DE60304823T2

DE60304823T2 - Selektives pflanzenwachstum unter verwendung von d-aminosäuren

Info

Publication number: DE60304823T2
Application number: DE60304823T
Authority: DE
Inventors: Torgny NÄSHOLM; Oskar Erikson; Magnus Hertzberg
Original assignee: BASF Plant Science GmbH; SweTree Technologies AB
Current assignee: BASF Plant Science GmbH; SweTree Technologies AB
Priority date: 2002-01-17
Filing date: 2003-01-13
Publication date: 2007-01-25
Anticipated expiration: 2023-01-14
Also published as: AU2003235629B2; CN1620506B; US7741540B2; GB0201043D0; AU2003235629A1; WO2003060133A3; JP4377241B2; US20050076409A1; ZA200406486B; PT1468096E; EP1468096B1; MXPA04006606A; WO2003060133A2; CN1620506A; US20070016973A1; EP1468096A2; ES2261938T3; IL162644A0; BR0306978A; NZ534469A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das selektive Wachstum von Pflanzenzellen, Pflanzengeweben oder Gefäßpflanzen, die genetisches Fremdmaterial enthalten.
Stickstoff wird von Pflanzen in großen Mengen als Mineralnährstoff benötigt. Das Pflanzenwachstum, insbesondere in der Landwirtschaft, wird häufig durch die Menge an verfügbarem Stickstoff begrenzt.
Traditionell wurde angenommen, daß Pflanzen nur Ammonium und/oder Nitrat als Stickstoffquellen nutzen. Diese Verbindungen werden entweder durch natürliche Vorgänge, wie die Mineralisierung von organischem Stickstoff und die Fixierung von Stickstoff durch symbiontische Prokaryonten oder durch die Ausbringung von Düngemitteln, die industriemäßig fixierten Stickstoff enthalten, bereitgestellt.
Jüngste Forschungen haben jedoch ergeben, daß nicht nur anorganischer Stickstoff, sondern auch gewisse organische Stickstoffverbindungen für Pflanzen verfügbar sind (Näsholm, T. et al. (1998) Nature 392, 914–916, Näsholm T. et al. (2000) Ecology 81: 1155–1161, Näsholm, T. und Persson, J. (2001) Physiol Plant 111: 419–426, Lipson, D. und Näsholm T. (2001) Oecologia 128: 305–316). Insbesondere scheint es, daß die Aufnahme und der Stoffwechsel von Aminosäuren aus dem Boden ein allgemeines Merkmal von Pflanzen ist.
Unter den Aminosäuren, die als Bausteine für Proteine verwendet werden, liegen mit einer Ausnahme (Glycin) alle in zwei isomeren Formen vor, die aufgrund ihrer Fähigkeit, polarisiertes Licht zu drehen, unterschieden werden. Die Form, die in der Natur in den größten Mengen vorkommt, dreht Licht nach links und wird als L- oder linksdrehend bezeichnet, während die weniger häufige Form als D- oder rechtsdrehend bezeichnet wird.
Obwohl D-Aminosäuren in der Natur vorkommen, liegen sie nur in sehr niedrigen Konzentrationen und nur in bestimmten Verbindungen als Zellwandproteine in Bakterien vor (z.B. in der Verbindung Peptidoglucan).
Obwohl pflanzliche Aminosäuretransporter den Transport von beiden Formen, nämlich der D- und L-Form, von Aminosäuren vermitteln (Soldal, T. und Nissen, P. (1978) Physiol. Plant, 43: 181–188, Boorer, K.J. et al. 1996. J. Biol. Chem 271: 2213–2220, Montamat et al (1999) Plant Mol. Biol. 41: 259–268), fehlen den Pflanzen die Enzyme, die erforderlich sind, um D-Aminosäuren in Stickstofformen, die in Synthesereaktionen innerhalb der Pflanze verwendet werden können, umzuwandeln. Pflanzen können daher D-Aminosäuren nicht als Stickstoffquelle benutzen.
Die Fähigkeit, D-Aminosäuren zu metabolisieren, ist jedoch unter den Bakterien, Pilzen und Tieren weit verbreitet. Es sind mehrere Reaktionen, die zum Katabolismus von D-Aminosäuren in Organismen führen, beschrieben worden (siehe 2) (Friedman, M (1999) J. Agric. Food Chem. 47: 3457–3479, Pilone, M.S. (2000) CMLS 57: 1732–1747, Yurimoto et al. (2000) Yeast 16(13): 1217–1227).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde nun gefunden, daß Pflanzen, die ein heterologes Gen, das ein D-Aminosäure-metabolisierendes Enzym codiert, exprimieren fähig sind, diese D-Aminosäure als Stickstoffquelle zu nutzen und auf Medien wachsen können, die andernfalls nicht das Wachstum der Wildtyppflanze ermöglichen würden.
Im allgemeinen ist nur ein einziges D-Aminosäuremetabolisierendes Enzym erforderlich, um die D-Aminosäure in Verbindungen umzuwandeln, die an den üblichen pflanzeneigenen Stickstoffstoffwechselwegen teilnehmen können (d.h. Verbindungen die nicht rechtsdrehend sind).
So kann zum Beispiel das Enzym D-Serindehydratase dazu verwendet werden, um D-Serin in Ammoniak, Pyruvat und Wasser umzuwandeln, und D-Aminosäureoxidasen können dazu verwendet werden, um D-Aminosäuren in Ammoniak, eine Ketosäure (je nach dem D-Aminosäuresubstrat) und Wasserstoffperoxid umzuwandeln. Stickstoff, der andernfalls nicht verfügbar in D-Aminosäuren gebunden ist, kann so enzymatisch in Formen umgewandelt werden, die leicht von der Pflanze verwendet werden können.
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine isolierte Nukleinsäure, umfassend eine Sequenz, die für ein Polypeptid mit D-Aminosäure-metabolisierender Wirksamkeit codiert, bereitgestellt, wobei die Sequenz mit einem oder mehreren pflanzenspezifischen Regulationselementen operativ verbunden ist.
In manchen Ausführungsformen der Erfindung kann eine isolierte Nukleinsäure aus einer Sequenz, die für ein Polypeptid mit D-Aminosäure-metabolisierender Wirksamkeit codiert und einem oder mehreren pflanzenspezifischen Regulationselementen, das bzw. die mit der Sequenz operativ verbunden ist/sind, bestehen.
In manchen Ausführungsformen können D-Aminosäuren als Selektionsmarker verwendet werden. Eine wie oben beschriebene isolierte Nukleinsäure kann weiterhin eine heterologe Nukleinsäuresequenz, die für ein interessierendes Polypeptid codiert, umfassen. Die Expression dieses Polypeptids kann zum Beispiel den Phänotyp einer Pflanze auf vorteilhafte Weise verändern oder sonstige günstige Auswirkungen verursachen. Die Expression des Polypeptids mit D-Aminosäuremetabolisierender Wirksamkeit ermöglich die wirksame Selektion von Transformanten, die diese im vorliegenden Text beschriebene heterologe Nukleinsäuresequenz enthalten.
Ein Polypeptid mit einer D-Aminosäure-metabolisierenden Wirksamkeit bezeichnet ein Polypeptid, das ein D-Aminosäuresubstrat in Produkte umwandelt, die als Substrate für endogene pflanzliche Enzyme dienen (d.h. die von Pflanzen metabolisiert werden können). Zu Produkten, die von Pflanzen metabolisiert werden, zählen nichtrechtsdrehende Verbindungen, also nichtchirale bzw. L-Verbindungen. Das D-Aminosäuremetabolisierende Polypeptid katalysiert daher die biochemische Umwandlung eines D-Aminosäuresubstrats in Produkte, zum Beispiel nichtrechtsdrehende Produkte, die von Pflanzen als Nährstoffquellen, insbesondere als Stickstoffquellen, genutzt werden können.
Bei einem geeigneten D-Aminosäure-metabolisierenden Polypeptid kann es sich um ein eukaryontisches Enzym, zum Beispiel aus einer Hefe (z.B. Rhodotorula gracilis), einem Pilz oder einem Tier handeln, oder es kann sich um ein prokaryontisches Enzym, zum Beispiel aus einem Bakterium wie Escherichia coli handeln. Beispiele für geeignete Polypeptide, die D-Aminosäuren metabolisieren, sind in Tabelle 1 und Tabelle 2 dargestellt.
Wie oben beschrieben ist über keine endogene D-Aminosäure-metabolisierende Aktivität in Pflanzen berichtet worden.
Bei dem Substrat für das D-Aminosäure-metabolisierende Polypeptid kann es sich um D-Arg, D-Glu, D-Ala, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-His, D-Ile, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Asn, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Trp, D-Tyr oder D-Val handeln.
Weitere geeignete Substrate für D-Aminosäuremetabolisierende Enzyme umfassen nichtproteinartige rechtsdrehende Aminosäuren, Vorstufen von rechts-drehenden Aminosäuren und rechtsdrehende Aminosäurederivate. Solche Substrate können erst nach Umwandlung durch ein D-Aminosäure-metabolisierendes Enzym in eine geeignete metabolisierbare Form als Stickstoffquelle für Pflanzen genutzt werden.
Bei dem Substrat für das D-Aminosäure-metabolisierende Polypeptid handelt es sich um eines aus der Reihe D-ser, D-asn, D-ala, D-ile, D-glu, D-arg, D-lys, D-his oder D-asp, stärker bevorzugt D-ala, D-ile oder D-ser.
Das Vorliegen einer nichtchiralen Amidgruppe in einer D-Aminosäure kann zu Pflanzenwachstum in einem geringen Ausmaß führen, da diese Gruppe häufig von einer Pflanze metabolisiert und als Stickstoffquelle verwendet werden kann. Auf einem Medium, das D-gln enthält, wirken zum Beispiel endogene Glutamatsynthasen auf die nichtchirale Amidgruppe unter Bildung von D-glu ein. Da es sich bei den Produkten einer solchen nichtchiralen Aktivität um andere D-Aminoverbindungen, die selbst wiederum nicht von endogenen pflanzlichen Enzymen metabolisiert werden, handelt, sind die Wachstumsraten bei diesen D-Aminosäuren niedrig, obwohl eine gewisse Menge an Stickstoff verfügbar gemacht wird.
Bei dem D-Aminosäure-metabolisierenden Polypeptid kann es sich zum Beispiel um eine Oxidase, Racemase, Decarboxylase, Transaminase oder Dehydratase (auch als Ammoniaklyase bezeichnet) handeln. Oxidasen katalysieren die Umwandlung einer D-Aminosäure zu NH₄ ⁺, einer Ketosäure (je nach dem D-Aminosäuresubstrat) und H₂O₂ (siehe 2). Racemasen wandeln eine D-Aminosäure in die entsprechende L-Aminosäureform um. L-Aminosäuren eignen sich als Stickstoffquelle für Pflanzen. Decarboxylasen wandeln eine D-Aminosäure in eine γ-Aminosäure um, die von Pflanzen metabolisiert werden kann. Transaminasen wandeln eine D-Aminosäure in eine andere L- oder D-Aminosäureform um. Die L- Aminosäuren können anschließend direkt metabolisiert werden, während die D-Aminosäuren in metabolisierbare Formen weiter umgewandelt werden können. Dehydratasen katalysieren die Umwandlung einer D-Aminosäure in NH₄ ⁺, eine Ketosäure (je nach D-Aminosäuresubstrat) und H₂O (siehe 2). Beispiele für geeignete Oxidasen, Racemasen, Decarboxylasen, Transaminasen und Dehydratasen sind in Tabelle 1 und Tabelle 2 dargestellt.
In bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich bei dem D-Aminosäure-metabolisierenden Polypeptid um eine Dehydratase, zum Beispiel die D-Ser-Ammoniaklyase (ehemals als D-Ser-Dehydratase bekannt) oder eine Oxidase, zum Beispiel die D-Aminosäureoxidase.
Der Fachmann kann mit Routineversuchen leicht feststellen, ob ein Polypeptid eine D-Aminosäuremetabolisierende Wirksamkeit wie oben beschrieben aufweist (d.h. ob es sich um ein D-Aminosäuremetabolisierendes Enzym handelt).
Zu geeigneten D-Aminosäure-metabolisierenden Polypeptiden zählen auch Fragmente, Mutanten, Derivate, Varianten und Allele der in Tabelle 1 und Tabelle 2 beispielhaft angegebenen Polypeptide.
Geeignete Fragmente, Mutanten, Derivate, Varianten und Allele sind solche, die die funktionellen Eigenschaften des D-Aminosäure-metabolisierenden Enzyms beibehalten, also solche, die die Umsetzung eines D-Aminosäuresubstrats zu einer von Pflanzen metabolisierbaren Form katalysieren. Veränderungen, die an einer Sequenz vorgenommen werden und zu einer Mutante, Variante oder einem Derivat führen, können durch einen oder mehrere Vorgänge aus der Reihe Addition, Insertion, Deletion oder Substitution von einem oder mehreren Nukleotid(en) in der Nukleinsäure vorgenommen werden und zur Addition, Insertion, Deletion oder Substitution von einer oder mehreren Aminosäure(n) in dem codierten Polypeptid führen. Natürlich zählen dazu auch Veränderungen, die an der Nukleinsäure vorgenommen werden und ohne Auswirkung auf die codierte Aminosäuresequenz bleiben.
Ein Polypeptid, das ein D-Aminosäuresubstrat metabolisiert, kann eine Aminosäuresequenz mit mehr als ungefähr 30% Sequenzidentität mit einer in Tabelle 1 oder Tabelle 2 dargestellten Sequenz, mehr als ungefähr 35%, mehr als ungefähr 40%, mehr als ungefähr 45%, mehr als ungefähr 55%, mehr als ungefähr 65%, mehr als ungefähr 70%, mehr als ungefähr 80%, mehr als ungefähr 90% oder mehr als ungefähr 95% umfassen. Die Sequenz kann mehr als ungefähr 30% Ähnlichkeit mit einer in Tabelle 1 oder 2 dargestellten Sequenz, mehr als ungefähr 40% Ähnlichkeit, mehr als ungefähr 50% Ähnlichkeit, mehr als ungefähr 60% Ähnlichkeit, mehr als ungefähr 70% Ähnlichkeit, mehr als ungefähr 80% Ähnlichkeit oder mehr als ungefähr 90% Ähnlichkeit aufweisen.
Sequenzähnlichkeit und -identität wird üblicherweise im Bezug auf den GAP-Algorithmus (Genetics Computer Group, Madison, WI) definiert. Bei GAP bedient man sich des Algorithmus nach Needleman und Wunsch zur Erstellung eines Alignment von zwei vollständigen Sequenzen, die die Anzahl von Übereinstimmungen maximiert und die Anzahl Lücken minimiert. Im allgemeinen verwendet man vorgegebene Parameter mit einer "gap creation penalty" von 12 und einer "gap extension penalty" von 4.
Obwohl die Verwendung von GAP bevorzugt sein kann, können auch andere Algorithmen verwendet werden, z.B. BLAST (wobei das Verfahren von Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 405–410 verwendet wird), FASTA (wobei das Verfahren von Pearson und Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444–2448 verwendet wird) oder der Smith-Waterman-Algorithmus (Smith und Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147: 195–197), oder das TBLASTN-Programm von Altschul et al. (1990) oben, wobei im allgemeinen vorgegebene Parameter verwendet werden. Insbesondere kann der psi-Blast-Algorithmus (Nucl. Acids Res. (1997) 25 3389–3402) verwendet werden.
"Ähnlichkeit" gestattet eine "konservative Variation", also die Substitution von einem hydrophoben Rest wie Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin durch einen anderen, oder die Substitution eines polaren Rests durch einen anderen, wie die Substitution von Lysin durch Arginin, Asparaginsäure durch Glutaminsäure oder Asparagin durch Glutamin. Bestimmte Aminosäuresequenzvarianten können sich von einer bekannten Polypeptidsequenz wie im vorliegenden Text beschrieben durch Insertion, Addition, Substitution oder Deletion von 1 Aminosäure, 2, 3, 4, 5-10, 10-20, 20-30, 30-50 oder mehr als 50 Aminosäuren unterscheiden.
Eine pflanzenspezifische Regulationssequenz bzw. ein pflanzenspezifisches Element ist eine Sequenz, die die Expression (d.h. Transkription) einer Nukleinsäure vorzugsweise innerhalb einer Pflanzenzelle gegenüber anderen Zelltypen steuert.
So kann zum Beispiel die Expression von solch einer Sequenz in nichtpflanzlichen Zellen, wie in Bakterien- oder Säugetierzellen reduziert sein oder fehlen. Eine geeignete Regulationssequenz kann zum Beispiel von einem Pflanzenvirus wie dem Blumenkohlmosaikvirus 35 stammen.
Eine Regulationssequenz ist vorzugsweise in bezug auf das Gen, das für das D-Aminosäure-metabolisierende Enzym codiert, heterolog oder fremd. Solche Regulationssequenzen können eine wirksame Expression innerhalb einer Pflanzenzelle gewährleisten.
Der Begriff "heterolog" kann dazu verwendet werden, um anzuzeigen, daß das entsprechende Gen bzw. die entsprechende Nukleotidsequenz in diese Zellen der Pflanze oder eines ihrer Vorläufer mittels Gentechnik oder rekombinantem Weg, also durch den Eingriff des Menschen, eingeschleust worden ist.
Nukleotidsequenzen, die zu einer Pflanzenzelle heterolog bzw. exogen bzw. fremd sind, können nicht-natürlich vorkommende Nukleotidsequenzen in Zellen dieses Typs, dieser Sorte oder dieser Art sein. So wird zum Beispiel nichts über D-Aminosäure-metabolisierende Enzyme (also Enzyme, die D-Aminosäuren in von Pflanzen metabolisierbare Formen umwandeln) in Pflanzenzellen berichtet, und Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit dieser Wirksamkeit codiert, ist daher zu einer hiermit transformierten Pflanzenzelle "heterolog".
Zusätzlich zu Regulationssequenzen, die zu dem Gen, das für das D-Aminosäure-metabolisierende Polypeptid codiert, heterolog sind, kann eine Nukleinsäure ein oder mehrere cis-Elemente des endogenen Promoters des D-Aminosäure-metabolisierenden Polypeptids umfassen.
Unter "Promoter" versteht man eine Sequenz von Nukleotiden, von denen die Transkription von DNA, die stromabwärts (also in 3' Richtung des Sinnstrangs bei doppelsträngiger DNA) operativ verbunden ist, initiiert werden kann.
"Operativ verbunden" bedeutet zusammengefügt als Teil des gleichen Nukleinsäuremoleküls und in einer geeigneten Position und Orientierung, so daß die Transkription vom Promoter aus initiiert werden kann. Operativ mit einem Promoter verknüpfte DNA steht "unter Transkriptionsinitiationsregulation" des Promoters.
Ein geeignetes Regulationselement kann einen induzierbaren Promoter in operativer Verknüpfung mit der Nukleinsäure codierenden Sequenz beinhalten. Die Erfindung stellt auch Pflanzenzellen, die mit diesem Genkonstrukt transformiert sind, sowie Verfahren, darunter auch das Einschleusen solch einen Konstrukts in eine Pflanzenzelle und/oder die Induktion der Expression eines Konstrukts innerhalb einer Pflanzenzelle, z.B. durch Ausüben eines geeigneten Reizes, bereit.
Der Begriff "induzierbar" im Zusammenhang mit einem Promoter ist dem Fachmann gut bekannt. Im Prinzip wird eine Expression unter der Kontrolle eines induzierbaren Promoters als Reaktion auf einen ausgeübten Reiz (der innerhalb einer Zelle erzeugt oder exogen bereitgestellt werden kann) "eingeschaltet" oder verstärkt. Die Art des Reizes hängt von den Promotern ab. Wie hoch auch immer das Expressionsniveau ohne den Reiz ist, die Expression von jeglichem induzierbaren Promoter wird in Anwesenheit des richtigen Reizes erhöht. Die bevorzugte Situation ist, wenn das Expressionsniveau in Gegenwart des entsprechenden Reizes um solch eine Menge erhöht wird, daß eine phänotypische Eigenschaft, also die Erhöhung der Toleranz einer D-Aminosäure, geändert wird. So kann zum Beispiel ein induzierbarer (oder "schaltbarer") Promoter verwendet werden, der ein Expressionsgrundniveau bei Fehlen des Reizes verursacht, das zu niedrig ist, um den gewünschten D-aminosäuretoleranten Phänotyp zu bewirken (der nämlich null sein kann). Bei Ausübung des Reizes wird die Expression auf ein Niveau, das eine erhöhte D-Aminosäuretoleranz verursacht, erhöht (bzw. eingeschaltet).
Der Fachmann ist mit vielen Beispielen für induzierbare Promoter vertraut.
Zu anderen geeigneten Promotern können zum Beispiel der Promoter des 35S-Gens des Blumenkohlmosaikvirus (CaMV 35S), der auf hohem Niveau in praktisch allen Pflanzengeweben exprimiert wird (Benfey et al. (1990) EMBO J 9: 1677–1684), der Blumenkohl-meri-5-Promoter, der in dem vegetativen Apikalmeristem sowie an mehreren gut lokalisierten Punkten im Pflanzenkörper z.B. dem innerem Phloem, den Blütenanlagen, den Verzweigungspunkten in Wurzel und Sproß exprimiert wird (Medford, J.I. (1992) Plant Cell 4, 1029–1039; Medford et al. (1991) Plant Cell 3, 359–370), sowie der LEAFY-Promoter von Arabidopsis thaliana, der sehr früh während der Blütenentwicklung exprimiert wird (Weigel et al. (1992) Cell 69, 843–859), zählen. Weitere Beispiele sind auf Seite 120 von Lindsey und Jones (1989) "Plant Biotechnology in Agriculture" Pub. OU Press, Milton Keynes, Großbritannien, beschrieben.
Die Erfindung stellt einen Vektor, der eine wie oben beschriebene Nukleinsäure umfaßt, zum Beispiel einen Plasmid- oder Virusexpressionsvektor, bereit.
Im vorliegenden Zusammenhang kann die Expression eines Polypeptids mit D-Aminosäure-metabolisierender Wirksamkeit ausgehend von der codierenden Nukleinsäure für die Selektion von Transformanten, die ein Nukleinsäurekonstrukt oder einen Vektor wie hierin beschrieben enthalten, verwendet werden.
In manchen Ausführungsformen kann ein Vektor zusätzlich einen selektierbaren genetischen Marker umfassen, der aus einem chimären Gen, das einen selektierbaren Phänotyp vermittelt, wie Resistenz gegen ein Antibiotikum wie Kanamycin, Hygromycin, Phosphinotricin, Chlorsulfuron, Methotrexat, Gentamycin, Spectinomycin, Imidazolinone und Glyphosate, besteht. Dies ermöglicht zusätzlich zu der Selektion mit Hilfe der Expression des D-Aminosäure-metabolisierenden Polypeptids gewünschtenfalls ein zweites Selektionsniveau.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung einer Nukleinsäure wie hierin beschrieben zur Herstellung einer transgenen Pflanze bereitgestellt. Solch ein Verfahren kann die Selektion oder die selektive Formierung von transgenen Pflanzen, die genetisches Fremdmaterial umfassen, ermöglichen oder der Verbesserung der Toleranz einer Pflanze gegenüber D-Aminosäuren dienen. Selektiert wird vorzugsweise dadurch, daß man die Pflanze oder Pflanzenzelle auf einem Medium mit einem definierten Stickstoffgehalt, der eine D-Aminosäure umfaßt, heranzieht, der Stickstoff in dem Medium liegt also vollständig oder teilweise in Form einer D-Aminosäure vor.
Die Identität der D-Aminosäure in dem Medium wird durch die Spezifität des heterologen D-Aminosäuremetabolisierenden Polypeptids, das von der Pflanze oder Pflanzenzelle exprimiert wird, bestimmt, das Medium enthält also das D-Aminosäuresubstrat des heterologen D-Aminosäure-metabolisierenden Polypeptids. Wird zum Beispiel eine heterologe D-Serindehydratase von einer Pflanze exprimiert, so ist D-Serin in dem Wachstumsmedium vorhanden.
Erfindungsgemäße Nukleinsäuren können in aus ihrer natürlichen Umgebung isolierter und/oder aufgereinigter Form, in im wesentlichen reiner oder homogener Form oder frei bzw. im wesentlichen frei von anderen Nukleinsäuren der Ausgangsart bereitgestellt werden. Im vorliegenden Zusammenhang umfaßt der Begriff "isoliert" alle diese Möglichkeiten.
Nukleinsäure kann natürlich doppelt- oder einzelsträngig, cDNA oder genomische DNA, oder RNA sein. Expresionsprodukte können daher durch Expression von codierender Nukleinsäure unter geeigneten Bedingungen in geeigneten Wirtspflanzenzellen hergestellt werden.
Die Nukleinsäuremoleküle können ganz oder teilweise synthetisch sein. Insbesondere können sie rekombinant sein, und zwar in dem Sinn, daß Nukleinsäuresequenzen, die nicht gemeinsam in der Natur vorkommen (die nicht direkt aneinander anschließen), ligiert oder auf sonstige Weise künstlich kombiniert worden sind. Sie können jedoch auch direkt, z.B. mit einem automatischen Synthesegerät, synthetisiert worden sein.
Der Fachmann kann leicht Vektoren konstruieren und Protokolle für die Expression von rekombinanten Genen, insbesondere in einer Pflanzenzelle, ausarbeiten. Es können geeignete Vektoren ausgewählt oder konstruiert werden, die entsprechende Regulationssequenzen, darunter auch und je nach Bedarf Promotersequenzen, Terminatorfragmente, Polyadenylierungssequenzen, Enhancer-Sequenzen, Markergene oder sonstige Sequenzen beinhalten. Genaueres ist zum Beispiel aus Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3. Ausgabe, Sambrook & Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press ersichtlich.
"Vektor" wird so definiert, daß der Begriff unter anderem ein beliebiges Plasmid, Cosmid, einen beliebigen Phagen oder binären Agrobakterium-Vektor in doppel- oder einzelsträngiger, linearer oder ringförmiger Form, das bzw. der gegebenenfalls selbstübertragbar oder selbstmobilisierbar ist und der fähig ist, einen prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt, insbesondere einen pflanzlichen Wirt, entweder durch Integration in das Zellgenom oder durch extrachromosomales Vorliegen (z.B. autonom replizierendes Plasmid mit Replikationsursprung) zu transformieren.
Insbesondere zählen dazu Shuttle-Vektoren, worunter man ein DNA-Klonierungsvehikel versteht, das entweder natürlich oder geplant fähig ist, in zwei unterschiedlichen Organismen, die aus der Reihe Actinomyces und verwandte Arten, Bakterien und eukaryontische Zellen (z.B. Zellen aus höheren Pflanzen, Säugetieren, Hefe oder Pilzen) zu replizieren.
Viele bekannte Techniken und Protokolle für die Manipulation von Nukleinsäure, zum Beispiel bei der Herstellung von Nukleinsäurekonstrukten, bei der Mutagenese, beim Sequenzieren, bei der Einschleusung von DNA in Zellen und bei der Genexpression, sowie für die Analyse von Proteinen sind detailliert in Protocols in Molecular Biology, zweite Ausgabe, Hrsg. Ausubel et al., John Wiley & Sons, 1992, beschrieben.
Bevan et al. (Bevan et al Nucl Acids Res. (1984) 12, 8711–8721) und Guerineau und Mullineaux (Guerineau und Mullineaux (1993) Plant transformation and expression vectors. In: Plant Molecular Biology Labfax (Hrsg. RRD Croy) Oxford, BIOS Scientific Publishers, S. 121–148) beschreiben einzelne Vorgehensweisen und Vektoren, die bereits äußerst erfolgreich in Pflanzen verwendet worden sind.
Beim Einschleusen eines Nukleinkonstrukts in eine Zelle müssen gewisse Gesichtspunkte, mit denen der Fachmann gut vertraut ist, in Betracht gezogen werden. Es muß ein Verfahren für den Transfer des Konstrukts in die Zelle verfügbar sein. Sobald sich das Konstrukt innerhalb der Zellmembran befindet, findet gegebenenfalls eine Integration in das endogene chromosomale Material statt. Das Expressionsprodukt des D-Aminosäure-metabolisierenden Gens kann an ein bestimmtes intrazelluläres Kompartiment, wie den Peroxisomen oder das Cytosol geleitet oder überall exprimiert werden. Schließlich muß bei Pflanzen der Zelltyp, auf den abgezielt wird, es ermöglichen, daß Zellen zu ganzen Pflanzen regeneriert werden können.
Zur Einschleusung von Nukleinsäurekonstrukten und Vektoren in Pflanzen zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit einem entsprechenden D-aminosäuretoleranten Phänotyp können Techniken verwendet werden, mit denen der Fachmann gut vertraut ist.
Ein Verfahren, das vom Fachmann auf dem Gebiet der Transformation von Pflanzenzellen, insbesondere von dikotyledonen Arten, verwendet wird, ist die Transformation mit Agrobakterium. Stabile, fruchtbare, transgene Pflanzen werden derzeit routinemäßig bei beinahe allen ökonomisch wichtigen monokotyledonen Pflanzen erzeugt: (Toriyama, et al. (1988) Bio/Technology 6, 1072–1074; Zhang, et al. (1988) Plant Cell Rep. 7, 379–384; Zhang, et al. (1988) Theor Appl Genet 76, 835–840; Shimamoto, et al. (1989) Nature 338, 274–276; Datta, et al. (1990) Bio/Technology 8, 736–740; Christou, et al. (1991) Bio/Technology 9, 957–962; Peng, et al. (1991) International Rice Research Institute, Manila, Philippines 563–574; Cao, et al. (1992) Plant Cell Rep. 11, 585–591; Li, et al. (1993) Plant Cell Rep. 12, 250–255; Rathore, et al. (1993) Plant Molecular Biology 21, 871–884; Fromm, et al. (1990) Bio/Technology 8, 833–839; Gordon-Kamm, et al. (1990) Plant Cell 2, 603–618; D'Halluin, et al. (1992) Plant Cell 4, 1495–1505; Walters, et al. (1992) Plant Molecular Biology 18, 189–200; Koziel, et al. (1993) Biotechnology 11, 194–200; Vasil, I. K. (1994) Plant Molecular Biology 25, 925–937; Weeks, et al. (1993) Plant Physiology 102, 1077–1084; Somers, et al. (1992) Bio/Technology 10, 1589–1594; WO92/14828). Insbesondere stellt die Transformation mittels Agrobakterium nun ein hochwirksames Transformationsverfahren bei Monokotyledonen dar (Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6, 271–282).
In Aspekten der Erfindung wird ein Expressionsvektor für solche Transformationsverfahren, bei denen ein entwaffnetes Agrobakterium Ti-Plasmid und ein Agrobakterium tumefaciens Bakterium, das solch einen Expressionsvektor umfaßt, bereitgestellt.
Mit diesem Ansatz sind erfolgreich fruchtbare transgene Pflanzen bei den Getreiden Reis, Mais, Weizen, Hafer und Gerste (Übersichtsartikel in Shimamoto, K. (1994) Current Opinion in Biotechnology 5, 158–162; Vasil, et al. (1992) Bio/Technology 10, 667–674; Vain et al., 1995, Biotechnology Advances 13 (4): 653–671; Vasil, 1996, Nature Biotechnology 14 Seite 702) erzeugt worden. Wan und Lemaux (1994) Plant Physiol. 104: 37–48 beschreiben Techniken für die Erzeugung von vielen unabhängig transformierten fruchtbaren Gerstenpflanzen.
In Fällen, wo die Transformation mit Agrobakterium nicht schlagkräftig oder unwirksam ist, können andere Verfahren, wie der Beschuß mit Mikroprojektilen oder Teilchen ( US 5100792 , EP-A-444882, EP-A-434616), Elektroporation ( EP 290395 , WO 8706614), Mikroinjektion (WO 92/09696, WO 94/00583, EP 331083 , EP 175966 , Green et al. (1987) Plant Tissue and Cell Culture, Academic Press) die direkte DNA-Aufnahme ( DE 4005152 , WO 9012096, US 4684611 ) die liposomenvermittelte DNA-Aufnahme (z.B. Freeman et al. Plant Cell Physiol. 29: 1353 (1984)) oder das Vortex-Verfahren (z.B. Kindle, PNAS U.S.A. 87: 1228 (1990d)) bevorzugt werden.
Insbesondere können Gymnospermen wie Koniferen mit Partikelbeschußtechniken transformiert werden (Clapham, D. et al. 2000. Scan. J. For. Res. 15: 151.160). Physikalische Methoden für die Transformation von Pflanzenzellen werden von Oard, (1991) Biotech. Adv. 9: 1–11 in einem Übersichtsartikel behandel.
Man jedoch auch eine Kombination von unterschiedlichen Techniken verwenden, um die Effizienz des Transformationsvorgangs, z.B. Beschuß mit agrobakteriumbeschichteten Mikropartikeln (EP-A-486234) oder Beschuß mit Mikroprojektilen zwecks Verwundung sowie anschließende Cokultivierung mit Agrobakterium (EP-A-486233) zu erhöhen.
Im Anschluß an die Transformation kann eine Pflanze z.B. aus einzelnen Zellen, aus Kallusgewebe oder aus Blattscheibchen auf fachbekannte Weise regeneriert werden. Beinahe alle Pflanzen können vollständig aus Zellen, Geweben und Organen der Pflanze regeneriert werden. Verfügbare Techniken werden von Vasil et al., Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Band I, II und III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, 1984, und Weissbach und Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989 in Übersichtsartikeln behandelt.
Die jeweilige Auswahl einer Transformationsmethode wird aufgrund ihrer Wirksamkeit bei der Transformation der Zielpflanzenart sowie der Erfahrung und Bevorzugung des Anwenders bei einer bestimmten Methodik bestimmt werden. Dem Fachmann wird klar sein, daß die jeweilige Wahl eines Transformationssystems für die Einschleusung von Nukleinsäure in Pflanzenzellen sowie die Wahl der Pflanzenregenerationstechnik nicht erfindungswesentlich sind bzw. die Erfindung nicht einschränken.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer Zelle, insbesondere einer Pflanzenzelle, bereitgestellt, bei dem eine isolierte Nukleinsäure, umfassend eine Sequenz, die für ein D-Aminosäure-metabolisierendes Polypeptid codiert und die operativ mit einem pflanzenspezifischen Regulationselement verbunden ist, oder ein Vektor, der solch eine Nukleinsäure umfaßt, mittels Transformation in die Zelle eingeschleust wird. Solch ein Verfahren zur Herstellung einer Zelle kann beinhalten, daß man die Nukleinsäure mit der Nukleinsäure des Zellgenoms so rekombiniert, daß sie darin stabil eingebaut ist. Aus einer oder mehreren Zellen, die wie beschrieben transformiert worden ist bzw. sind, kann eine Pflanze regeneriert werden.
Das D-Aminosäure-metabolisierende Polypeptid, die codierende Nukleinsäure und/oder der Vektor, der die Nukleinsäure umfaßt, können zu der damit transformierten Pflanzenzelle heterogen, also exogen oder fremd, sein.
Ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanzenzelle kann beinhalten, daß man die Nukleinsäure exprimiert und die Akkumulation des dadurch exprimierten D-Aminosäuremetabolisierenden Polypeptids im Cytosol, Peroxisom, Chloroplasten und/oder sonstigen intrazellulären Kompartiment der Pflanzenzelle verursacht oder ermöglicht.
Ein Verfahren zur Herstellung solch einer Pflanzenzelle kann beinhalten, daß man solch eine Nukleinsäuresequenz oder einen geeigneten Vektor, der die Nukleinsäure beinhaltet, in eine Pflanzenzelle einschleust und eine Rekombination zwischen dem Vektor und dem Pflanzenzellgenom verursacht oder ermöglicht, um die Nukleinsäuresequenz in das Genom einzuschleusen, Ein Verfahren kann weiterhin die sexuelle oder asexuelle Vermehrung oder das Heranziehen von Nachkommenschaft bzw. einem Nachkommen der aus der Pflanzenzelle regenerierten Pflanze umfassen.
Die Erfindung umfaßt weiterhin eine Wirtszelle, die mit einer oben beschriebenen Nukleinsäuresequenz oder einem oben beschriebenen Vektor transformiert worden ist, die also eine wie oben beschriebene Nukleinsäure oder einen wie oben beschriebenen Vektor enthält, insbesondere eine Pflanzenzelle, zum Beispiel eine Zelle von einer höheren Pflanze, oder die Zelle eines pflanzlichen Mikroorganismus. Es wird also eine Wirtszelle, wie eine Pflanzenzelle, die eine wie im vorliegenden Text beschriebene Nukleotidsequenz beinhaltet, bereitgestellt. Innerhalb der Zelle kann die Nukleotidsequenz innerhalb der Chromosoms eingebaut sein oder extrachromosomal vorliegen. Es kann mehr als eine heterologe Nukleotidsequenz pro haploidem Genom vorliegen. Dies ermöglicht zum Beispiel die erhöhte Expression des Genprodukts im Vergleich zu dem endogenen Niveau, wie dies im folgenden diskutiert wird. Eine innerhalb einer Pflanzenzelle umfaßte Nukleinsäurecodiersequenz kann unter der Kontrolle eines pflanzenspezifischen Regulationselements, bei dem es sich um einen äußerlich induzierbaren Genpromoter handelt, stehen, zum Beispiel, um die Expression unter die Kontrolle des Verwenders zu stellen.
Das D-Aminosäure-metabolisierende Polypeptid kann im Cytosol, im Peroxisom oder in einem sonstigen intrazellulären Kompartiment der Pflanzenzelle vorliegen. Die Zielsteuerung des D-Aminosäuremetabolisierenden Polypeptids in ein Kompartiment kann durch Fusionieren der Nukleinsäuresequenz, die für das D-Aminosäure-metabolisierende Polypeptid codiert, mit einer Sequenz, die für ein Leitpeptid codiert, unter Bildung eines Fusionsproteins erzielt werden. Genprodukte, die ohne solche Leitpeptide exprimiert werden, werden üblicherweise in Cytosol angehäuft.
Eine Nukleinsäure, die stabil in das Genom einer Pflanze eingebaut ist, wird von Generation zu Generation an nachkommende Pflanzen weitergegeben, wobei Zellen dieser Nachkommen das codierte D-Aminosäure-metabolisierende Polypeptid exprimieren können und so über eine erhöhte D-Aminosäuretoleranz verfügen können.
Eine Pflanzenzelle kann eine für ein D-Aminosäuremetabolisierendes Polypeptid codierende Nukleinsäuresequenz in operativer Verknüpfung mit einem pflanzenspezifischen Regulationselement aufgrund der Einschleusung der Nukleotidsequenz in eine Vorfahrenzelle enthalten.
Eine wie hier beschriebene Pflanzenzelle kann in einer Pflanze, einem Pflanzenteil oder einem pflanzlichen Vermehrungsorgan, oder einem Extrakt oder einem Folgeprodukt einer Pflanze wie im folgenden beschrieben vorliegen.
Pflanzen, die eine wie im vorliegenden Text beschriebene Pflanzenzelle beinhalten, werden ebenfalls bereitgestellt, genau wie ein beliebiger Teil bzw. ein beliebiges Vermehrungsorgan davon, Samen, durch Selbstdung erzeugte Nachkommenschaft oder Hybridnachkommenschaft sowie -nachkommen. Insbesondere werden transgene monokotyledone Pflanzen, dikotyledone Pflanzen, Gymnospermen, Algen, Farne. und Moose bereitgestellt. Von besonderem Interesse sind transgene höhere Pflanzen, insbesondere landwirtschaftliche und waldbauliche Kulturen, zum Beispiel Getreide, Bäume und Zierpflanzen, die dahingehend verändert worden sind, daß sie ein wie oben beschriebenes Nukleinsäurekonstrukt tragen.
Zu geeigneten Pflanzen zählen zum Beispiel Tabak, Kürbisgewächse, Karotte, Kohlgemüsearten, Melonen, Paprika, Weintrauben, Salat, Erdbeere, Brassica-Ölsaaten, Zuckerrübe, Weizen, Gerste, Mais, Reis, Sojabohnen, Erbsen, Sorghum, Sonnenblume, Tomate, Kartoffel, Pfeffer, Chrysantheme, Nelke, Poplar, Eukalyptus, Baumwolle, Lein, Hanf, Fichte, Birke, Erdnüsse, Roggen und Föhre.
Bei einer erfindungsgemäßen Pflanze kann es sich um eine Pflanze handeln, die bezüglich einem oder mehrerer Merkmale nicht reinerbig ist. Pflanzensorten, insbesondere Pflanzensorten, die nach dem Sortenschutzrecht schützbar sind, können ausgenommen sein. Es ist anzumerken, daß eine Pflanze nicht einfach deshalb, weil sie ein Transgen, das in eine Zelle der Pflanze oder einen ihrer Vorfahren eingeschleust worden ist, stabil innerhalb seines Genoms enthält, als "Pflanzensorte" zu betrachten ist.
Zusätzlich zu einer Pflanze stellt die vorliegende Erfindung einen beliebigen Klon solch einer Pflanze, Samen, durch Selbstdung erhaltene Nachkommenschaft oder Hybridnachkommenschaft und -nachkommen und einen beliebigen Teil oder Vermehrungsmaterial von diesen, wie Ableger und Samen, die bei der sexuellen oder asexuellen Vermehrung oder Reproduktion verwendet werden können, bereit. Ebenfalls von der Erfindung umfaßt ist eine Pflanze, bei der es sich um eine(n) sexuell oder asexuell vermehrte(n) Nachkommenschaft, Klon oder Nachkommen von solch einer Pflanze oder einen beliebigen Teil oder Vermehrungsmaterial von dieser Pflanze, dieser Nachkommenschaft, diesem Klon oder diesem Nachkommen handelt.
Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung sehen die Verwendung von D-Aminosäuren für das selektive Heranziehen, Regenerieren oder Vermehren von transgenen Pflanzenzellen, Pflanzengeweben oder Gefäßpflanzen, die ein heterogenes D-Aminosäure-metabolisierendes Polypeptid wie oben beschrieben umfassen, vor.
Ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze kann folgendes umfassen:
Transformieren einer Pflanzenzelle mit einer Nukleinsäure oder Vektor umfassend eine Sequenz, die für ein Polypeptid, das ein D-Aminosäuresubstrat metabolisiert, codiert, wie im vorliegenden Text beschrieben, sowie
Regenerieren einer Planze aus der Zelle auf einem Medium, das eine definierte Stickstoffquelle umfaßt,
wobei die definierte Stickstoffquelle dieses D-Aminosäuresubstrat umfaßt oder daraus besteht.
Transformierte Pflanzenzellen sind fähig, die in dem Medium als Stickstoffquelle vorhandene D-Aminosäure zu verwerten. Zellen, die nicht transformiert sind und das Polypeptid mit D-Aminosäure-metabolisierender Wirksamkeit nicht enthalten, sind unfähig, diese Stickstoffquelle zu verwerten, und ihr Wachstum ist deshalb behindert. Weiterhin kann D-Aminosäure in dem Medium eine toxische Wirkung auf nichttransformierte Pflanzen (Pflanzen, die über keine D-Aminosäuremetabolisierende Wirksamkeit verfügen) ausüben.
Eine D-Aminosäure, die sich für das Medium als Substrat für das D-Aminosäure-metabolisierende Enzym eignet, kann aus der Gruppe D-Arg, D-Ser, D-Glu, D-Ala, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-His, D-Ile, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Asn, D-Thr, D-Trp, D-Tyr und D-Val stammen. Es wird vorzugsweise eine der Aminosäuren D-Ser, D-Ala, D-Glu, D-Asn, D-Arg, D-Lys, D-His oder D-Asp, stärker bevorzugt D-Ala oder D-Ser, verwendet. Diese D-Aminosäuren sind für Pflanzen, die nicht über das entsprechende D-Aminosäure-metabolisierende Enzym verfügen, toxisch.
Zu weiteren geeigneten Substraten für D-Aminosäuremetabolisierende Enzyme zählen Nichtproteinaminosäuren, Vorstufen von Aminosäuren und Aminosäureabkömmlinge.
Stickstoff ist häufig dasjenige Element, das das Wachstum von Pflanzen in landwirtschaftlichen Systemen limitiert. Zusammensetzungen, in denen der Stickstoffgehalt ganz oder teilweise in Form von einer oder mehreren D-Aminosäuren vorliegt (in denen also der Stickstoffgehalt des Düngers teilweise oder vollständig in Form von einer oder mehreren D-Aminosäuren vorliegt) eignen sich als bevorzugte oder selektive Dünger für transgene Pflanzen, die ein Enzym, das die D-Aminosäure metabolisiert, exprimieren. Nichtransgene Pflanzen, die solch ein Enzym nicht exprimieren, werden aus solch einer Düngerzusammensetzung weniger Nutzen ziehen. Bei manchen Ausführungsformen ist die D-Aminosäure für solche Pflanzen toxisch und hemmt oder hindert aktiv deren Wachstum. So ist zum Beispiel D-Ser für Wildtyppflanzen toxisch (3).
Eine Zusammensetzung für die selektive Düngung einer transgenen Pflanze, die ein Polypeptid, das ein D-Aminosäuresubstrat metabolisiert, umfaßt, ist im vorliegenden Text beschrieben; wobei diese Zusammensetzung dieses D-Aminosäuresubstrat umfaßt.
Der Stickstoffgehalt der Zusammensetzung kann ganz oder teilweise in Form des D-Aminosäuresubstrats vorliegen, (kann also die einzige Stickstoffquelle oder eine von mehreren Quellen für Stickstoff in der Zusammensetzung sein). Der Anteil des verfügbaren Stickstoffs in der Zusammensetzung, der in D-Aminosäureform vorliegt, kann 0,1%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% oder 100 betragen.
Zu den D-Aminosäuresubstraten, die sich für die Zusammensetzung eignen zählen D-Arg, D-Ser, D-Glu, D-Ala, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-His, D-Ile, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Asn, D-Thr, D-Trp, D-Tyr oder D-Val.
Vorzugsweise wird eine der Aminosäuren D-Ser, D-Ala, D-Glu, D-Arg, D-Lys, D-His, D-Asn oder D-Asp, stärker bevorzugt D-Ala oder D-Ser, verwendet. Diese D-Aminosäuren sind für Pflanzen, die kein heterogenes Polypeptid, das sie metabolisiert, enthalten, toxisch und weisen also insofern "Doppelwirkung" auf, als sie sowohl erwünschtes Pflanzenwachstum fördern als auch unerwünschtes Pflanzenwachstum hemmen.
Zu weiteren geeigneten Substraten für das D-Aminosäuremetabolisierende Polypeptid zählen Nichtprotein-D-Aminosäuren, Vorstufen von D-Aminosäuren und D-Aminosäurederivate.
Ein Verfahren zur Herstellung eines wie oben beschriebenen Düngers kann die Bereitstellung einer Pflanzendüngerzusammensetzung, der eine Stickstoffquelle fehlt bzw. im wesentlichen fehlt, und das Zumischen eines im vorliegenden Text beschriebenen D-Aminosäuresubstrats zu dieser Zusammensetzung umfassen.
Eine selektive Herbizidzusammensetzung, die eine D-Aminosäure umfaßt, wird beschrieben.
Solch ein Herbizid wird das Wachstum von Pflanzen, die das entsprechende D-Aminosäure-metabolisierende Enzym nicht enthalten, hemmen oder reduzieren, wohingegen das Wachstum von transgenen Pflanzen, die zur Metabolisierung der D-Aminosäure fähig sind, nicht negativ beeinflußt wird oder, stärker bevorzugt, erhöht. oder verstärkt sein wird.
Die Zusammensetzung kann 0,1%(w/w) oder mehr, 1%(w/w) oder mehr, 5%(w/w) oder mehr, 10%(w/w) oder mehr, 15%(w/w) oder mehr, 20%(w/w) oder mehr, 25%(w/w) oder mehr oder 30%(w/w) oder mehr an dieser D-Aminosäure umfassen.
Solch eine Herbizidzusammensetzung kann in Verfahren zur Kontrolle von Pflanzenwachstum verwendet werden, bei denen eine oder mehrere Pflanzen mit der Zusammensetzung behandelt werden.
Ein Verfahren zur Herstellung solch einer Herbizidzusammensetzung kann das Zumischen einer D-Aminosäure zu einer Grundlage, einem Träger oder einem Grundstoff beinhalten.
Geeignete Grundlagen, Träger und Grundstoffe für landwirtschaftliche Zusammensetzungen, insbesondere herbizide Zusammensetzungen, sind in der Fachwelt gutbekannt.
D-Aminosäuren werden von Aminosäureoxidasen metabolisiert, wobei Wasserstoffperoxid (H₂O₂) entsteht. Diese Verbindung wirkt als Signal, das Abwehrreaktionen in Pflanzen hervorruft. Solche Reaktionen werden im allgemeinen durch Umweltstreß wie übermäßig starkes Licht, Kälte oder Infektion durch Krankheitserreger ausgelöst.
Eine Pflanze, die ein D-Aminosäureoxidaseenzym enthält, reagiert auf den Zusatz von D-Aminosäuren dadurch, daß sie H₂O₂ erhöht, also dadurch, daß Abwehrreaktionen ausgelöst werden. Dadurch wird ein Mechanismus bereitgestellt, der es ermöglicht, daß Landwirte spezifisch pflanzliche Abwehrreaktionen auslösen. Der Zusatz einer D-Aminosäure zu Pflanzen, die das D-Aminooxidasegen exprimieren, führt zu einem starken Ansteigen der endogenen H₂O₂ Produktion, die die normalen Abwehrreaktionen in diesen Pflanzen induziert. Diese Abwehrreaktion könnte vom Landwirt ausgelöst werden, um die Streßtoleranz zu erhöhen, wenn er Pflanzen von innen nach außen bringt, um die Gefriertoleranz zu erhöhen, wenn die Gefahr von Frostschädigung besteht, wenn bekannte Schädlinge und Pathogene im Zunehmen sind, oder in anderen Situationen, wenn eine aktive Abwehrreaktion in der Pflanze möglicherweise von Vorteil ist.
Ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit einer induzierbaren Streßreaktion kann folgendes umfassen:
Transformieren einer Pflanzenzelle mit einer Nukleinsäuresequenz, die für eine D-Aminosäureoxidase codiert, sowie
Regenerieren der transgenen Pflanze aus der Pflanzenzelle.
Ein Verfahren zur Stimulation der Streßtoleranz einer transgenen Pflanze kann folgendes umfassen:
Exprimieren eines Polypeptids, das ein D-Aminosäuresubstrat oxodiert, in dieser Pflanze, sowie
Behandeln dieser Pflanze mit dem D-Aminosäuresubstrat.
Geeignete D-Aminosäureoxidase-Polypeptide sind oben beschrieben und in Tabelle 1 und Tabelle 2 beispielhaft angeführt.
Eine geeignete Dosis D-Aminosäure stimuliert eine Streßreaktion, ohne eine dauerhafte Zellschädigung zu verursachen. Die genaue Dosierung wird von der Pflanzenart, dem Wachstumsstadium, der Bodenart, der Temperatur und den Wetterbedingungen abhängen, kann jedoch für eine bestimmte Situation leicht vom Fachmann nach Routinemethoden bestimmt werden.
Bei manchen bevorzugten Ausführungsformen können zur Induktion der Streßtoleranz hohe D-Aminosäuregehalte, z.B. 0,1 bis 50 mM D-Aminosäure, stärker bevorzugt 1 bis 10 mM, in dem Kulturmedium verwendet werden.
Eine verbesserte Streßtoleranz kann eine im Vergleich zu normalen, unbehandelten Pflanzen verstärkte oder erhöhte Toleranz gegen Umweltstreß wie Ultraviolett-UV-Strahlung, Extremtemperaturen, Bestrahlung und/oder Infektion mit Pathogenen, zum Beispiel Infektion durch Bakterien oder Pilze, insbesondere durch nekrotisierende Pathogene beinhalten.
Die wie oben beschriebene Produktion von H₂O₂ durch D-Aminosäureoxidasen bzw. die Akkumulierung von Produkten des D-Aminosäuremetabolismus kann, wenn die Produktionsgeschwindigkeit hoch ist und/oder die Produktion in einem Zellkompartiment, das gegenüber H₂O₂ oder anderen Stoffwechselprodukten empfindlich ist, für die transgenen Pflanzen schädlich sein.
Verfahren der vorliegenden Erfindung können daher verwendet werden, um transgene Pflanzen selektiv aus Mischpopulationen zu entfernen oder sogar auch dazu, um Hybride zwischen transgenen Pflanzen und Wildtyppflanzen aus natürlichen Populationen zu entfernen.
Ein Verfahren zur Hemmung des Wachstums oder der Lebensfähigkeit einer transgenen Pflanze, die ein Polypeptid exprimiert, das ein D-Aminosäuresubstrat wie im vorliegenden Text beschrieben oxidiert, kann folgendes umfassen:
Behandeln der Pflanze mit dem D-Aminosäuresubstrat.
Die Lokalisierung der exprimierten D-Aminosäureoxidase im Peroxisom produziert H₂O₂, das von dem H₂O₂-abbauenden Enzym Katalase rasch metabolisiert werden kann. Zur Produktion von schädigenden H₂O₂-Gehalten sind daher hohe D-Aminosäuregehalte erforderlich. Eine Expression der D-Aminosäureoxidase in Cytosol, wo die Katalaseaktivität niedriger ist, verringert die für die Produktion von schädigenden H₂O₂-Gehalten erforderlichen D-Aminosäuremengen.
Eine Expression der D-Aminosäureoxidase in Cytosol kann dadurch erzielt werden, daß man Signale oder Signalpeptide, die der Zielsteuerung an die Peroxisomen dienen, von der codierenden Nukleinsäuresequenz entfernt.
Der Zusatz einer D-Aminosäure kann daher zur Hemmung oder Verringerung des Wachstums oder der Lebensfähigkeit einer transgenen Pflanze, die über eine cytosolische D-Aminosäureoxidaseaktivität verfügt, dienen.
Ein Verfahren zur Hemmung des Wachstums oder der Lebensfähigkeit einer transgenen Pflanze, die ein Polypeptid exprimiert, das ein D-Aminosäuresubstrat wie im vorliegenden Text beschrieben oxidiert, kann folgendes umfassen:
Verursachen oder Gestatten der Akkumulierung des Polypeptids im Cytosol der Pflanze, sowie
Behandeln der Pflanze mit dem D-Aminosäuresubstrat.
D-Aminosäuren, die eine niedrige Toxizität für Wildtyppflanzen aufweisen, zum Beispiel D-Ile, D-Asn oder D-Gln, die jedoch gemäß dem Metabolismus in transgenen Pflanzen, die exogene D-Aminosäureoxidasen enthalten, zur Produktion von H₂O₂ oder anderen toxischen Stoffwechselprodukten führen, eignen sich besonders für solche Verfahren.
Bei den im vorliegenden Text beschriebenen Verfahren können gegebenenfalls Kontrollversuche durchgeführt werden. Der Fachmann auf diesem Gebiet ist leicht zur Durchführung von geeigneten Kontrollen befähigt und mit diesen vertraut.
Verschiedene weitere Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann im Licht der vorliegenden Offenbarung klar werden.
Gewisse Aspekte und Ausführungsformen der Erfindung sollen nun beispielhaft und unter Bezugnahme auf die im folgenden beschriebenen Abbildungen erläutert werden.
1 zeigt das Frischgewicht von Arabidopsis thaliana-Pflanzen, die 20 Tage lang in steriler Agar-Agar-Kultur gezüchtet und mit unterschiedlichen N-Quellen versorgt wurden. Die Kontrollpflanzen wurden ohne jegliche Stickstoffquelle herangezogen.
2 zeigt Beispiel für mögliche Verstoffwechselungen von D-Aminosäuren in Organismen.
3 zeigt das Frischgewicht von Wildtyppflanzen (Wt; schwarze Balken) und von Pflanzen, die mit dem für das Enzym bakterielle Enzym D-Serindehydratase codierenden Bakteriengen transformiert worden sind (dsdA21, hellgraue Balken) die auf sterilem Agar-Agar herangezogen und mit D-Serin in unterschiedlichen Konzentrationen (2,5, 30, 3 und 0,3 mM) mit (MS) bzw. ohne (MS-N) der üblichen Stickstoffquelle Nitrat behandelt wurden.
4 zeigt die Biomasse (a) und den Stickstoffgehalt (b) nach der Ernte von Arabidopsis thaliana-Pflanzen, die 14 Tage nach der Keimung herangezogen worden waren. Die Pflanzen wurden auf MS-Medium in halber Stärke ohne eine Stickstoffquelle außer D-Serin herangezogen. Die leeren Balken stellen transgene Pflanzen, die dsdA exprimieren, dar, während die schraffierten Balken die Wildtyppflanzen darstellen. Die Balken stellen das Mittel ± den Standardfehler dar, n = 4.
5 zeigt die Biomasse (a) und den Stickstoffgehalt (b) nach der Ernte von Arabidopsis thaliana-Pflanzen, die 14 Tage nach der Keimung herangezogen worden waren. Die Pflanzen wurden auf MS-Medium in halber Stärke mit 3 mM Nitrat als N-Basisquelle unter Zusatz von unterschiedlichen D-Serinkonzentrationen herangezogen. Die leeren Balken stellen transgene Pflanzen, die dsdA exprimieren, dar, während die schraffierten Balken die Wildtyppflanzen darstellen. Die Balken stellen das Mittel ± den Standardfehler dar, n = 4.
In den Tabellen 1 und 2 sind Beispiele für Polypeptide mit D-Aminosäure-metabolisierender Wirksamkeit dargestellt, die erfindungsgemäß verwendet werden können.
Versuchsteil
Methoden
Transformation von Arabidopsis
Das E. coli-Gen dsdA (D-Serindehydratase (D-Serindesaminase) [EC:4.3.1.18] NCBI Zugangsnummer J01603) wurde mittels PCR unter Verwendung der Primer 5' – AATGGATCCTCATCTAAGCGCAAAGAGACGTACTATGG und 5' – ATTGGATCCATGCTGCGTTGAAACGTTATTAACGG amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde in pT-easy (Promega) subkloniert und mit dem DYEnamics Cycle Sequenzierkit (Amersham Pharmacia biotech) sequenziert. Mit der Alignment-Analyse mit der Datenbanksequenz wurde bestätigt, daß dsdA erfolgreich in seiner vollen Länge kloniert worden war. Der Klon wurde anschließend in die BamH1-Stelle der CaMV 355 Expressionskassette des binären Vektors pPCV702Km, bei dem es sich um ein entwaffnetes Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens handelt, ligiert, wodurch man zu dem Vektor pPCV702:dsdA gelangte. Mittels Restriktionsanalyse dieses Vektors durch Endonuklease wurde die Orientierung der Insertion bestätigt.
A. thaliana Pflanzen des Ecotyps Col-0 wurden mit dem Agrobacterium tumefaciens-Stamm (GV3101:pMP90 RK) durch Vakuuminfiltration (Clough, S.J. & Bent, A.F. Plant Journal. 16, 735–743 (1998)) transformiert. Die Transformanten wurden auf kanamycinhaltigen Platten selektiert und molekular mit Northern-Blots bestätigt. Alle Analysen wurden mit Linien, die für das transgene Merkmal homozygot waren, durchgeführt.
Transgene Pflanzen, die D-Aminosäureoxidase exprimieren, wurden im wesentlichen auf gleiche Art und Weise wie die oben beschriebenen dsdA-Pflanzen konstruiert, jedoch mit den folgenden Änderungen: Das dao1-Gen (EC: 1.4.3.3: NCBIU60066) aus der Hefe Rhodotorula gracilis (Rhodosporidium toruloides) wurde mittels PCR kloniert, wobei als Matrize eine cDNA-Bibliothek, die aus Hefe, die zur Induktion der Expression des Zielgens auf D-alaninhaltigem Medium gezüchtet worden war, hergestellt wurde. Die PCR-Primer waren 5' – ATTAGATCTTACTACTCGAAGGACGCCATG und 5' – ATTAGATCTACAGCCACAATTCCCGCCCTA.
Eine PCR wurde auch mit einem weiteren Satz Primer durchgeführt, wobei ein Primer das 5'-Ende des offenen Leserasters wie oben beschrieben flankierte und ein 3'-Primer die letzten 6 Nukleotide ausschloß. Die letzten neun Nukleotide codieren das Signalpeptid SKL, das das Protein zu dem subzellulären Organellumperoxisom leitet.
Die erhaltenen amplifizierten Sequenzen codieren für Proteine, die die gleiche Aminosäuresequenz aufweisen, sich jedoch in Bezug auf ihre Lokalisierung in der Zelle unterscheiden. Das verkürzte Polypeptid ohne das Signalpeptid wird im Cytosol exprimiert, während das Vollängen-Polypeptid im Peroxisom exprimiert wird.
Pflanzenanzucht
A. thaliana-Samen von nichttransformierten Pflanzen und von mit D-Serinammoniaklyase transformierten Pflanzen wurden 10 Minuten lang mit 70%igem Ethanol und 0,1% Tween 80 oberflächensterilisiert und kurz mit 95%igem Ethanol gespült. Es wurden 10 Samen pro Platte ausgesät und die Platten wurden anschließend mit einem gasdurchlässigen Band verschlossen. Bei dem Wachstumsmedium handelte es sich um MS (Murashige, T. & Skoog, F. Physiol Plant 15, 310–313 (1962)) in halber Stärke (mit 0,5% w/v Saccharose und 0,8% w/v Agar), wobei Stickstoff entweder nicht mitverwendet wurde oder in Form von 3 mM Nitrat mitverwendet wurde. Nach dem Autoklavieren wurde das Medium mit sterilfiltriertem D-Serin versetzt. Die Pflanzen wurden 14 Tage lang nach der Keimung bei 24°C im 16-h-Tage herangezogen. Die Pflanzen wurden von den Platten entnommen, dreimal mit 0,5 mM CaCl₂ gewaschen und anschließend 48 Stunden lang bei 40°C getrocknet, bevor das Trockengewicht bestimmt wurde. Der N-Gehalt der trockenen Pflanzen wurde mit einem Elementaranalysegerät (PerkinElmer 2400 CHN) bestimmt. Die Biomasse und der Stickstoffgehalt wurden pro Platte bestimmt, und jede Platte wies 10 Pflanzen auf. Es wurden sechs unabhängige transgene Linien auf ihre Fähigkeit, auf D-Serin zu wachsen, ausgewertet, und zwischen den Linien wurde kein wesentlicher Unterschied beobachtet, obwohl die dsdA-Transkriptmengen gemäß Northern-Blot-Analyse beträchtliche Unterschiede aufwiesen.
Für die Transformation von Fichte wies der Expressionsvektor ein pUC8-Gerüst auf, das eine 355-Expressionskassette mit dsdA und einer pUbi-Bar (Ubiquitin-Promoter mit dem Bar-Gen, das Resistenz gegen Basta vermittelt)-Kassette zwecks Selektion mit Basta aufwies. Bei dem verwendeten Transformationsverfahren handelt es sich um den Teilchenbeschuß einer Zellsuspension.
Ergebnisse
Auswirkung von D-Aminosäuren auf das Wachstum von Wildtyppflanzen
Es wurde das Wachstum von Arabidopsis thaliana Wildtyppflanzen in steriler Agarkultur mit unterschiedlichen N-Quellen beobachtet. Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt. Bei Pflanzen, die auf D-Aminosäuremedien herangezogen wurden, wurde wenig oder gar kein Wachstum beobachtet.
Samen von Solanum esculentum, Hordeum vulgare, Zea mays, Populus tremuloides, Nicotiana tabacum und Arabidopsis thaliana wurden oberflächensterilisiert und zwei bis drei Wochen lang auf Agarmedien gezüchtet, die mit den oben beschriebenen nitratfreien Medien identisch waren und mit 0, 0,3, 3 bzw. 30 mM D-Serin verändert wurden. Es wurde beobachtet, daß das Wachstum von Lycopersicon esculentum, Populus tremuloides, Nicotiana tabacum und Arabidopsis thaliana bei einer Konzentration von 3mM D-Serin in den Medien gehemmt wurde, während das Wachstum von Zea mays und Hordeum vulgare bei 30 mM gehemmt wurde.
Es wurde beobachtet, daß D-Serin sowie mehrere andere D-Aminosäuren das Wachstum von Wildtyp A. thaliana und anderen Arten hemmten. Bei A. thaliana wird bei einer Konzentration von 0,3 mM D-Serin im Wachstumsmedium eine deutliche Wachstumshemmung beobachtet; bei 3 mM findet eine vollständige Wachstumshemmung statt (2).
Somatische Embryozellsuspensionskulturen von Picea abies wurden mit einer Reihe von D-Serinkonzentrationen, nämlich 0, 0,3, 3 und 30 mM D-Serin, herangezogen. Bei 3 mM und darüber war das D-Serin für die Zellen letal. Es wurde gefunden, daß dsdA-transformierte Embryonen auf einem D-Serinmedium, das 3 mM D-Serin enthielt, selektiert werden konnten. Diese Ergebnisse zeigen die herbiziden Eigenschaften von D-Aminosäuren gegenüber Wildtyppflanzen.
Arabidopsis thaliana, die D-Serinammoniaklyase aus E. coli exprimieren
Arabidopsis thaliana wurde mit dem E. coli-Gen dsdA, das für D-Serinammoniaklyase [EC:4.3.1.18] unter der Kontrolle des CaMV-355-Promoters codiert. Die D-Serinammoniaklyase setzt D-Serin zu den Produkten Ammonium, Pyruvat und Wasser um, die von Pflanzen leicht verwertet werden, und die transformierten Pflanzen können auf D-Serin als einziger N-Quelle wachsen.
Transgene Arabidopsis thaliana Pflanzen, die das für D-Serindehydratase codierende Gen exprimieren, wurden gemeinsam mit Wildtyppflanzen 20 Tage lang auf Standard-MS-Medium mit einem Zusatz von unterschiedlichen D-Serinkonzentrationen als einziger N-Quelle (30 mM, 3 mM, 0,3 mM) sowie auf einer Kontrolle ohne jeglichen Stickstoff herangezogen.
Auf dem Kontrollmedium ohne Stickstoff wurde sowohl bei den transgenen Pflanzen als auch bei den Wildtyppflanzen minimales Wachstum beobachtet. Mit steigender D-Serinkonzentration wurde ein signifikantes Ansteigen von Wachstum und N-Gehalt bei den transgenen Pflanzen beobachtet (Varianzanalyse, p < 0,0001; 4a, b). Bei den Wildtyppflanzen wurde kein steigendes Wachstum beobachtet (3). Mit steigender D-Serinkonzentration stiegen auch in Gegenwart einer Basalmenge an Nitrat Wachstum und Stickstoffgehalt der transgenen Pflanzen signifikant an (p < 0,0001), während bei Wildtyppflanzen das Gegenteil eintritt (5). Hieraus geht hervor, daß D-Serin auf die Wildtyppflanze toxisch wirkt, jedoch nicht auf die transgene Pflanze. Innerhalb des beobachteten D-Ser-Konzentrationsbereichs wiesen die transgenen Pflanzen keine Toxizitätssymptome auf.
Die relative Wachstumsreaktion auf eine erhöhte D-Serinkonzentration ist unabhängig davon, ob die transgenen Pflanzen eine Basismenge Nitrat erhalten oder nicht, ähnlich (4a und 5a). Bei Pflanzen, denen sowohl D-Serin als auch Nitrat angeboten wird, ist die entsprechende Reaktion bezüglich des N-Gehalts der Pflanzen jedoch höher (4b und 5b). Bei gleicher Konzentration ist das Wachstum der Pflanzen auf Nitrat signifikant höher als auf D-Serin (4a und 5a). Die N-Konzentration der auf 3 mM D-Serin herangezogenen Pflanzen ist jedoch signifikant niedriger als bei Pflanzen, die auf 3 mM Nitrat herangezogen wurden (ANOVA, p < 0,0001). Der Grund für das geringere Wachstum auf D-Serin ist unbekannt, die relativ niedrige N-Konzentration von auf D-Serin herangezogenen Pflanzen könnte jedoch anzeigen, daß diese N-Form im Vergleich zu Nitrat in geringeren Mengen aufgenommen wird.
Transgene Arabidopsis-Pflanzen wurden auch dadurch erfolgreich selektiert, daß man auf Erde herangezogene Arabidopsis-Keimlinge dreimal im Verlauf von einer Woche einer Spritzbehandlung mit 30 mM D-Serin unterzog.
Arabidopsis thaliana, die D-Glutamatracemase aus E. coli exprimieren
Arabidopsis thaliana-Pflanzen, die E. coli D-Glutamatracemase exprimieren, wurden im wesentlichen wie oben beschrieben konstruiert. Das Gen murI, NCBI-Eingangsnummer AAC76949, codiert für die Racemase EC: 5.1.1.3. Die Primer für die Klonierung des Gens wurden so ausgearbeitet, daß sie entsprechend der Datenbanksequenz das offene Leseraster flankierten.
Es wurde beobachtet, daß die transgenen Pflanzen auf traditionellen Medien und traditionellen Stickstoffquellen überleben und wachsen.
Arabidopsis thaliana, die D-Aminosäuren unter gleichzeitiger Produktion von Wasserstoffperoxid metabolisieren
Arabidopsis thaliana-Pflanzen, die zwei Varianten der D-Aminosäureoxidase aus Rhodotorula gracilis exprimierten, wurden wie oben beschrieben hergestellt.
Es wurde beobachtet, daß diese transgenen Pflanzen auf traditionellen Medien mit einer traditionellen Stickstoffquelle überleben und wachsen.
Ähnlich Ergebnisse wie für Pflanzen, die D-Serinammoniaklyase exprimieren wurden erhalten, wenn das für D-Aminosäureoxidase (EC 1.4.3.3.) codierende Gen aus Hefe (Rhodotorula gracilis) in A. thaliana exprimiert wurde, das heißt, daß Wachstum und N-Gehalt der transgenen Pflanzen im Vergleich zu den Wildtyppflanzen auf Medien, die D-Aminosäuren enthielten, erhöht waren.
Die D-Aminosäureoxidase weist einen Bereich von D-Aminosäuren als Substrat auf, und in Tests mit D-Alanin und D-Serin wurde bestätigt, daß das Enzym D-Aminosäureoxidase auch fähig war, diese N-Formen in verfügbare N-Quellen umzuwandeln und so die von D-Alanin und D-Serin verursachte Toxizität verringern konnte.
Es wurde beobachtet, daß 30 mM D-Asn das Wachstum von D-Aminooxidase exprimierenden Pflanzen in steriler Agarkultur wirksam zum Stillstand brachte. Bei D-Aminooxidase exprimierenden Pflanzen wurde keine Keimung beobachtet, was auf eine vollständige Wachstumshemmung hinweist. Es wurde beobachtet, daß Wt-Pflanzen keimten und langsam zu kleinen grünen Keimlingen heranwuchsen. Das Wachstum des Wildtyps war daher nur teilweise verzögert, und die Wildtyppflanzen wurden gerettet und in Erde umgesetzt, um sich zu erholen.
Es wurde gefunden, daß D-Ile das Wachstum von transgenen Pflanzen, die dao1 exprimierten, noch wirksamer hinderte, ohne daß eine sichtbare Hemmwirkung auf die Wildtyppflanzen vorlag. Es wurde gefunden, daß das Wachstum von Wildtyp-Arabidopsis mit steigender D-Ile-Konzentration innerhalb des geprüften Bereichs (0,3 bis 30 mM) anstieg.
Obwohl zwischen cytosolisch und peroxisomal exprimierter D-Aminooxidase keine signifikanten Unterschiede beobachtet wurden, wurde gefunden, daß das peroxisomale Konstrukt im Bezug auf die Hemmung der Keimung der D-Aminooxidasepflanze auf 30 mM D-Asn etwas wirksamer als die cytosolische Version war. Beide Konstrukte werden jedoch signifikant stärker als der Wildtyp gehemmt und können daher für eine konditionale Negativselektion verwendet werden.
Pappel und Tabak, die das dsdA-Gen (D-Serindehydratase) aus E. coli exprimieren
Pappel und Tabak wurden mit dem gleichen Vektor und nach dem gleichen Transformationsprotokoll, wie oben für die Transformation von Arabidopsis beschrieben transformiert.
Es wurde gefunden, daß 3 mM und 30 mM D-Ser ausreicht, um jegliche Sproßbildung bei Wildtyp-Pappel bzw. Tabak zu hemmen, wenn diese auf sproßinduzierende Medien gesetzt wurden. Es wurde jedoch gefunden, daß mit dsdA transformierte(r) Tabak und Pappel bei Konzentrationen oberhalb 30 mM gegen D-Ser resistent waren.
Wie im vorliegenden Text beschrieben hergestellte transgene Pflanzen metabolisieren N-Formen, die für andere Pflanzen nicht verfügbar sind. Dadurch ist es möglich, in Mischpflanzungen zugesetzten N gezielt bei solchen Pflanzen einzusetzen. Ausgebrachte D-Aminosäuren haben insofern eine zweifache Wirkung, als sie das Wachstum von transgenen Pflanzen fördern und das Wachstum von anderen Pflanzen hemmen, und dies kann bei landwirtschaftlicher Anwendung zu synergistischen Wirkungen führen. Eine direkte Kontrolle über die N-Vorräte kann die für gutes Wachstum erforderliche N-Menge verringern und so möglicherweise die Umweltbelastung, die durch unnötig hohe N-Mengen verursacht wird, reduzieren. Außerdem kann bei Kultursystemen, in denen die Kulturpflanzen aufgrund der Tatsache, daß sie einen bestimmten N-Vorrat nutzen können, einen Wettbewerbsvorteil aufweisen, die Erfordernis einer Unkrautbekämpfung abnehmen, wodurch der Gesamtbedarf an Herbiziden verringert wird.
Tabelle 1
SEQUENZBESCHREIBUNG

Claims

Isolierte Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit D-Aminosäuremetabolisierender Wirksamkeit codiert, wobei die Sequenz mit einem pflanzenspezifischen Regulationselement, das zu dem Gen, das für das D-Aminosäure-metabolisierende Enzym codiert, heterolog ist, operativ verbunden ist.
Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei die D-Aminosäure-metabolisierende Aktivität aus der Gruppe Oxidase-, Racemase-, Carboxylase-, Transaminase- und Dehydrataseakivität stammt.
Nukleinsäure nach Anspruch 2, wobei das Polypeptid in Tabelle 1 oder Tabelle 2 dargestellt ist.
Nukleinsäure nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die D-Aminosäure aus der Gruppe D-Ser, D-Ala, D-Glu, D-Arg, D-Lys, D-His, D-Asp, D-Asn bzw. D-Gln stammt.
Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die weiterhin eine Nukleotidsequenz, die für ein heterologes Polypeptid codiert, umfaßt.
Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Polypeptid mit D-Aminosäuremetabolisierender Aktivität ein Leitpeptid umfaßt, das die Anhäufung dieses Enzyms in ein intrazelluläres Kompartiment der Pflanzenzelle steuert.
Expressionsvektor, umfassend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
Pflanzenzelle, umfassend einen Expressionsvektor nach Anspruch 7 oder eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
Pflanze, umfassend eine Pflanzenzelle nach Anspruch 8.
Pflanze nach Anspruch 9, bei der es sich um eine monokotyledone Pflanze, eine dikotyledone Pflanze, eine Gymnosperme, eine Alge, einen Farn oder ein Moos handelt.
Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, das folgendes umfaßt: Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 7 und Regenerieren der Pflanze aus der Zelle aus einem Medium, das eine D-Aminosäure umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Medium eine einzige Stickstoffquelle umfaßt, wobei diese Stickstoffquelle aus einer D-Aminosäure besteht.
Verfahren zur Steuerung des Pflanzenwachstums, bei dem man eine Pflanze nach Anspruch 9 oder 10 mit einer Zusammensetzung, die eine D-Aminosäure umfaßt, behandelt.
Verfahren zur Stimulation der Streßtoleranz einer Pflanze, umfassend die folgende Schritte: Exprimieren eines Polypeptids, das ein D-Aminosäuresubstrat oxidiert, in der Pflanze, wobei das Polypeptid von einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 6 exprimiert wird; und Behandeln der Pflanze mit dem D-Aminosäuresubstrat.
Verfahren zur Hemmung des Wachstums einer transgenen Pflanze nach Anspruch 9 oder 10, die ein Polypeptid, das ein D-Aminosäuresubstrat oxidiert, exprimiert, wobei man bei dem Verfahren die Pflanze mit dem D-Aminosäuresubstrat behandelt.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei es sich bei dem D-Aminosäuresubstrat um D-Ile oder D-Asn handelt.
Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in einem Verfahren zur Selektion von transformierten Pflanzenzellen.