CN101935343A - 与尿素吸收相关的蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了来源于水稻的与尿素吸收相关的蛋白及其编码基因与应用。该蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与尿素吸收相关的由(a)衍生的蛋白质。该蛋白对水稻直接利用尿素作为氮源具有重要作用。本发明为农作物的尿素高效吸收研究提供了更有特色的基因资源，在基因工程改良植物的营养高效性能研究中将发挥重要作用。

Description

与尿素吸收相关的蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域中的一种蛋白质及其编码基因与应用，特别涉及与尿素吸收相关的蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

氮素是作物生长发育所必需的三大营养元素之一。高等植物对氮素的吸收，占其营养吸收总量的80％。因此，农业生产上，氮肥的施用是保证作物稳产高产最重要的因素之一。尿素是第一个利用无机物人工合成的有机化合物，因其具有氮含量高，化学性质稳定，易运输，价格相对较低等特点，日益成为农民偏爱的氮肥品种，数据表明尿素态氮肥占总氮肥的比例由1980年的37％增长到2004年的61％。尿素分子广泛存在于自然界中，除动植物残体的分解以及人和动物的排泄物之外，农业生产中尿素氮肥的施用是其主要来源。尿素的自然水解率很低，约0.2％。尿素施入土壤后，在土壤微生物的脲酶作用下会被分解生成氨(NH₃)和二氧化碳(CO₂)(Watson CJ，Miller H，P oland P，Kilpatrick DJ，Allen，MBD，Garret MK，Christianson CB.Soil properties a nd the ability of the urease inhibitor N-(n-butyl)thiophosphoric triamide(nBTPT)to reduce ammonia volatilization from surface-applied urea.Soil Biol.Biochem.26，1165-1171.1994.)，故其半衰期为1-8天(Kiss.S and M.Simihǎian Improving efficien cy of urea fertilizer by inhibition of soil urease activity Kluwer Academic publisher s ISBN 1-4020-0493-1，2002)。因此，尿素氮肥施入土壤后，短期内土壤中会有较高浓度(如毫摩尔级)的尿素存在。NH₄ ⁺虽然能作为重要的氮源被植物吸收利用，但它的形成(或直接施用)也不可避免地会诱导多种失氮途径的发生(如氨挥发、硝化和反硝化，以及硝态氮的淋洗等)，导致大部分尿素-氮损失于大气和土壤环境中，造成水体富营养化，大气污染等一系列环境问题，这也是作物对氮肥的当季利用率很低的一个重要原因，因此创建和培育高效吸收氮素的植物品种是农业科学技术研究的主要目标之一。

早期的植物营养生理学研究表明高等植物可能吸收尿素分子。Gerendás and Satt elmacher(Significance of Ni supply for growth，urease activity and the concentratio ns of urea，amino acids and mineral nutrients of urea-grown plants.Plant and Soil 190：153-162，1997.)发现在缺镍(Ni)的情况下(Ni离子是植物体内活化脲酶的必要辅助因子)，以尿素为氮源时，植物(大麦，小麦，油菜，向日葵，瓜)体内会累积大量的尿素，而且植物生长明显受到抑制；而在同样缺镍的生长条件下，以矿质无机态氮(NH₄NO₃)作为氮源的南瓜植株体内累积尿素量明显低于且其以尿素为氮源的植株，且其生长状况明显好于以尿素为氮源的植株。由此说明尿素很可能被植物根系吸收。此外，叶面喷施尿素氮肥后，植物叶片组织中尿素含量明显升高(Krogmeier MJ，Mac carty W，Bremner JM，Phytotoxicity of foliar-applied urea PNAS 86：8189-8191.1989)。当对小麦(Triticum aestivum)的地上部施用尿素时，使用脲酶抑制剂——苯基磷二酰胺(phenyl phosphorodiamidate，PPD)，则可导致小麦叶片中尿素含量增高，且伴有严重的叶尖坏死症状，此也表明尿素分子能够被直接吸收而进入叶片细胞中。近年来，在缺失脲酶(活性)的大豆和马铃薯的突变体中，也有关于植物能够直接吸收尿素氮源的类似报道(Witte C，Tiller SA，Taylor MA，Davies HV.Leaf urea metabolism in potato.Urease activity profiles and patterns of recovery and distribution of 15N after foliar urea application in wild-type and urease-antisense transgenics.Plant Physiol 1 29，1129-1136.2002)。总之，上述生理学现象均表明植物可能直接吸收并利用尿素作为生长的氮源。

针对尿素作为主要的氮素化肥而其利用率很低的农业生产实际问题，且目前农作产量的保证主要依赖于氮肥的施用，因此，培育能够提高尿素氮肥利用率的新品种具有重要的农业实践意义和社会经济生态价值。

发明内容

本发明的一个目的是提供与尿素吸收相关的蛋白及其编码基因。

本发明所提供的与尿素吸收相关的蛋白，名称为OsDUR3，来源于稻属的水稻(Oryza sativa L.)，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与水稻尿素吸收相关的由(a)衍生的蛋白质。

序列表中的序列1由721个氨基酸残基组成。

上述(a)中的OsDUR3蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的OsDUR3衍生蛋白可人工合成，也可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中失和/或增加一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到编码基因，再进行生物表达得到。

上述与尿素吸收相关蛋白的编码基因(命名为OsDUR3基因)也属于本发明的保护范围。

与尿素吸收相关蛋白的编码基因具体可为如下1)-3)中任一所述的基因：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的基因；

3)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的基因。

序列表中的序列2由2166个核苷酸组成。

上述严格条件为可用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

含有上述与尿素吸收相关蛋白的编码基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体具体可为在pCF203载体的多克隆位点间插入上述与尿素吸收相关蛋白的编码基因得到的重组表达载体。

所述重组菌为重组酵母菌。

本发明的又一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，是将上述与尿素吸收相关蛋白的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物与所述目的植物相比，对尿素的吸收能力增强。

所述的编码基因是通过所述重组表达载体导入目的植物中。

所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物为拟南芥，所述单子叶植物为水稻。

本发明从水稻中获得了与尿素吸收相关的蛋白OsDUR3及其编码基因OsDUR3，该蛋白对水稻直接利用尿素作为氮源具有重要作用。将OsDUR3基因转入到遗传学模式植物即拟南芥的细胞中，获得了相应的转基因植株。植物的生长测试及尿素吸收试验结果表明，与对照(野生型)植株相比，该基因在拟南芥植株中超表达后，能够显著增强拟南芥植株对尿素的吸收能力。本发明为农作物的尿素高效吸收研究提供了更有特色的基因资源，在基因工程改良植物的营养高效性能研究中将发挥重要作用。

附图说明

图1为无菌条件下水稻在含有不同形态氮素的培养基上生长状况和全氮含量的鉴定。

图2为本发明中利用实时定量PCR技术对OsDUR3基因在不同氮素处理下的表达水平的鉴定。

图3为OsDUR3基因恢复酵母菌突变体YNVW1(ura3^-，dur3^-)在2mM外源尿素作为唯一氮源的生长测定。

图4为OsDUR3基因在异源表达系统即爪蟾卵母细胞中吸收尿素的酶动力学特征鉴定。

图5为OsDUR3基因的超表达拟南芥转基因植物利用较低浓度尿素的生长表型鉴定。

图6为OsDUR3基因的超表达拟南芥转基因植株吸收尿素能力的鉴定。

图7为拟南芥中超表达OsDUR3基因载体的构建。

图8为酵母功能互补试验中OsDUR3酵母表达载体的构建。

图9为爪蟾卵母细胞表达载体的构建。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、与尿素吸收相关蛋白及其编码基因的获得及其功能验证

一、水稻吸收尿素能力的测定

选取一定量的水稻种子，进行表面消毒(75％的乙醇浸泡1.5分钟，Blench溶液浸泡10-15分钟后)，灭菌去离子水洗种子五次。将表面消毒后的水稻种子平行摆放在圆形培养皿中(置有无菌滤纸及4.5mL的无菌MilliQ水)，培养皿用parafilm膜封好，4℃冰箱培养24小时，以使水稻苗发芽整齐。而后将水稻种子置入水稻光照培养箱中(28℃16h光照/27℃8h黑暗)培养两天。随后挑选长势较为整齐的水稻移入装有琼脂固体培养基(无氮水培营养液+1μM Ni²⁺+不同浓度的尿素或其他氮源)的带盖儿广口瓶中，5株/瓶，移入时保证水稻根插进培养基中。每处理三次重复，移入广口瓶后，盖好盖子，用parafilm膜封好置入水稻光照培养箱中培养7天后收获。收获水稻植株后，分别将其装入已标好样品名称的纸袋中(5株/样品)，40℃烘干7天后，测量五株植物的全氮含量(质谱仪(Delta^plusXp，Germany)。结果见图1中A和B(图1：A为无菌条件下，水稻在不同氮素形态培养基上的生长状况；B为生长于不同氮素形态的培养基上水稻植株的全氮含量(No N：无任何氮源供应，AN：硝酸铵，NH₄ ⁺：硫酸铵，NO₃ ^-：硝酸钾，Urea：尿素)，结果显示当水稻植株以硝态氮，铵态氮，及二者混合形态氮为直接氮源时，植物地上部生长情况无明显差异。而以尿素为直接氮源的水稻植株，地上部明显发黄，氮营养缺乏的明显症状，但随着外源尿素浓度的提高，水稻植株的生长状况明显改善，即使当外界氮源源尿素浓度达到5mM时，其全氮含量(2.7％)仍明显低于生长于以1mM硝酸铵(3.3％)为氮源的水稻，仍处于一个氮营养缺乏的状态。以上结果均表明水稻可直接利用尿素为唯一直接氮源进行生长，但可能是其吸收利用效率较低，从而导致植物处于氮营养缺乏的状态。

二、与尿素吸收相关蛋白的基因OsDUR3的获得

序列2所示的基因可人工合成得到，也可按照如下方法得到：

本发明中采用水稻常用品种日本晴(Nipponbare)，水稻种子发芽4天后移入营养液中培养(28℃16h光照/26℃，8h黑暗)，营养液组成成份为：(NH₄)₂SO₄1mM，K₂HPO₄-12H₂O 0.17mM，K₂SO₄ 0.27mM，CaCl₂-2H₂O 0.47mM，MgSO₄-7H₂O 0.37mM，Fe-EDTA 45μM，CuSO₄-5H₂O 0.16μM，ZnSO₄-7H₂O 0.15μM，Na₂MoO₄-2H₂O 0.10μM，H₃BO₄ 15μM，MnSO₄-5H₂O 4.6μM，pH：5.7-5.8。培养第9天时，对水稻植株分别进行缺氮3天处理，第12天是收获地下根部。

提取上述缺氮处理水稻(日本晴)的根部总RNA(Trizol方法，Invitrogen.Cat.no 15596-026)，取约1μg的水稻总RNA进行反转录反应，加入0.5μL Oligo(dT)₁₈primer(1μg/μL)，1μL dNTPs(10mM)，根据总反应体积为20μL，加入相应量的无DNA酶、RNA酶水，小心混匀，65℃保温5分钟。其余步骤参照invitrogen super scripscript^TmIIIreverse transcriptase(Cat.No.18080-085)说明书，获得cDNA。

以上述获得的cDNA为模板进行PCR扩增获得目的片段，所用引物为：OsORF(BgLII)-5′：AAGAGATCTATGGCGAGCGGCGTGTGCCCTC和OsORF(BgLII)-3′：TGGAGATCTTCAGGATGTCATCATCTGATTA，应体系如下：

上、下游引物(10μM)       各1μl

cDNA模板(50ng/μl)        1μl

Pfu酶(5U/μl)             1μl

4×dNTPs(各10mM)          1μl

10×buffer(Mg²⁺)          5μl

加水补足到                40μl

PCR反应条件为：预热94℃预变性2min、然后94℃变性30s、退火30s的退火温度为58℃，72℃延伸180s，共进行28个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，经扩增获得了大小分为2184DNA片段，回收并纯化上述片段，将其连接入载体pGem-T esay(promega公司)中，再将连接产物分别用CaCl₂法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，挑选阳性单菌落加入到5mL含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养12-16小时，提质粒，得到含有目的片段的重组质粒，进行测序鉴定，将阳性重组质粒命名为pGem(bglII)-OsDUR3。

序列测定结果表明，PCR反应获得的片段的核苷酸序列如序列表中的序列2所示，即为本发明的与尿素吸收相关的蛋白的编码基因的核苷酸序列，该编码基因编码序列表中序列1所示的蛋白，将该蛋白命名为OsDUR3，将其编码基因命名为OsDUR3。

三、与尿素吸收相关蛋白及其编码基因的功能验证

1、OsDUR3基因在异源系统酵母中的功能互补验证

将OsDUR3基因克隆到p426HXT7(酵母表达载体)中的步骤：将步骤一中测序后的pGem(BglII)-OsDUR3用BglII酶切后，通过琼脂糖电泳回收包含OsDUR3的酶切目的片段，同时将酵母表达载体p426HXT7(公众可从中国农业大学获得，记载过该材料的非专利文献是Wieczorke，R.，Krampe，S.，Weierstall，T.，Freidel，K.，Holl enberg，C.P.，and Boles，E.Concurrent knock-out of at least 20 transportergenes is r equired to block uptake of hexoses in Saccharomyce scerevisiae.FEBS Lett.1999(464)：123-128.)用BamHI酶切完毕后加磷酸转移酶(CIP)去除5’端磷酸基团后，用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提以纯化酶切产物。将两酶切产物做连接反应，16℃过夜，然后转化到大肠杆菌DH5a，提取质粒用于酶切和测序检测，将检测表明正确的含有OsDUR3基因的重组载体命名为p426HXT7：OsDUR3(图8)。将重组载体p426HXT7：OsDUR3转入酵母菌尿素突变体YNVW1(ura3^-，dur3^-)(公众可从中国农业大学获得，记载过该材料的非专利文献是Liu，L.-H.，Ludewig，U.，Frommer，W.B.，and von Wir én，N.AtDUR3encodes a new type of high affinity Urea/H+symporter in Arabidop sis.The Plant Cell，2003(15)：790-800.)中，在不含有尿嘧啶的培养基(SD+20mMNH4+)上筛选以获得阳性克隆YNVW1+OsDUR3，通过菌落PCR检测排除假阳性克隆的可能性，PCR扩增产物为718bp即为鉴定阳性。PCR检测的引物为：

OsDUR3(orf1595-1616)-F：TGGCGGGCAACCTGGTGTCCAT和

p426-R：AGACTTCAGGTTGTCTAACTC。

在SD+2mM urea培养基上，以转入空载体p426HXT7的酵母突变体YNVW1为阴性对照，野生型酵母23346c(公众可从中国农业大学获得，记载过该材料的非专利文献是Liu，L.-H.，Ludewig，U.，Frommer，W.B.，and von Wirén，N..AtDUR3 encod es a new type of high affinity Urea/H+symporter in Arabidopsis.The Plant Cell，2003(15)：790-800.)为阳性对照，28℃条件下生化培养箱中培养进行生长表型比较检测。结果如图3所示(图3：23346c为野生型的酵母菌株；YNVW1+p426HXT为转入空载体的酵母突变体；YNVW1+OsDUR3为转OsDUR3基因的酵母突变体)，野生型和转基因OsDUR3的酵母突变体能够在以2mM的尿素为唯一氮源的培养基上生长，但转入空载体的酵母突变体不能正常生长，说明获得的OsDUR3基因在酵母系统中具有尿素吸收功能。

2、异源系统爪蟾卵母细胞中OsDUR3生化参数的测定

OsDUR3克隆于爪蟾卵母细胞表达载体pOO2中的步骤：将步骤一中测序后的pGem(bglII)-OsDUR3用BglII酶切后，通过跑胶回收酶切产物目的片段，同时将爪蟾卵母细胞表达载体pOO2(公众可从中国农业大学获得，记载过该材料的非专利文献是Liu，L.-H.，Ludewig，U.，Frommer，W.B.，and von Wirén，N..AtDUR3 encodes a new type of high affinity Urea/H+svmporter in Arabidopsis.The Plant Cell，2003(15)：790-800.)用BamHI酶切完毕后加磷酸转移酶(CIP)去除5’端磷酸集团后，用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，纯化酶切产物。将两目的酶切产物连接，16℃过夜，转化到大肠杆菌DH5a，提取质粒用于酶切和测序检测，测序结果为在载体pOO2的BamHI位点插入了如序列表中序列2所示的核苷酸序列，将检测表明正确的含有OsDUR3基因的重组载体命名为pOO2:OsDUR3。重组载体pOO2:OsDUR3的构建过程如图9所示。

通过MluI酶切将重组载体pOO2:OsDUR3线性化后，用2.5mM的醋酸钠回收线性化后的表达载体，取0.1-1μg线性化后的载体在eppendorf管中利用mMessage mMachine kit(Ambion，Austin，TX)合成OsDUR3的cRNA，凝胶电泳检测cRNA的大小及完整性。而后取15-50ng cRNA注射到预处理好的成熟的爪蟾卵母细胞(该爪蟾卵母细胞可通过从中科院遗传与发育所购买非洲爪蟾，选取养殖2-4年的健康雌性爪蟾作为取卵材料)中，以注入相同体积的水作为对照。每3个卵母细胞作为一个处理，每个处理三次重复。将已注入cRNA的卵母细胞在含有(0-200μM)C¹⁴-urea的缓冲培养液中培养20min后，用含有的非标记的尿素(为标记尿素的50倍)缓冲液冲洗3次以去除吸附在卵母细胞表面的C¹⁴-urea，利用液体闪烁计数器(Perkin-Elmer，Bosto n，MA)来统计爪蟾卵母细胞中的C¹⁴强度，所获得的数据运用SPSS来统计计算，采用非线性回归模型计算获得Km及Vmax(具体方法参照非专利文献Liu，L.-H.，Lude wig，U.，Frommer，W.B.，and von Wirén，N..AtDUR3 encodes a new type of high affinity Urea/H+symporter in Arabidopsis.The Plant Cell，2003(15)：790-800.中的方法)。结果如图4所示，Km＝8.81±0.43(SE)uM，Vmax＝4+0.05(SE)(Km为达到最大吸收速率时所需底物浓度的二分之一浓度，Vmax为最大吸收速率)。

实施例2、培育尿素吸收高效植物

1、重组植物表达载体的构建

将OsDUR3基因转到拟南芥双元表达载体pCF203(公众可从中国农业大学获得，记载过该材料的非专利文献是Lai-Hua Liu，Uwe Ludewig，Brigitte Gassert，Wolf B.Frommer and Nicolaus von Wirén.Urea transport by nitrogen regulated tonoplast intr insic proteins in Arabidopsis.Plant Physiology.2003(133)：1220-1228.)中，该载体含有35s启动子及报告基因GFP，重组质粒的构建步骤如下：利用BamHI及SalI酶切去除pCF203P中的GFP片段，在酶切3小时后加入小牛肠碱性磷酸酶(CIP)以去除5’-端磷酸基团，反应继续1小时后，用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，以纯化酶切产物。以重组质粒pGem(BglII)-OsDUR3为模板通过PCR反应获得5’-端带BglII，3’-端带有有SalI克隆位点的OsDUR3-orf片段，PCR反应的引物为：

OsORF(BglII)-5′：AAGAGATCTATGGCGAGCGGCGTGTGCCCTC和

OsORF(SalI)-3′：TGGGTCGACTCAGGAGTGCATCATCTGATT。

琼脂糖电泳回收目的PCR片段，利用BglII及SalI酶切回收产物以获得带有粘性末端的OsDUR3-orf片段，用含有BglII/SalI粘性末端的OsDUR3-orf酶切片段与BamHI及SalI酶切后的载体pCF203做连接反应，16℃过夜，转化到大肠杆菌DH5a，壮观霉素抗性筛选培养，提取质粒，酶切鉴定，获得阳性重组载体pCF203:OsDUR3，如图7所示。测序检测表达载体pCF203:OsDUR3中OsDUR3基因序列，结果在载体的pCF203的BamHI及SalI酶切位点间插入的基因序列与序列表中序列2第1-2166位核苷酸序列一致。

2、OsDUR3基因转化拟南芥植株

用农杆菌介导法将上述步骤1中获得的重组载体pCF203:OsDUR3转入到野生型拟南芥(Col-0)(购自美国SALK公司)及AtDUR3-1突变体和AtDUR3-3突变体(公众可从中国农业大学获得，记载过该AtDUR3-1突变体和AtDUR3-3突变体的非专利文献是Kojima，S.，Bohner，A.，Gassert，B.，Yuan，L.，and von Wirén，N.(2007).AtDU R3 represents the major transporter for high-affinity urea transport across the plasma membrane of nitrogen-deficient Arabidopsis roots.Plant J.52：30-40.)中。具体操作步骤为：将重组载体pCF203:OsDUR3通过电击法转入农杆菌GV3101(购自天根生化科技有限公司)中(GV3101带有利福平抗性)，用壮观霉素抗性筛选阳性重组农杆菌，将获得的阳性重组农杆菌的单菌落接种于含壮观霉素50mg/L和利福平50mg/L的20mLYEB液体培养基中，在28℃、150rpm下振荡培养2-3天，然后将菌液以1∶100的体积比转接入200-500ml的含有50mg/L壮观霉素和50mg/L利福平的YEB培养基中，28℃、150rpm下振荡过夜培养30小时，待OD值达到1.5时，离心收集菌液，用接种培养基(5％蔗糖(50g/l)、0.02％Silwet L-77(200μl/l)、1/2MS大量元素+1×MS微量元素+1×MS铁盐+1×MS肌醇+1×MS维生素+MES 0.5g/L，pH5.7)将其稀释至OD600约为0.8-1.0左右即可。

从温室取正在开花的拟南芥植株，具体为野生型拟南芥(Col-0)及拟南芥突变体AtDUR3-1，AtDUR3-3植株，去除果荚，将拟南芥的上部缓缓、螺旋式浸入含有农杆菌的接种培养基内，轻轻顺时针晃荡，约30秒，后小心将拟南芥植株连同培养容器平躺放入苗盘中，用避光塑料罩盖严，放入温室过夜。浸泡后一天，移去避光塑料罩，将植株直立放置，浇透水。而后保证植株水份养分充足，去除新开的花，待第一果荚成熟变黄时，用塑料代套住，将纸袋内所有果荚变黄后，停止浇水，1-2周干燥后取回实验室，进行转化种子的筛选，筛选方法如下：拟南芥种子灭菌后，用枪头将种子平摊在含有50mg/L Kan+1/50B5的培养基(B5培养基的组成成分为：KCl 5mM，MgSO₄.7H₂O 2mM，CaCl₂.2H₂O1mM，NaH₂PO₄1.1mM，MnSO₄·H₂O 0.045mM，KI 4.5μM，H₃BO₃ 48.5μM，ZnSO₄·7H₂O 7μM，CuSO₄·5H₂O 0.1μM，Na₂MoO₄·2H₂O 1.03μM，CoCl₂·6H₂O 0.105μM，EDTA-Fe3.6μM，MES调节pH值至5.7-5.8)上，4℃春化24小时后，放入拟南芥培养室中进行培养，选择生长势比较旺盛，除子叶外能生长出新的叶片，且生长出多级根的植株移栽到土培中进行培养，剪取叶片，利用DNA快速提取试剂盒(sigma Extract-N-Amp ^TM plant PCR Kits Cat.No.XNAP2)提取DNA，PCR检测其否为阳性植株，PCR检测所用的引物为：OsDUR3f：5’-GTCGTCTTCGTCTTCCTCGTC-3和OsDUR3r：5’-GCTCATCCAGTAGCCGTTGT C-3；在琼脂糖凝胶上能得到263bp的PCR扩增条带的为阳性转化拟南芥植株，转化当代转基因植株为T0代，由该T0代植株自交产生的种子及由它所长成的植株为T1代。混合收集T1代种子，播种于含50mg/L Kan的MS固体培养基上，筛选能正常生长的植株移栽于盆内继续生长，单株收种，为T2代种子。

同时以转入空载体pCF203的野生型拟南芥为空载体对照。

3、转OsDUR3基因拟南芥植株的生长表型鉴定及OsDUR3基因表达量测定

收获Wt+OsDUR3及AtDUR3-1+OsDUR3转基因拟南芥种子(T2代)。各选两个基因型(Wt+OsDUR3-7，Wt+OsDUR3-6；atdur3-1+OsDUR3-1，atdur3-1+OsDUR3-2)，选取一定量的种子，进行表面消毒(75％的乙醇浸泡1.5分钟，Blench溶液浸泡10-15分钟后)，灭菌去离子水洗种子五次。种子风干后，将种子依间隔1cm的距离播种在含有不同氮源水平的培养基上(无氮，0.5mM urea，1mM urea，3mM ur ea，0.5mM NH₄NO₃及3mM NH₄NO₃)，4℃冰箱24小时春化，然后移到拟南芥培养室培养观察生长表型，并以OsDUR3f和OsDUR3r为引物扩增OsDUR3基因，以AtACT2f和AtACT2r为引物扩增看家基因AtACT2为内参对照，检测拟南芥植株的根中OsDUR3基因表达情况。所用的引物如下：

OsDUR3f：5’-GTCGTCTTCGTCTTCCTCGTC-3和

OsDUR3r：5’-GCTCATCCAGTAGCCGTTGTC-3’；

AtACT2f，：5’-TCCAAGCTGTTCTCTCCTTG-3’和

AtACT2r：5’-AGACGGAGGATGGCATGAG-3’。

结果如图5(图5：A为野生型拟南芥及转基因植株中OsDUR3基因表达情况的检测；B为OsDUR3基因超表达于野生型拟南芥及AtDUR3拟南芥突变体后生长表型比较(无菌条件下agar培养基生长情况)；Wt为野生型拟南芥(Col-0)；Wt+OsDUR3-6和Wt+OsDUR3-7为超表达OsDUR3的转基因拟南芥株系；atdur3-1为拟南芥尿素突变体；atdur3-1+OsDUR3-1和atdur3-1+OsDUR3-2为互补表达拟南芥株系。AN：硝酸铵，Urea：尿素)所示，由图5中A可知，在Wt+OsDUR3-6和Wt+OsDUR3-7中可检测到OsDUR3基因的表达量，而在Wt中未检测到OsDUR3基因的表达量；在atdur3-1+OsDUR3-1和atdur3-1+OsDUR3-2中可检测到OsDUR3基因的表达量，而在atdur3-1中未检测到OsDUR3基因的表达量；由图5中B可知，Wt+OsDUR3-6和Wt+OsDUR3-7与Wt相比，在较低浓度尿素(0.5mM urea和1mM urea)下生长较好；atdur3-1+OsDUR3-1和atdur3-1+OsDUR3-2与atdur3-1相比，在较低浓度尿素(0.5mM urea和1mM urea)下生长较好。此结果说明，OsDUR3基因的表达能够使拟南芥转基因植物有效利用较低浓度尿素。空载体对照的植株表型与野生型表型无显著差异。

4、转OsDUR3基因拟南芥植株尿素吸收能力的测定

选用转OsDUR3基因拟南芥植株的T2代种子，对Wt+OsDUR3-7，Wt+OsDUR3-6两个转基因系进行尿素吸收能力的测定。将拟南芥种子进行表面消毒(75％的乙醇浸泡1.5分钟，Blench溶液浸泡10-15分钟后)，灭菌去离子水洗种子五次，完成后，4℃冰箱春化24小时，拟南芥种子在筛选培养基上1/50B5+卡那霉素(50mg/L)进行筛选发苗(拟南芥培养室20℃光照16h/黑暗8h)，6天后选取生长茁壮有3片叶以上的拟南芥植株，利用水培方法在培养罐中(体积3.2L)对拟南芥进行前期培养，营养液组成成分为K₂SO₄ 2mM，MgSO₄.H2O 1mM，KH₂PO₄ 2mM，Ca(NO₃)₂.4H₂O 1mM，CaSO₄.2H₂O 0.4mM，ZnSO₄.7H₂O 0.2μM，MnSO₄.H₂O 0.2μM，CuSO₄.5H₂O 0.05μM，Na₂MoO₄.2H₂O 0.05μM，H₃BO₃ 2.5uM，FeSO₄-EDTA 4μM，用CaCO3调节其pH值到5.7。水培3周后(10株/罐)，进行尿素吸收试验。三次生物学重复，以野生型拟南芥(Col-0)为本实验的对照。

尿素吸收试验采用稳定性同位素N¹⁵标记的方法，往培养罐中加入200μM的尿素，N¹⁵丰度为50％，根系吸收尿素二十分钟后，将拟南芥植株从培养罐中取出，用培养液(含有2mM非标记尿素)洗涤拟南芥根部三次(10秒/次)，剪取拟南芥根部，60℃的烘箱中烘7天后，用研钵将其磨成粉末，用质谱仪(Delta^plusXP，Germany)测定样品中N¹⁵的丰度，以计算尿素的吸收量。结果如图6(图6：Wt为野生型拟南芥；Wt+OsDUR3-7和Wt+OsDUR3-6为转OsDUR3基因拟南芥株系)所示，转OsDUR3基因拟南芥株系Wt+OsDUR3-6和Wt+OsDUR3-7的尿素吸收量分别为1.72μM urea/g(DW·h^-1)、1.92μM urea/g(DW·h^-1)，野生型拟南芥的尿素吸收量为0.33μM urea/g(D W·h^-1)，转空载体拟南芥的尿素吸收量与野生型拟南芥Wt无显著差异。

实施例3、OsDUR3在不同组织及不同氮素处理下的基因表达水平鉴定

本发明中采用水稻常用品种日本晴(Nipponbare)，水稻种子发芽4天后移入营养液中培养(28℃16h光照/26℃，8h黑暗)，营养液组成成份为：(NH₄)₂SO₄1mM，K₂HPO₄-12H₂O 0.17mM，K₂SO₄ 0.27mM，CaCl₂-2H₂O 0.47mM，MgSO₄-7H₂O 0.37mM，Fe-EDTA 45μM，CuSO₄-5H₂O 0.16μM，ZnSO₄-7H₂O 0.15μM，Na₂MoO₄-2H₂O 0.10μM，H₃BO₄15μM，MnSO₄-5H₂O 4.6μM，pH：5.7-5.8。培养第16天、17天时，对部分水稻植株分别进行缺氮2天、1天处理，第18天时，对缺氮2天处理的水稻植株分别加入2mM NH₄ ⁺，2mM urea诱导3小时处理后，地上部部分(茎和叶)、地下部分(根)分别收获。利用Trizol方法分别提取水稻地上部及地下部总RNA，进行反转录前，利用DNAaseI去除RNA中的水稻基因组DNA污染(方法参照TURBO DNA-free^TM Cat.no AM1907)，取约1μg的水稻总RNA，加入0.5μl Olig o(dT)₁₈primer(1μg/μl)，1μl dNTPs(10mM)，根据总反应体积为20μl，加入相应量的无DNA酶、RNA酶水，小心混匀，65℃保温5分钟。其余步骤参照invitrogen super scripscript^TmIII reverse transcriptase说明书，获得cDNA。

将得到的cDNA产物稀释10倍，取2μl作为qPCR(实时定量PCR)反应的模板，20μL PCR反应体系为：上、下游引物(10μM)各0.5μl，cDNA模板2μl，iQ^TM Green Supermix(Cat.no 170-8882)10μl，DNase-free水7μl。所用到的引物序列为：

OsDUR3-F：5’-CCTTGGCTACTTCACGCTGT-3’和

OsDUR3-R：5’TGCATCTCCGTCTCGTGTAG-3’；

OsTubline-F：5’-TACCGTGCCCTTACTGTTCC-3’和

OsTubline-R：5’-CGGTGGAATGTCACAGACAC-3’。

qPCR仪为Bio-Rad iCycler，反应步骤为：95℃预变性2min，然后95℃变性20s、退火20s的退火温度分别为62℃-OsTubline，59℃-OsDUR3，72℃延伸20s，共进行40个循环；最后升温到95℃，变性30s退火到55℃，每0.5℃检测荧光值以检测其PCR产物是否唯一。反应完成后将PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳检测PCR产物的特异性，试验结果均表明PCR产物单一特异.以OsTubline为内参，计算OsDUR3的相对表达水平。结果如图2所示(图2：NH4⁺：对照处理，生长期内一直提供2mM铵态氮；-1N：氮饥饿1天处理；-2N：氮饥饿2天处理；-2N+Urea：氮饥饿2天处理后，加入1mM尿素诱导处理3小时；-2N+NH4⁺：氮饥饿2天处理后，加入2mM NH4⁺诱导处理3小时)，结果显示，水稻根部OsDUR3基因相对表达量高于茎部；不同处理下，氮饥饿2天处理后，加入1mM尿素诱导处理3小时的水稻根部和茎部中OsDUR3基因相对表达量均比其他处理高。此结果说明OsDUR3基因的表达受植物缺氮及其本身转运底物的诱导。

Claims (9)

1.一种蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与尿素吸收相关的由(a)衍生的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一所述的基因：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的基因；

3)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的基因。

4.含有权利要求2或3所述编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌；

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组表达载体是在pCF203载体的多克隆位点间插入所述编码基因得到的重组表达载体。

6.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为重组酵母菌。

7.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物与所述目的植物相比，对尿素的吸收能力增强。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述的编码基因是通过权利要求4或5所述的重组表达载体导入目的植物中。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物为拟南芥，所述单子叶植物为水稻。

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