至1uM的最终浓度，并且尿素处于0.1μM和20μM之间的不同浓度。通过存在的黄色荧光蛋白(YFP)选择表达转基因的T₀植物，该黄色荧光蛋白也由转化载体编码，并且在进一步实验中使用不表达YFP的幼苗作为空白对照。产生T₁植物，并在接种到前述琼脂糖培养基之后的多个时间点，通过计算总叶面积和相对绿叶面积来分析这些植物的生长速率的改变，并将转基因平均参数与非转基因空白对照的相应平均参数进行比较。在比较多个生长参数之后，收获植物并(在分离各部分并在70℃下干燥70小时之后)确定根和苗总干重。还将对干燥组织进行研磨，并通过微量凯氏定氮法(micro-Kjeldahlmethod)测量总还原性N。将对转基因平均参数和非转基因对照物的平均参数进行比较。

为了测试转基因表达对玉蜀黍的植物性能的影响，通过监测[¹⁴-C]-标记尿素的摄取来评估转基因植物或来自这些转基因植物的根部分摄取的的尿素。如图11所示，过表达来自黑孢块菌(Tubermelanosporum)的尿素转运蛋白(SeqIDNo.244)的转基因植物显示出标记尿素的积聚的显著增加(p＜0.05)。使用类似于前述的[¹⁵-N]-标记尿素的类似测定还将用于确定植物从尿素获取N的能力。对于生长测定，植物将水培生长或在改性霍格兰溶液中的基于朦脱石的无土基质中生长，该溶液补充有尿素作为唯一氮源。还将计算用尿素作为氮源生长的植物(在分离各部分并且在70℃下干燥70小时之后)的根和苗总干重，并且将对干燥组织进行研磨，同样通过微量凯氏定氮法测量总还原性N。将对转基因平均参数和非转基因对照物的平均参数进行比较。

实例8：使用三个单独的表达盒进行尿素转运蛋白、尿素酶和谷氨酰胺合成酶的转基因表达

由于被植物细胞利用的尿素可受到尿素进入细胞、尿素在细胞中分解或尿素分解产物到可用形式的同化作用的限制，因此参与这些过程的任何组合的基因的堆叠将用于转基因植物。进行实验以测试共表达多种尿素转运蛋白与尿素酶基因以使尿素分解代谢的功效以及共表达多种尿素转运蛋白与谷氨酰胺合成酶以同化释放出的氨气(转基因叠堆)的功效。若干新型转运蛋白与尿素酶和谷氨酰胺合成酶的堆叠显著增加了植物在含有尿素作为氮源的基本培养基上的生长。产生被设计用于来自根优选的ZmRM2启动子(SEQIDNO：306)的转运蛋白表达的构建体，并将所述构建体转化到精良玉蜀黍种质中，其中ZmUrease和ZmGS1-3通过叶优选的ZmPEPC启动子(SEQIDNO：305)表达。还构建了用于多种转运蛋白以及通过35S(SEQIDNO：304)启动子表达的AtUrease和AtGS1-3的组成型表达的构建体，并使用农杆菌介导的转化方案将所述构建体转化到拟南芥属中。虽然这些是在植物中工程改造的基因叠堆的具体例子，但还可以使用尿素转运蛋白/通道与尿素酶基因和谷氨酰胺合成酶基因的任何启动子/基因组合。表10给出了还可以采用的一些可能的基因/启动子组合的列表。

表10

转基因	启动子类型
		高亲和力尿素转运蛋白	组成型(高、中或低)
低亲和力尿素通道	绿色组织特异性
		尿素酶	根优选的(中柱、皮质或硝酸盐诱导型)
谷氨酰胺合成酶	尿素诱导型
			硝酸盐诱导型
	干旱诱导型
			昼夜调控的
	保卫细胞优选的
			穗优选的
	茎优选的
			种子特异性(胚+糊粉、胚乳或果皮)

就玉蜀黍和拟南芥属而言，T₀事件的RNA表达分析将用于选择表达所有三个转基因的事件，并且将对来自这些植物的种子的一般生长参数进行评估以及筛选使用尿素作为氮源的能力增强的植物。还将使用产量的田间测试在精良杂交玉米中对这些构建体中的两个进行测试。通过监测[¹⁴-C]-标记尿素和/或[¹⁵-N]-标记尿素的摄取来对转基因叠堆摄取的尿素进行评估。将计算用尿素作为氮源生长的植物(在分离各部分并且在70℃下干燥70小时之后)的根和苗总干重，并且还将对干燥组织进行研磨，并通过微量凯氏定氮法测量总还原性N。将对转基因平均参数和非转基因对照物的平均参数进行比较。如实例7中所述，对拟南芥属转基因植物在作为氮源的尿素上生长的能力进行评估。将使用类似于先前由WitteandMedina-Escobar，AnalyticalBiochemistry，2001(Witte和Medina-Escobar，《分析生物化学》，2001年)报道的改进方案或等同方法评估转基因叠堆的尿素酶活性。按照先前由Kingdon，etal，Biochemistry，1968(Kingdon等人，《生物化学》，1968年)报道的或等同方法进行谷氨酰胺合成酶测定。在所有情况下，将对转基因平均参数与野生型植物或非转基因空白对照的任一者的平均参数进行比较。

实例9：用于增强叶的尿素摄取的参与尿素摄取和同化的基因的过表达

使用此前描述的表达单独的尿素转运蛋白或表达与尿素酶和谷氨酰胺合成酶堆叠的转运蛋白的玉蜀黍Gaspé转基因，对植物增强的摄取[¹⁵N]-标记尿素的能力进行测试，所述尿素以水溶液形式施加到叶上。这将使用类似于先前由Below，etal，AgronomyJournal，1985(Below等人，《农学杂志》，1985年)描述的方法完成。在叶面施加标记尿素之后，将收获多种组织，并通过使用质谱法确定每种组织中¹⁵N的浓度，来检测N的摄取和结合。将相对于用等量标记尿素同等处理的空白植物，对转基因植物对¹⁵N的摄取和结合进行评估。此外，还将确定总氮水平以及硝酸盐和游离氨基酸水平，因为先前已证实这些参数将在叶面施加尿素之后增加。

实例10：用于在广泛的细胞外尿素浓度范围内增加尿素摄取的高亲和力和低亲和力转运蛋白的堆叠和共表达

在现代农业实践中，通常在生长周期内以有限次数将尿素肥料施加于作物。这导致土壤中的尿素浓度可根据施加尿素的时间以及在此期间占主导的环境条件产生数量级的变化。能够从土壤提取稀有尿素的高亲和力转运蛋白以及在可用尿素过量时可增加尿素摄取的低亲和力通道的共表达将在广泛的浓度范围内增加摄取，从而无论土壤中的底物浓度如何，都允许通过转基因有效摄取尿素。此前在该专利中已给出了类似于已知的Dur3型高亲和力尿素转运蛋白以及较低亲和力UreI型尿素通道的新鉴定出的蛋白质的例子。用于测试来自高亲和力尿素转运蛋白的Dur3家族以及来自尿素通道蛋白的UreI家族两者的多个尿素转运蛋白的共表达的功效的实验尚在进行中，然而，类似的共表达叠堆可与具有不同的K_m和V_max值的转运蛋白的任何组合一起使用。已设计并形成被设计用于共表达来自组成型启动子和根优选的启动子两者的两种尿素转运蛋白的构建体(表11)。将这些构建体转化到拟南芥属和玉蜀黍Gaspé种质中。将评估阳性转基因事件的一般生长和生殖参数，并且筛选增强的使用尿素作为氮源的能力。将评估转基因植物在低和高细胞外尿素水平下增强尿素摄取的潜能，并且预期有意义事件将增加摄取以及在如图13所示生长培养基中的广泛尿素范围内的细胞的N状态。

表11

高亲和力转运蛋白	启动子	低亲和力通道	启动子
				卷柏属DUR3	35S(组成型)	螺杆菌属UREI	(组成型)
卷柏属DUR3	35S(组成型)	乳杆菌属UREI	(组成型)
				Lachancea DUR3	35S(组成型)	螺杆菌属UREI	(组成型)
Lachancea DUR3	35S(组成型)	乳杆菌属UREI	(组成型)
				青霉菌属DUR3	35S(组成型)	螺杆菌属UREI	(组成型)
青霉菌属DUR3	35S(组成型)	乳杆菌属UREI	(组成型)
				柄孢壳菌属DUR3	35S(组成型)	螺杆菌属UREI	(组成型)
柄孢壳菌属DUR3	35S(组成型)	乳杆菌属UREI	(组成型)
				块菌属DUR3	35S(组成型)	螺杆菌属UREI	(组成型)
块菌属DUR3	35S(组成型)	乳杆菌属UREI	(组成型)

实例11：使用农杆菌介导的转化来转化和再生转基因植物

对于用本公开的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶序列的有义序列对玉蜀黍进行农杆菌介导的转化，优选的是采用Zhao的方法(美国专利No.5,981,840和PCT专利公布WO1998/32326，所述专利的内容据此以引用的方式并入本文)。简而言之，从玉蜀黍分离出未成熟胚并使胚接触农杆菌的悬浮液，其中该细菌能够将尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶有义序列转移至该未成熟胚中的至少一者的至少一个细胞(步骤1：感染步骤)。在该步骤中，优选将未成熟胚浸入农杆菌悬浮液中用于开始接种。将胚与农杆菌共培养一段时间(步骤2：共培养步骤)。优选地，在感染步骤之后，将未成熟胚在固体培养基上培养。在这个共培养期之后，设想到任选的“静息”步骤。在这个静息步骤中，将胚在至少一种已知能抑制农杆菌生长的抗生素的存在下进行温育，不添加植物转化体的选择剂(步骤3：静息步骤)。优选将未成熟胚在固体培养基上与抗生素一起培养，但不加选择剂，用于消除农杆菌以及为了受感染细胞的静息期。接着，将经接种的胚在含有选择剂的培养基上进行培养，回收生长出的转化愈伤组织(步骤4：选择步骤)。优选地，将未成熟胚在固体培养基上与选择剂一起进行培养，从而导致转化细胞的选择性生长。然后将愈伤组织再生为植株(步骤5：再生步骤)，并优选将在选择性培养基上生长的愈伤组织在固体培养基上进行培养以再生出植株。针对组织发育的调节对植株进行监测并评分。

用质粒轰击来自温室供体植物的未成熟玉蜀黍胚，所述质粒含有有效连接至组成型或组织特异性启动子(Vilardell，etal.，(1990)PlantMolBiol14：423-432(Vilardell等人，1990年，《植物分子生物学》，第14卷，第423-432页))的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶序列和赋予针对除草剂双丙氨膦的抗性的选择性标记基因PAT。或者，该选择性标志物基因在单独的质粒上提供。如下进行转化。培养基配方见下文。

靶标组织的制备：

将穗去壳并在30％漂白剂加0.5％Micro去污剂中表面灭菌20分钟，然后用无菌水清洗两次。将未成熟胚切下，并以胚轴一侧朝下(盾片一侧朝上)放置，每板25个胚，在560Y培养基上放置4小时，然后在2.5cm靶区内排成一行准备进行轰击。

DNA的制备：

制备质粒载体，该质粒载体包含有效连接至泛素启动子的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶序列。使用如下的CaCl₂沉淀程序将该质粒DNA加上含有PAT选择性标记的质粒DNA沉淀于1.1μm(平均直径)的钨小球上：

100μl制备的钨粒子水溶液

10μlTrisEDTA缓冲液中的(1μg)DNA(1μg总DNA)

100μl2.5MCaCl₂

10μl0.1M亚精胺

将每种试剂依序加到钨粒子悬浮液，同时保持在复式管涡旋机上。将最终的混合物进行短暂超声处理，并且允许其在恒定漩涡混合下温育10分钟。在沉淀期后，将各管进行短暂离心，除去液体，用500ml100％乙醇洗涤，离心30秒。再次除去液体，将105μl100％乙醇加至最终的钨粒子小球。对于粒子枪轰击，将钨/DNA粒子进行短暂超声处理，并取10μl点滴到每个巨载体(macrocarrier)的中央上，让其干燥约2分钟后进行轰击。

粒子枪处理：

将样品板在粒子枪#HE34-1或#HE34-2中以水平#4进行轰击。所有样品接受650PSI的单次射击，每管的制备粒子/DNA共取十个等分试样。

后续处理：

在轰击之后，将胚保持在560Y培养基上2天，然后转移到含有3mg/L双丙氨膦的560R选择培养基，每隔2星期进行分培。在进行大约10个星期的选择后，将抗选择的愈伤组织克隆转移到288J培养基以引发植物再生。在体细胞胚成熟后(2-4个星期)，将发育良好的体细胞胚转移到培养基中进行发芽并转移到有光照的培养室。大约7-10天后，将发育的小植株转移到管中的272V无激素培养基7-10天，直到小植株完全长好。然后将植株转移到含有盆栽土的insertsinflats(相当于2.5英寸盆)，在生长室中生长1星期，随后在温室中再生长1-2个星期，然后转移到典型的600个盆(1.6加仑)并生长至成熟。针对增加的耐旱性对植株进行检测和评分。测量改善的耐旱性的测定法是本领域的常规工作，包括例如当与干旱条件下的对照玉蜀黍植物比较时在相同环境条件下的核仁-抽穗能力产量增加。作为另一种选择，可针对分生组织发育的调节(即穗上小穗形成的降低)监测转化植株。参见例如Bruce，etal.，(2002)JournalofExperimentalBotany53：1-13(Bruce等人，2002年，《实验植物学杂志》，第53卷，第1-13页)。

轰击法和培养基：

轰击培养基(560Y)包含4.0g/lN6基础盐(SIGMAC-1416)、1.0mlEriksson维生素混合物(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺、120.0g/l蔗糖、1.0mg/l2，4-D和288g/lL-脯氨酸(用KOH调至pH5.8后用去离子水定容)；2.0g/l(在去离子水定容后加入)；及8.5mg/L硝酸银(将培养基灭菌并冷却到室温后加入)。选择培养基(560R)包含4.0g/lN6基础盐(SIGMAC-1416)、1.0ml/lEriksson维生素混合物(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺、30.0g/l蔗糖和2.0mg/l2，4-D(用KOH调至pH5.8后用去离子水定容)；3.0g/l(在用去离子水定容后加入)和0.85mg/l硝酸银和3.0mg/l双丙氨磷(均在培养基灭菌并冷却到室温后加入)。

植物再生培养基(288J)包含4.3g/lMS盐(GIBCO11117-074)、5.0ml/lMS维生素母液(0.100g烟酸、0.02g/l盐酸硫胺、0.10g/l盐酸吡哆辛和0.40g/l甘氨酸，用精制去离子水定容)(MurashigeandSkoog，(1962)Physiol.Plant.15：473(Murashige和Skoog，1962年，《植物生理学》，第15卷，第473页))、100mg/l肌醇、0.5mg/l玉米素、60g/l蔗糖和1.0ml/l0.1mM脱落酸(调至pH5.6后用精制去离子水定容)；3.0g/l(在用去离子水定容后加入)和1.0mg/l吲哚乙酸和3.0mg/l双丙氨磷(均在培养基灭菌并冷却到60℃后加入)。无激素培养基(272V)包含4.3g/lMS盐(GIBCO11117-074)、5.0ml/lMS维生素母液(0.100g/l烟酸、0.02g/l盐酸硫胺素、0.10g/l盐酸吡哆辛和0.40g/l甘氨酸，用精炼去离子水定容)、0.1g/l肌醇和40.0g/l蔗糖(在调至pH5.6后用精炼去离子水定容)和6g/lbacto^TM琼脂(在用精炼去离子水定容后加入)，灭菌并冷却至60℃。

实例12：大豆胚转化

如下所述，用含有有效连接至泛素启动子的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶有义序列的质粒轰击大豆胚。为诱导体细胞胚，将从大豆栽培种A2872的经表面灭菌的不成熟种子切取的3-5mm长的子叶在适当的琼脂培养基中，在26℃下在光照或黑暗中培养六到十周。然后切取产生次级胚的体细胞胚并置于合适的液体培养基中。在反复选择作为早期球状阶段的胚繁殖的体细胞胚的簇之后，如下所述维持悬浮物。

大豆胚发生悬浮培养物可在旋转振荡器上在150rpm、26℃下维持在35ml液体培养基中，以荧光灯按16∶8小时白日/黑夜时间表进行维持。每隔两周，通过将大约35mg的组织接种到35ml的液体培养基中，将培养物进行传代培养。

可然后通过粒子枪轰击方法(Klein，etal.，(1987)Nature(London)327：70-73(Klein等人，1987年，《自然》(伦敦)，第327卷，第70-73页)、美国专利No.4,945,050)转化大豆胚发生悬浮培养物。可使用DuPontBiolisticPDS1000/HE仪器(氦改型)进行这些转化。

可用于促进大豆转化的选择性标记基因，是由来自花椰菜花叶病毒的35S启动子(Odell，etal.，(1985)Nature313：810-812(Odell等人，1985年，《自然》，第313卷，第810-812页))、来自质粒pJR225(来自大肠杆菌；Gritz，etal.，(1983)Gene25：179-188(Gritz等人，1983年，《基因》，第25卷，第179-188页))和来自根瘤农杆菌的Ti质粒的T-DNA的胭脂碱合酶基因的3′区。包含有效连接至泛素启动子的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶有义序列的表达盒可作为限制性片段分离。然后可将这个片段插入携带标志物基因的载体的独特限制性酶切位点中。

向50μL的60mg/ml1μm金粒子悬浮液加入(按顺序)：5μlDNA(1μg/μl)、20μl亚精胺(0.1M)和50μlCaCl₂(2.5M)。然后将粒子制备物搅动三分钟，在微量离心机中离心10秒，移除上清液。然后将DNA包被的粒子在400μl70％乙醇中洗涤一次并再悬浮于40μl无水乙醇中。可将DNA/粒子悬浮液超声处理三次，每次1秒。然后将五微升DNA包被的金粒子加载至每个巨载体盘上。

将大约300-400mg两周龄悬浮培养物置于空的60X15mm培养皿中，用移液管将残余液体从组织移除。对于每次转化实验，通常轰击大约5-10个组织平板。将膜破裂压力设定为1100psi，将室抽至28英寸汞柱的真空。将组织距离阻滞屏(retainingscreen)大约3.5英寸放置，轰击三次。轰击后，可将组织一分为二并放回进液体中，如上所述进行培养。

轰击后五至七天，可将液体培养基与新鲜培养基交换，轰击后七至十二天与含有50mg/ml潮霉素的新鲜培养基交换。可每周更新这个选择培养基。轰击后七至八周，可观察到绿色的转化组织从未转化的坏死的胚发生簇长出来。移出分离的绿色组织并接种进单独的烧瓶中以产生新的、克隆繁殖的、转化的胚发生悬浮培养物。可将每一新品系当作独立的转化事件。然后可将这些悬浮物传代培养，并作为未成熟胚簇维持或者通过使各单独体细胞胚成熟和发芽而再生成完整植株。

实例13：向日葵分生组织转化

如下所述，用含有有效连接至泛素启动子的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶有义序列的表达盒转化向日葵分生组织(还可参见欧洲专利No.0486233，其以引用方式并入本文，以及Malone-Schoneberg，etal.，(1994)PlantScience103：199-207(Malone-Schoneberg等人，1994年，《植物科学》，第103卷，第199-207页))。

实例14：尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶序列的变体

A.不改变所编码的氨基酸序列的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶的变体核苷酸序列

使用尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶核苷酸序列产生变体核苷酸序列，所述变体核苷酸序列所具有的开放阅读框核苷酸序列与相应的SEQIDNO的起始未改变的ORF核苷酸序列相比具有约70％、75％、80％、85％、90％和95％核苷酸序列同一性。这些功能变体是用标准密码子表产生的。虽然变体的核苷酸序列被改变，但开放阅读框所编码的氨基酸序列没有改变。

B.尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶多肽的变体氨基酸序列

产生尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶多肽的变体氨基酸序列。在该实例中，变更一个氨基酸。具体而言，观察开放阅读框以确定适当的氨基酸变更。通过考虑蛋白质比对(与其他直系同源物或来自各种物种的其他基因家族成员的比对)来选择氨基酸进行改变。选择出这样的氨基酸，其被认为不处在高选择压力下(不高度保守)，且相当容易地被具有相似的化学特性(即相似的功能侧链)的氨基酸置换。使用图6或图8中所示的蛋白质比对，可改变适当的氨基酸。一旦鉴别出目标氨基酸，就随后进行如下C部分中所述的程序。使用这个方法产生出具有约70％、75％、80％、85％、90％和95％核酸序列同一性的变体。

C.尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶多肽的另外的变体氨基酸序列

在该实例中，产生出相对于参比蛋白质序列而言具有80％、85％、90％和95％同一性的人工蛋白质序列。这后一尝试要求从图6或图8所示的比对鉴定保守区和可变区域，然后明智地应用氨基酸置换表。这些部分将在下文中作更详细的讨论。

主要根据尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶蛋白或其他尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶多肽中的保守区域来确定改变哪些氨基酸序列。基于序列比对，尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶多肽的可能进行改变的不同区域以小写字母表示，而保守区域以大写字母表示。应认识到，可在以下保守区域中作出保守置换而又不改变功能。此外，技术人员应当理解，本公开的尿素转运蛋白、尿素酶或谷氨酰胺合成酶序列的功能性变体可以在保守区中具有微量的非保守氨基酸改变。

然后产生出与原始蛋白质序列相差在80-85％、85-90％、90-95％和95-100％同一性范围内的人工蛋白质序列。目标定在这些范围的中点，正负偏差近似幅度例如为1％。氨基酸置换将通过定制的Perl脚本来实现。置换表在下表12中提供。

表12.置换表

氨基酸	强相似的和最佳的置换	改变顺序排列	注释
				I	L，V	1	50∶50置换
L	I，V	2	50∶50置换
				V	I，L	3	50∶50置换
A	G	4
				G	A	5
D	E	6
				E	D	7
W	Y	8
				Y	W	9
S	T	10
				T	S	11
K	R	12
				R	K	13
N	Q	14
				Q	N	15
F	Y	16
				M	L	17	第一个甲硫氨酸不能改变
H		Na	无好的置换物
				C		Na	无好的置换物
P		Na	无好的置换物

首先，鉴定出蛋白质中不应改变的任何保守氨基酸并“作上记号”以隔离开来不作置换。起始甲硫氨酸当然将自动被加到这个名单。接着，作出改变。

H、C和P在任何情况下都不改变。该改变将首先以异亮氨酸开始，从N端扫描至C端。然后是亮氨酸，如此按列表往下直至达到所需的目标。可作出中数置换(interimnumbersubstitution)，以便不造成改变的逆转。名单的顺序是1-17，因此按需以尽可能多的异亮氨酸变化开始，然后是亮氨酸，一直到甲硫氨酸。显然，按此方式，许多氨基酸将不需要改变。L、I和V将涉及两个交替的最佳置换的50∶50置换。

将变体氨基酸序列作为输出写出。用Perl脚本计算同一性百分数。使用这个程序，产生出与起始未改变的ORF核苷酸序列具有约80％、85％、90％和95％氨基酸同一性的Dur3和UreI多肽的变体。

本说明书中的所有出版物和专利申请表明了本公开所属领域的普通技能水平。所有出版物和专利申请均以引用的方式并入本文，所引用的程度就如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和独立地指出以引用的方式并入本文一样。

藉着各个具体的和优选的实施例和技术描述了本公开。但是，应理解，在保持在本公开的精神和范围的前提下可以作出许多变化和修改。

Claims

1.一种调节尿素同化作用的重组多核苷酸，选自：

a.编码多肽的多核苷酸，如通过GAP算法在默认参数下确定的，所述多肽与选自SEQIDNO：224-250、300、302和321的多肽的全长序列具有至少80％序列同一性，其中所述多肽用作尿素摄取的改性剂；

b.多核苷酸，如通过GAP算法确定的，所述多核苷酸与选自SEQIDNO：224-250、300、302和321的多核苷酸序列至少80％相同；

c.选自SEQIDNO：224-250、300、302和321的多核苷酸；以及

d.与所述(a)、(b)或(c)的多核苷酸互补的多核苷酸，其中所述(a)-(d)的多核苷酸有效连接至在植物细胞中起作用的异源调控元件。

2.一种重组表达盒，包含权利要求1所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸以有义取向有效连接至启动子。

3.一种宿主细胞，包含权利要求2所述的表达盒。

4.一种转基因植物，包含权利要求2所述的重组表达盒。

5.根据权利要求4所述的转基因植物，其中所述植物是单子叶植物。

6.根据权利要求4所述的转基因植物，其中所述植物是双子叶植物。

7.根据权利要求4所述的转基因植物，其中所述植物选自：玉蜀黍、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、粟、花生、柳枝稷、芒草、黑小麦和可可。

8.一种转基因种子，来自权利要求4所述的转基因植物。

9.一种调节植物细胞中的尿素摄取的方法，所述方法包括：

a.向植物细胞中引入包含权利要求1所述的多核苷酸的重组表达盒；以及

c.表达所述多核苷酸，从而调节所述植物细胞中的尿素摄取。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述植物选自：玉蜀黍、大豆、苜蓿、大麦、卡诺拉油菜、可可、棉花、粟、芒草、花生、水稻、裸麦、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦和小麦。

11.一种增加植物细胞中的所述尿素同化活性的方法，包括：

a.提供核苷酸序列，所述核苷酸序列编码与SEQIDNO：1-223、251-299、301和322中的一者具有至少90％序列同一性的尿素转运蛋白；

b.任选地提供另外的核苷酸序列，所述序列选自：另外的尿素转运蛋白、尿素酶和谷氨酰胺合成酶；以及

c.将所述(a)的核苷酸序列和所述(b)的任选的核苷酸序列共表达到所述植物细胞中，其中所述植物细胞中的所述尿素同化作用增加。

12.根据权利要求9所述的方法，其中所述植物细胞来自单子叶植物。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述单子叶植物为玉蜀黍、大豆、苜蓿、大麦、卡诺拉油菜、可可、棉花、粟、芒草、花生、水稻、裸麦、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦或小麦。

14.根据权利要求9所述的方法，其中所述植物细胞来自双子叶植物。

15.根据权利要求4所述的转基因植物，其中所述植物中的所述尿素转运、尿素分解或氨同化活性增大。

16.根据权利要求15所述的转基因植物，其中所述植物具有增强的幼苗活力。

17.根据权利要求15所述的转基因植物，其中所述植物具有增加的穗丝突出体。

18.根据权利要求15所述的转基因植物，其中所述植物在根中具有增强的氮同化作用。

19.根据权利要求15所述的转基因植物，其中所述植物具有提高的每株植物的种子数。

20.根据权利要求15所述的转基因植物，其中所述植物具有增大的种子大小和质量。

21.根据权利要求15所述的转基因植物，其中所述植物具有胚大小增加的种子。

22.根据权利要求15所述的转基因植物，其中所述植物在所述叶中具有增强的氮同化作用。

23.根据权利要求15所述的转基因植物，其中所述植物具有增加的穗大小。

24.根据权利要求15所述的转基因植物，其中所述植物具有增大的氮利用效率。

25.根据权利要求15所述的转基因植物，其中所述植物在衰老期具有增加的氮再活化作用。

26.根据权利要求15所述的转基因植物，其中所述植物在籽粒发育期具有增加的氮再活化作用。

27.一种修饰玉蜀黍植物的尿素摄取的方法，所述方法包括：

a.用高亲和力尿素转运蛋白和低亲和力尿素转运蛋白转化玉蜀黍植物；以及

b.表达所述低亲和力尿素转运蛋白和所述高亲和力尿素转运蛋白，从而与对照植物相比，所述转基因植物摄取的尿素增加。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述低亲和力尿素转运蛋白和所述高亲和力尿素转运蛋白在玉蜀黍的不同生长期具有活性。

29.根据权利要求27所述的方法，其中根据所述土壤中的所述可用尿素浓度，所述低亲和力尿素转运蛋白和所述高亲和力尿素转运蛋白具有活性。

30.根据权利要求27所述的方法，其中所述转运蛋白为Dur3或Urel家族成员。

31.根据权利要求27所述的方法，其中用包含选自尿素调控启动子、组成型启动子或根优选的启动子的启动子的表达盒转化所述植物。

32.一种通过在生殖期或在生殖期期间向植物提供氮源来增加产量的方法，所述方法包括：

(a)使所述植物生长到生殖期；以及

(b)以叶面施肥或土壤施肥向所述植物提供尿素形式的氮源，其中所述植物能够通过在所述植物中表达一种或多种尿素转运蛋白来利用所述叶面施加的尿素或所述土壤施加的尿素，从而增加所述植物的所述产量。

33.一种降低农业生产环境中的氮损失的方法，所述方法包括：

(a)使能够从所述土壤或通过叶面施肥利用尿素作为直接氮源的植物生长；

(b)向所述植物提供含有尿素的营养物质源；

(c)使所述植物生长，并从而降低所述农业生产环境中的所述氮损失。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述植物表达尿素转运蛋白。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述尿素转运蛋白为高亲和力转运蛋白。

36.根据权利要求33所述的方法，其中通过增加所述植物对尿素的摄取来降低所述氮损失。