MXPA04006606A - CRECIMIENTO SELECTIVO DE LAS PLANTAS UTILIZANDO D-AMINOáCIDOS. - Google Patents

Abstract

Esta invencion se refiere a plantas y celulas de plantas las cuales expresan enzimas heterologas metabolizadoras del D-aminoacido y por lo tanto pueden emplear D-aminoacidos como una fuente de nitrogeno. Los metodos y medios se proporcionan para modular selectivamente el crecimiento y tolerancia a la tension de tales plantas utilizando D-aminoacidos.

Description

European patent (AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, (88) Date of paUicattoa of tbe ¡Dteroatioiial search report: BS, FL FR, GB, GR, HU, IB. IT, LU, MC L, PT, SE, SI, 24 December2003 SK, TR), OAPI patent (BF. BJ, CF, CG, O, CM, GA, QN, GQ, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TO). For two-letter codes and olher abbreviafíons, rtfer to Ihe "Gvid- PuWished: anee Notes on Codes andAbbreviations " appearing at the begin- — with International search repon ning of each regular issue of the PCT Gazettt. 1 CRECIMIENTO SELECTIVO DE LAS PLANTAS UTILIZANDO D-AMINOÁCIDOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al crecimiento selectivo de células de plantas, tejido de plantas o plantas vasculares que contengan material genético extraño.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El nitrógeno en grandes cantidades es necesario para las plantas como un nutriente mineral. El crecimiento de plantas, particularmente en la agricultura, frecuentemente está limitado por la cantidad de nitrógeno disponible. Tradicionalmente, se han considerado que las plantas utilicen solamente amoníaco y/o nitrato como fuentes de nitrógeno. Estos compuestos se proporcionan ya sea mediante procesos naturales, tales como la mineralización de nitrógeno orgánico y la fijación del nitrógeno por medio de procariotes simbióticos, o por medio de la aplicación de fertilizantes que contengan nitrógeno fijado industrialmente . Sin embargo, una investigación reciente ha indicado que las plantas también pueden tener acceso a ciertos compuestos de nitrógeno orgánico, así como a nitrógenos inorgánicos (Násholm, T. et al. (1998) Nature 392, 914-916, Násholm, T. et al (2000) Ecology 81: 1155-1161, Násholm, T. y Persson, J. 2 (2001) P ysiol Plant 111: 419-426, Lipson, D. y Násholm, T. (2001) Oecologia 128: 305-316). En particular, la absorción y el metabolismo de los aminoácidos desde la tierra de cultivo parecen ser una característica ubicua de las plantas. Entre los aminoácidos utilizados como componentes esenciales para las proteínas, se pueden encontrar todos excepto uno (glicina) en dos formas isoméricas las cuales se distinguen por su capacidad de rotar la luz polarizada. La forma encontrada en grandes cantidades en la naturaleza, rota la luz a la izquierda y se denomina L- o levo-rotatoria, mientras que la forma menos común se denomina D- o dextro-rotatoria . Aunque los D-aminoácidos se encuentran en la naturaleza, los mismos están presentes solamente en concentraciones muy bajas y solamente en compuestos específicos como proteínas de pared celular en bacterias (por ejemplo, en el compuesto péptidoglucano) . A pesar de que los transportadores de aminoácidos de las plantas median el transporte de las formas tanto D- como L- de los aminoácidos (Soldal, T. y Nissen, P. (1978) Physiol. Plant. 43: 181-188, Boorer, K. J. et al. 1996. J. Biol . Chem 271: 2213-2220, ontamat et al (1999) Plant Mol. Biol. 41: 259-268) , las plantas carecen de las enzimas necesarias para convertir los D-aminoácidos en formas de nitrógeno que se 3 puedan utilizar en las reacciones sintéticas dentro de la planta. Por lo tanto las plantas no pueden utilizar los D-aminoácidos como una fuente de nitrógeno. Sin embargo, la capacidad de metabolizar los D-aminoácidos, está muy difundida entre las bacterias, hongos y animales. Se han descrito varias reacciones, que llevan al catabolismo de los D-aminoácidos en los organismos (ver la figura 2) (Friedman, M (1999) J. Agrie. Food Chem. 47: 3457-3479, Pilone, M. S. (2000) CMLS 57: 1732-1747, Yurimoto et al. (2000) Yeast 16 (13) : 1217-1227) .

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los presentes inventores han descubierto que las plantas que expresan un gen heterólogo que codifica una enzima que metaboliza un D-aminoácido, son capaces de utilizar aquel D-aminoácido como una fuente de nitrógeno y de crecer en el medio que de otra manera no podría dar soporte al crecimiento de plantas de tipo silvestre. Generalmente, solamente es necesaria una sola enzima que metabolice un D-aminoácido para convertir el D-aminoácido en compuestos que puedan participar en las vías usuales de las plantas del metabolismo de nitrógeno (es decir, compuestos los cuales no sean dextrorrotatorios) . 4 Por ejemplo, la enzima D-serina deshidratasa se puede utilizar para convertir la D-serina en amoníaco, piruvato y agua y las D-aminoácido oxidasas se pueden utilizar para convertir los D-aminoácidos en amoníaco, un ceto-ácido (dependiendo del substrato de D-aminoácido) y peróxido de hidrógeno. El nitrógeno que de otra manera se enlaza inaccesiblemente a los D-aminoácidos, por consiguiente se puede convertir enzimáticamente en formas que se pueden utilizar fácilmente por la planta. Un aspecto de la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido el cual tiene la actividad metabolizante del D-aminoácido, la secuencia se enlaza operablemente a uno o más elementos reguladores específicos de la planta. En algunas modalidades de la invención, un ácido nucleico aislado puede consistir de una secuencia que codifica un polipéptido la cual tiene la actividad metabolizadora del D-aminoácido y uno o más elementos reguladores específicos de la planta, enlazados operablemente a la secuencia. En algunas modalidades, se pueden utilizar D-aminoácidos como marcadores de selección. Como se describe anteriormente un ácido nucleico aislado puede comprender además una secuencia de ácido nucleico heteróloga la cual codifique un polipéptido de interés. La expresión de este polipéptido, por 5 ejemplo, puede alterar el fenotipo de una planta de una manera ventajosa o producir otros efectos benéficos. La expresión del polipéptido con la actividad metabolizadora del D-aminoácido permite la selección eficiente de transformantes los cuales contengan esta secuencia de ácido nucleico heteróloga, como se describe en la presente. Un polipéptido el cual tiene una actividad metabolizadora del D-aminoácido significa un polipéptido que convierte un substrato de D-aminoácido en productos los cuales son substratos para enzimas de plantas endógenas (es decir los mismos se pueden metabolizar por las plantas) . Los productos que se metabolizan por las plantas incluyen compuestos no dextro-rotatorios es decir compuestos L o no quirales. El polipéptido metabolizador del D-aminoácido por lo tanto cataliza la conversión bioquímica de un substrato del D-aminoácido en productos, por ejemplo productos no dextro-rotatorios, los cuales se pueden utilizar por las plantas como fuentes de nutrientes, en particular como fuentes de nitrógeno . Un polipéptido metabolizador del D-aminoácido, adecuado, puede ser una enzima eucariótica, por ejemplo de una levadura (por ejemplo Rhodotorula gracilis) , hongos, o animales o la misma puede ser una enzima procariótica , por ejemplo, de una bacteria tal como Escherichia coli. Los ejemplos de polipéptidos adecuados los cuales metabolizan los D-aminoácidos, se muestran en la Tabla 1 y la Tabla 2. Como se describe anteriormente, se ha reportado actividad metabolizadora del D-aminoácido endógeno en las plantas. El substrato para el polipéptido metabolizador del D-aminoácido puede ser D-arg, D-glu, D-ala, D-asp, D-cys, D-gln, D-his, D-ile, D-leu, D-lys, D-met, D-asn, D-phe, D-pro, D-ser, D-thr, D-trp, D-tyr ó D-val . Otros substratos adecuados para las enzimas metabolizadoras del D-aminoácido, incluyen aminoácidos dextro-rotatorios que no son de proteínas, precursores de aminoácidos dextro-rotatorios y derivados de aminoácidos dextro-rotatorios. Tales substratos se pueden utilizar como una fuente de nitrógeno de las plantas solamente después de su conversión en una forma metabolizable adecuada mediante una enzima metabolizadora del D-aminoácido. Los precursores adecuados incluyen D—ornitina y D-citrulina. Preferiblemente, el substrato para el polipéptido metabolizador del D-aminoácido es uno de D-ser, D-asn, D-ala, D-ile, D-glu, D-arg, D-lys, D-his ó D-asp, más preferiblemente D-ala, D-ile ó D-ser. La presencia de un grupo de amida no quiral en un D-aminoácido puede producir pequeñas cantidades del 7 crecimiento de plantas, cuando este grupo se puede metabolizar frecuentemente por una planta y se puede utilizar como una fuente de nitrógeno. Por ejemplo, en un medio que contiene D-gln, glutamato sintasas endógenas, actúa en el grupo de amida no quiral para generar D-glu. Como los productos de tal actividad no quiral son otros compuestos D-amino los cuales no se metabolizan por sí mismos por las enzimas de plantas endógenas, las relaciones de crecimiento con estos D-aminoácido son bajas, aún cuando algún nitrógeno esté disponible. El polipéptido metabolizador del D-aminoácido por ejemplo, puede ser una oxidasa, racemasa, descarboxilasa, transaminasa o deshidratasa (también llamada una liasa de amoníaco) . Las oxidasas catalizan la conversión de un D-aminoácido en NH+, un ceto-ácido (dependiendo del substrato del D-aminoácido) y H202 (ver la figura 2) . Las racemasas convierten un D-aminoácido en la correspondiente forma de L-aminoácido. Los L-aminoácidos son útiles como una fuente de nitrógeno para las plantas. Las descarboxilasas convierten un D-aminoácido en un ?-aminoácido el cual se puede metabolizar por las plantas. Las transaminasas convierten un D-aminoácido en una forma diferente de L- o D-aminoácido. Los L-aminoácidos se pueden metabolizar entonces directamente aunque los D- 8 aminoácidos puedan padecer una conversión adicional en formas metabolizables . Las deshidratasas catalizan la conversión de un D-aminoácido en NH4+, un ceto-ácido (dependiendo del substrato del D-aminoácido) y H20 (ver la figura 2) . Los ejemplos de oxidasas, racemasas, transaminasas y deshidratasas adecuadas, se muestran en la Tabla 1 y Tabla 2. En las modalidades preferidas, el polipéptido metabolizador del D-aminoácido es una deshidratasa, por ejemplo D-ser amoníaco liasa (conocida con anterioridad como D-ser deshidratasa) o una oxidasa, por ejemplo D-aminoácido oxidasa . Una persona experta es capaz de determinar fácilmente utilizando técnicas habituales, si un polipéptido posee una actividad metabolizadora del D-aminoácido (es decir, es una enzima metabolizadora del D-aminoácido) , como se describe anteriormente . Los polipéptidos adecuados metabolizadores del D-aminoácido también incluyen fragmentos, mutantes, derivados, variantes y alelos de los polipéptidos ejemplificados en la Tabla 1 y Tabla 2. Los fragmentos, mutantes, derivados, variantes y alelos son adecuados aquellos que conservan las características funcionales del polipéptido metabolizador del D-aminoácido es decir que catalicen la reacción de un substrato de D-aminoácido en una forma metabolizable de la planta. Los cambios a una secuencia, para producir un mutante, variante o derivado, pueden ser por medio de una o más adiciones, inserciones, supresiones o sustituciones de uno o más nucleótidos en el ácido nucleico, que conduzcan a la adición, inserción, supresión o sustitución de uno o más aminoácidos en el polipéptido codificado. Por supuesto, se incluyen cambios al ácido nucleico que no hacen diferencia en la secuencia de aminoácidos codificada. Un polipéptido que metaboliza un substrato del D-aminoácido puede comprende una secuencia de aminoácidos la cual comparte más de aproximadamente 30% de la identidad de secuencia con una secuencia mostrada en la Tabla 1 ó Tabla 2, más de aproximadamente 35%, más de aproximadamente 40%, más de aproximadamente 45%, más de aproximadamente 55%, más de aproximadamente 65%, más de aproximadamente 70%, más de aproximadamente 80%, más de aproximadamente 90%, ó más de aproximadamente 95%. La secuencia puede compartir más del 30% de la similitud con una secuencia mostrada en la Tabla 1 ó Tabla 2, más de aproximadamente 40% de la similitud, más de aproximadamente 50% de la similitud, más de aproximadamente 60% de la similitud, más de aproximadamente 70% de la similitud, más de aproximadamente 80% de la similitud ó más de aproximadamente 90% de la similitud. 10 La similitud e identidad de la secuencia se define comúnmente con referencia al algoritmo GAP (Genetics Computer Group, Madison, WI) . El GAP utiliza el algoritmo de Needleman y unsch para alinear dos secuencias completas que maximizan el número de coincidencias y minimizan el número de diferencias. Generalmente, se utilizan parámetros de penalización, con una penalización por creación de separaciones 12 y una penalidad por extensión de separaciones = 4. Se puede preferir el uso del GAP aunque se pueden utilizar otros algoritmos, por ejemplo BLAST (el cual utiliza el método de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 405-410) , FASTA (el cual utiliza el método de Pearson y Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448), ó el algoritmo de Smith-Waterman (Smith y Waterman (1981) J. Mol Biol. 147: 195-197), o el program TBLASTN, de Altschul et al. (1990) supra, que emplean por lo general parámetros por defecto. En particular, se puede utilizar el algoritmo psi-Blast (Nucí. Acids Res. (1997) 25 3389-3402) . La similitud permite la "variación conservadora", es decir, la sustitución de un residuo hidrófobo tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro, o la sustitución de un residuo polar por otro, tal como arginina por lisina, ácido glutámico por aspártico, o glutamina por 11 asparagina. Las variantes de la secuencia de aminoácidos particular puede diferir de una secuencia de polipéptidos conocida como se describe aquí mediante la inserción, adición, sustitución o supresión de 1 aminoácido, 2, 3, 4, 5-10, 10-20 20-30, 30-50, ó más de 50 aminoácidos. Una secuencia o elemento regulador específico de la planta es una secuencia que preferencialmente dirige la expresión (es decir la trascripción) de un ácido nucleico dentro de una célula de la planta con relación a otros tipos de células. Por ejemplo, la expresión de tal secuencia se puede reducir o eliminar en las células que no sean de plantas, tales como bacterias o células de mamíferos. Una secuencia reguladora, adecuada, por ejemplo, se puede derivar de un virus de plantas tal como el Virus 35 de Mosaico de la Coliflor. Una secuencia reguladora preferiblemente es heteróloga o extraña al gen que codifica la enzima metabolizadora del D-aminoácido. Tales secuencias reguladoras pueden proporcionar una expresión eficiente dentro de la célula de la planta. El término "heterólogo" se puede utilizar para indicar que el gen/secuencia de nucleótidos en cuestión se ha introducido en dichas células de la planta o en un ancestro de la misma, utilizando ingeniería genética o medios recombinantes, es decir por medio de la intervención humana. Las secuencias de nucleótidos heterólogas, o exógenas o extrañas, para las células de la plantas pueden estar presentes de manera no natural en las células de ese tipo, variedad o especie. Por ejemplo, no existen reportes de las enzimas metabolizadoras del D-aminoácido (es decir enzimas que convierten los D-aminoácidos en formas metabolizables por las plantas) en células de plantas y el ácido nucleico que codifica un polipéptido con esta actividad por lo tanto es "heterólogo" para una célula de la planta transformada con el mismo . Además de las secuencias reguladoras que son heterólogas al gen que codifica el polipéptido metabolizador del D-aminoácido, un ácido nucleico puede comprender uno o más elementos cis del promotor endógeno del polipéptido metabolizador del D-aminoácido. Por "promotor" se entiende una secuencia de nucleótidos a partir de la cual se puede iniciar la trascripción del ADN enlazado operablemente corriente abajo (es decir, en la dirección 3' en el sentido de la hebra del ADN de doble hebra) . "Enlazado operablemente" significa unido como parte de la misma molécula de ácido nucleico, colocada adecuadamente y 13 orientada para que su trascripción se inicie desde el promotor, el ADN enlazado operablemente a un promotor está "bajo la regulación de la iniciación de trascripción" del promotor . Un elemento regulador adecuado puede incluir un promotor inducible enlazado operablemente al ácido nucleico que codifica la secuencia. La invención también proporciona células de plantas transformadas con dicha estructura del gen y métodos que incluyen la introducción de tal estructura en una célula de la planta y/o la introducción de la expresión de una estructura dentro de la célula de la planta, por ejemplo mediante la aplicación de un estímulo adecuado. El término "inducible" como se aplica a un promotor es bien entendido por aquellos expertos en la técnica. En esencia, la expresión bajo el control de un promotor inducible se "enciende" o se disminuye en respuesta a un estímulo aplicado (el cual se puede generar dentro de una célula o proporcionar exógenamente) . La naturaleza del estímulo varía entre los promotores. Cualquiera que sea el nivel de la expresión que esté en la ausencia del estímulo, incrementa la expresión de cualquier promotor inducible en la presencia del estímulo correcto. La situación preferible es en la cual el nivel de expresión se incrementa en la presencia del estímulo relevante por medio de una cantidad efectiva para alterar una 14 característica fenotípica es decir para mejorar la tolerancia de un D-aminoácido. Por consiguiente se puede utilizar un promotor inducible (o "que se puede encender") el cual provoque un nivel básico de expresión en la ausencia del estímulo cuyo nivel es demasiado bajo para aportar aproximadamente el fenotipo tolerante del D-aminoácido deseado (y de hecho puede ser cero) . En la aplicación del estímulo, se incrementa la expresión (o se enciende) a un nivel que provoque una tolerancia mejorada del D-aminoácido. Muchos ejemplos de promotores inducibles serán conocidos para aquellos expertos en la técnica. Otros promotores adecuados pueden incluir el gen promotor del Virus 35S de Mosaico de la Coliflor (CaMV 35S) que se expresa a un nivel elevado en virtud de todos los tejidos de plantas (Benfey et al, (1990) EMBO J 9: 1677-1684); el promotor meri 5 de la coliflor que se expresa en el área de las células de división así como varias posiciones bien localizadas en el cuerpo de la planta, por ejemplo te ido interno de la planta, el primordio de la flor, puntos de ramificación en las raíces y retoños (Medford, J.I. (1992) Plant Cell 4, 1029-1039; Medford et al, (1991) Plant Cell 3, 359-370) y el promotor LEAFY de la Arabidopsis thaliana que se expresa muy tempranamente en el desarrollo de la flor ( eigel et al, (1992) Cell 69, 843-859) . Otros ejemplos se 15 describen en la página 120 de Lindsey y Jones (1989) "Plant Biotechnology in Agriculture" Pub. OU Press, Milton Keynes, UK. La invención proporciona un vector que comprende un ácido nucleico como se describe anteriormente, por ejemplo un plásmido o vector de expresión viral. Como se describe en la presente, se puede utilizar la expresión de un polipéptido que tenga actividad metabolizadora del D-aminoácido a partir del ácido nucleico de codificación para seleccionar transformantes que contengan una estructura de ácido nucleico o vector como se describe en la presente. En algunas modalidades, un vector puede comprender adicionalmente un marcador genético seleccionable que consiste de un gen quimérico que confiere un fenotipo seleccionable tal como la resistencia a un antibiótico tal como la kanamicina, higromicina, fosfinotricina, clorsulfurona, metotrexato, gentamicina, espectinomicina, imidazolinonas y glifosato. Esto permite un segundo nivel de selección, si se desea, además de la selección que utiliza la expresión del polipéptido metabolizador del D-aminoácido. Otro aspecto de la presente invención proporciona el uso de un ácido nucleico como se describe en la presente en la producción de una planta transgenética. Tal método puede permitir la selección o propagación selectiva de plantas 16 transgenéticas las cuales comprenden material genético, extraño, o puede mejorar la tolerancia de una planta a los D-aminoácidos . La selección se realiza preferiblemente cultivando la planta o célula de la planta en un medio el cual tenga un contenido de nitrógeno definido que comprende un D-aminoácido es decir el nitrógeno en el medio está completa o parcialmente en la forma de un D-aminoácido. La identificación del D-aminoácido en el medio se determina mediante la especificidad del polipéptido metabolizador del D-aminoácido expresado por la planta o célula de la planta es decir el medio contiene el substrato del D-aminoácido del polipéptido metabolizador del D-aminoácido, heterólogo. Por ejemplo, cuando la D-serina deshidratasa heterologa se expresa por medio de una planta, la D-serina está presente en el medio de crecimiento. De conformidad con la presente invención se pueden proporcionar ácidos nucleicos aislados y/o purificados de su medio ambiente natural, en forma substancialmente pura u homogénea, o sustancialmente libre de otros ácidos nucleicos de la especie de origen. Cuando se utiliza aquí, el término "aislado" abarca todas estas posibilidades. Por supuesto el ácido nucleico puede ser un ADNc de doble hebra o de una sola hebra, o ADN genómico, o AR . El producto de expresión se puede hacer mediante la expresión de 17 un ácido nucleico de codificación bajo condiciones adecuadas en células adecuadas de plantas hospederas. Las moléculas de ácido nucleico pueden ser completa o parcialmente sintéticas. En particular, las mismas pueden ser recombinantes , en la medida en que las secuencias de ácido nucleico que no se encuentran conjuntamente en la naturaleza (no corren contiguamente) se hayan ligado o de otra manera combinado artificialmente. De manera alternativa las mismas se han sintetizado directamente, por ejemplo, utilizando un sintetizador automatizado. Aquellos expertos en la técnica son perfectamente capaces de construir vectores y de diseñar protocolos para la expresión del gen recombinante, en particular en una célula de la planta. Los vectores adecuados se pueden elegir o construir, de manera que contengan secuencias reguladoras apropiadas, que incluyan secuencias promotoras, fragmentos terminadores, secuencias de poliadenilación, secuencias de mejoramiento, genes marcadores según convenga. Para detalles adicionales ver, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3rd edition, Sambrook & Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press. "Vector" se define para incluir, inter alia, cualquier cósmido de plásmido, fago o vector binario de Agrrojacterium en forma lineal o circular, de doble hebra o una sola hebra, el 18 cual puede o no puede ser en sí mismo transmisible o movible, y el cual puede transformar un hospedero procariótico o eucariótico, en particular un hospedero de la planta, ya sea mediante su integración en el genoma celular o estando presente de manera extracromosómica (por ejemplo un plásmido de replicación autónoma con un origen de replicación) . Específicamente se incluyen vectores transbordadores por medio de lo cual se entiende un vehículo de ADN capaz, de manera natural o mediante un diseño, de su replicación en dos diferentes organismos, los cuales se pueden seleccionar a partir de los actinomices y especies relacionadas, bacterias y celulares eucarióticas (por ejemplo plantas superiores, mamíferos, levaduras u hongos) . Muchas técnicas conocidas y protocolos para la manipulación del ácido nucleico, por ejemplo en la preparación de estructuras de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciación, introducción del ADN en las células y la expresión de los genes, y el análisis de proteínas, se describen con detalle en Protocols ín Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992. Bevan et al (Bevan et al Nucí Acids Res. (1984) 12, 8711-8721) y Guerineau y Mullineaux (Guerineau y Mullineaux (1993) Plant transformation and expression vectors. In: Plant Molecular Biology Labfax (Croy RRD ed) Oxford, BIOS Scientific 19 Publishers, p 121-148) describe procedimientos específicos y vectores que se han utilizado previamente con gran éxito en plantas . Cuando se introduce un ácido nucleico en una célula, se deben tomar en cuenta ciertas consideraciones bien conocidas para aquellos hábiles en la técnica. Debe estar disponible un método de transportar el constructo o construcción dentro de la célula. Una vez que el constructo está dentro de la membrana celular, la integración en el material cromosómico endógeno ya sea se presentará o no se presentará. El producto de expresión del gen que metaboliza el D-aminoácido se puede dirigir a un compartimiento intracelular particular tal como el peroxisoma o citosol o expresado ubicuamente. Finalmente, en lo que respecta a las plantas, el tipo de células objetivo debe ser tal que las células se puedan regenerar en plantas completas . Las técnicas bien conocidas para aquellos expertos en la técnica, se pueden utilizar para introducir estructuras de ácido nucleico y vectores en las células de las plantas para producir plantas transgénicas del fenotipo tolerante del D-aminoácido, apropiado. La transformación del Agrobacterium es un método ampliamente utilizado por aquellos expertos en la técnica para transformar las células de plantas, en particular la especie 20 dicotiledónea. La producción de plantas transgénicas , fértiles, estables, en casi todas las plantas monocotiledóneas , económicamente relevantes, es ahora rutinaria: (Toriyama, et al. (1988) Bio/Technology 6, 1072-1074; Zhang, et al. (1988) Plant Cell Rep. 7, 379-384; Zhang, et al. (1988) Theor Appl Genet 76, 835-840; Shimamoto, et al. (1989) iVature 338, 274-276; Datta, et al. (1990) Bio/Technology 8, 736-740; Christou, et al. (1991) Bio/Technology 9, 957-962; Peng, et al. (1991) International Rice Research Institute, Manila, Philippines 563-574; Cao, et al. (1992) Plant Cell Rep. 11, 585-591; Li, et al. (1993) Plant Cell Rep. 12, 250-255; Rathore, et al. (1993) Plant Molecular Biology 21, 871-884; Fromm, et al. (1990) Bio/Technology 8, 833-839; Gordon-Kamm, et al. (1990) Plant Cell 2, 603-618; D'Halluin, et al. (1992) Plant Cell 4, 1495-1505; Walters, et al. (1992) Plant Molecular Biology 18, 189-200; Koziel, et al. (1993) Biotechnology 11, 194-200; Vasil, I. K. (1994) Plant Molecular Biology 25, 925-937; Weeks, et al. (1993) Plant Physiology 102, 1077-1084; Somers, et al. (1992) Bio/Technology 10, 1589-1594; W092/14828) . En particular, la transformación mediada con Agrobacterium ahora es un método para una transformación altamente eficiente en las monocotiledóneas (Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6, 271-282) . 21 Los aspectos de la invención proporcionan un vector de expresión para su uso en tales métodos de transformación, el cual es un plásmido Ti desarmado del Agrobacterium, y una bacteria Agrobacterium tumefaciens que comprende tal vector de expresión. La generación de plantas transgénicas , fértiles, se ha logrado utilizando esta metodología en los cereales de arroz, maíz, trigo, avena, y cebada (revisado en Shimamoto, K. (1994) Current Opinión in Biotechnology 5, 158-162.; Vasil, et al. (1992) Bio/Technology 10, 667-674; Vain et al., 1995, Biotechnology Advances 13 (4): 653-671; Vasil, 1996, Nature Biotechnology 14 página 702) . Wan y Lemaux (1994) Plant Physiol. 104: 37-48 describen técnicas para la generación de grandes números de plantas fértiles de cebada, transformadas independientemente. Se puede preferir otros métodos, tales como microproyectiles o bombardeo de partículas (US 5100792, EP-A-444882, EP-A-434616) , electroporación (EP 290395, O 8706614), microinyección (WO 92/09696, WO 94/00583, EP 331083, EP 175966, Green et al. (1987) Plant Tissue and Cell Culture, Academic Press) absorción directa de AND (DE 4005152, WO 9012096, US 4684611) , absorción de AND mediada con liposomas (por ejemplo Freeman et al. Plant Cell Physiol. 29: 1353 (1984)), o el método con tratamiento en un vórtice (por 22 ejemplo Kindle, PNAS U.S.A. 87: 1228 (1990d) ) cuando la transformación del Agrobacterium sea ineficiente o inefectiva.

En particular, la transformación de gimnospermas, tales como confieras, se puede realizar utilizando técnicas de bombardeo de partículas (Clapham, D. et al. 2000. Sean. J. For. Res. 15: 151.160). Los métodos físicos para la transformación de células de plantas se revisan en Oard, (1991) Biotech. Adv. 9: 1-11. Alternativamente, se puede utilizar una combinación de diferentes técnicas para mejorar la eficiencia del proceso de transformación, por ejemplo el bombardeo con micropartículas revestidas con Agrobacterium (EP-A-486234) o bombardeo de microproyectiles para inducir una herida seguida por el co-cultivo con Agrobacterium (EP-A-486233 ) . Después de la transformación, se puede regenerar una planta, por ejemplo a partir de las células individuales, tejido de callos o discos de hojas, como es la norma en la técnica. Casi cualquier planta se puede regenerar completamente a partir de células, tejidos y órganos de la planta. Las técnicas disponibles se revisan en Vasil et al., Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol . I, II and III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, 1984, y Weissbach y eissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989. 23 La elección particular de una tecnología de transformación se determinará por su eficiencia para transformar la especie objetivo de la planta así como la experiencia y preferencia del usuario con una metodología particular. Será aparente para la persona experta que la elección particular de un sistema de transformación para introducir un ácido nucleico en las células de la planta no es esencial para o una limitación de la invención, ni es la elección de una técnica para la regeneración de la planta. Otro aspecto de la invención proporciona un método para producir una célula, en particular una célula de la planta, el cual incluye incorporar un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido metabolizador del D-aminoácido enlazado operablemente a un elemento regulador, específico, de la planta, o un vector que comprende tal ácido nucleico, en la célula por medio de transformación. Tal método para producir una célula puede incluir recombinar el ácido nucleico con el ácido nucleico del genoma celular tal que el mismo se incorpora establemente en la misma. Una planta se puede regenerar a partir de una o más células transformadas como se describe. El polipéptido metabolizador del D-aminoácido, el ácido nucleico de codificación y/o el vector que comprenden el ácido nucleico pueden ser heterogéneos, es decir, exógenos o 24 extraños, para la célula de la planta transformada con los mismos . Un método para producir una célula de la planta puede incluir expresar el ácido nucleico y provocar o permitir la acumulación del polipéptido metabolizador del D-aminoácido expresado por el mismo en el citosol, peroxisoma, cloroplasto y/u otro compartimiento intracelular de dicha célula de la planta. Un método para elaborar tal célula de la planta puede incluir introducir tal secuencia de ácido nucleico o un vector adecuado que incluya el ácido nucleico en una célula de la planta y provocar o permitir la recombinación entre el vector y el genoma de la célula de la planta para introducir la secuencia de ácido nucleico en el genoma. Un método puede incluir además propagar o cultivar sexual o asexualmente vástagos o un descendiente de la planta regenerada de dicha célula de la planta. La invención abarca además una célula hospedera transformada con una secuencia de ácido nucleico o vector como se establece anteriormente, es decir que contiene un ácido nucleico o vector como se describe con anterioridad, especialmente una célula de la planta, por ejemplo una célula de la planta superior, o una célula de la planta microbiana. Por consiguiente, se proporciona una célula hospedera, tal 25 como una célula de la planta, que incluye una secuencia de nucleótidos como se indica en la presente. Dentro de la célula, la secuencia de nucleótidos se puede incorporar dentro del cromosoma o puede ser extra-cromosómica . Puede haber más de una secuencia de nucleótidos heteróloga por genoma monosomático o haploide. Por consiguiente, por ejemplo, posibilita la expresión incrementada del producto del gen comparado con los niveles endógenos, como se discute posteriormente. Un ácido nucleico que codifica una secuencia comprendido dentro de una célula de la planta puede estar bajo el control de un elemento regulador específico de la planta el cual es un promotor de genes inducible externamente, por ejemplo para colocar la expresión bajo el control del usuario.

El polipéptido metabolizador del D-aminoácido puede estar presente en el citosol, peroxisoma, u otro compartimiento intracelular de la célula de la planta. La compartimentalización del polipéptido metabolizador del D-aminoácido se puede lograr fusionando la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido metabolizador del D-aminoácido a una secuencia que codifica un péptido de tránsito para generar una proteína de fusión. Los productos del gen expresado sin tales péptidos de tránsito generalmente se acumulan en el citosol. 26 Un ácido nucleico que se incorpora establemente en el genoma de la planta se pasa de generación a generación a los descendientes de la planta, las células cuyos descendientes pueden expresar el polipéptido metabolizador del D-aminoácido, pueden tener así una tolerancia mejorada al D-aminoácido. Una célula de la planta puede contener una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido metabolizador del D-aminoácido enlazado operablemente a un elemento regulador, específico, de la planta como resultado de la introducción de la secuencia de ácido nucleico en una célula predecesora. Una célula de la planta descrita aquí puede estar comprendida en una planta, una parte de la planta o un propágulo de la planta, o un extracto o derivado de una planta como se describe anteriormente . También se proporcionan plantas que incluyen una célula de la planta como se describe en la presente, junto con cualquier parte o propágulo de las mismas, semillas, progenie autopolinizada o híbrida y descendientes. Particularmente se proporcionan monocotiledóneas , dicotiledóneas, gimnospermas y algas, heléchos y musgos transgené icos . Son de interés particular las plantas superiores, transgenéticas, especialmente los cultivos agrícolas y forestales, por ejemplo cereales, árboles y flores ornamentales, las cuales se han 27 diseñado para que porten una estructura de ácido nucleico como se describe anteriormente. Los ejemplos de plantas adecuadas incluyen tabaco, cucurbitáceas, zanahoria, vegetales del género brassica, melones, pimientos, vinos de uvas, lechuga, fresa, semillas oleaginosas del género brassica, remolacha de azúcar, trigo, cebada, maíz, arroz, soya, arvejas, sorgo, girasol, tomate, patata, pimentón, crisantemo, clavel, álamo, eucalipto, algodón, linaza, cáñamo, abeto, abedul, cacahuate, centeno y pino. Una planta de conformidad con la presente invención puede ser una que no se reproduzca genuinamente en una o más propiedades. Las variedades de la planta se pueden excluir, particularmente las variedades de plantas certificables de conformidad con los Derechos de los Productores de Plantas. Se indica que una planta necesaria no se considera una "variedad de planta" simplemente debido a que la misma contiene establemente dentro de su genoma un transgen, introducido en una célula de la planta o en un predecesor de la misma. Además de una planta, la presente invención proporciona cualquier clon de la semilla, progenie autopolinizada o híbrida y descendientes de tal planta, y cualquier parte o propágulo de cualquiera de estos, tales como cortezas y semillas, las cuales se pueden utilizar en la reproducción o 28 propagación, sexual o asexual. La invención también abarca una planta la cual es un vástago, clon o descendiente propagado sexual o asexualmente de tal planta, o cualquier parte o propágulo de dicho vástago, clon o descendiente de la planta. Otros aspectos de la presente invención proporcionan el uso de D-aminoácidos para desarrollar, regenerar o propagar selectivamente células de plantas transgenéticas, tejido de la planta o plantas vasculares que comprenden un polipéptido metabolizador del D-aminoácido, heterólogo, como se describe anteriormente. Un método para producir una planta transgénica puede comprender : transformar una célula de la planta con un ácido nucleico o vector que comprende una secuencia que codifica un polipéptido el cual metaboliza un substrato del D-aminoácido, como se describe en la presente: regenerar una planta de la célula en un medio que comprende una fuente de nitrógeno definida, en donde la fuente de nitrógeno definido comprende o consiste de dicho substrato del D-aminoácido. Las células de plantas transformadas son capaces de utilizar el D-aminoácido presente en el medio como una fuente de nitrógeno. Las células que no se transforman y que no contienen el polipéptido con la actividad metabolizadora del 29 D-aminoácido son capaces de utilizar esta fuente de nitrógeno y como resultado se evita su crecimiento. Además, el D-aminoácido en el medio puede tener un efecto tóxico en las plantas no transformadas (las cuales no poseen actividad metabolizadora del D-aminoácido) . Un D-aminoácido adecuado para su uso en el medio como un substrato para la enzima metabolizadora del D-aminoácido, se puede seleccionar del grupo que consiste de D-arg, D-ser, D-glu, D-ala, D-asp, D-cys, D-gln, D-his, D-ile, D-leu, D-lys, D-met, D-phe, D-pro, D-asn, D-thr, D-trp, D-tyr y D-val . Preferiblemente, se utiliza uno de D-ser, D-ala, D-glu, D-asn, D-arg, D-lys, D-his ó D-asp, más preferiblemente D-ala o D-ser. Estos D-aminoácidos son tóxicos para las plantas que no contienen la enzima metabolizadora del D-aminoácido, apropiada. Otros substratos adecuados para la enzima metabolizadora del D-aminoácido incluyen aminoácidos que no son de proteínas, precursores de aminoácidos y derivados de aminoácidos . El nitrógeno frecuentemente es el elemento que limita el crecimiento de las plantas en los sistemas agrícolas. Las composiciones en las cuales una parte o la totalidad del contenido de nitrógeno está en la forma de uno o más D-aminoácidos (es decir el contenido de nitrógeno del fertilizante está parcial o complemente en la forma de uno o más D-aminoácidos) , son útiles como fertilizantes preferenciales o selectivos para las plantas transgenéticas que expresan una enzima la cual metaboliza el D-aminoácido . Las plantas no transgenéticas, que no expresan tal enzima, obtendrán un beneficio reducido de tal composición fertilizante. En algunas modalidades, el D-aminoácido es tóxico para tales plantas y evita o inhibe activamente su crecimiento. Por ejemplo, D-ser muestra toxicidad para las plantas de tipo silvestre (figura 3) . Otro aspecto de la presente invención proporciona una composición para la fertilización de una planta transgenética que comprende un polipéptido que metaboliza un substrato del D-aminoácido como se describe en la presente; dicha composición comprende dicho substrato del D-aminoácido. La totalidad o parte del contenido de nitrógeno de la composición puede estar en la forma del substrato de D-aminoácido (es decir el mismo puede ser la única fuente de nitrógeno o uno de una serie de fuentes de nitrógeno en la composición) . La proporción del nitrógeno disponible en la composición que no está en la forma de D-aminoácido puede ser del 0.1%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% ó 100%. Los substratos de D-aminoácido adecuados para su uso en la composición incluyen D-arg, D-ser, D-glu, D-ala, D-asp, 31 D-cys, D-gln, D-his, D-ile, D-leu, D-lys, D-met, D-phe, D-pro, D-asn, D-thr, D-trp, D-tyr ó D-val . Preferiblemente, se utiliza uno de D-ser, D-ala, D-glu, D-arg, D-lys, D-his, D-asn ó D-asp, más preferiblemente D-ala ó D-ser. Estos aminoácidos son tóxicos para las plantas que no contienen un polipéptido heterogéneo el cual metaboliza las mismas, proporcionando así una acción "dual" tanto para promover el crecimiento de plantas deseadas como para inhibir el crecimiento de plantas indeseadas. Otros substratos adecuados para el polipéptido metabolizador del D-aminoácido, incluyen D-aminoácidos que no son de proteína, precursores de D-aminoácidos o derivados de D-aminoácido . Un método para producir un fertilizante como se describe anteriormente, puede comprender proporcionar una composición fertilizante para plantas que carezcan o que carezcan sustancialmente de una fuente de nitrógeno y mezclar con dicha composición un substrato de D-aminoácido como se describe en la presente. Otro aspecto de la presente invención proporciona una composición selectiva de herbicidas que comprende un D-aminoácido como se describe anteriormente. Tal herbicida inhibirá o reducirá el crecimiento de plantas que no contengan la enzima metabolizadora del D- 32 aminoácido, apropiada, mientras que el crecimiento de las plantas transgenéticas que no sean capaces de metabolizar el D-aminoácido, no se verá afectado o, más preferiblemente se incrementará o mejorará. La composición puede comprender 0.1% (p/p) o más, 1% (p/p) o más, 5% (p/p) o más, 10% (p/p) o más, 15% (p/p) o más, 20% (p/p) o más, 25% (p/p) o más ó 30% (p/p) o más del D-aminoácido . Tal composición herbicida se puede utilizar en métodos para controlar el crecimiento de las plantas, los cuales comprenden tratar una o más plantas con la composición. Un método para producir tal composición herbicida puede incluir mezclar un D-aminoácido con una base, portador o excipiente . Las bases, portadores o excipientes adecuados para su uso en composiciones agrícolas, en particular herbicidas, las composiciones son bien conocidas en la técnica. Los D-aminoácidos se metabolizan por los aminoácidos oxidasas para producir peróxido de hidrógeno (H202) . Este compuesto actúa como una señal que induce las reacciones de defensa en las plantas. Tales reacciones generalmente se desencadenan por tensiones ambientales tales como luz excesiva, heladas o infección patógena. 33 Una planta que contiene una enzima del D-aminoácido oxidasa responde a los D-aminoácidos agregados incrementado el H202 y desencadenando en consecuencia reacciones de defensa. Esto proporciona un mecanismo por medio del cual se pueden desencadenar específicamente respuestas de defensa de la planta por los cultivadores. La adición de un D-aminoácido a las plantas que expresan el gen de D-amino oxidasa conduce a un exabrupto en la producción de H202 endógeno, el cual induce la reacción defensiva normal en estas plantas. Esta reacción defensiva podría ser desencadenada por el cultivador para incrementar la tolerancia a la tensión cuando se trasladan las plantas de condiciones internas a externas, para incrementar la tolerancia al congelamiento cuando existe un riesgo de daño por helada, cuando se desarrollan pestes y patógenos conocidos, o en otras situaciones cuando una reacción de defensa activa en la planta es de ventaja potencial. Un método para producir una planta transgénica que tiene una respuesta de tensión inducible, puede comprender: transformar una célula de la planta con una secuencia de ácido nucleico que codifica una D-aminoácido oxidasa; y, regenerar la planta transgenética de la célula de la planta . Un método para estimular la tolerancia a la tensión de una planta transgenética, puede comprender: expresar en dicha planta un polipéptido que oxide un substrato del D-aminoácido; y tratar dicha planta con el substrato del D-aminoácido. Los polipéptidos adecuados de D-aminoácido oxidasa se describen anteriormente y se ejemplifican en la Tabla 1 y Tabla 2. Una dosis adecuada de D-aminoácido estimula una respuesta a la tensión sin provocar daño celular permanente. La dosificación precisa variará de acuerdo al tipo de planta, etapa de crecimiento, tipo de tierra de cultivo, temperatura y condiciones climáticas aunque se pueden determinar fácilmente por una persona experta para una situación en particular utilizando metodología de rutina. En algunas modalidades preferidas, se pueden utilizar niveles elevados de D-aminoácido, por ejemplo 0.1 a 50 mM del D-aminoácido en el medio de cultivo, más preferiblemente 1 a 10 mM, para inducir la tolerancia a la tensión. La tolerancia mejorada a la tensión puede incluir tolerancia mejorada o incrementada a tensiones ambientales tales como radiación UV ultravioleta, temperaturas extremas, irradiación, y/o infección patógena, por ejemplo infección bacterial o fúngica, en particular patógenos que provocan la necrosis, con relación a las plantas normales, no tratadas. 35 La producción de H202 mediante D-aminoácido oxidasas como se describe anteriormente o la acumulación de productos del metabolismo de D-aminoácidos , puede ser nociva para las plantas transgénicas, si las relaciones de producción son elevadas y/o si la producción ocurre en un compartimiento celular el cual sea sensible al H202 u otros productos metabólicos . Por lo tanto, se pueden utilizar los métodos de la presente invención para remover selectivamente las plantas transgénicas de poblaciones mixtas, o aún para remover los híbridos entre las plantas transgénicas y plantas de tipo silvestre de las poblaciones naturales. Un método para inhibir el crecimiento o viabilidad de una planta transgénica que expresa un polipéptido el cual oxida un substrato del D-aminoácido como se describe en la presente, puede comprender; tratar dicha planta con el substrato de D-aminoácido. La localización del D-aminoácido oxidasa expresada en el peroxisoma produce el H202 que se puede metabolizar rápidamente por la enzima catalasa que degrada el H202. Por lo tanto se requieren niveles elevados de D-aminoácidos para producir niveles nocivos de H202. La expresión del D-aminoácido oxidasa en el citosol, cuando los niveles de la actividad de la 36 catalasa son inferiores, reduce la cantidad de D-aminoácido requerido para producir niveles nocivos de H202. Se puede lograr una expresión del D-aminoácido oxidasa en el citosol removiendo las señales para la localización del peroxisoma o los péptidos de tránsito de la secuencia de ácido nucleico de codificación. Por lo tanto se puede utilizar la adición de un D-aminoácido para inhibir o reducir el crecimiento o viabilidad de una planta transgenética la cual tenga una actividad del D-aminoácido oxidasa citosólico. Un método para inhibir el crecimiento o viabilidad de una planta transgenética la cual expresa un polipéptido el cual oxida un substrato del D-aminoácido como se describe en la presente, puede comprender; provocar o permitir la acumulación del polipéptido en el citosol de dicha planta, y; tratar dicha planta con el substrato del D-aminoácido. Los D-aminoácidos que exhiben una baja toxicidad a las plantas de tipo silvestre, por ejemplo D-ile, D-asn, ó D-gln, pero los cuales, después del metabolismo en las plantas transgenéticas que contienen D-aminoácido oxidasas exógenos, conducen a la producción de H202 u otros productos metabolicos, tóxicos, son particularmente adecuados para su uso en tales métodos . 37 Los experimentos de control se pueden realizar según convenga en los métodos descritos en la presente. El desempeño de los controles adecuados está dentro de los límites del nivel profesional y capacidad de una persona experta en el campo . Varios aspectos y modalidades adicionales de la presente invención serán evidentes para aquellos expertos en la técnica en vista de la presente descripción. Todos los documentos mencionados en esta especificación se incorporan en la presente en su totalidad como referencia. Ciertos aspectos y modalidades de la invención se ilustrarán ahora a manera de ejemplo y con referencia a la figura descrita posteriormente. La figura 1 muestra el peso más reciente que desarrollaron las plantas de Arabidopsis thaliana durante 20 días en un cultivo de agar estéril y se dotaron de diferentes fuentes de N. Las plantas de control se hicieron crecer sin ninguna fuente de nitrógeno. La figura 2 muestra los ejemplos de las conversiones metabólicas potenciales de los D-aminoácidos en los organismos . La figura 3 muestra el peso más reciente de las plantas de tipo silvestre (Peso; barras negras) y las plantas transformadas con el gen bacterial que codifica la enzima 38 bacteriana, enzima D-serina deshidratasa (dsdA21, barras gris claro) crecen en un agar estéril y se dotaron de D-serina a diferentes concentraciones (2.5, 30, 3 y 0.3 mM) con (MS) o sin (MS-N) la fuente de nitrógeno estándar, nitrato. La figura 4 muestra una biomasa (a) y un contenido de nitrógeno (b) en la cosecha de Arabidopsis thaliana durante 14 días después de la germinación. Las plantas se desarrollaron en un medio MS de resistencia media sin fuentes de nitrógeno aparte de la D-serina. Las barras abiertas son plantas transgénicas que expresan el dsdA, las barras sombreadas son plantas de tipo silvestre. Las barras representan la media + error estándar, n = 4. La figura 5 muestra una biomasa (a) y un contenido de nitrógeno (b) en la cosecha de Arabidopsis thaliana durante 14 días después de la germinación. Las plantas se desarrollaron en un medio MS de resistencia media con 3 mM de nitrato como un suministro de N básico y se corrigen con diferentes concentraciones de D-serina. Las barras abiertas son plantas transgénicas que expresan el dsdA, las barras sombreadas son plantas de tipo silvestre. Las barras representan la media + error estándar, n = 4. La Tabla 1 y 2 muestran los ejemplos de polipéptidos que tienen una actividad metabolizadora del D-aminoácido la cual se puede utilizar de conformidad con la presente invención. 39 Experimento Métodos Transformación de la Arabidopsis El gen dsdA de la E. coli (D-serina deshidratasa (D-serina desaminasa) [EC : 4.3.1.18] número de acceso NCBI J01603) se amplifica por medio de PCR utilizando los cebadores 5 ' -AATGGATCCTCATCTAAGCGCAAAGAGACGTACTATGG y 5'-ATTGGATCCATGCTGCGTTGAAACGTTATTAACGG. El producto PCR se sub-clonó en el pT-easy (Promega) y se secuenció con el equipo de secuenciación en ciclos DYEnamics, (Amersham Pharmacia biotech) . El análisis de alineación con la secuencia de la base de datos, confirmó exitosamente la clonación de longitud completa del dsdA. El clon se ligó subsecuentemente en el sitio BamHl del cásete de expresión CaMV 35S del vector binario pPCV702 m, el cual es un plásmido Ti desarmado de Agrojbacter uin tumefaciens, para generar el vector pPCV702 : dsdA. El análisis de restricción de este vector con endonucleasa, confirmó la orientación de la inserción. Las plantas del ecotipo Col-0 de A. thaliana, se transformaron con la cepa Agrobacterium tumefaciens (GV3101 :pMP90 RK) a través de infiltración con vacío (Clough, S. J. & Bent, A. F. Plant Journal. 16, 735-743 (1998)). Los transformantes se seleccionaron en placas que contenían canamicina, y se confirmaron molecularmente utilizando 40 manchados northern. Todos los análisis se realizaron utilizando líneas de homocigotos para el rasgo transgenético .

Las plantas transgénicas que expresan el D-aminoácido oxidasa se construyen esencialmente de la misma manera que las plantas dsdA descritas anteriormente, con las siguientes modificaciones: El gen daol (EC: 1.4.3.3: NCBIU60066) de la levadura Rhodotorula gracilis (Rhodosporidium toruloides) se clonó con PCR con una genoteca de ADNc preparada a partir del crecimiento de levadura en D-alanina que contiene el medio para inducir la expresión del gen objetivo, como una plantilla. Los cebadores PCR son 5 ' -ATTAGATCTTACTACTCGAAGGACGCCATG y 5 ' - ATTAGATCTACAGCCACAATTCCCGCCCTA. La PCR también se realizó con otro conjunto de cebadores, con un cebador que flanquea el extremo 5' de la estructura de lectura abierta como se establece anteriormente y un cebador 3' que excluye los últimos 6 nucleótidos. Los últimos nueve nucleótidos codifican el péptido de señal SKL, el cual guía la proteína hacia el órganelo sub-celular del peroxisoma. Las secuencias amplificadas resultantes codifican las proteínas que tienen la misma secuencia de aminoácidos aunque éstas difieran con respecto a su localización en la célula. El polipéptido truncado, sin el péptido de señal, se expresa en 41 el citosol, mientras que el polipeptido de longitud completa se expresa en el peroxisoma.

Cultivo de plantas Las semillas de A. thaliana de las plantas no transformadas y de las plantas transformadas de D-serina de amoníaco-liasa, se esterilizaron superficialmente con etanol al 70% y Tween 80 al 0.1% durante 10 minutos y se enjuagaron brevemente en etanol al 95%. Se siembran 10 semillas en cada placa y después de esto las placas se sellaron con cinta permeable al gas. El medio de crecimiento fue de resistencia media MS (Murashige, T. & Skoog, F. Physiol Plant 15, 310-313(1962)) (con sacarosa al 0.5% p/v y agar al 0.8% p/v) con nitrógeno ya sea excluido o incluido como 3 mM de nitrato. Se agrega D-serina esterilizada con filtración al medio después de tratarla en una autoclave. Las plantas se hicieron crecer durante 14 días después de la germinación con un foto-período de 16 horas a 24°C. Las plantas se extrajeron de las placas, se lavaron tres veces en 0.5 mM de CaCl2 y después de esto se secaron a 40°C durante 48 horas antes de las mediciones del peso en seco. El contenido N se determinó en las plantas secas utilizando un analizador elemental (PerkinElmer 2400 CHN) . La biomasa y el contenido de nitrógeno se midieron en una base por placa y se hallaron 10 plantas por placa. Seis líneas 42 transgenéticas independientes se evaluaron por su capacidad de crecer en D-serina y no se observaron diferencias sustanciales entre las líneas, a pesar de que los niveles del trascripto dsdA variaron substancialmente de conformidad con los análisis de manchado northern. Para la transformación del abeto, el vector de expresión tuvo un estructura de soporte pUC8 con un cásete de expresión 35S con dsdA y un cásete pUbi-Bar (promotor Ubiquitina con el gen Bar que confiere una resistencia basta) para el propósito de su selección basta. El método de transformación utilizado fue el bombardeo de partículas de una suspensión de células.

J?esul tados Efecto de los D-aminoácidos en el crecimiento de la planta de tipo silvestre Se observó el crecimiento de las plantas de AraJbidopsis thaliana de tipo silvestre en un cultivo de agar estéril utilizando diferentes fuentes de N. Los resultados se muestran en la Figura 1. Se observó un poco o nada de crecimiento de las plantas en un medio de D-aminoácido . Las semillas de Solanum esculentum, Hordeum vulgare, Zea mays, Populus tremuloides, Nicotiana tabacum y Arabidopsis thaliana se esterilizaron superficialmente y se hicieron crecer de dos a tres semanas en un medio de agar idéntico al 43 medio libre de nitrato descrito anteriormente y corregido con 0, 0.3, 3 y 30 mM de D-serina. Se observó que el crecimiento de Lycopersicon esculentum, Populus tremuloides, Nicotiana tabacum y Arabidopsis thaliana se inhibió a una concentración de 3 mM de D-serina en el medio, mientras que el crecimiento de Zea mays y Hordeum vulgare se inhibió a 30 mM. Se observó que la D-serina y otros cuantos D-aminoácidos inhiben el crecimiento de la A. thaliana de tipo silvestre y otras especies. Se observó una inhibición en el crecimiento claro de la A. thaliana, a una concentración de 0.3 mM de D-serina en el medio de crecimiento y la inhibición total del crecimiento se presenta a 3 mM (Fig. 2) . Los cultivos de suspensión de células embrionarias, somáticas, de Picae abies, se hicieron crecer en un rango de concentraciones de D-serina; 0, 0.3, 3 y 30 mM de D-serina. La D-serina fue letal para las células a y por arriba de 3 mM. Se encontró que es posible seleccionar embriones transformados con dsdA en un medio de D-serina que contiene 3 mM de D-serina . Estos resultados demuestran las propiedades herbicidas de los D-aminoácidos en plantas de tipo silvestre.

Arabidopsis thaliana que expresa la D-serina de amoniaco-liasa de E. coli 44 La Arabidopsis thaliana se transformó con el gen dsdA de E. coli, que codifica la D-serina amoníaco-liasa [EC : 4.3.1.18] bajo el control del promotor CaMV 35S. La D-serina de amoníaco-liasa convierte la D-serina en los productos de amoníaco, piruvato y agua, los cuales se utilizan fácilmente por las plantas y las plantas transformadas se pueden hacer crecer en D-serina como su única fuente N. Las plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana que expresan el gen que codifica la D-serina deshidratasa, se hicieron crecer de manera estéril junto a las plantas de tipo silvestre en un agar durante 20 días en un medio MS estándar suplementado con concentraciones variantes de D-serina como la única fuente N (30 mM, 3 mM, 0.3 mM) junto con un control que carece de cualquier nitrógeno. Se observó un crecimiento mínimo tanto en las plantas de tipo silvestre como transgenéticas en el medio de control que carece de nitrógeno. Se observó que tanto el crecimiento como el contenido N del las plantas transgenéticas se incrementan significativamente (análisis de varianza, p<0.0001) con una concentración incrementada de D-serina (fig. 4a, b) . No se observó un incremento en el crecimiento de las plantas de tipo silvestre (figura 3) . En la presencia de un nivel básico de nitrato, también se incrementó significativamente el crecimiento y el contenido de nitrógeno de las plantas 45 transgénicas (p<0.0001) con una concentración incrementada de D-serina, mientras que se encontró una respuesta opuesta para las plantas de tipo silvestre (fig. 5) . Esto indica que la D-serina tiene un efecto tóxico en la planta de tipo silvestre pero no en la planta transgénica. Dentro del rango observado de D-ser, las plantas transgénicas no muestran síntomas de toxicidad . La respuesta relativa del crecimiento con respecto a la concentración de D-serina, es similar ya sea que las plantas transgenéticas reciban o no un suministro básico de nitrato (Fig. 4a y 5a) . La correspondiente respuesta en el contenido N de la planta, sin embargo, es mayor en las plantas dotadas tanto con D-serina como con nitrato (Fig. 4b y 5b) . En una concentración equitativa, el crecimiento de las plantas en nitrato es significativamente mayor que en la D-serina (Fig. 4a y 5a) . La concentración de N del crecimiento de las plantas en 3 mM de D-serina sin embargo, es significativamente inferior que el crecimiento de las plantas en 3 mM de nitrato (A OVA, p<0.0001). La causa del crecimiento inferior en D-serina es desconocido aunque la concentración de N relativamente baja de las plantas con crecimiento en D-serina, puede indicar una relación de absorción de esta forma N comparada con aquélla del nitrato. 46 También se logró una selección exitosa de plantas transgenéticas de Arabidopsis rociando tres veces 30 mM de D-serina durante una semana en el crecimiento del semillero de Arabidopsis en la tierra de cultivo.

Arabidopsis thaliana que expresa el D-glutamato racemasa de E. coli La construcción de las plantas de Arabidopsis thaliana que expresan el D-glutamato racemasa de E. coli, se elaboró esencialmente de la misma manera descrita anteriormente. El gen murl, número de acceso NCBI AAC76949, codifica la racemasa EC: 5.1.1.3. Los cebadores para la clonación del gen, se diseñaron para flanquear la estructura de lectura abierta partiendo de la secuencia de la base de datos. Se observó que las plantas transgénicas sobrevivieron y crecieron en un medio convencional y en fuentes de nitrógeno convencionales .

Arabidopsis thaliana que metaboliza los D-aminoácidos con una producción simultánea de peróxido de hidrógeno La construcción de plantas de Arabidopsis thaliana que expresan dos variantes del D-aminoácido oxidasa de Rodotorula gracilis se elaboraron como se describe anteriormente. 47 Se observó que estas plantas transgénicas sobrevivieron y crecieron en un medio convencional con una fuente convencional de nitrógeno. Se obtuvieron resultados similares a aquellos descritos para las plantas que expresan el amoniaco-liasa de D-serina cuando se expresan el gen de la levadura (Rhodotorula gracilis) que codifica el D-aminoácido oxidasa (EC 1.4.3.3) en A. thaliana es decir se incrementó el crecimiento y contenido N de plantas transgénicas con relación a las plantas de tipo silvestre en el medio que contiene D-aminoácidos . El D-aminoácido oxidasa tiene un rango de los D-aminoácidos del substrato y las pruebas con D-alanina y D-serina confirmaron que la enzima D-aminoácido oxidasa también podría convertir estas formas N en fuentes N accesibles y por consiguiente aliviar la toxicidad provocada por la D-alanina y la D-serina. Se observó que 30 mM del D-Asn detuvieron efectivamente las plantas que expresan la D-amino oxidasa del crecimiento en un cultivo estéril del agar. No se observó germinación en las plantas que expresan la D-amino oxidasa, lo que indica una inhibición total del crecimiento. Se observó que las plantas Wt germinan y crecen lentamente para producir pequeños retoños verdes. Por consiguiente, el crecimiento de tipo silvestre se retardó únicamente de manera parcial y las plantas de tipo 48 silvestre se rescataron y colocaron en la tierra de cultivo para su recuperación. Se encontró que D-ile es aún más efectivo para evitar el crecimiento de plantas transgenéticas que expresan el daol sin un efecto inhibidor visible en las plantas de tipo silvestre. Se encontró que la Arabidopsis de tipo silvestre se incrementa en el crecimiento con una concentración incrementada de D-ile, dentro del intervalo examinado (0.3 a 30 mM) . Aunque no se observaron diferencias significativas entre la D-amino oxidasa expresada, citosólica y de peroxisoma, se encontró que la construcción de la peroxisoma es marginalmente más efectiva que la versión citosólica con relación a la inhibición de la germinación de la planta de D-amino oxidasa en 30 mM de D-Asn. Sin embargo, ambas estructuras se inhibieron significativamente más que el tipo silvestre y por consiguiente se pueden utilizar para una selección negativa de condiciones . Álamo y Tabaco que expresan el gen dsdA de E. coli (D-serina deshidratasa) El álamo y el tabaco se transforman utilizando el mismo vector y el protocolo de transformación descrito anteriormente para la transformación del Arabidopsis. 49 Se observó que 3 m y 30 mM de D-ser son suficientes para detener completamente la formación de retoños del álamo y tabaco de tipo silvestre respectivamente, cuando se colocan en un medio inductor de retoños. Sin embargo, se encontró que el tabaco y el álamo transformados con dsdA son resistentes al D-Ser en concentraciones que exceden 30 mM. Las plantas transgenéticas producidas como se describe en la presente, metabolizan las formas N que son inaccesibles para otras plantas. Esto permite que el N agregado sea el objetivo de tales plantas en una configuración de la planta mixta. Los D-aminoácidos aplicados tienen un efecto dual para promover el crecimiento de plantas transgenicas y para inhibir el crecimiento de otras plantas y esto puede crear efectos sinérgicos cuando se utiliza en la agricultura. El control directo sobe las fuentes N puede reducir la cantidad de N que es necesaria para un buen crecimiento, reduciendo potencialmente la presión ambiental provocada innecesariamente por elevadas cargas de N. Además, en los sistemas de cultivo en los cuales las plantas de cultivo tienen una ventaja competitiva teniendo acceso a una fuente específica de N, puede disminuir la demanda para el control de las malas hierbas, reduciendo en total la necesidad de herbicidas. 5 O Enzima Número de acceso Organismo Substrato (Base de datos fuente de proteínas Brenda) Deshidratase D-Serina amonio Número EC -E. intermedia -D-Ser liasa (también 4.3.1.18 -E. coli -D-Thr conocida como - lebsiella -D-alotreonina D-serina pneumoniae deshidratasa) -Pollo Oxidasas D-Aminoácido Número EC -Cerdo -Más D-amino-oxidasa 1.4.3.3 -Humano ácido -Rata -Candida tropicalis -Trigonopsis variabilis -Neuspora crassa -Chlorella vulgaris -Rhodotorula gracilis D-Glutamato Número EC -Octopus -D-Asp oxidasa 1.4.3.7 vulgaris -D-Glu -Orconectes limosus 51 -D-Aspartato Número EC -Conejo -D-Asp oxldasa 1.4.3.1 -Humano -D-Glu -Cerdo -N-metil-D-Asp -Bovino -Meso-2, 3- -Bos taurus diaminosuccinato (relevancia no conocida) -cis- Tiazolidina- 2,4- dicarboxilato (relevancia no conocida) Racemasas D-Glutamato Número EC -Lactobacillus -D/L-Glu racemasa 5.1.1.3 sp -Pediococcus pentosaceus -E. coli Transaminasas D-Metionina Número EC -Brassica sp -D-Metionina transaminasa 2.6.1.21 mitochond ia 52 Tabla 1 O <_p O D-AMINOÁCIDO TRANSFERASA/D-AMINO ATRANSAMINASA P54692 D -ALA INA AMINOTRANSFERASA (EC 2 .6 1 .21) (DAAT) . Bacillus licheniformis . DAT. P54693 D -ALANINA AMINOTRANSFERASA (EC 2 .6 1 .21) (DAAT) . Bacillus sphaericus. DAT. P19938 D -ALANINA AMINOTRANSFERASA (EC 2 6 1 .21) (DAAT) . Bacillus sp. (cepa YM-1) . DAT. 007597 D -ALANINA AMINOTRANSFERASA (EC 2 6 1 .21) (DAAT) . Bacillus subtilis. DAT. 085046 D -ALANINA AMINOTRANSFERASA (EC 2 6 1 .21) (DAAT) . Listeria monocytogenes . DAT . P54694 D -ALANINA AMINOTRANSFERASA (EC 2 6 1 .21) (DAAT) . Staphylococcus haemolyticus . DAT D-ASPARTATO OXIDASA P31228 D-ASPARTATO OXIDASA (EC 1.4.3.1) (DASOX) (DDO). Bos taurus (Bovino) . DDO. Q99489 D-ASPARTATO OXIDASA (EC 1.4.3.1) (DASOX) (DDO). Homo sapiens (Humano) . DDO. Q9UJ09 DJ261K5.2 (D-ASPARTATO OXIDASA (EC 1.4.3.1)) . Homo sapiens (Humano) . DDO. Q9TRA3 D-ASPARTATO OXIDASA (EC 1.4.3.1) (FRAGMENTO) . Bos taurus (Bovino) .

D-SERINA DESHIDRATASA P54555 D-SERINA DESHIDRATASA PROBABLE (EC 4.2.1.14) (D-SERINA DESAMINASA) . Bacillus subtilis. YQJR. P00926 D-SERINA DESHIDRATASA (EC 4.2.1.14) (D-SERINA DESAMINASA) . Escherichia coli. DSDA. Q9KL72 D-SERINA DESHIDRATASA. Vibrio cholera. VCA0875. Q9KC12 D-SERINA DESHIDRATASA (EC 4.2.1.14) . Bacillus halodurans . DSDA. 3 O Oí D-AMINOACIDO OXIDASA Q19564 D-AMINOACIDO OXIDASA PUTATIVO (EC 1.4.3.3) (DAMOX) (DAO) (DAAO) . Caenorhabditis elegans. F18E3. 7. P24552 D-AMINOÁCIDO OXIDASA (EC 1.4.3.3) (DAMOX) (DAO) (DAAO) . Fusarium solani (subsp. pisi) (Nectria haematococca) . P14920 D-AMINOÁCIDO OXIDASA (EC 1.4.3.3) (DAMOX) (DAO) (DAAO) . Homo sapiens (Humano) . DAO Ó DAMOX. P18894 D-AMINOÁCIDO OXIDASA (EC 1.4.3.3) (DAMOX) (DAO) (DAAO) . MUS musculus (Ratón) . DAO Ó DAOl. P00371 D-AMINOÁCIDO OXIDASA (EC 1.4.3.3) (DAMOX) (DAO) ' (DAAO) . Sus scrofa (Cerdo) . DAO. P22942 D-AMINOÁCIDO OXIDASA (EC 1.4.3.3) (DAMOX) (DAO) (DAAO) . Oryctolagus cuniculus (Conejo) . DAO. 035078 D-AMINOÁCIDO OXIDASA (EC 1.4.3.3) (DAMOX) (DAO) (DAAO) . Ratatus norvegicus (Rata) . DAO. P80324 D-AMINOÁCIDO OXIDASA (EC 1.4.3.3) (DAMOX) (DAO) (DAAO) . Rhodosporidium toruloides (Levadura) (Rhodotorula gracilis) . DAO: Q99042 D-AMINOÁCIDO OXIDASA (EC 1.4.3.3) (DAMOX) (DAO) (DAAO) . Trigonopsis variabilis. DA01.</RTI> Q9Y7N4 D-AMINOÁCIDO OXIDASA PUTATIVA (EC 1.4.3.3) (DAMOX) (DAO) (DAAO) . Schizosaccharomyces pombe (levadura Fission) SPCC1450. (001739 SIMILAR AL D- AMINOÁCIDO OXIDASA. Caenorhabditis elegans. F20H11. 5.

O (_n Q28382 D-AMINOÁCIDO OXIDASA (FRAGMENTO) . Sus scrofa (Cerdo) . DAO. 033145 D-AMINOÁCIDO OXIDASA PUTATIVO (EC 1. 4. 3.3) . Mycobacterium leprae . AAO. Q9X7P6 D-AMINOÁCIDO OXIDASA PUTATIVO. Streptomyces coelicolor. SC5F2A. 23C. Q9JXF8 D-AMINOÁCIDO OXIDASA DE FLAVOPROTEÍNA, PUTATIVO. Neisseria meningitidis (serogrupo B) . NMB2068. Q9Z302 D-AMINOÁCIDO OXIDASA. Cricetulus griseus (hámster chino) . Q9Z1M5 D-AMINOÁCIDO OXIDASA. Cavia porcellus (conejillo de indias) .

RACEMASA 068006 GLUTAMATO RACEMASA (EC 5. 1 .1 .3) 3. Bacillus licheniformis . BACA. Q9L870 GLUTAMATO RACEMASA (EC 5. 1 .1 .3) . Anabaena sp. (cepa PCC 7120) . MURI . 066662 GLUTAMATO RACEMASA (EC 5. 1 .1 -3) . Aquifex aeolicus. MURI Ó AQ 325. P56868 GLUTAMATO RACEMASA (EC 5. 1 .1 .3) . Aquifex pyrophilus. MURI. 031332 GLUTAMATO RACEMASA (EC 5. 1 .1 .3) . Bacillus cereus. MURI Ó GLR. 082826 GLUTAMATO RACEMASA (EC 5. 1 .1 .3) . Bacillus subtilis var. natto. MURI Ó GLR P52972 GLUTAMATO RACEMASA (EC 5. 1 .1 -3) . Bacillus sphaericus. MURI Ó GLR. P94556 GLUTAMATO RACEMASA (EC 5. 1 .1 .3) . Bacillus subtilis. RACE.

N O 051127 GLUTAMATO RACEMASA (EC 5.1.1.3) . Borrelia burgdorferi (espiroqueta del padecimiento de Lyme) . MURI Ó BE >100. Q9XDZ7 GLUTAMATO RACEMASA (EC 5.1.1.3) . Brevibacterium lactofermentum. MURI. P57619 GLUTAMATO RACEMASA (EC 5.1.1.3) . Buchnera aphidicola (subsp. Acyrthosiphon pisum) (AcyrthosipMURI Ó BU554. Q9PM24 GLUTAMATO RACEMASA (EC 5.1.1.3) . Campylobacter jejuni. MURI Ó CJ1652. Q9L4V5 GLUTAMATO RACEMASA (EC 5.1.1.3) . Carnobacterium sp. (cepa St2) . MURI ÓGLR. Q9RU10 GLUTAMATO RACEMASA (EC 5.1.1.3) . Deinococcus radiodurans . MURI Ó DR1586. P22634 GLUTAMATO RACEMASA (EC 5.1.1.3) . Escherichia coli. MURI Ó DGA Ó GLR. P52973 GLUTAMATO RACEMASA (EC 5.1.1.3) . Haemophilus influenzae. MURI Ó HI1739.2. Q9ZLTO GLUTAMATO RACEMASA (EC 5.1.1.3) . Helicobacter pylori J99 (Campylobacter pylori J99) . MURI Ó GLR Ó HP0549. P56068 GLUTAMATO RACEMASA (EC 5.1.1.3) . Helicobacter pylori (Campylobacter pylori) . MURI Ó GLR Ó HP0549. P48797 GLUTAMATO RACEMASA (EC 5.1.1.3) . Lactobacillus brevis. MURI. Q03469 GLUTAMATO RACEMASA (EC 5.1.1.3) . Lactobacillus fermentum. MURI. P46705 GLUTAMATO RACEMASA (EC 5.1.1.3) . Mycobacterium leprae. MURI Ó B1549-C2-210. Q10626 GLUTAMATO RACEMASA (EC 5.1.1.3) . Mycobacterium tuberculosis. MURI Ó RV1338 Ó MTCY130.23 Ó MTCY02B10. 02. Q9RQW7 GLUTAMATO RACEMASA (EC 5.1.1.3) . Neisseria meningitidis (serogrupo A) , y MURI GLR Ó NMA2026 Ó NMB0458.

O GLUTAMATO RACEMASA (EC 5 Pediococcus pentosaceus . MURI . GLUTAMATO RACEMASA (EC 5 (FRAGMENTO) . Salmonella typhimurium. MURI.</RTI> GLUTAMATO RACEMASA (EC 5 Staphylococcus haemolyticus. MURI Ó DGA. GLUTAMATO RACEMASA (EC 5 Synechocystis sp. (cepa PCC 6803) . MURI Ó SLR1746. GLUTAMATO RACEMASA (EC 5 Treponema pallidum. MURI Ó TP0406. GLUTAMATO RACEMASA (EC 5 Vibrio cholerae. MURI Ó VC0158.

TABLA 2 -J 58 LISTADO DE SECUENCIA <110> SweTreeGenomics AB Nasholm, Torgny Erikson, Oskar Hertzberg, Magus <120> Crecimiento selectivo de plantas utilizando D- aminoácidos <130> NRS/6123806 <140> PCT/EP03/00222 <141> 2003-01-13 <150> GB 0201043.7 <151> 2002-01-17 <160> 4 <170> Patentln versión 3.1 <210> 1 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador <400> 1 aatggatcct catctaagcg caaagagacg tactatgg 38 <210> 2 <211> 35 59 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223 Cebador <400> 2 attggatcca tgctgcgttg aaacgttatt aacgg <210> 3 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador <400> 3 attagatctt actactcgaa ggacgccatg <210> 4 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador <400> 4 attagatcta cagccacaat tcccgcccta

Claims (19)

1. 60
2. REIVINDICACIONES 1. - Un ácido nucleico aislado caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido el cual tiene una actividad metabolizante del D-aminoácido, la secuencia se enlaza operablemente a un elemento regulador específico de plantas. 2. - Un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la actividad metabolizante del D-aminoácido se selecciona del grupo que consiste de la actividad de la oxidasa, racemasa, carboxilasa, transminasa y deshidratasa .
3. 3. - Un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el polipéptido se muestra en la Tabla 1 ó Tabla 2.
4. 4.- Un ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque dicho D-aminoácido seleccionado del grupo que consiste de D-ser, D-ala, D-glu, D-arg, D-lys, D-his, D-asp, D-asn, ó D-gln.
5. 5.- Un ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido heterologo. 61
6. 6. - Un ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicho polipéptido que tiene actividad metabolizante del D-aminoácido comprende un péptido de tránsito o transporte que dirige la acumulación de dicha enzima en un compartimiento intracelular de dicha célula de la planta .
7. 7. - Un vector de expresión caracterizado porque comprende un ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. 8.- Una célula de la planta caracterizada porque comprende un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 7.
9. 9.- Una planta caracterizada porque comprende una célula de la planta de conformidad con la reivindicación 8.
10. 10.- Una planta de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque es una monocotiledónea, dicotiledónea, gimnosperma, alga, helécho o musgo.
11. 11.- Un método para producir una planta transgénica, caracterizado porque comprende; transformar una célula de la planta con un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 7; y, regenerar dicha planta de dicha célula en un medio el cual comprende un D-aminoácido. 62
12. 12.- Un método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el medio comprende una sola fuente de nitrógeno, dicha fuente de nitrógeno consiste de un D-aminoácido .
13. 13.- Una composición fertilizante para la fertilización selectiva de una planta de conformidad con la reivindicación 9 ó reivindicación 10; dicho fertilizante está caracterizado porque comprende un D-aminoácido.
14. 14. - Una composición que tiene actividad herbicida y caracterizada porque comprende uno o más D-aminoácidos .
15. 15. - Un método para controlar el crecimiento de las plantas, caracterizado porque comprende tratar una planta con una composición de conformidad con la reivindicación 13.
16. 16. - Un método para estimular la tolerancia a la presión de una planta, caracterizado porque comprende; expresar en dicha planta un polipéptido el cual oxide un substrato de D-aminoácido; y, tratar dicha planta con dicho substrato de D-aminoácido.
17. 17. - Un método para inhibir el crecimiento de una planta transgénica la cual exprese un polipéptido que oxide una oxidasa del substrato de D-aminoácido; el método está caracterizado porque comprende permitir la acumulación del polipéptido en el citosol de la planta, y; 63 tratar la planta con el substrato de D-aminoácido .
18. 18. - Un método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el substrato de D-aminoácido es D-ile ó D-asn.
19. 19. - El uso de un ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en un método para la selección de células de plantas transformadas.