ES2261938T3 - Crecimiento selectivo de plantas usando d-aminoacidos. - Google Patents
Crecimiento selectivo de plantas usando d-aminoacidos.Info
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Abstract
Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una actividad metabolizante de D-aminoácido, estando la secuencia conectada operablemente a un elemento regulador específico de planta heterólogo al gen que codifica la enzima metabolizante de D-aminoácido.
Description
Crecimiento selectivo de plantas usando
D-aminoácidos.
La presente invención se refiere al crecimiento
selectivo de células de planta, tejido de planta o plantas
vasculares que contienen material genético extraño.
El nitrógeno es necesitado en grandes cantidades
por las plantas como un nutriente mineral. El crecimiento de las
plantas, particularmente en la agricultura, a menudo está limitado
por la cantidad de nitrógeno disponible.
Tradicionalmente, se ha considerado que las
plantas usan solo amonio y/o nitrato como fuentes de nitrógeno.
Estos compuestos se suministran mediante procesos naturales, tales
como la mineralización de nitrógeno orgánico y la fijación de
nitrógeno por procariotas simbióticos, o mediante la aplicación de
fertilizantes que contienen nitrógeno fijado industrialmente.
Sin embargo, una investigación reciente ha
indicado que las plantas también pueden tener acceso a ciertos
compuestos de nitrógeno orgánico, así como nitrógeno inorgánico
(Näsholm, T. y otros (1998) Nature 392, 914-916,
Näsholm, T. y otros (2000) Ecology 81: 1155-1161,
Näsholm, T. y Persson, J. (2001) Physiol Plant 111:
419-426, Lipson, D. y Näsholm, T. (2001) Oecologia
128: 305-316). En particular, la captación y el
metabolismo de aminoácidos procedentes del suelo parece ser una
característica ubicua de las plantas.
Entre los aminoácidos usados como bloques de
construcción para proteínas, todos menos uno (glicina) pueden
encontrarse en dos formas isómeras que se distinguen por su
capacidad para hacer girar luz polarizada. La forma encontrada en
mayores cantidades en la naturaleza hace girar la luz hacia la
izquierda y se denomina L o levógira, mientras que la forma menos
común se denomina D o dextrógira.
Aunque los D-aminoácidos se
encuentran en la naturaleza, están presentes solo en concentraciones
muy bajas y solo en compuestos específicos como proteínas de la
pared celular en bacterias (por ejemplo, en el compuesto
peptidoglucano).
Aunque los transportadores de aminoácidos de
plantas median en el transporte de las formas tanto D como L de
aminoácidos (Soldal, T. y Nissen, P. (1978) Physiol. Plant. 43:
181-188, Boorer, K. J. y otros, 1996. J. Biol. Chem
271: 2213-2220, Montamat y otros (1999) Plant Mol.
Biol. 41: 259-268), las plantas carecen de las
enzimas necesarias para convertir D-aminoácidos en
formas nitrogenadas que puedan usarse en reacciones sintéticas
dentro de la planta. Por lo tanto, las plantas no pueden usar los
D-aminoácidos como una fuente de nitrógeno.
Sin embargo, la capacidad para metabolizar
D-aminoácidos está ampliamente extendida entre las
bacterias, los hongos y los animales. Se han descrito varias
reacciones que conducen al catabolismo de
D-aminoácidos en organismos (véase la figura 2)
(Friedman, M (1999) J. Agric. Food Chem. 47:
3457-3479, Pilone, M. S. (2000) CMLS 57:
1732-1747, Yurimoto y otros, (2000) Yeast
16(13): 1217-1227).
Los presentes inventores han descubierto que las
plantas que expresan un gen heterólogo que codifica una enzima que
metaboliza un D-aminoácido son capaces de utilizar
ese D-aminoácido como una fuente de nitrógeno y
crecer sobre medios que de otro modo no podrían soportar el
crecimiento de la planta silvestre.
Generalmente, solo es necesaria una enzima
metabolizante de D-aminoácido para convertir el
D-aminoácido en compuestos que pueden participar en
las rutas de metabolismo de nitrógeno habituales de la planta (es
decir, compuestos que no son dextrógiros).
Por ejemplo, la enzima D-serina
deshidratasa puede usarse para convertir D-serina en
amoníaco, piruvato y agua y las D-aminoácido
oxidasas pueden usarse para convertir D-aminoácidos
en amoníaco, un cetoácido (dependiendo del substrato de
D-aminoácido) y peróxido de hidrógeno. El nitrógeno
que de otro modo está unido inaccesiblemente en los
D-aminoácidos puede convertirse así enzimáticamente
en formas que pueden ser utilizadas fácilmente por la planta.
Un aspecto de la presente invención proporciona
un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica
un polipéptido que tiene actividad metabolizante de
D-aminoácido, estando la secuencia conectada
operablemente a uno o más elementos reguladores específicos de
planta.
En algunas modalidades de la invención, un ácido
nucleico aislado puede consistir en una secuencia que codifica un
polipéptido que tiene una actividad metabolizante de
D-aminoácido y uno o más elementos reguladores
específicos de planta conectados operablemente a la secuencia.
En algunas modalidades, los
D-aminoácidos pueden usarse como marcadores de
selección. Un ácido nucleico aislado como el descrito anteriormente
puede comprender además una secuencia de ácido nucleico heteróloga
que codifica un polipéptido de interés. La expresión de este
polipéptido, por ejemplo, puede alterar el fenotipo de una planta de
una manera ventajosa o producir otros efectos beneficiosos. La
expresión del polipéptido con actividad metabolizante de
D-aminoácido permite la selección eficaz de
transformantes que contienen esta secuencia de ácido nucleico
heteróloga, según se describe aquí.
Un polipéptido que tiene una actividad
metabolizante de D-aminoácido significa un
polipéptido que convierte un substrato de
D-aminoácido en productos que son substratos para
enzimas de planta endógenas (es decir, pueden ser metabolizados por
plantas). Productos que son metabolizados por plantas incluyen
compuestos no dextrógiros, es decir compuestos no quirales o L. El
polipéptido metabolizante de D-aminoácido cataliza
por lo tanto la conversión bioquímica de un substrato de
D-aminoácido en productos, por ejemplo productos no
dextrógiros, que pueden ser usados por plantas como fuentes de
nutrientes, en particular como fuentes de nitrógeno.
Un polipéptido metabolizante de
D-aminoácido adecuado puede ser una enzima
eucariótica, por ejemplo de una levadura (por ejemplo,
Rhodotorula gracilis), un hongo o un animal o puede ser una
enzima procariótica, por ejemplo de una bacteria tal como
Eschuerichia coli. Ejemplos de polipéptidos adecuados que
metabolizan D-aminoácidos se muestran en la Tabla 1
y Tabla 2.
Según se describe anteriormente, se ha
presentado en plantas actividad metabolizante de
D-aminoácidos no endógena.
El substrato para el polipéptido metabolizante
de D-aminoácido puede ser D-arg,
D-glu, D-ala, D-asp,
D-cys, D-gln, D-his,
D-ile, D-leu, D-lys,
D-met, D-asn, D-phe,
D-pro, D-ser, D-thr,
D-trp, D-tyr o
D-val.
Otros substratos adecuados para enzimas
metabolizantes de D-aminoácido incluyen aminoácidos
dextrógiros no proteínicos, precursores de aminoácidos dextrógiros y
derivados de aminoácidos dextrógiros. Tales substratos pueden usarse
como una fuente de nitrógeno de plantas solo después de la
conversión en una forma metabolizable adecuada mediante una enzima
metabolizante de D-aminoácido. Precursores adecuados
incluyen D-ornitina y
D-citrulina.
Preferiblemente, el substrato para el
polipéptido metabolizante de D-aminoácido es uno de
D-ser, D-asn, D-ala,
D-ile, D-glu, D-arg,
D-lys, D-his o
D-asp, más preferiblemente D-ala,
D-ile o D-ser.
La presencia de un grupo amido no quiral en un
D-aminoácido puede producir pequeñas cantidades de
crecimiento de planta, ya que este grupo a menudo puede ser
metabolizado por una planta y usado como una fuente de nitrógeno.
Por ejemplo, sobre medio que contienen D-gln, las
glutamato sintasas endógenas actúan sobre el grupo amido no quiral
para generar D-glu. Como los productos de tal
actividad no quiral son otros D-aminocompuestos que
por sí mismos no son metabolizados por enzimas de planta endógenas,
las velocidades de crecimiento con estos
D-aminoácidos son bajas, aun cuando algo de
nitrógeno se haga disponible.
El polipéptido metabolizante de
D-aminoácido puede, por ejemplo, ser una oxidasa,
racemasa, descarboxilasa, transaminasa o deshidratasa (también
llamada una amoníaco liasa). Las oxidasas catalizan la conversión de
un D-aminoácido en NH_{4}^{+}, un cetoácido
(dependiendo del substrato de D-aminoácido) y
H_{2}O_{2} (véase la figura 2). Las racemasas convierten un
D-aminoácido en la correspondiente forma de
L-aminoácido. Los L-aminoácidos son
útiles como una fuente de nitrógeno para plantas. Las
descarboxilasas convierten un D-aminoácido en un
\gamma-aminoácido que puede ser metabolizado por
plantas. Las transaminasas convierten un
D-aminoácido en una forma de L- o
D-aminoácido diferente. Los
L-aminoácidos pueden metabolizarse a continuación
directamente mientras que los D-aminoácidos pueden
sufrir conversión adicional en formas metabolizables. Las
deshidratasas catalizan la conversión de un
D-aminoácido en NH_{4}^{+}, un cetoácido
(dependiendo del substrato de D-aminoácido) y
H_{2}O (véase la figura 2). Ejemplos de oxidasas, racemasas,
descarboxilasas, transaminasas y deshidratasas adecuadas se muestran
en la Tabla 1 y Tabla 2.
En modalidades preferidas, el polipéptido
metabolizante de D-aminoácido es una deshidratasa,
por ejemplo D-ser amoníaco liasa (primeramente
conocida como D-ser deshidratasa) o una oxidasa, por
ejemplo D-aminoácido oxidasa.
Una persona experta puede fácilmente determinar
usando técnicas habituales si un polipéptido posee una actividad
metabolizante de D-aminoácido (es decir, es una
enzima metabolizante de D-aminoácido), según se
describe anteriormente.
Polipéptidos metabolizantes de
D-aminoácidos adecuados también incluyen fragmentos,
mutantes, derivados, variantes y alelos de los polipéptidos
ejemplificados en la Tabla 1 y Tabla 2.
Fragmentos, mutantes, derivados, variantes y
alelos adecuados son los que retienen las características
funcionales del polipéptido metabolizante de
D-aminoácido, es decir los que catalizan la reacción
de un substrato de D-aminoácido en una forma
metabolizable por la planta. Cambios en una secuencia, para producir
un mutante, variante o derivado, pueden ser uno o más de adición,
inserción, deleción o substitución de uno o más nucleótidos en el
ácido nucleico, conduciendo a la adición, inserción, deleción o
substitución de uno o más aminoácidos en el polipéptido codificado.
Por supuesto, se incluyen cambios en el ácido nucleico que no
constituyen una diferencia con la secuencia de aminoácidos
codificada.
Un polipéptido que metaboliza un substrato de
D-aminoácido puede comprender una secuencia de
aminoácidos que comparte más de aproximadamente 30% de identidad de
secuencia con una secuencia mostrada en la Tabla 1 o la Tabla 2, más
de aproximadamente 35%, más de aproximadamente 40%, más de
aproximadamente 45%, más de aproximadamente 55%, más de
aproximadamente 65%, más de aproximadamente 70%, más de
aproximadamente 80%, más de aproximadamente 90% o más de
aproximadamente 95%. La secuencia puede compartir más de
aproximadamente 30% de similitud con una secuencia mostrada en la
Tabla 1 o la Tabla 2, más de aproximadamente 40% de similitud, más
de aproximadamente 50% de similitud, más de aproximadamente 60% de
similitud, más de aproximadamente 70% de similitud, más de
aproximadamente 80% de similitud o más de aproximadamente 90% de
similitud.
La similitud y la identidad de secuencia se
definen comúnmente con referencia al algoritmo GAP (Genetics
Computer Group, Madison, WI). GAP usa el algoritmo de Needleman y
Wunsch para alinear dos secuencias completas, lo que maximiza el
número de coincidencias y minimiza el número de huecos.
Generalmente, se usan parámetros por defecto, con una penalización
por creación de huecos = 12 y una penalización por extensión de
huecos = 4.
Puede preferirse el uso de GAP pero pueden
usarse otros algoritmos, por ejemplo BLAST (que usa el método de
Altschul y otros, (1990) J. Mol. Biol. 215:
405-410), FASTA (que usa el método de Pearson y
Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448),
o el algoritmo de Smith-Waterman (Smith y Waterman
(1981) J. Mol. Biol. 147: 195-197) o
el programa TBLASTN, de Altschul y otros, (1990), anteriormente,
empleando generalmente parámetros por defecto. En particular, puede
usarse el algoritmo psi-Blast (Nucl. Acids Res.
(1997) 25 3389-3402).
La similitud permite la "variación
conservativa", es decir, la substitución de un residuo hidrófobo,
tal como isoleucina, valina, leucina o metionina, por otro, o la
substitución de un residuo polar por otro, tal como lisina por
arginina, ácido aspártico por glutámico o asparagina por glutamina.
Las variantes de las secuencias de aminoácidos particulares pueden
diferir de una secuencia polipeptídica conocida según se describe
aquí por inserción, adición, substitución o deleción de 1
aminoácido, 2, 3, 4, 5-10, 10-20,
20-30, 30-50 o más de 50
aminoácidos.
Una secuencia o elemento regulador específico de
planta es una secuencia que dirige preferentemente la expresión (es
decir, la transcripción) de un ácido nucleico dentro de una célula
de planta con relación a otros tipos de célula.
Por ejemplo, la expresión a partir de tal
secuencia puede reducirse o suprimirse en células que no son de
planta, tales como células bacterianas o de mamífero. Una secuencia
reguladora adecuada, por ejemplo, puede derivarse de un virus de
planta tal como el virus del mosaico de la coliflor 35.
Una secuencia reguladora es preferiblemente
heteróloga o extraña al gen que codifica la enzima metabolizante de
D-aminoácido. Tales secuencias reguladoras pueden
proporcionar una expresión eficaz dentro de una célula de
planta.
El término "heterólogo" puede usarse para
indica que el gen/la secuencia de nucleótidos en cuestión se ha
introducido en dichas células de la planta o un ancestro de las
mismas, usando medios de ingeniería genética o recombinantes, es
decir, mediante intervención humana.
Secuencias de nucleótidos heterólogas o exógenas
o extrañas a una célula de planta pueden no estar presentes en la
naturaleza en células de ese tipo, variedad o especie. Por ejemplo,
no existen informes de enzimas metabolizantes de
D-aminoácidos (es decir, enzimas que convierten
D-aminoácidos en formas metabolizables por la
planta) en células de planta y el ácido nucleico que codifica un
polipéptido con esta actividad es por lo tanto "heterólogo" a
una célula de planta transformada con el mismo.
Además de secuencias reguladoras que son
heterólogas al el gen que codifica el polipéptido metabolizante de
D-aminoácido, un ácido nucleico puede comprender uno
o más elementos cis procedentes del promotor endógeno del
polipéptido metabolizante de D-aminoácido.
Por "promotor" se entiende una secuencia de
nucleótidos a partir de la cual puede iniciarse la transcripción de
DNA conectado operablemente aguas abajo (es decir, en la dirección
3' en la hebra de sentido de DNA de doble hebra).
"Conectado operablemente" significa ligado
como parte de la misma molécula de ácido nucleico, adecuadamente
situada y orientada para que la transcripción se inicie desde el
promotor. El DNA conectado operablemente a un promotor está "bajo
regulación de iniciación transcripcional" del promotor.
Un elemento regulador adecuado puede incluir un
promotor inducible conectado operativamente a la secuencia de
codificación de ácido nucleico. La invención también proporciona
células de planta transformadas con dicho constructo génico y
métodos que incluyen la introducción de tal constructo en una célula
de planta y/o la inducción de la expresión de un constructo dentro
de una célula de planta, por ejemplo mediante la aplicación de un
estímulo adecuado.
El término "inducible", cuando se aplica a
un promotor, es bien conocido por los expertos en la especialidad.
En esencia, la expresión bajo el control de un promotor inducible se
"pone en marcha" o incrementa en respuesta a un estímulo
aplicado (que puede generarse dentro de una célula o proporcionarse
exógenamente). La naturaleza del estímulo varía entre promotores.
Cualquiera que sea el nivel de expresión en ausencia del estímulo,
la expresión a partir de cualquier promotor inducible se incrementa
en presencia del estímulo correcto. La situación preferible es
cuando el nivel de expresión se incrementa en presencia del estímulo
pertinente en una cantidad eficaz para alterar una característica
fenotípica, es decir para potenciar la tolerancia de un
D-aminoácido. Así, puede usarse un promotor
inducible o ("conmutable") que provoca un nivel básico de
expresión en ausencia del estímulo, nivel que es demasiado bajo para
conseguir el fenotipo tolerante a D-aminoácidos
deseado (y de hecho puede ser cero). Al aplicar el estímulo, la
expresión se incrementa (o se pone en marcha) hasta un nivel que
provoca una tolerancia de D-aminoácidos
potenciada.
Muchos ejemplos de promotores inducibles serán
conocidos por los expertos en la especialidad.
Otros promotores adecuados pueden incluir el
promotor del gen del virus del mosaico de la coliflor 35S (CaMV 35S)
que es expresado en un alto nivel en tejidos de virtualmente todas
las plantas (Benfey y otros, (1990) EMBO J. 9:
1677-1684); el promotor meri 5 de coliflor que es
expresado en el meristemo apical vegetativo así como varias
posiciones bien localizadas en el cuerpo de la planta, por ejemplo
el floema interno, los primordios de las flores, puntos de
ramificación en raíz y tallo (Medford, J. I. (1992) Plant
Cell 4, 1029-1039; Medford y otros, (1991)
Plant Cell 3, 359-370) y el promotor LEAFY de
Arabidopsis thaliana que es expresado muy tempranamente en
el desarrollo de las flores (Weigel y otros, (1992) Cell 69,
843-859). Otros ejemplos se describen en la página
120 de Lindsey y Jones (1989) "Plant Biotechnology in
Agriculture" Pub. OU Press, Milton Keynes, UK.
La invención proporciona un vector que comprende
un ácido nucleico como el descrito anteriormente, por ejemplo un
vector de expresión plasmídico o viral.
Según se describe aquí, la expresión de un
polipéptido que tiene actividad metabolizante de
D-aminoácido a partir de ácido nucleico codificante
puede usarse para seleccionar transformantes que contienen un
constructo o vector de ácido nucleico según se describe aquí.
En algunas modalidades, un vector puede
comprender adicionalmente un marcador genético seleccionable que
consiste en un gen quimérico que confiere un fenotipo seleccionable
tal como resistencia a un antibiótico tal como kanamicina,
higromicina, fosfinotricina, clorsulfurón, metotrexato, gentamicina,
espectinomicina, imidazolinonas y glifosato. Esto permite un segundo
nivel de selección, si se desea, además de la selección usando la
expresión del polipéptido metabolizante de
D-aminoácido.
Otro aspecto de la presente invención
proporciona el uso de un ácido nucleico como el descrito aquí en la
producción de una planta transgénica. Tal método puede permitir la
selección o la propagación selectiva de plantas transgénicas que
comprenden material genético extraño o puede ser para mejorar la
tolerancia de una planta a D-aminoácidos. La
selección se realiza preferiblemente haciendo crecer la planta o la
célula de planta sobre un medio que tiene un contenido de nitrógeno
definido que comprende un D-aminoácido, es decir el
nitrógeno en el medio está completamente o parcialmente en forma de
un D-aminoácido.
La identidad del D-aminoácido en
el medio se determina mediante la especificidad del polipéptido
metabolizante de D-aminoácido heterólogo expresado
por la planta o la célula de planta, es decir, el medio contiene el
substrato de D-aminoácido del polipéptido
metabolizante de D-aminoácido heterólogo. Por
ejemplo, cuando D-serina deshidratasa heteróloga es
expresada por una planta, está presente D-serina en
el medio de crecimiento.
Los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente
invención pueden proporcionarse aislados y/o purificados de su
ambiente natural, en forma substancialmente pura u homogénea, o
libres o substancialmente libres de otros ácidos nucleicos de la
especie de origen. Cuando se usa aquí, el término "aislado"
abarca todas estas posibilidades.
El ácido nucleico puede ser por supuesto cDNA o
DNA genómico o RNA de doble o de una sola hebra. El producto de
expresión puede formarse mediante la expresión a partir de ácido
nucleico codificante, por lo tanto bajo condiciones adecuadas en
células de planta huésped adecuadas.
Las moléculas de ácido nucleico pueden ser
totalmente o parcialmente sintéticas. En particular, pueden ser
recombinantes, ya que las secuencias de ácido nucleico que no se
encuentran juntas en la naturaleza (no se trasladan contiguamente)
se han ligado o combinado de otro modo artificialmente.
Alternativamente, pueden sintetizarse directamente, por ejemplo
usando un sintetizador automatizado.
Los expertos en la especialidad bien pueden
construir vectores y diseñar protocolos para la expresión de genes
recombinantes, en particular en una célula de planta. Pueden
elegirse o construirse vectores adecuados, que contienen secuencias
reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias promotoras, fragmentos
terminadores, secuencias de poliadenilación, secuencias
potenciadoras, genes marcadores y otras secuencias según sea
apropiado. Para detalles adicionales, véase, por ejemplo,
Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3ª edición, Sambrook
& Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
"Vector" se define para incluir, entre
otras cosas, cualquier plásmido, cósmido, fago o vector binario de
Agrobacterium en forma lineal o circular de doble o una sola
hebra, que puede o no ser autotransmisible o movilizable, y que
puede transformar un huésped procariótico o eucariótico, en
particular un huésped de planta, mediante integración en el genoma
celular, o existir extracromosómicamente (por ejemplo, un plásmido
replicante autónomo con un origen de replicación).
\newpage
Se incluyen específicamente vectores lanzadera,
por lo que se entiende un vehículo de DNA capaz, naturalmente o
mediante diseño, de replicación en dos organismos diferentes, que
pueden seleccionarse de Actinomyces y especies afines, bacterias y
células eucarióticas (por ejemplo, de planta superior, mamífero,
levadura u hongo).
Muchas técnicas y protocolos conocidos para la
manipulación de un ácido nucleico, por ejemplo en la preparación de
constructos de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciación,
introducción de DNA en células y expresión génica, y en análisis de
proteínas, se describen con detalle en Protocols in Molecular
Biology, Segunda Edición, Ausubel y otros, eds., John Wiley
& Sons, 1992.
Bevan y otros (Bevan y otros, Nucl Acids Res.
(1984) 12, 8711-8721) y Guerineau y Mullineaux
(Guerineau y Mullineaux (1993) Plant transformation and expression
vectors. En: Plant Molecular Biology Labfax (Croy RRD ed) Oxford,
BIOS Scientific Publishers, pp 121-148) describen
procedimientos y vectores específicos que se han usado previamente
con amplio éxito en plantas.
Cuando se introduce un constructo nucleico en
una célula, deben tenerse en cuenta ciertas consideraciones bien
conocidas por los expertos en la especialidad. Debe estar disponible
un método para transportar el constructo a la célula. Una vez que el
constructo está dentro de la membrana celular, la integración en el
material cromosómico endógeno se producirá o no. El producto de
expresión del gen metabolizante de D-aminoácido
puede dirigirse a un compartimento intracelular particular tal como
el peroxisoma o el citosol o expresarse ubicuamente. Finalmente, en
lo que concierne a las plantas, el tipo de célula diana debe ser tal
que las células puedan regenerarse en plantas
enteras.
enteras.
Pueden usarse técnicas bien conocidas por los
expertos en la especialidad para introducir constructos y vectores
de ácido nucleico en células de planta para producir plantas
transgénicas del fenotipo tolerante a D-aminoácido
apropiado.
La transformación de Agrobacterium es un método
ampliamente usado por los expertos en la especialidad para
transformar células de planta, en particular especies
dicotiledóneas. La producción de plantas transgénicas fértiles
estables en casi todas las plantas monocotiledóneas económicamente
pertinentes es ahora habitual: Toriyama y otros (1988)
Bio/Technology 6, 1072-1074; Zhang y
otros (1988) Plant Cell Rep. 7,
379-384; Zhang y otros (1988) Theor Appl
Genet 76, 835-840; Shimamoto y otros
(1989) Nature 338, 274-276; Datta y
otros (1990) Bio/Technology 8,
736-740; Christou y otros (1991)
Bio/Technology 9, 957-962; Peng y
otros (1991) International Rice Research Institute, Manila,
Filipinas 563-574; Cao y otros (1992) Plant Cell
Rep. 11, 585-591; Li y otros (1993)
Plant Cell Rep. 12, 250-255; Rathore y
otros (1993) Plant Molecular Biology 21,
871-884; Fromm y otros (1990) Bio/Technology
8, 833-839; Gordon-Kamm y
otros (1990) Plant Cell 2, 603-618;
D'Halluin, y otros (1992) Plant Cell 4,
1495-1505; Walters y otros (1992) Plant Molecular
Biology 18, 189-200; Koziel y otros
(1993) Biotechnology 11, 194-200;
Vasil, I. K. (1994) Plant Molecular Biology 25,
925-937; Weeks y otros (1993) Plant
Physiology 102, 1077-1084; Somers y otros
(1992) Bio/Technology 10, 1589-1594;
WO92/14828). En particular, la transformación mediada por
Agrobacterium es ahora un método de transformación altamente
eficaz en monocotiledóneas (Hiei y otros (1994) The Plant
Journal 6, 271-282).
Aspectos de la invención proporcionan un vector
de expresión para usar en tales métodos de transformación que es un
plásmido Ti de Agrobacterium desarmado y una bacteria
Agrobacterium tumefaciens que comprende tal vector de
expresión.
La generación de plantas transgénicas fértiles
se ha alcanzado usando este sistema en los cereales arroz, maíz,
trigo, avena y cebada (revisado en Shimamoto, K. (1994) Current
Opinión in Biotechnology 5, 158-162;
Vasil, y otros (1992) Bio/Technology 10,
667-674; Vain y otros, 1995, Biotechnology
Advances 13 (4): 653-671; Vasil, 1996,
Nature Biotechnology 14 página 702). Wan y Lemaux
(1994) Plant Physiol. 104: 37-48
describen técnicas para la generación de grandes números de plantas
de cebada fértiles transformadas independientemente.
Otros métodos, tales como el bombardeo con
microproyectiles o partículas (US 5.100.792,
EP-A-444882,
EP-A-434616), la electroporación (EP
290395, WO 8706614), la microinyección (WO 92/09696, WO 94/00583, EP
331083, EP 175966, Green y otros (1987) Plant Tissue and Cell
Culture, Academic Press), la captación de DNA directa (DE
4005152, WO 9012096, US 4.684.611), la captación de DNA mediada por
liposomas (por ejemplo, Freeman y otros, Plant Cell Physiol.
29: 1353 (1984)), o el método de turbulencia (por ejemplo,
Kindle, PNAS U.S.A. 87: 1228 (1990d)) pueden
preferirse cuando la transformación con Agrobacterium es
ineficaz o ineficiente.
En particular, la transformación de
gimnospermas, tales como coníferas, puede realizarse usando técnicas
de bombardeo de partículas (Clapham, D. y otros, 2000. Scan. J. For.
Res. 15: 151.160). Métodos físicos para la transformación de células
de planta se revisan en Oard, (1991) Biotech. Adv. 9:
1-11.
Alternativamente, puede emplearse una
combinación de diferentes técnicas para potenciar la eficacia del
procedimiento de transformación, por ejemplo bombardeo con
micropartículas revestidas con Agrobacterium
(EP-A-486234) o bombardeo con
microproyectiles para inducir lesiones seguido por cocultivo con
Agrobacterium
(EP-A-486233).
Después de la transformación, una planta puede
regenerarse, por ejemplo, a partir de células simples, tejido
calloso o discos foliares, como es estándar en la especialidad. Casi
cualquier planta puede regenerarse totalmente a partir de células,
tejidos u órganos de la planta. Técnicas disponibles se revisan en
Vasil y otros, Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants,
Vol I, II and III, Laboratory Procedures and Their Applications,
Academic Press, 1984, y Weissbach and Weissbach, Methods for
Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989.
La elección particular de una tecnología de
transformación estará determinada por su eficacia para transformar
la especie de planta diana así como la experiencia y la preferencia
del usuario con una metodología particular. Será evidente para el
experto que la elección particular de un sistema de transformación
para inducir ácido nucleico en células de planta no es esencial
para, o una limitación de, la invención, ni lo es la elección de una
técnica para la regeneración de plantas.
Otro aspecto de la invención proporciona un
método para producir una célula, en particular una célula de planta,
que incluye incorporar un ácido nucleico aislado, que comprende una
secuencia que codifica un polipéptido metabolizante de
D-aminoácido conectado operablemente a un elemento
regulador específico de la planta, o un vector que comprende tal
ácido nucleico, a la célula por medio de transformación. Tal método
para producir una célula puede incluir recombinar el ácido nucleico
con el ácido nucleico del genoma de la célula de modo que se
incorpore establemente en la misma. Una planta puede regenerarse a
partir de una o más células transformadas según se describe.
El polipéptido metabolizante de
D-aminoácido, el ácido nucleico codificante y/o el
vector que comprende el ácido nucleico puede ser heterogéneo, es
decir, exógeno o extraño, para la célula de planta transformada con
el mismo.
Un método para producir una célula de planta
puede incluir expresar el ácido nucleico y provocar o permitir la
acumulación de polipéptido metabolizante de
D-aminoácido expresado de ese modo en el citosol, el
peroxisoma, el cloroplasto y/u otro compartimento intracelular de
dicha célula de planta.
Un método para elaborar tal célula de planta
puede incluir introducir tal secuencia de ácido nucleico o un vector
adecuado que incluye el ácido nucleico en una célula de planta y
provocar o permitir la recombinación entre el vector y el genoma de
célula de planta para introducir la secuencia de ácido nucleico en
el genoma.
Un método puede incluir además propagar o hacer
crecer sexualmente o asexualmente la descendencia o un descendiente
de la planta regenerada de dicha célula de planta.
La invención abarca además una célula huésped
transformada con una secuencia de ácido nucleico o un vector como
los descritos anteriormente, especialmente una célula de planta, por
ejemplo una célula de planta superior o una célula de planta
microbiana. Así, se proporciona una célula huésped, tal como una
célula de planta, que incluye una secuencia de nucleótidos como la
indicada aquí. Dentro de la célula, la secuencia de nucleótidos
puede incorporarse dentro del cromosoma o puede ser
extracromosómica. Puede haber más de una secuencia de nucleótidos
heteróloga por genoma aploide. Esto, por ejemplo, permite la
expresión incrementada del producto génico en comparación con
niveles endógenos, según se analiza posteriormente. Una secuencia de
codificación de ácido nucleico comprendida dentro de una célula de
planta puede estar bajo el control de un elemento regulador
específico de la planta que es un promotor génico externamente
inducible, por ejemplo para poner la expresión bajo el control del
usuario.
El polipéptido metabolizante de
D-aminoácido puede estar presente en el citosol, el
peroxisoma u otro compartimento intracelular de la célula de planta.
La compartimentalización del polipéptido metabolizante de
D-aminoácido puede alcanzarse fusionando la
secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido
metabolizante de D-aminoácido a una secuencia que
codifica un péptido transitorio para generar una proteína de fusión.
Los productos génicos expresados sin tales péptidos transitorios se
acumulan generalmente en el citosol.
Un ácido nucleico que está incorporado
establemente en el genoma de una planta se hace pasar de generación
en generación a los descendientes de la planta, descendientes cuyas
células pueden expresar el polipéptido metabolizante de
D-aminoácido codificado y así pueden tener
tolerancia a D-aminoácido potenciada.
Una célula de planta puede contener una
secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido
metabolizante de D-aminoácido conectado
operablemente a un elemento regulador específico de planta como
resultado de la introducción de la secuencia de ácido nucleico en
una célula antecesora.
Una célula de planta como la descrita aquí puede
estar comprendida en una planta, una parte de planta o un propágulo
de planta, o un extracto de derivado de una planta según se describe
posteriormente.
También se proporcionan plantas que incluyen una
célula de planta según se describe aquí, junto con cualquier parte o
propágulo de la misma, semilla, progenie autofecundada o híbrida y
descendientes. Particularmente, se proporcionan monocotiledóneas,
dicotiledóneas, gimnospermas y algas transgénicas, helechos y
musgos. De particular interés son las plantas superiores
transgénicas, especialmente cultivos agrícolas y forestales, por
ejemplo cereales, árboles y flores ornamentales, que se han
manipulado para tener un constructo de ácido nucleico como el
descrito anteriormente.
Ejemplos de plantas adecuadas incluyen tabaco,
cucurbitáceas, zanahoria, colza, melones, chiles, vides, lechuga,
fresa, colza oleaginosa, caña de azúcar, trigo, cebada, maíz, arroz,
habas de soja, guisantes, sorgo, girasol, tomate, patata, pimiento,
crisantemo, clavel, álamo, eucalipto, algodón, linaza, cáñamo,
picea, abedul, cacahuetes, centeno y pino.
Una planta de acuerdo con la presente invención
puede ser una que no se procree exactamente en una o más
propiedades. Pueden excluirse variedades de plantas, particularmente
variedades de plantas registrables de acuerdo con Plant Breeders
Rights. Se apunta que una planta no necesita considerarse una
"variedad de planta" simplemente debido a que contenga
establemente dentro de su genoma un transgén, introducido en una
célula de la planta o un antecesor de la misma.
Además de una planta, la presente invención
proporciona cualquier clon de tal planta, semilla, progenie
autofecundada o híbrida y descendientes, y cualquier parte o
propágulo de cualquiera de estos, tales como esquejes y semillas,
que pueda usarse en la reproducción o propagación, sexual o asexual.
Además, se abarca mediante la invención una planta que es una
descendencia, un clon o un descendiente propagado sexualmente o
asexualmente de tal planta, o cualquier parte o propágulo de dicha
planta, descendencia, clon o descendiente.
Otros aspectos de la presente invención
proporcionan el uso de D-aminoácidos para hacer
crecer, regenerar o propagar selectivamente células de planta,
tejido de planta o plantas vasculares, transgénicos, que comprenden
un polipéptido metabolizante de D-aminoácido
heterólogo, según se describe anteriormente.
Un método para producir una planta transgénica
puede comprender:
transformar una célula de planta con un ácido
nucleico o vector que comprende una secuencia que codifica un
polipéptido que metaboliza un substrato de
D-aminoácido, según se describe aquí; y
regenerar una planta a partir de la célula sobre
un medio que comprende una fuente de nitrógeno definida,
en donde la fuente de nitrógeno definida
comprende o consiste en dicho substrato de
D-aminoácido.
Las células de planta transformadas son capaces
de utilizar el D-aminoácido presente en el medio
como una fuente de nitrógeno. Las células que no están transformadas
y no contienen el polipéptido con actividad metabolizante de
D-aminoácido son incapaces de usar esta fuente de
nitrógeno y como resultado su crecimiento se impide.
Por otra parte, el D-aminoácido
en el medio puede tener un efecto tóxico sobre plantas no
transformadas (que no poseen actividad metabolizante de
D-aminoácido).
Un D-aminoácido adecuado para
usar en el medio como un substrato para la enzima metabolizante de
D-aminoácido puede seleccionarse del grupo que
consiste en D-arg, D-ser,
D-glu, D-ala, D-asp,
D-cys, D-gln, D-his,
D-ile, D-leu, D-lys,
D-met, D-phe, D-pro,
D-asn, D-thr, D-trp,
D-tyr y D-val.
Preferiblemente, se usa uno de
D-ser, D-ala, D-glu,
D-asn, D-arg, D-lys,
D-his o D-asp, más preferiblemente
D-ala o D-ser. Estos
D-aminoácidos son tóxicos para las plantas que no
contienen la enzima metabolizante de D-aminoácido
apropiada.
Otros substratos adecuados para la enzima
metabolizante de D-aminoácido incluyen aminoácidos
no proteínicos, precursores de aminoácidos y derivados de
aminoácidos.
El nitrógeno es a menudo el elemento que limita
el crecimiento de plantas en sistemas agrícolas. Composiciones en
las que parte o la totalidad del contenido de nitrógeno está en la
forma de uno o más D-aminoácidos (es decir, el
contenido de nitrógeno del fertilizante está parcialmente o
completamente en la forma de uno o más
D-aminoácidos) son útiles como fertilizantes
preferentes o selectivos para plantas transgénicas que expresan una
enzima que metaboliza el D-aminoácido. Las plantas
no transgénicas, que no expresan tal enzima, derivarán en un
beneficio reducido de tal composición fertilizante. En algunas
modalidades, el D-aminoácido es tóxico para tales
plantas e impide o inhibe activamente su crecimiento. Por ejemplo,
D-ser muestra toxicidad para plantas silvestres
(figura 3).
Se describe aquí una composición para la
fertilización selectiva de una planta transgénica que comprende un
polipéptido que metaboliza un substrato de
D-aminoácido; comprendiendo dicha composición dicho
substrato de D-aminoácido.
La totalidad o parte del contenido de nitrógeno
de la composición puede estar en la forma del substrato de
D-aminoácido (es decir, puede ser la única fuente de
nitrógeno o una de un número de fuentes de nitrógeno en la
composición). La proporción del nitrógeno disponible en la
composición que está en la forma de D-aminoácido
puede ser 0,1%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%,
99% o 100%.
Substratos de D-aminoácido
adecuados para usar en la composición incluyen
D-arg, D-ser, D-glu,
D-ala, D-asp, D-cys,
D-gln, D-his, D-ile,
D-leu, D-lys, D-met,
D-phe, D-pro, D-asn,
D-thr, D-trp, D-tyr
o D-val.
Preferiblemente, se usa uno de
D-ser, D-ala, D-glu,
D-arg, D-lys, D-his,
D-asn o D-asp, más preferiblemente
D-ala o D-ser. Estos
D-aminoácidos son tóxicos para plantas que no
contienen un polipéptido heterólogo que los metabolice,
proporcionando así una acción "doble" tanto promoviendo el
crecimiento de la planta deseado como inhibiendo el crecimiento de
la planta no deseado.
Otros substratos adecuados para el polipéptido
metabolizante de D-aminoácido incluyen
D-aminoácidos no proteínicos, precursores de
D-aminoácidos y derivados de
D-aminoácidos.
Un método para producir un fertilizante como el
descrito anteriormente puede comprender proporcionar una composición
fertilizante de plantas que carece o carece substancialmente de una
fuente de nitrógeno y mezclar con dicha composición un substrato de
D-aminoácido según se describe aquí.
Se describe una composición de herbicida
selectivo que comprende un D-aminoácido.
Tal herbicida inhibirá o reducirá el crecimiento
de plantas que no contienen la enzima metabolizante de
D-aminoácido apropiada, mientras que el crecimiento
de plantas transgénicas que son capaces de metabolizar el
D-aminoácido no estará afectado o, más
preferiblemente, se incrementará o potenciará.
La composición puede comprender 0,1% (p/p) o
más, 1% (p/p) o más, 5% (p/p) o más, 10% (p/p) o más, 15% (p/p) o
más, 20% (p/p) o más, 25% (p/p) o más o 30% (p/p) o más del
D-aminoácido.
Tal composición de herbicida puede usarse en
métodos para controlar el crecimiento de plantas que comprenden
tratar una o más plantas con la composición.
Un método para producir tal composición de
herbicida puede incluir mezclar un D-aminoácido con
una base, un portador o un excipiente.
Bases, portadores y excipientes adecuados para
usar en composiciones agrícolas, en particular herbicidas, son bien
conocidos en la especialidad.
Los D-aminoácidos son
metabolizados por aminoácido oxidasas para producir peróxido de
hidrógeno (H_{2}O_{2}). Este compuesto actúa como una señal que
induce reacciones de defensa en las plantas. Tales reacciones son
activadas generalmente por estreses ambientales tales como luz
excesiva, refrigeración o infección con patógenos.
Una planta que contiene una enzima
D-aminoácido oxidasa responde a
D-aminoácidos añadidos incrementado el
H_{2}O_{2} y de ahí activando reacciones de defensa. Esto
proporciona un mecanismo por el que las respuestas de defensa de la
planta pueden ser activadas específicamente por los cultivadores. La
adición de un D-aminoácido a plantas que expresan el
gen de D-amino oxidasa conduce a un estallido en la
producción endógena de H_{2}O_{2} que induce la reacción
defensiva normal en estas plantas. Esta reacción defensiva podría
ser activada por el cultivador para incrementar la tolerancia al
estrés cuando se trasladan plantas de condiciones interiores a
exteriores, para incrementar la tolerancia a la congelación cuando
existe un riesgo de daño por heladas, cuando se están acumulando
plagas y patógenos conocidos o en otras situaciones en las que una
reacción de defensa activa en la planta es potencialmente
beneficiosa.
beneficiosa.
Un método para producir una planta transgénica
que tiene una respuesta al estrés inducible puede comprender:
transformar una célula de planta con una
secuencia de ácido nucleico que codifica una
D-aminoácido oxidasa; y
regenerar la planta transgénica a partir de la
célula de planta.
Un método para estimular la tolerancia al estrés
de una planta transgénica puede comprender:
expresar en dicha planta un polipéptido que
oxida un substrato de D-aminoácido; y
tratar dicha planta con el substrato de
D-aminoácido.
Polipéptidos de D-aminoácido
oxidasa adecuados se describen anteriormente y se ejemplifican en la
Tabla 1 y la Tabla 2.
Una dosis adecuada de
D-aminoácido estimula una respuesta al estrés sin
provocar daño celular permanente. La dosificación precisa variará de
acuerdo con el tipo de planta, la fase de crecimiento, el tipo de
suelo, la temperatura y las condiciones climatológicas, pero puede
ser determinada fácilmente por un experto para una situación
particular usando metodología habitual.
En algunas modalidades preferidas, pueden usarse
altos niveles de D-aminoácido, por ejemplo de 0,1 a
50 mM de D-aminoácido en el medio de cultivo, más
preferiblemente de 1 a 10 mM, para inducir tolerancia al estrés.
La tolerancia al estrés mejorada puede incluir
tolerancia potenciada o incrementada a estreses ambientales tales
como radiación ultravioleta UV, temperaturas extremas, irradiación
y/o infección por patógenos, por ejemplo infección bacteriana o
fúngica, en particular patógenos necrotizantes, con relación a
plantas no tratadas normales.
La producción de H_{2}O_{2} por
D-aminoácido oxidasas según se describe
anteriormente o la acumulación de productos del metabolismo de
D-aminoácidos puede ser perjudicial para las plantas
transgénicas, si las velocidades de producción son altas y/o si la
producción se produce en un compartimento celular que es sensible a
H_{2}O_{2} u otros productos metabólicos.
Los métodos de la presente invención pueden
utilizarse por lo tanto para retirar selectivamente plantas
transgénicas de poblaciones mixtas, o incluso para retirar híbridos
entre plantas transgénicas y plantas silvestres de poblaciones
naturales.
Un método para inhibir el crecimiento o la
viabilidad de una planta transgénica que expresa un polipéptido que
oxida un substrato de D-aminoácido según se describe
aquí puede comprender:
tratar dicha planta con el substrato de
D-aminoácido.
La localización de D-aminoácido
oxidasa expresada en el peroxisoma produce H_{2}O_{2} que puede
ser metabolizado rápidamente por la enzima degradadora de
H_{2}O_{2} catalasa. Por lo tanto, se requieren altos niveles de
D-aminoácidos para producir niveles dañinos de
H_{2}O_{2}. La expresión de D-aminoácido oxidasa
en el citosol, donde los niveles de actividad de catalasa son
inferiores, reduce la cantidad de D-aminoácido
requerida para producir niveles dañinos de H_{2}O_{2}.
La expresión de D-aminoácido
oxidasa en el citosol puede alcanzarse retirando señales de
orientación al peroxisoma o péptidos transitorios de la secuencia de
ácido nucleico codificante.
La adición de un D-aminoácido
puede usarse por lo tanto para inhibir o reducir el crecimiento o la
viabilidad de una planta transgénica que tiene una actividad de
D-aminoácido oxidasa citosólica.
Un método para inhibir el crecimiento o la
viabilidad de una planta transgénica que expresa un polipéptido que
oxida un substrato de D-aminoácido según se describe
aquí puede comprender:
provocar o permitir la acumulación del
polipéptido en el citosol de dicha planta; y
tratar dicha planta con el substrato de
D-aminoácido.
D-aminoácidos que exhiben baja
toxicidad para plantas silvestres, por ejemplo
D-ile, D-asn o
D-gln, pero que, después del metabolismo en plantas
transgénicas que contienen D-aminoácido oxidasas
endógenas, conducen a la producción de H_{2}O_{2} u otros
productos metabólicos tóxicos, son particularmente adecuados en
tales métodos.
Pueden realizarse experimentos de control según
sea apropiado en los métodos descritos aquí. El comportamiento de
los controles adecuados está totalmente dentro de la competencia y
la capacidad de un experto en la materia.
Diversos aspectos y modalidades de la presente
invención serán evidentes para los expertos en la especialidad en
vista de la presente descripción.
Ciertos aspectos y modalidades de la invención
se ilustrarán ahora a modo de ejemplo y con referencia a las figuras
descritas posteriormente.
La figura 1 muestra el peso fresco de plantas de
Arabidopsis thaliana durante 20 días en cultivo en agar
estéril y alimentadas con diferentes fuentes de N. Las plantas de
control se dejaron crecer sin ninguna fuente de nitrógeno.
La figura 2 muestra ejemplos de conversiones
metabólicas potenciales de D-aminoácidos en
organismos.
La figura 3 muestra el peso fresco de plantas
silvestres (Wt; barras negras) y plantas transformadas con el gen
bacteriano que codifica la enzima bacteriana
D-serina deshidratasa (dsdA21, barras de color gris
claro), desarrolladas sobre agar estéril y alimentadas con
D-serina a diferentes concentraciones (2,5, 30, 3 y
0,3 mM) con (MS) o sin (MS-N) la fuente de nitrógeno
estándar, el nitrato.
La figura 4 muestra la biomasa (a) y el
contenido de nitrógeno (b) en la recogida de Arabidopsis
thaliana desarrollada durante 14 días después de la germinación.
Las plantas se hicieron crecer sobre medio MS de intensidad media
sin fuentes de nitrógeno distintas de la D-serina.
Las barras abiertas son plantas transgénicas que expresan
dsdA, las barras rayadas son plantas silvestres. Las barras
representan media ± error estándar, n = 4.
La figura 5 muestra la biomasa (a) y el
contenido de nitrógeno (b) en la recogida de Arabidopsis
thaliana desarrollada durante 14 días después de la germinación.
Las plantas se hicieron crecer sobre medio MS de intensidad media
con nitrato 3 mM como una alimentación de N básica y se les
aportaron diferentes concentraciones de D-serina.
Las barras abiertas son plantas transgénicas que expresan
dsdA, las barras rayadas son plantas silvestres. Las barras
representan media ± error estándar, n = 4.
Las Tablas 1 y 2 muestran ejemplos de
polipéptidos que tienen actividad metabolizante de
D-aminoácido que pueden usarse de acuerdo con la
invención.
El gen de E. coli dsdA
(D-serina deshidratasa (D-serina
desaminasa) [EC: 4.3.1.18] número de registro del
NCBI J01603) se amplificó mediante PCR usando los cebadores 5'-AATGGATCCTCATCTAAGCGCAAAGAGACG
TACTATGG y 5'-ATTGGATCCATGCTGCGTTGAAACGTTATTAACGG. Los productos de PCR se subclonaron en pT-easy (Promega) y se sometieron a secuenciación con el estuche de secuenciación cíclico DYEnamics (Amersham Pharmacia biotech). El análisis del alineamiento con la secuencia de la base de datos confirmaba la clonación de longitud completa satisfactoria de dsdA. El clon se ligó subsiguientemente en el sitio BamH1 del casete de expresión de CaMV 35S del vector binario pPCV702Km, que es un plásmido de Ti desarmado de Agrobacterium tumefaciens, para generar el vector pPCV702:dsdA. El análisis de restricción de este vector con endonucleasa confirmaba la orientación de la inserción.
NCBI J01603) se amplificó mediante PCR usando los cebadores 5'-AATGGATCCTCATCTAAGCGCAAAGAGACG
TACTATGG y 5'-ATTGGATCCATGCTGCGTTGAAACGTTATTAACGG. Los productos de PCR se subclonaron en pT-easy (Promega) y se sometieron a secuenciación con el estuche de secuenciación cíclico DYEnamics (Amersham Pharmacia biotech). El análisis del alineamiento con la secuencia de la base de datos confirmaba la clonación de longitud completa satisfactoria de dsdA. El clon se ligó subsiguientemente en el sitio BamH1 del casete de expresión de CaMV 35S del vector binario pPCV702Km, que es un plásmido de Ti desarmado de Agrobacterium tumefaciens, para generar el vector pPCV702:dsdA. El análisis de restricción de este vector con endonucleasa confirmaba la orientación de la inserción.
Plantas de A. thaliana, ecotipo
Col-0, se transformaron con una cepa de
Agrobacterium tumefaciens (GV3101:
pM90 RK) a través de infiltración a vacío (Clough, S. J. & Bent, A. F. Plant Journal. 16, 735-743 (1998)). Los transformantes se seleccionaron sobre placas que contenían kanamicina y se confirmaron molecularmente usando transferencias Northern. Todos los análisis se realizaron usando líneas homocigóticas para el rasgo transgénico.
pM90 RK) a través de infiltración a vacío (Clough, S. J. & Bent, A. F. Plant Journal. 16, 735-743 (1998)). Los transformantes se seleccionaron sobre placas que contenían kanamicina y se confirmaron molecularmente usando transferencias Northern. Todos los análisis se realizaron usando líneas homocigóticas para el rasgo transgénico.
Se construyeron plantas transgénicas que
expresaban D-aminoácido oxidasa esencialmente del
mismo modo que las plantas dsdA descritas anteriormente, con
las siguientes modificaciones: el gen dao1 (EC: 1.4.3.3:
NCBIU60066) de la levadura Rhodotorula gracilis
(Rhodosporidium toruloides) se clonó con PCR con una
biblioteca de cDNA preparada a partir de levadura desarrollada sobre
medio que contenía D-alanina para inducir la
expresión del gen diana, como una plantilla. Los cebadores de PCR
eran 5'-ATTAGATCTTACTACTCGAAGGACGCCATG y
5'-AT
TAGATCTACAGCCACAATTCCCGCCCTA.
TAGATCTACAGCCACAATTCCCGCCCTA.
También se realizó PCR con otro grupo de
cebadores, flanqueando un cebador el extremo 5' del marco de lectura
abierto según se indica anteriormente y excluyendo un cebador 3' los
6 últimos nucleótidos. Los 9 últimos nucleótidos codifican el
péptido de señal SKL, que guía la proteína al orgránulo subcelular
peroxisoma.
Las secuencias amplificadas resultantes
codifican proteínas que tienen la misma secuencia de aminoácidos
pero que difieren con respecto a su localización en la célula. El
polipéptido truncado, sin el péptido de señal, se expresa en el
citosol, mientras que el polipéptido de longitud completa se expresa
en el peroxisoma.
Semillas de A. thaliana procedentes de
plantas no transformadas y plantas transformadas con
D-serina amoníaco liasa se esterilizaron
superficialmente con etanol al 70% y Tween 80 al 0,1% durante 10
minutos y se enjuagaron brevemente en etanol al 95%. Se sembraron 10
semillas en cada placa y las placas se sellaron posteriormente con
cinta permeable al gas. El medio de crecimiento era MS de intensidad
media (Murashige, T. & Skoog, F. Physiol Plant 15,
310-313 (1962)) (con sacarosa al 0,5% p/v y agar al
0,8% p/v) con nitrógeno excluido o incluido como nitrato 3 mM. Se
añadió al medio D-serina esterilizada por filtración
después del tratamiento en autoclave. Las plantas se desarrollaron
durante 14 días después de la germinación con un fotoperíodo de 16 h
a 24ºC. Las plantas se extrajeron de las placas, se lavaron tres
veces en CaCl_{2} 0,5 mM y posteriormente se secaron a 40ºC
durante 48 horas antes de las medidas del peso seco. El contenido de
N se determinó sobre plantas secadas usando un analizador elemental
(PerkinElmer 2400 CHN). La biomasa y el contenido de nitrógeno se
midieron sobre una base por placa y había 10 plantas por placa. Seis
líneas transgénicas independientes se evaluaron con respecto a su
capacidad para desarrollarse sobre D-serina y no se
apreció diferencia substancial entre las líneas, aunque los niveles
del transcrito dsdA variaban substancialmente de acuerdo con un
análisis de transferencia Northern.
Para la transformación de piceas, el vector de
expresión tenía una cadena principal de pUC8 con un casete de
expresión de 35S con dsdA y un casete pUbi-Bar
(promotor de ubiquitina con el gen Bar que confiere resistencia a
BASTA) con el propósito de selección de BASTA. El método de
transformación usado era bombardeo con partículas de una suspensión
de células.
Se observó el crecimiento de plantas de
Arabidopsis thaliana silvestres en cultivo en agar estéril
usando diferentes fuentes de N. Los resultados se muestran en la
Figura 1. Se observó poco o ningún crecimiento para plantas
desarrolladas sobre medios de D-aminoácido.
Semillas de Solanum esculentum, Hordeum
vulgare, Zea mays, Populus tremuloides, Nicotiana tabacum y
Arabidopsis thaliana se esterilizaron superficialmente y se
hicieron crecer durante de dos a tres semanas en medio de agar
idéntico al medio libre de nitrato descrito anteriormente y se
complementaron con D-serina 0, 0,3, 3 y 30 mM. Se
observó que el crecimiento de Lycopersicon esculentum, Populus
tremuloides, Nicotiana tabacum y Arabidopsis thaliana era
inhibido a una concentración de D-serina 3 mM en el
medio, mientras que el crecimiento de Zea mays y Hordeum vulgare se
inhibía a 30 mM.
Se observó que la D-serina y
varios otros D-aminoácidos inhibían el crecimiento
de A. thaliana silvestre y otras especies. Para A.
thaliana, se observó una clara inhibición del crecimiento a una
concentración de D-serina 0,3 mM en el medio de
crecimiento y la inhibición del crecimiento total se producía a 3 mM
(Fig. 2).
Cultivos en suspensión de células embrionarias
somáticas de Picea abies se desarrollaron sobre un intervalo
de concentraciones de D-serina,
D-serina 0, 0,3, 3 y 30 mM. La
D-serina era letal para las células a y por encima
de 3 mM. Se encontró que era posible seleccionar embriones
transformados con dsdA sobre un medio de D-serina
que contenía 3 mM de D-serina.
Estos resultados demuestran las propiedades
herbicidas de los D-aminoácidos sobre plantas
silvestres.
Arabidopsis thaliana se transformó con el
gen de E. coli dsdA, que codifica D-serina
amoníaco liasa [EC:4.3.1.18] bajo el control del promotor 35S de
CaMV. La D-serina amoníaco liasa convierte la
D-serina en los productos amonio, piruvato y agua,
que son fácilmente utilizados por las plantas, y las plantas
transformadas pueden crecer sobre D-serina como su
única fuente de N.
Plantas de Arabidopsis thaliana
transgénicas que expresan el gen que codifica
D-serina deshidratasa se hicieron crecer
estérilmente junto con plantas silvestres sobre agar durante 20 días
sobre medio MS estándar complementado con concentraciones variables
de D-serina como la única fuente de N (30 mM; 3 mM,
0,3 mM) junto con un control que carece de nitrógeno.
El crecimiento mínimo de plantas tanto
transgénicas como silvestres se observó sobre el medio de control
que carecía de nitrógeno. Se observó que tanto el crecimiento como
el contenido de N de las plantas transgénicas se incrementaba
significativamente (análisis de varianza, p<0,001) con la
concentración creciente de D-serina (fig. 4a, b). No
se observó incremento en el crecimiento de las plantas silvestres
(figura 3). En presencia de un nivel básico de nitrato, el
crecimiento y el contenido de nitrógeno de las plantas transgénicas
también se incrementaban significativamente (p<0,0001) con
concentración creciente de D-serina, mientras que la
respuesta opuesta se encuentra para plantas silvestres (fig. 5).
Esto indica que la D-serina tiene un efecto tóxico
sobre la planta silvestre pero no sobre la planta transgénica.
Dentro del intervalo observado de D-Ser, las plantas
transgénicas no mostraban síntomas de toxicidad.
La respuesta relativa de crecimiento a la
concentración de D-serina incrementada es similar ya
reciban o no las plantas transgénicas un suministro básico de
nitrato (fig. 4a y 5a). Sin embargo, la respuesta correspondiente en
el contenido de N de la planta es superior en plantas alimentadas
tanto con D-serina como con nitrato (fig. 4b y 5b).
A igual concentración, el crecimiento de plantas sobre nitrato es
significativamente superior que sobre D-serina (fig.
4a y 5a). Sin embargo, la concentración de N de plantas
desarrolladas sobre D-serina 3 mM es
significativamente inferior que en plantas desarrolladas sobre
nitrato 3 mM (ANOVA, p<0,0001). La causa del crecimiento inferior
sobre D-serina es desconocida pero la concentración
de N relativamente baja de plantas desarrolladas en
D-serina puede indicar una velocidad de captación
inferior de esta forma de N en comparación con la de nitrato.
La selección satisfactoria de plantas de
Arabidopsis transgénicas también se alcanzó pulverizando
D-serina 30 mM tres veces durante una semana sobre
plántulas de Arabidopsis desarrolladas en suelo.
La construcción de plantas de Arabidopsis
thaliana que expresan D-glutamato racemasa de
E. coli se realizó esencialmente del mismo modo que se
describe anteriormente. El gen murI, número de registro del NCBI
AAC76949, codifica la racemasa EC: 5.1.1.3. Los cebadores para la
clonación del gen se diseñaron para flanquear el marco de lectura
abierto sobre la base de la secuencia de la base de datos.
Se observó que las plantas transgénicas
sobrevivían y se desarrollaban sobre medios convencionales y fuentes
de nitrógeno convencionales.
La construcción de plantas de Arabidopsis
thaliana que expresan dos variantes de
D-aminoácido oxidasa de Rhodotorula gracilis
se realizó como se describe anteriormente.
Se observó que estas plantas transgénicas
sobrevivían y crecían sobre medios convencionales con una fuente de
nitrógeno convencional.
Resultados similares a los descritos para
plantas que expresan D-serina
amoníaco-liasa se obtuvieron cuando se expresaba el
gen de levadura (Rhodotorula gracilis) que codifica
D-aminoácido oxidasa (EC 1.4.3.3) en A.
thaliana, es decir el crecimiento y el contenido de N de las
plantas transgénicas se incrementaba con relación a las plantas
silvestres sobre medios que contenían
D-aminoácidos.
La D-aminoácido oxidasa tiene
una gama de D-aminoácidos de substrato y las pruebas
con D-alanina y D-serina confirmaban
que la enzima D-aminoácido oxidasa también podría
convertir estas formas de N en fuentes de N accesibles y así aliviar
la toxicidad provocada por la D-alanina y la
D-serina.
Se observó que D-Asn 30 mM
detenía eficazmente a las plantas que expresaban
D-amino oxidasa del crecimiento en cultivo en agar
estéril. No se observó germinación para plantas que expresaban
D-amino oxidasa, indicando una inhibición total del
crecimiento. Se observó que las plantas silvestres germinaban y
crecían lentamente para producir pequeños vástagos verdes. Así, el
crecimiento silvestre solo era parcialmente retardado y las plantas
silvestres se rescataron y se pusieron en suelo para la
recuperación.
Se encontró que la D-ile era
incluso más eficaz para impedir el crecimiento de plantas
transgénicas que expresaban dao1 sin efecto inhibidor visible
sobre plantas silvestres. Se encontró que Arabidopsis
silvestre incrementaba en el crecimiento con una concentración de
D-ile creciente, dentro del intervalo examinado (de
0,3 a 30 mM).
Aunque no se observaron diferencias
significativas entre D-amino oxidasa expresada
citosólica y peroxisomática, se encontró que la construcción
peroxisomática era marginalmente más eficaz que la versión
citosólica con respecto a inhibir la germinación de la planta con
D-amino oxidasa sobre D-Asn 30 mM.
Sin embargo, ambas construcciones son inhibidas significativamente
más que la silvestre y así pueden usarse para una selección negativa
condicional.
Álamo y tabaco se transformaron usando el mismo
vector y protocolo de transformación descrito anteriormente para la
transformación de Arabidopsis.
Se observó que D-Ser 3 mM y 30
mM era suficiente para detener toda la formación de vástagos de
álamo y tabaco silvestres, respectivamente, cuando se ponía en medio
inductor de vástagos. Sin embargo, se encontró que el tabaco y el
álamo transformados con dsdA eran resistentes a
D-Ser a concentraciones que superaban 30 mM.
Las plantas transgénicas producidas según se
describe aquí metabolizan formas de N que son inaccesibles para
otras plantas. Esto permite que N añadido se oriente hacia tales
plantas en entornos de plantas mixtas. Los
D-aminoácidos aplicados tienen un efecto doble al
promover el crecimiento de plantas transgénicas e inhibir el
crecimiento de otras plantas y esto puede crear efectos sinérgicos
cuando se usa en la agricultura. El control directo sobre los
recursos de N puede reducir la cantidad de N que es necesaria para
un buen crecimiento, reduciendo potencialmente la presión ambiental
provocada por cargas de N innecesariamente altas. Por otra parte, en
sistemas de cultivo en los que las plantas cosechadas tienen una
ventaja competitiva accediendo a un recurso específico de N, la
demanda de control de malas hierbas puede disminuir, reduciendo la
necesidad global de herbicidas.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
<110> SweTreeGenomics AB
\hskip1cmNasholm, Torgny
\hskip1cmErikson, Oskar
\hskip1cmHertzberg, Magnus
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Crecimiento selectivo de plantas
usando D-aminoácidos
\vskip0.400000\baselineskip
<130> NRS/6123806
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/EP03/00222
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<141>
2003-01-13
\vskip0.400000\baselineskip
<150> GB 0201043.7
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-01-17
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatggatcct catctaagcg caaagagacg tactatgg
\hfill38
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<210> 2
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\hskip-.1em\dddseqskipattggatcca tgctgcgttg aaacgttatt aacgg
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\hskip-.1em\dddseqskipattagatcta cagccacaat tcccgcccta
\hfill30
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Claims (17)
1. Un ácido nucleico aislado que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una
actividad metabolizante de D-aminoácido, estando la
secuencia conectada operablemente a un elemento regulador específico
de planta heterólogo al gen que codifica la enzima metabolizante de
D-aminoácido.
2. Un ácido nucleico de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la actividad metabolizante de
D-aminoácido se selecciona del grupo que consiste en
actividad de oxidasa, racemasa, carboxilasa, transaminasa o
deshidratasa.
3. Un ácido nucleico de acuerdo con la
reivindicación 2, en el que el polipéptido se muestra en la Tabla 1
o la Tabla 2.
4. Un ácido nucleico de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho
D-aminoácido se selecciona del grupo que consiste en
D-ser, D-ala, D-glu,
D-arg, D-lys, D-his,
D-asp, D-asn o
D-gln.
5. Un ácido nucleico de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además una
secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido heterólogo.
6. Un ácido nucleico de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho
polipéptido que tiene actividad metabolizante de
D-aminoácido comprende un péptido transitorio que
dirige la acumulación de dicha enzima en un compartimento
intracelular de dicha célula de planta.
7. Un vector de expresión que comprende un ácido
nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
6.
8. Una célula de planta que comprende un vector
de expresión de acuerdo con la reivindicación 7 o un ácido nucleico
de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
9. Una planta que comprende una célula de planta
de acuerdo con la reivindicación 8.
10. Una planta de acuerdo con la reivindicación
9, que es una monocotiledónea, una dicotiledónea, una gimnosperma,
un alga, un helecho o un musgo.
11. Un método para producir una planta
transgénica, que comprende:
transformar una célula de planta con un vector
de expresión de acuerdo con la reivindicación 7; y
regenerar dicha planta a partir de dicha célula
sobre un medio que comprende un D-aminoácido.
12. Un método de acuerdo con la reivindicación
11, en el que el medio comprende una sola fuente de nitrógeno,
consistiendo dicha fuente de nitrógeno en un
D-aminoácido.
13. Un método para controlar el crecimiento de
plantas que comprende tratar una planta de acuerdo con la
reivindicación 9 ó 10 con una composición que comprende un
D-aminoácido.
14. Un método para estimular la tolerancia al
estrés de una planta, que comprende:
expresar en dicha planta un polipéptido que
oxida un substrato de D-aminoácido, expresándose
dicho polipéptido mediante un ácido nucleico de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; y
tratar dicha planta con dicho substrato de
D-aminoácido.
15. Un método para inhibir el crecimiento de una
planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 9 ó 10, que
expresa un polipéptido que oxida un substrato de
D-aminoácido; comprendiendo el método
tratar la planta con el substrato de
D-aminoácido.
16. Un método de acuerdo con la reivindicación
15, en el que el substrato de D-aminoácido es
D-ile o D-asn.
17. Uso de un ácido nucleico de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en un método para la
selección de células de planta transformadas.
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