EP1257636A2 - Ozon- und/oder pathogen-induzierbare genexpression in pflanzen - Google Patents

Ozon- und/oder pathogen-induzierbare genexpression in pflanzen

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Publication number
EP1257636A2
EP1257636A2 EP01903725A EP01903725A EP1257636A2 EP 1257636 A2 EP1257636 A2 EP 1257636A2 EP 01903725 A EP01903725 A EP 01903725A EP 01903725 A EP01903725 A EP 01903725A EP 1257636 A2 EP1257636 A2 EP 1257636A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
ozone
promoter
plants
acid molecule
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP01903725A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hélène CHIRON
Alain Drouet
Dieter Ernst
Heinrich Sandermann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Original Assignee
Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH filed Critical Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Publication of EP1257636A2 publication Critical patent/EP1257636A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8237—Externally regulated expression systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)

Definitions

  • the invention relates to recombinant nucleic acid molecules which comprise plant defense genes and promoters which mediate gene expression which can be induced by pathogens and / or ozone.
  • the invention further relates to methods for generating new plants which contain these nucleic acid molecules or fragments thereof, these new plants and the use of the promoters for generating pathogen and / or ozone-responsive gene expression in plants and plant cells.
  • Stilbenes were said to have an antibacterial and fungitoxic effect at an early stage. They are found in some unrelated plant families, but only rarely in important crop plants. In the pine (Pinus sylvestris), the constitutive stilbenes Pinosylvin (PS; 3,5-dihydroxystilbene) and Pinosylvinmonomethylether (PSM) occur exclusively in the heartwood (H. Kindl (1985), Biosynthesis of stilbenes in: Biosynthesis and Biodegradation of Wood Components ( Ed .: T. Higuchi), Academic Press, London, 349-377).
  • PS Pinosylvin
  • PSM Pinosylvinmonomethylether
  • the stilbenes can generally be divided into constitutive compounds to protect wood degradation from microorganisms and into induced phytoalexins, which protect the phloem against bark beetles and other insects as well as against fungi symbiotically associated with beetles (Hart, supra; Lieutier, supra).
  • the metabolism to methoxystilbenes starts from L-phenylalanine and includes the activities of the enzymes phenylalanine ammonium lyase (PAL), stilbene synthase (STS) and pinosylvin-3-O-methyltransferase (PMT). It has been shown that STS activity is the limiting factor in metabolism to PS and PSM (S. Schanz et al. (1992), FEBS 313, 71-74). Changes in the gene expression of STS and / or PMT are likely to have a decisive influence on the induced resistance of plants by stilbenoids acting as phytoalexins.
  • PAL phenyla
  • Methyl transferases are known per se. They catalyze the transfer of methyl groups from one compound to another. Vegetable O-methyltransferases are also known which cause methylation of the oxygen atom. Examples of this are the O-methyltransferase from Pinus radiata (Acc. No. U70873), the caffeic acid-O-Methyltransferase from Pinus taeda (Acc. No. U39301), the catechol-O-methyltransferase from Nicotiana tabacum (Acc. No. X74452) and the lignin-bispecific acid / 5-hydroxyferulic acid-O-methyltransferase from Populus tremoides (Acc. No. X62096).
  • a recombinant nucleic acid molecule the regulatory sequences of a promoter active in plant cells which mediates gene expression which can be induced by pathogens and / or ozone, and operatively linked thereto a DNA sequence which is essential for a protein with the enzymatic activity of a pinosylvin Encoded -3-O-methyltransferase (PMT).
  • PMT pinosylvin Encoded -3-O-methyltransferase
  • the nucleic acid molecule according to the invention can be used with above-average advantage, for example, in modern crop protection.
  • the recombinant nucleic acid molecules according to the invention comprise functional fragments of the DNA.
  • “Functional” means fragments of the PMT sequence with specific functions, such as promoters, enhancers and other control sequences.
  • the promoter and / or the DNA sequence of the recombinant nucleic acid molecule according to the invention is isolated from Pinus sylvestris (pine).
  • genomic DNA sequence with the sequence SEQ No. 1 from Pinus sylvestris, which codes for a PMT protein.
  • This genomic sequence includes a total of 1908 base pairs including exon, intron and flanking sequences.
  • the gene that codes for a protein with the enzymatic activity of a PMT consists of two coding exon regions and an intron region.
  • the intron is 102 base pairs in size, which is common for introns (introns usually consist of between 70 and thousands of nucleotides; GJ Goodall and W. Filipowicz (1991), EMBO J. 10, 2635-2644).
  • the 5'-exon / intron and 3'-intron / exon limits confirm the well-known GT / AG donor / acceptor rule, which applies both in plants and in animals (JWS Brown (1986), Nucl. Acids Res. 14, 9549-9559).
  • the AG / GTA motif at the 5 'exon / intron splice point matches the AG / GTAAG consensus sequence.
  • the intron also contains a CAG / motif at the 3'- Intron / exon splice site analogous to the TGCAG / G consensus sequence for plant genes (Goodall and Filipowicz, supra).
  • the intron is AT-rich, which is essential for the splicing process (Goodall and Filipowicz, supra).
  • the upstream sequences showed conserved prokaryotic elements such as the cap signal TCATTCGT at position -18, one identified as a TATA box
  • a promoter of the PMT gene or fragments thereof which mediate gene expression in plant cells which can be induced by pathogen and / or ozone.
  • Such an inducible promoter has the advantage over constitutive promoters that the pathogen defense by the products of the genes or coding sequences operatively linked to the promoter according to the invention (for example cDNA sequences) only takes place at the required point in time and not permanently, and thus a higher disease resistance in Plants that contain this chimeric gene construct can be obtained.
  • the promoter according to the invention is preferably isolated from Pinus sylvestris.
  • fragments of the promoter of the PMT gene from Pinus sylvestris (jaw) are W boxes in the range from -450 to -420, -280 to -240, -220 to -180 and -100 to -30, which are particularly suitable for defense against pathogens are important (Rushton and Somssich (1998), Curr. Opinion Plant Biol. 1, 311-315), as explained in detail below.
  • the Scottish pine PMT promoter contains potential cis elements.
  • yb-responsive elements MRE
  • MRE yb-responsive elements
  • the ACTTACCACCCT element in position - 358 corresponds in eight out of twelve positions to the consensus sequence T / A CT C / A ACCTA C / ACC / A in plant gene promoters of phenylpropanoid metabolism induced with UV light and with mushroom monitors (Lois et al. (1989) , EMBO J. 8, 1641-1648).
  • the (A + C) -rich motifs CCAACCACCTCC and CCAACCACTC match with a second one
  • Consensus motif (CC A AJC CA / T AAC C / T CC) in ten or nine out of twelve positions (Lois et al., Supra).
  • the element GTTG at position -194 is the inverse of the core motif CAAC.
  • Another motif at position -129, TCCCATCTCC corresponds in nine out of ten positions to the consensus sequence of the boxE (A / T CCC A / T ' T / ACA / TA / TG / Q, which is evident in stress-inducible phenylpropanoid genes -Promotors is conserved (B. Grimmig and U. Matern (1997), Plant Mol. Biol. 33, 323-341).
  • the PMT promoter from Pinus sylvestris also contains the following regulatory, ice-acting elements which are known for genes which synthesize flavonoids and stilbene: G-box-like motifs (GTGG on the
  • GGTAGG at position -140 the GC box GGGGCAGAAT (consensus sequence G / T GGGCGG G / A G / A C / T) at position -72; Elicitor-responsive elements, i.e. W-
  • the characterization of the promoter from Pinus sylvestris enables the determination of potential cis-regulatory elements, which may be in relation to the rapid temporary accumulation of PMT mRNA by the treatment of jaws with ozone and fungal icitor stand.
  • Genes encoding PAL, cinnamate 4-hydroxylase and 4-coumarate-CoA ligase (4CL) are known to be under strong control at the level of transcription and to respond to both developmental and environmental stimuli can be expressed in a coordinated manner in many plant species.
  • the members of the My b family are involved in the regulation of these phenylpropanoid genes (Rushton and Somssich, supra).
  • MREs are located in the PMT promoter from Pinus sylvestris according to the invention at positions -121, -129, -194, -230, -310 and -358.
  • the MREs at positions -358, -310 and -230 were in parsley as boxes L, A and P for almost all known PAL and 4 CL genes (Logemann et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 5905-5909) and also for CCoAOMT genes in parsley (Grimmig and Mattern, supra).
  • these elements alone or a promoter region that contains all of these elements together cannot mediate the elicitor or light responsiveness of a reporter gene in transient expression assays.
  • a G-box which is located near the TATA box, is a widely used sequence motif in eukaryotic promoters. Such G boxes are present in the PMT promoter from Pinus sylvestris according to the invention at positions -147 and - 165 and in an inverse orientation at position -353.
  • the functional analysis of plant promoters has shown that the G-Box plays a role in Promoter activation by various signals such as light, abscisic acid and UV light plays (Faktor et al., Supra).
  • An H box is located in the jaw promoter according to the invention in an inverse orientation at position -140 between the TATA and the G boxes. Both G and H boxes were found in the promoter-near region of a number of genes encoding phenylpropanoid biosynthesizing enzymes such as PAL, 4CL and CHS (Zhu et al. (1996), Current Oppinion in Genetics & Development 6, 624-630). The G and H boxes near the TATA box were both described as essential for floral expression (Faktor et al., Supra).
  • G boxes triggered by development signals and pathogenic signals such as abscisic acid, light, UV radiation and wounding, are involved in the regulation of various genes.
  • the H box is not as widespread, and is characteristic of phenylpropanoid biosynthesizing gene promoters (Zhu et al, supra).
  • the G-box and the H-boxes are necessary together and obviously sufficient for feed-forward stimulation by 4-coumaric acid (Loake et al (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 9230-9234).
  • the H box is also present in parsley CHS and PAL promoters, and functional analysis has shown that this cis element is involved in UV induction (Loake et al., Supra).
  • Enhancer or activator elements dramatically increase the transcriptional activity of certain eukaryotic genes.
  • a copy of the SV40 enhancer core sequence is found at position -356 in the PMT promoter.
  • Enhancer sequences have been reported in connection with the promoters of PAL genes from Phaseolus vulgaris (Cramer et al. (1989), Plant. Mol. Biol. 12, 367-383) and parsley CCoAOMT (Grimmig and Mattern, supra).
  • Elicitor-responsive elements TTGACC were developed by Raventos et al. (Plant J. 7, 147-155 (1995)) and by Rushton et al. (supra). Such W boxes are found in the PMT promoter from Pinus sylvestris at position -440 and in inverse orientation at positions -55, -199 and -263. Sequences with such elicitor-responsive elements occur in promoters of various genes related to defense genes including PR1 from parsley (Rushton, Supra), in the CHS promoter from maize (Franken et al (1991) EMBO J. 10, 2605-2612) and in STS promoter from Wein on (Schubert et al.
  • the ozone-responsive region differs from the pathogen-responsive region (-280 to -140) (Schubert et al., Supra; Ernst el al., Supra).
  • the pathogen- or elicitor-responsive W boxes are present to a greater extent in the range between -263 and -50.
  • the invention relates to chimeric nucleic acid molecules into which the above-mentioned promoter according to the invention or fragments thereof, such as the aforementioned W-boxes, have been introduced.
  • the chimeric nucleic acid molecules according to the invention in addition to the promoter mentioned above or fragments thereof, DNA sequences operatively linked to the promoter, which encode proteins which catalyze the synthesis of phytoalexins.
  • Phytoalexins in the context of the present invention are compounds which can be formed by plants due to an ozone load or due to an infection to ward off the pathogens, usually fungi.
  • the coding regions contained in the chimeric nucleic acid sequences according to the invention can be inductively expressed in plants by ozone and / or pathogens.
  • These coding regions are particularly preferably defense genes, most preferably genes for the synthesis of phytoalexin-catalyzing proteins which are naturally not inducible by ozone and / or pathogens.
  • the nucleic acid molecules according to the invention can be any nucleic acid molecules, in particular DNA or RNA molecules, for example cDNA, genomic DNA, mRNA etc. They can be naturally occurring molecules or those produced by genetic engineering or chemical synthesis methods.
  • the present invention further relates to vectors which contain the abovementioned recombinant nucleic acid molecules, promoters or chimeric nucleic acid molecules.
  • the present invention thus also includes vectors, in particular plasmids, cosmids, viruses, bacteriophages and other vectors which are common in genetic engineering and which contain the nucleic acid molecules according to the invention described above and which can be used for the transfer of the nucleic acid molecules according to the invention or for planting or plant cells.
  • the invention also relates to transformed microorganisms, such as bacteria, viruses, fungi, which contain the nucleic acid sequences according to the invention.
  • promoters or vectors according to the invention it is now possible to use genetic engineering methods to modify plant cells to have an ozone and / or pathogen-inducible characteristic.
  • genetic engineering methods to modify plant cells to have an ozone and / or pathogen-inducible characteristic.
  • plant cells by means of genetic engineering methods to the effect that they fuse one or more plant genes for the synthesis of proteins catalyzing phytoalexins, the expression of which is naturally not or not significantly induced by ozone and / or pathogens, by fusion of the promoter according to the invention or a fragment thereof with pathogen or ozone inducible with such plant genes.
  • Plant cells can also be modified by means of genetic engineering methods to the effect that by inserting the nucleic acid molecules according to the invention or at least one fragment thereof into plants or plant cells which do not naturally contain these DNA sequences, they have an ozone and / or pathogen-inducible characteristic ,
  • This object is achieved by the provision of the DNA sequence coding for the PMT and the provision of the promoter responsible for ozone and / or pathogen induction or fragments thereof which have a gene expression of the defense genes controlled by them which can be induced by ozone and / or pathogens enable in plants and plant cells.
  • the invention thus relates to transgenic plants which in the present case contain the recombinant nucleic acid molecules, promoters or chimeric nucleic acid molecules according to the invention integrated into the plant genome.
  • these plants can be any plant. It is preferably a monocot or dicot crop.
  • monocotyledonous plants are plants belonging to the genera Avena (oat), Triticum (wheat), Seeale (rye), Hordeum (barley), Oryza (rice), Panicum, Pennisetum, Setaria, sorghum (millet), Zea (corn ) and the like.
  • Dicotyledonous crops include cotton, legumes such as legumes and in particular alfalfa, soybean, rapeseed, tomato, sugar beet, potatoes, ornamental plants and trees.
  • Other useful plants can include fruit (in particular apples, pears, cherries, grapes, citrus, pineapples and bananas), oil palms, tea, cocoa and coffee bushes, tobacco, sisal and, for medicinal plants, rauwolfia and digital.
  • the cereals wheat, rye, oats, barley, rice, corn and millet, sugar beet, rapeseed, soybeans, tomato, potatoes and tobacco are particularly preferred.
  • the invention further relates to propagation material of plants according to the invention, for example seeds, fruits, cuttings, tubers, root pieces, etc., and parts of these plants, such as plant cells, protoplasts and calli.
  • the plant cells include differentiated and undifferentiated plant cells, including protoplasts, in which the recombinant according to the invention Nucleic acid molecules, promoters or chimeric nucleic acid molecules integrated into the plant genome or as autonomous molecules (including transient transformation).
  • the invention relates to host cells, in particular prokaryotic and eukaryotic cells, which have been transformed or infected with a nucleic acid molecule according to the invention, a promoter according to the invention or a vector according to the invention, and cells which originate from such host cells and contain the nucleic acid molecules or vectors described.
  • the host cells can be bacteria or fungal cells as well as plant or animal cells.
  • the present invention is also based on the object of demonstrating methods for producing plants or plant cells which have increased pathogen and / or ozone-inducible disease resistance.
  • the object is achieved by methods with the aid of which it is possible to produce new plants or plant cells in which there are naturally no plant defense genes against ozone and pathogens or the desired defense gene expression is not present to a sufficient extent and / or which have no or insufficient, naturally occurring ozone and / or pathogen inducible gene expression.
  • plants or plant cells can be modified using conventional genetic engineering transformation methods in such a way that the DNA sequences or promoters according to the invention are integrated into the plant genome, so that stable transformants are produced.
  • plants or plant cells with increased pathogen and / or ozone-inducible disease resistance are produced by a method in which one or more defense genes, preferably genes which encode proteins which catalyze the synthesis of phytoalexins, in the form of the recombinant nucleic acid molecules according to the invention comprise the promoter according to the invention and a sequence coding for PMT, or in the form of the chimeric nucleic acid molecules according to the invention which comprise the promoter according to the invention and one or more defense genes and preferably genes which code for proteins which catalyze the synthesis of phytoalexins.
  • one or more defense genes preferably genes which encode proteins which catalyze the synthesis of phytoalexins
  • plants or plant cells with increased pathogen and / or ozone-inducible disease resistance are produced by a process in which one or more defense genes, preferably genes which code for proteins which catalyze the synthesis of phytoalexins, are naturally present, but not by ozone and / or pathogens can be made inducible by introducing the promoter according to the invention or functional fragments thereof.
  • one or more defense genes preferably genes which code for proteins which catalyze the synthesis of phytoalexins
  • the method according to the invention comprises in particular the following steps:
  • Pinosylvin provided, which serves as a substrate for the PMT, which is encoded by the DNA sequence of the recombinant nucleic acid molecules according to the invention), (b) the introduction of the recombinant nucleic acid molecule according to the invention into the plant cell, and optionally
  • the recombinant PMT enzyme is preferably expressed in such an amount that the methylation of pinosylvin provides at least partial protection against ozone and / or diseases of the plants caused by pathogenic organisms. It may be sufficient that only the functional parts of the recombinant protein are expressed to provide such protection.
  • the recombinant protein or a functional part thereof is used for the methylation of Pinosylvin or a derivative of Pinosylvin, whereby this application can also extend to pharmaceutical fields of application or other fields in which a methylation of Pinosylvin of high specificity is required ,
  • Another object of the invention is to demonstrate advantageous uses of the nucleic acid molecules according to the invention or of the promoters according to the invention.
  • the invention therefore includes uses of the nucleic acid molecules according to the invention or the promoters according to the invention for producing the plants and plant cells according to the invention described above, which differ from non-transgenic plants and plant cells due to the presence of the nucleic acid molecules according to the invention by an ozone and / or pathogen-induced characteristic expression ,
  • the invention comprises the use of the nucleic acid molecules according to the invention or the promoters according to the invention or of fragments thereof for the detection and identification of ozone and / or pathogen-responsive nucleic acid elements in plant genes.
  • hybridization means hybridization under conventional hybridization conditions, preferably under stringent conditions, as described, for example, in Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
  • Nucleic acid molecules that hybridize with the molecules according to the invention can be isolated, for example, from genomic or from cDNA libraries.
  • nucleic acid molecules can be identified and isolated using the nucleic acid molecules according to the invention or parts of these molecules or the reverse complements of these molecules, for example by means of hybridization according to standard methods (see for example Sambrook et al, supra).
  • the invention thus also relates to the use of a DNA sequence according to the invention or parts thereof for the identification and isolation of homologous sequences from plants or other organisms.
  • nucleic acid molecules can be used as the hybridization probe which have the nucleic acid molecules according to the invention or parts of these sequences exactly or essentially.
  • Fragments used hybridization probe can also be synthetic fragments, which were produced with the help of the usual synthetic techniques and whose sequence essentially corresponds to that of a nucleic acid molecule according to the invention. If one has identified and isolated genes which hybridize with the nucleic acid sequences according to the invention, one is
  • the molecules hybridizing with the nucleic acid molecules according to the invention also comprise fragments, derivatives and allelic variants of the DNA sequences described above which contain an ozone and / or pathogen-responsive sequence, in active or inactivated form.
  • derivative in this context means that the sequences of these molecules differ from the sequences of the nucleic acid molecules described above at one or more positions and have a high degree of homology to these sequences.
  • Homology means a sequence identity of at least 40%, in particular an identity of at least 60%, preferably over 80% and particularly preferably over 90%.
  • the deviations from the nucleic acid molecules described above may have arisen through deletion, addition, substitution, insertion or recombination.
  • Molecules are and represent derivatives of these molecules, there are usually variations of these molecules that represent modifications that perform the same biological function. This can involve both naturally occurring variations, for example sequences from other organisms, or mutations, it being possible for these modifications to have occurred naturally or to have been introduced by targeted mutagenesis. Furthermore, the variations can be synthetically produced sequences.
  • the allelic variants can be both naturally occurring and synthetically produced variants or those produced by recombinant DNA techniques.
  • cloning vectors which contain a replication signal for E. coli and a marker gene for the selection of transformed bacterial cells.
  • examples of such vectors are pBR322, pUC series, M13mp series, pACYC184 etc.
  • the desired sequence can be introduced into the vector at a suitable restriction site.
  • the resulting plasmid is used for the transformation of E. co / z ' cells.
  • Transformed E. co / z ' cells are grown in a suitable medium and then harvested and lysed. The plasmid is recovered.
  • Restriction analyzes, gel electrophoresis and other biochemical-molecular biological methods are generally used as the analysis method for characterizing the plasmid DNA obtained. After each manipulation, the Plasmid DNA is cleaved and DNA fragments obtained are linked to other DNA sequences. Each plasmid DNA sequence can be cloned into the same or different plasmids.
  • a large number of known techniques are available for introducing DNA into a plant host cell, and the person skilled in the art can determine the appropriate method in each case without difficulty. These techniques include the transformation of plant cells with T-DNA using Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes as transformation agents, the fusion of protoplasts, the direct gene transfer of isolated DNA to protoplasts, the electroporation of DNA, the introduction of DNA using the biolistic method and others Possibilities. Both stable and transient transformants can be generated.
  • Usual section markers are those which impart resistance to the transformed plant cells to a biocide or an antibiotic such as kanamycin, G418, bleomycin, hygromycin, methotrexate, glyphosate, streptomycin, sulfonylurea, gentamycin or phosphinotricin and the like.
  • an antibiotic such as kanamycin, G418, bleomycin, hygromycin, methotrexate, glyphosate, streptomycin, sulfonylurea, gentamycin or phosphinotricin and the like.
  • the DNA to be introduced must be cloned into special plasmids, either in an intermediate or in a binary vector.
  • the intermediate vectors can be integrated into the Ti or Ri plasmid of the agrobacteria by means of sequences which are homologous to sequences in the T-DNA by homologous recombination. This also contains the vir region necessary for the transfer of the T-DNA. Intermediate vectors cannot replicate in agrobacteria. Using a helper plasmid, the intermediate vector can be transferred to Agrobacterium tumefaciens (conjugation). Binary vectors can replicate in E. coli as well as in Agrobacteria.
  • the agrobacterium serving as the host cell is said to contain a plasmid which carries a vir region.
  • the vir region is necessary for the transfer of the T-DNA into the plant cell.
  • T-DNA may also be present.
  • the agrobacterium transformed in this way is used to transform plant cells.
  • T-DNA for the transformation of plant cells has been intensively investigated and has been sufficiently described in EP 120 515.
  • plant explants can expediently be used with Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes be cultivated.
  • Whole plants can then be regenerated from the infected plant material (for example leaf pieces, stem segments, roots, but also protoplasts or suspension-cultivated plant cells) in a suitable medium, which can contain antibiotics or biocides for the selection of transformed cells.
  • the plants are regenerated using conventional regeneration methods using known nutrient media.
  • the plants or plant cells obtained in this way can then be examined for the presence of the introduced DNA.
  • Two or more generations should be grown to ensure that the phenotypic trait is stably maintained and inherited. Seeds should also be harvested to ensure that the appropriate phenotype or other characteristics have been preserved.
  • transgenic lines can be determined by conventional methods, which are homozygous for the new nucleic acid molecules and which investigate their phenotypic behavior with regard to an existing or non-existing ozone and / or pathogen responsiveness and compare it with that of hemizygotic lines.
  • plant cells containing the nucleic acid molecules according to the invention can also be cultivated further as plant cells (including protoplasts, calli, suspension cultures and the like).
  • the present invention furthermore relates to the use of the nucleic acid molecules according to the invention or parts of these molecules or the reverse complements of these molecules for the identification and isolation of homologous molecules which comprise ozone and / pathogen-responsive elements from plants or other organisms.
  • homologous molecules which comprise ozone and / pathogen-responsive elements from plants or other organisms.
  • the fungus Leptographium wingfieldii comes from the INRA collection (Orleans, France) and was originally isolated from the bark beetle Tomicus piniperda. It was further purified by a monospur culture and grown on malt agar in the dark at 22 ° C (Lieutier et. Al. (1989), Ann. Sei. For. 46, 201-216). Cultures were kept at 4 ° C with an annual run on Scottish pine tree trunks at 22 ° C to maintain their activity.
  • the seedlings were acclimatized in climatic chambers for six days (Thiel et al. (1996), J. Plant Physiol. 148, 456-463).
  • the light duration was 14 hours per day (PAR: 1300 ⁇ E m "2 s "1 ; UV-A: 22.5 Wm '2 ; UV-B: 0.45 MEDh “1 ); the day / night temperatures were 22 ° C and 16 ° C and the relative humidity during the day and at night were 70% and 85%.
  • the seedlings were treated with ozone (0.15 or 0.3 ⁇ l l "1 ) for ten hours a day for a period of two Days.
  • RT-PCR control experiments carried out with cab primers showed a constant level of cab transcripts in non-ozone-treated tissues and a decrease in these transcripts in tissues which were exposed to 0.15 or 0.3 .mu.l "1" ozone.
  • a 4 cm (horizontal) x 7 cm (vertical) rectangle around the respective infection site of the phloem tissue was removed and used for the RNA analysis after a 1 cm x 2 cm rectangle of the phloem tissue that was directly around the Infection point was removed.
  • the SJS mRNA showed a progressive accumulation up to day 9 (120 ng ng "1 cDNA), then slowly decreased and was still at a high level after 16 days.
  • the P T mRNA progressively increased after day 5 (50 ng ng "1 cDNA) to return to the control level at the end of the experiment.
  • the mushrooms approximately doubled the amount of S7S and RT transcript that occurred during inoculation, occurring four days earlier for STS.
  • the S S and P T transcript sets showed similar responses to ozone. A significant decrease occurred at 0.15 ⁇ l l "1 , while at 0.3 ⁇ l l " 1 the peak height was lengthened or increased slightly.
  • Stilbene metabolites can be regulated at the level of transcription.
  • Ozone does not induce STS and P T mRNA in phloem, which indicates that there is no systematic ozone effect.
  • Lyophilized needles 70 to 90 mg discarding the current annual flower and lyophilized phloem tissue (100 mg) were ground to a fine powder and the total RNA was isolated in a conventional manner.
  • the genomic DNA was extracted from the needles of adult Scottish pine according to protocol 1 in Csaikl el. Al (Plant Mol. Biol. Rep. 16, 69-86 (1998)).
  • the promoter sequence was obtained in the gene-specific reverse primer from the PMT cDNA sequence (German patent application DE-A-198 36 774; Ernst et al. (1999) Forest Biotechnology, University of Oxford, July 11-16, 1999 ; Ernst et al. (1999) IUFRO Conference, University of Kunststoff, 12-17 September 1999) according to the method described by Cormack and Somssich (Gene 194, 273 to 276 (1997)).
  • 1.5 ⁇ g of the genomic DNA of the Scottish pine were completely digested with 20 units of EcoRI. The DNA was precipitated on ice with two volumes of isopropanol for five minutes, washed with 70% ethanol and resuspended in 15 ul HO.
  • the DNA was polyadenylated at 37 ° C with 0.5 mM dATP and 1.5 mM CoCl 2 in buffer for 1.5 hours.
  • TdT terminal transferase
  • the first polymerase chain reaction was carried out with a tenth of the volume of the polyadenylated DNA (150 ng), 100 pmol of the gene-specific primer 1 (5'-TCCCCGAGTTCCATGCCCAGAA-3 '), 100 pmol of the universal T17 primer (5 '- GTAAAACGACGGCCAGTCGACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'), 200 ⁇ M dNTPs and 5 units of AGS-Gold TM DNA polymerase (AGS) in 100 ⁇ l 1 x AGSGold TM - Buffer performed with the heat cycle conditions an initial denaturation step at 94 ° C for 1 minute, followed by 35 cycles of 1 minute denaturation at 94 ° C, primer attachment at 60 ° C for 1 minute, and 3 minutes extension at 72 ° C with a final ten minute extension step at 72 ° C.
  • AGS-Gold TM DNA polymerase AGS-Gold TM DNA polymerase
  • the second PCR was performed using 1 ⁇ l of the first PCR product under the same conditions as the first PCR, except that 100 pmol of the gene-specific primer 2 (5'-GCCGATCCCATTTCGAATCC-3 ') and 100 pmol of the universal primer (5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3 ') were used.
  • the final PCR product was purified and cloned into the pGEM-T vector (Promega) according to the manufacturer's instructions.
  • the plasmids were sequenced commercially (MWG).
  • RNA The total RNA (5 ⁇ g) from pine needles or phloem tissue was digested with DNasel and reverse transcribed by 200 units of Superscript II RT (Live Technologies) for 1 hour at 42 ° C., with a corresponding buffer, 10 mM DTT, 0, 4 mM of each dNTP's, 100 nM oligo-dT ⁇ 2-18 primer (Life Technologies) and 10 units of RNase inhibitor (Lfve Technologies) were added.
  • the cDNA was carried out according to the method described by Kiefer et. al. (supra) described method, and 10 ng were for the PCR with 2.5 units of 7 ⁇ ⁇ polymerase (Amersham Pharmacia Biotech), a corresponding buffer, 0.2 mM of each dNTP and 0.2 ⁇ 3'-and 5 'Primers used.
  • the amplification was performed during 35 cycles of 1 minute denaturation at 94 ° C, 1 minute primer attachment at 58 ° C (R T and c ⁇ b primer) or 62 ° C (STS primer) and 2 minutes extension 72 ° C carried out.
  • reaction products were analyzed by electrophoresis using a 1% agarose gel, visualized under UV light after staining with ethidium bromide and quantified using the Picogreen method (Molecure Probes).
  • Picogreen method Molecure Probes
  • the authenticity of the PCR products was checked by two directed partial sequencing using the Thermo Sequenase kits (Amersham Pharmacia Biotech).
  • conserveed eukaryotic promoter elements CAP signal, TATA, CATA, CAAT and GC boxes
  • potential plant regulatory elements G and H boxes
  • Myb-responsive elements MREs
  • Elicitor regulatory elements W boxes are printed in bold and the SV40 enhancer is printed in italics.

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Abstract

Die Erfindung betrifft rekombinante Nukleinsäuremoleküle, die pflanzliche Abwehrgene umfassen, sowie Promotoren, die eine durch Pathogene und/oder Ozon induzierbare Genexpression vermitteln. Ferner betrifft die Erfindung Verfahren zur Erzeugung neuer Pflanzen,die diese Nukleinsäuremoleküle oder Fragmente davon enthalten, diese neuen Pflanzen sowie die Verwendung der Promotoren zur Erzeugung Pathogen- und/oder Ozon-responsiver Genexpression in Pflanzen und Pflanzenzellen.

Description

Ozon- und/oder Pathogen-induzierbare Genexpression in Pflanzen
Die Erfindung betrifft rekombinante Nukleinsauremolekule, die pflanzliche Abwehrgene umfassen, sowie Promotoren, die eine durch Pathogene und/oder Ozon induzierbare Genexpression vermitteln. Ferner betrifft die Erfindung Verfahren zur Erzeugung neuer Pflanzen, die diese Nukleinsauremolekule oder Fragmente davon enthalten, diese neuen Pflanzen sowie die Verwendung der Promotoren zur Erzeugung Pathogen- und/oder Ozon-responsiver Genexpression in Pflanzen und Pflanzenzellen.
Stilbenen wurde schon früh eine antibakterielle und fungitoxische Wirkung zugesprochen. Sie finden sich in einigen nicht miteinander verwandten Pflanzenfamilen, jedoch nur selten in wichtigen Kulturpflanzen. In der Kiefer (Pinus sylvestris) treten die konstitutiven Stilbene Pinosylvin (PS; 3,5-Dihydroxystilben) und Pinosylvinmonomethylether (PSM) ausschließlich im Kernholz auf (H. Kindl (1985), Biosynthesis of stilbenes in: Biosynthesis and Biodegradation of Wood Components (Hrsgb.: T. Higuchi), Academic Press, London, 349-377). Die Synthese dieser beiden Verbindungen wird allerdings in den Trieben, dem Phloem und den Nadeln als Antwort auf Verwundung oder den Angriff von Pilzen induziert (J.H. Hart (1981), Annu. Rev. Phytopathol. 19, 437-^58; Kindl, supra; Lieutier et. al. (1996), Eur. J. For. Path. 26, 145-158).
Die Stilbene lassen sich allgemein in konstitutive Verbindungen zum Schutz des Holzabbaus vor Mikroorganismen und in induzierte Phytoalexine, die das Phloem gegen Borkenkäfer und andere Insekten sowie gegen mit Käfern symbiotisch assoziierten Pilze schützen, einteilen (Hart, supra; Lieutier, supra). Der Stoffwechsel zu Methoxystilbenen geht von L-Phenylalanin aus und umfasst die Aktivitäten der Enzyme Phenylalaninammoniumlyase (PAL), Stilbensynthase (STS) und Pinosylvin- 3-O-methyltransferase (PMT). Es wurde gezeigt, dass die STS-Aktivität der limitierende Faktor im Metabolismus zu PS und PSM ist (S. Schanz et al. (1992), FEBS 313, 71-74). Änderungen in der Genexpression von STS und/oder PMT beeinflussen somit voraussichtlich entscheidend die induzierte Resistenz von Pflanzen durch als Phytoalexine wirkende Stilbenoide.
Es ist bekannt, daß Pflanzen vor verschiedenen Streßfaktoren durch PSM wesentlich effizienter geschützt werden als durch PS. Beispiele hierfür sind der Schutz vor pathogenen Organismen wie beispielsweise Pilzen (Lieutier, supra) und der Schutz gegen Ozon (Rosemann et al. (1991), Plant Physiol. 97, 1280-1286), wobei PSM wesentlich stärker antimikrobiell wirksam ist als PS, die analoge Verbindung zu Resveratrol, einem weiteren Stilben. Des weiteren ist bekannt, daß die Pinosylvin-3- O-methyltransferase (PMT) durch Ozon wesentlich stärker induzierbar ist als die Stilbensynthase (STS) (Trost, Dissertation LMU München, 1994). Somit ist die Regulation der Aktivität der Pinosylvin-3-O-methyltransferase von wesentlicher biologischer und wirtschaftlicher Bedeutung.
Methyltransferasen sind an sich bekannt. Sie katalysieren die Übertragung von Methylgruppen von einer Verbindung auf eine andere. Bekannt sind ferner pflanzliche O-Methyltransferasen, die eine Methylierung des Sauerstoffatoms bewirken. Beispiele hierfür sind die O-Methyltransferase aus Pinus radiata (Acc. No. U70873) die Kaffeesäure-O-Methyltransferase aus Pinus taeda (Acc. No. U39301) die Catechol-O-methyltransferase aus Nicotiana tabacum (Acc. No. X74452) sowie die Lignin-bispezifϊsche Säure/5-Hydroxyferulasäure-O- methyltransferase aus Populus tremoides (Acc. No. X62096).
DNA-Sequenzen, die für Stilbensynthaseenzyme, d.h. die Synthese von Stilbenen wie Resveratrol bzw. Pinosylvin katalysierende Enzyme, codieren, sind beispielsweise in der europäischen Patentschrift EP 0 309 862, der deutschen Patentanmeldung DE-A-41 07 396, der europäischen Patentanmeldung EP 0 464 461 sowie der US-Patentschrift US 5,500,367 beschrieben. In diesen Dokumenten wird die Isolierung von Stilbensynthase-Genen und ihre Verwendung zur Erzeugung von transgenen Pflanzen beschrieben. Die resultierenden transgenen Pflanzen weisen eine erhöhte Resistenz gegenüber verschiedenen Pflanzenschädlingen wie Pilzen, Bakterien, Insekten, Viren und Nematoden auf. So wurde beispielsweise STS aus Weinrebe in Tabak und Reis exprimiert und führte dann zu einer erhöhten Resistenz gegenüber Pathogenen (Hain et al. (1993), Nature 361, 153-156; Stark-Lorenzen et al. (1997), Plant Cell Rep. 16, 668-673). Da, wie vorstehend erwähnt, PSM Pflanzen vor verschiedenen Streßfaktoren wesentlich wirksamer schützt als PS, wäre die Kenntnis der DNA-Sequenz, die für die die PSM-Synthese katalysierende PMT codiert, äußerst wünschenswert.
Es gibt inzwischen verschiedene Hinweise darauf, daß es für eine möglichst effiziente Krankheitsresistenz basierend auf der Expression von pflanzlichen Abwehrgenen wie beispielsweise STS oder PMT in transgenen Pflanzen vorteilhaft ist, wenn die Expression des heterologen pflanzlichen Abwehrgens (bzw. der heterologen pflanzlichen Abwehrgene) in der Pflanze erst durch den Angriff der Pathogene, d.h. erst durch die Interaktion von Pflanze und Krankheitserreger, stimuliert wird (Fischer und Hain (1994), Current Opinion in Biotechnology 5, 125- 130; Fischer, Optimierung der heterologen Expression von Stilbensynthasegenen für den Pflanzenschutz, Dissertation Universität Hohenheim, 1994). Beispielsweise zeigten Untersuchungen mit transgenen Tabakplanzen, in denen STS-Gene unter dem konstitutiven 35S RNA-Promotor von Cauliflower Mosaic Virus zur Expression gebracht wurden, daß die in diesen Pflanzen erzielte Krankheitsresistenz geringer ist als in Pflanzen, die die gleichen Gene unter Kontrolle des Pathogen-induzierbaren homologen STS-Promoters nach Pilzbefall exprimierten (Fischer und Hain (1994) supra; Fischer (1994) supra.) Eine Induktion der Pathogenabwehr erfolgt bei dem letztgenannten System somit nur zum benötigten Zeitpunkt und nicht permanent. Es ist somit eine wichtige Aufgabe der vorliegenden Erfindung, DNA-Sequenzen bereitzustellen, die für PMT codieren. Insbesondere ist es eine wesentliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen durch Pathogene und/oder Ozon induzierbaren PMT-Promotor bereitzustellen, um eine erhöhte Krankheitsresistenz in Pflanzen zu erzielen, in welche die PMT-Gene oder ein anderes pflanzliches Abwehrgen unter Kontrolle eines Pathogen- und/oder Ozon-induzierbaren Promotors eingeführt werden.
Ferner ist es eine wesentliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung transformierter Pflanzenzellen bzw. Pflanzen bereitzustellen, die eine erhöhte Pathogen- und/oder Ozon-induzierbare Krankheitsresistenz aufweisen. Weitere Aufgaben der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung und den beigefügten Patentansprüchen.
Zur Lösung dieser Aufgaben dienen die Merkmale der unabhängigen Schutzansprüche.
Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den jeweiligen Unteransprüchen definiert.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül gelöst, das regulatorische Sequenzen eines in Pflanzenzellen aktiven Promotors, der eine durch Pathogene und/oder Ozon induzierbare Genexpression vermittelt, und operativ damit verknüpft eine DNA-Sequenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Pinosylvin-3-O-methyltransferase (PMT) codiert, umfasst. Derartige rekombinante Nukleinsauremolekule führen nach der Einbringung in Pflanzenzellen zu einer Akkumulation von PSM in den transgenen Pflanzenzellen bzw. Pflanzen und damit zu einem wirksamen Schutz gegenüber Ozon und/oder Pathogenen wie Pilzen. Da PSM eine wesentlich stärkere antimikrobielle Wirkung als PS aufweist, dessen Synthese durch das im Stand der Technik beschriebene STS- Genprodukt katalysiert wird, kann das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül mit überdurchschnittlichem Vorteil beispielsweise im modernen Pflanzenschutz verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsauremolekule umfassen funktionelle Fragmente der DNA. Unter "funktionell" sind Fragmente der PMT-Sequenz mit spezifischen Funktionen zu verstehen, wie beispielsweise Promotoren, Enhancer sowie andere Steuersequenzen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Promotor und/oder die DNA-Sequenz des erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäuremoleküls aus Pinus sylvestris (Kiefer) isoliert.
Insbesondere wird eine genomische DNA-Sequenz mit der Sequenz SEQ No. 1 aus Pinus sylvestris bereitgestellt, die für ein PMT-Protein codiert. Diese genomische Sequenz umfasst einschließlich Exon-, Intron- und flankierenden Sequenzen insgesamt 1908 Basenpaare. Das Gen, das für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer PMT codiert, besteht aus zwei kodierenden Exonregionen und einer Intronregion. Das Intron weist mit 102 Basenpaaren eine Größe auf, die für Introns üblich ist (Introns bestehen üblicherweise aus zwischen 70 und Tausenden von Nukleotiden; G.J. Goodall und W. Filipowicz (1991), EMBO J. 10, 2635-2644). Die 5'-Exon/Intron- und 3'-Intron/Exon-Grenzen bestätigen die bekannte GT/AG- Donor/ Akzeptor-Regel, die sowohl in Pflanzen als auch in Tieren gültig ist (J.W.S. Brown (1986), Nucl. Acids Res. 14, 9549-9559). Bei genauerer Betrachtung stimmt das AG/GTA-Motiv an der 5 '-Exon/Intron- Spleißstelle mit der AG/GTAAG- Consensussequenz überein. Ferner enthält das Intron ein CAG/-Motiv an der 3'- Intron/Exon- Spleißstelle analog der TGCAG/G-Consensus-Sequenz für Pflanzengene (Goodall und Filipowicz, supra). Das Intron ist AT-reich, was für den Spleißvorgang essentiell ist (Goodall und Filipowicz, supra). Die stromaufwärts gelegenen Sequenzen zeigten konservierte prokaryotische Elemente wie das cap- Signal TCATTCGT an Position -18, ein als TATA-Box identifiziertes
TGATAAAAGCA-Motiv an Position -46 und mutmaßliche CAAT-Boxen an den Positionen -80 und -210 (vgl. SEQ ID No. 1).
Bei einem wesentlichen Gegenstand der vorliegenden Erfindung wird ein Promotor des PMT-Gens oder Fragmente davon bereitgestellt, die eine durch Pathogen- und/oder Ozon induzierbare Genexpression in Pflanzenzellen vermitteln. Ein derartiger induzierbarer Promotor weist gegenüber konstitutiven Promotoren den Vorteil auf, dass die Pathogenabwehr durch die Produkte der mit dem erfindungsgemäßen Promotor operativ verbundenen Gene bzw. kodierenden Sequenzen (z.B. cDNA-Sequenzen) nur zum benötigten Zeitpunkt und nicht permanent erfolgt und somit eine höhere Krankheitsresistenz in Pflanzen, die dieses chimäre Genkonstrukt enthalten, erzielt werden kann. Vorzugsweise wird der erfindungsgemäße Promotor aus Pinus sylvestris isoliert.
Beispiele für Fragmente des erfindungsgemäßen Promotors des PMT-Gens aus Pinus sylvestris (Kiefer) sind W-Boxen im Bereich von -450 bis -420, -280 bis -240, -220 bis -180 sowie -100 bis -30, die insbesondere für die Pathogenabwehr wichtig sind (Rushton und Somssich (1998), Curr. Opinion Plant Biol. 1, 311-315), wie nachstehend ausführlich erläutert wird.
Der erfindungsgemäße PMT-Promotor aus der schottischen Kiefer enthält potentielle cis-Elemente. yb-responsive Elemente (MRE) befinden sich an den Positionen - 121, -129, -194, -230, -310 und -358. Das Element ACTTACCACCCT an Position - 358 stimmt in acht von zwölf Positionen mit der Consensus-Sequenz T/A CT C/A ACCTA C/A C C/A in mit UV-Licht und mit Pilzelicitoren induzierten Pflanzengen- Promotoren des Phenylpropanoid-Metabolismus überein (Lois et al. (1989), EMBO J. 8, 1641-1648). An den Positionen -121 und -230 stimmen die (A+C)-reichen Motive CCAACCACCTCC und CCAACCACTC mit einem zweiten
Consensusmotiv (CC A AJC C A/T AAC C/T CC) in zehn bzw. neun von zwölf Positionen überein (Lois et al., supra). Das Element GTTG an Position -194 ist die inverse Stelle des Kernmotivs CAAC. Ein weiteres Motiv an Position -129, TCCCATCTCC, stimmt in neun von zehn Positionen mit der Consensus-Sequenz der boxE (A/T CCC A/T ' T/A C A/T A/T G/Q überein, die offensichtlich in Stress- induzierbaren Phenylpropanoidgen-Promotoren konserviert ist (B. Grimmig und U. Matern (1997), Plant Mol. Biol. 33, 323-341).
In dem erfindungsgemäßen PMT-Promotor aus Pinus sylvestris befinden sich ferner folgende regulatorische eis- wirkende Elemente, die für Flavonoid- und Stilben- biosynthetisierende Gene bekannt sind: G-Box-artige Motive (GTGG an den
Positionen -147 und -165, CACC an Position -353; Faktor et al. (1996) Plant Mol.
Biol. 32, 849-859), das H-Box-artige Motiv CCATCC in inverser Orientierung
(GGTAGG an Position -140), die GC-Box GGGGCAGAAT (Consensus-Sequenz G/T GGGCGG G/A G/A C/T) an Position -72; Elicitor-responsive Elemente, d.h. W-
Boxen (ACTG an den Positionen -55, -199 und -263, und TGAC an Position -440 ;
Rushton und Somssich, supra) und ein SV40-Enhancerkern in inverser Orientierung
(TTACCAC an Position -356).
Die Charakterisierung des erfindungsgemäßen Promotors aus Pinus sylvestris ermöglicht die Bestimmung von potentiellen cis-regulatorischen Elementen, die möglicherweise in Beziehung mit der schnellen vorübergehenden Akkumulierung von PMT mRNA durch die Behandlung von Kiefern mit Ozon und Pilzelicitoren stehen. PAL-, Cinnamat-4-hydroxylase und 4-Coumarat-CoA-ligase(4CL)- codierende Gene sind dafür bekannt, daß sie auf der Ebene der Transkription einer starken Kontrolle unterliegen und daß sie als Reaktion sowohl auf Entwicklungs- als auch auf Umgebungsstimuli in vielen Pflanzenspezies koordiniert exprimiert werden. Die Mitglieder der My b-Familie sind in die Regulierung dieser Phenylpropanoid- Gene involviert (Rushton und Somssich, supra).
MREs befinden sich in dem erfindungsgemäßen PMT-Promotor aus Pinus sylvestris an den Positionen -121, -129, -194, -230, -310 und -358. Die MREs an den Positionen -358, -310 und -230 wurden in Petersilie als Boxen L, A bzw. P für nahezu alle bekannten PAL-und 4 CL-Gene (Logemann et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92, 5905-5909) und ebenso für CCoAOMT-Gene in Petersilie (Grimmig und Mattern, supra) beschrieben. Diese Elemente alleine oder eine Promotorregion, die alle diese Elemente zusammen enthält, können jedoch keine Elicitor- oder Licht-Responsivität eines Reportergenes in transienten Expressions- Assays vermitteln. Folglich sind diese Elemente offenbar notwendig, aber nicht ausreichend für eine Elicitor- oder Licht-vermittelte PAL- und 4CL-Genaktivierung (Logemann et al, supra). Ferner ist außer diesen Genen kein weiteres Beispiel eines in den allgemeinen Phenylpropanoid- Stoffwechsel involvierten Gens bekannt, dessen Promotor einen vollständigen Satz aller dieser drei Boxen enthält, was deren funktionelle Wichtigkeit bei der koordinativen Regulierung dieser Gene weiter unterstreicht.
Eine G-Box, die sich in der Nähe der TATA-Box befindet, ist ein weit verbreitetes Sequenzmotiv in eukaryontischen Promotoren. Derartige G-Boxen liegen bei dem erfindungsgemäßen PMT-Promotor aus Pinus sylvestris an den Positionen -147 und - 165 und in einer inversen Orientierung an der Position -353 vor. Die funktionelle Analyse von Pflanzenpromotoren hat gezeigt, dass die G-Box eine Rolle bei der Promotoraktivierung durch verschiedene Signale wie Licht, Abscisinsäure und UV- Licht spielt (Faktor et al., supra).
Die Konservierung der G-Box sowie der H-Box zwischen TATA- und G-Boxen in unterschiedlichen CHS-Promotoren unterstreicht ihre Wichtigkeit als regulatorische Motive (Faktor et al., supra). Eine H-Box liegt in dem erfindungsgemäßen Promotor der Kiefer in einer inversen Orientierung an der Position -140 zwischen der TATA- und den G-Boxen. Sowohl G- als auch H-Boxen wurden in dem Promotoren-nahen Bereich einer Anzahl von Genen gefunden, die für Phenylpropanoid- biosynthetisierende Enzyme codieren, wie beispielsweise PAL, 4CL und CHS (Zhu et al. (1996), Current Oppinion in Genetics & Development 6, 624-630). Die G- und H-Box in der Nähe der TATA-Box wurden beide als essentiell für die florale Expression beschrieben (Faktor et al., supra).
G-Boxen sind, ausgelöst durch Entwicklungssignale sowie durch pathogene Signale wie Abscisinsäure, Licht, UV-Bestrahlung und Verwundung, in die Regulation von diversen Genen involviert. Die H-Box ist nicht so weit verbreitet, wobei sie charakteristisch für Phenylpropanoid-biosynthetisierende Genpromotoren ist (Zhu et al, supra). Die G-Box und die H-Boxen sind zusammen notwendig und offensichtlich ausreichend für eine feed-forward-Stimulierung durch 4-Coumarinsäure (Loake et al (1992), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 9230-9234). Die H-Box liegt ebenfalls in CHS- und PAL-Promotoren der Petersilie vor, und durch funktionelle Analyse wurde gezeigt, daß dieses cis-Element in die UV-Induktion involviert ist (Loake et al., supra).
Enhancer- oder Aktivatorelemente erhöhen die transkriptioneile Aktivität von bestimmten eukaryontischen Genen dramatisch. Eine Kopie der SV40-Enhancer- Kernsequenz wird an Position -356 im PMT-Promotor gefunden. Derartige Enhancer-Sequenzen wurden im Zusammenhang mit den Promotoren von PAL- Genen aus Phaseolus vulgaris (Cramer et al. (1989), Plant. Mol. Biol. 12, 367-383) und Petersilie-CCoAOMT (Grimmig und Mattern, supra) berichtet.
Elicitor-responsive Elemente (W-Boxen) TTGACC wurden von Raventos et al. (Plant J. 7, 147-155 (1995)) sowie von Rushton et al. (supra) beschrieben. Derartige W-Boxen finden sich bei dem erfindungsgemäßen PMT-Promotor aus Pinus sylvestris an Position -440 und in inverser Orientierung an den Positionen -55, -199 und -263. Sequenzen mit derartigen Elicitor-responsiven Elementen treten in Promotoren von verschiedenen mit Abwehrgenen verwandten Genen einschließlich PR1 aus Petersilie (Rushton, Supra), im CHS-Promotor von Mais (Franken et al (1991) EMBO J. 10, 2605-2612) und im STS-Promotor von Wein auf (Schubert et al. (1997), Plant Mol. Biol. 34, 417-426; Ernst et al. (1999) "Ozone induced genes mechanisms and biotechnological applications" in Plant Responses to environmental stress (Hrsgb.: M.S. Smallwood, CM. Calvert, DJ. Bowles), BIOS Scientific Publishers, Oxford, 33-41). Elicitor-responsive Elemente sind allgemein verantwortlich für die Induktion von Pflanzenabwehrmechanismen.
Im STS-Promotor aus Wein unterscheidet sich die Ozon-responsive Region (-430 bis -280) von der Pathogen-responsiven Region (-280 bis -140) (Schubert et al., supra; Ernst el al., supra). In dem erfindungsgemäßen PMT-Promotor liegen die Pathogen- bzw. Elicitor-responsiven W-Boxen im größeren Umfang in dem Bereich zwischen - 263 und -50 vor.
Bei einem weiteren wesentlichen Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Erfindung chimäre Nukleinsauremolekule, in die der vorstehend genannte erfindungsgemäße Promotor oder Fragmente davon wie beispielsweise die vorstehend genannten W-Boxen eingeführt wurden. Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen chimären Nukleinsauremolekule neben dem vorstehend genannten Promotor oder Fragmenten davon operativ mit dem Promotor verknüpfte DNA-Sequenzen, die für die Synthese von Phytoalexinen katalysierende Proteine codieren.
Phytoalexine im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen, die von Pflanzen aufgrund einer Ozon-Belastung oder aufgrund einer Infektion zur Abwehr der Pathogene, meist Pilze, gebildet werden können.
Somit können die in den erfindungsgemäßen chimären Nukleinsäuresequenzen enthaltenen codierenden Regionen durch Ozon und/oder Pathogene induzierbar in Pflanzen exprimiert werden. Besonders bevorzugt sind diese codierenden Regionen Abwehrgene, am meisten bevorzugt Gene für die Synthese von Phytoalexinen katalysierende Proteine, die natürlicherweise nicht Ozon- und/oder Pathogen- induzierbar sind.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekule können beliebige Nukleinsauremolekule sein, insbesondere DNA- oder RNA-Moleküle, beispielsweise cDNA, genomische DNA, mRNA usw. Sie können natürlich vorkommende oder durch gentechnische oder chemische Syntheseverfahren hergestellte Moleküle sein.
Weiter betrifft die vorliegende Erfindung Vektoren, welche die vorstehend genannten rekombinanten Nukleinsauremolekule, Promotoren oder chimären Nukleinsauremolekule enthalten. Die vorliegende Erfindung umfasst somit auch Vektoren, insbesondere Plasmide, Cosmide, Viren, Bakteriophagen und andere in der Gentechnik gängige Vektoren, die die vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekule enthalten und ggf. für den Transfer der erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekule aufpflanzen bzw. Pflanzenzellen eingesetzt werden können. Ebenso betrifft die Erfindung transformierte Mikroorganismen, wie Bakterien, Viren, Pilze, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen enthalten.
Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekule, Promotoren oder Vektoren besteht nun die Möglichkeit, pflanzliche Zellen mittels gentechnologischer Methoden dahingehend zu verändern, daß sie eine Ozon- und/oder Pathogen-induzierbare Merkmalsausprägung aufweisen. Insbesondere besteht nun die Möglichkeit pflanzliche Zellen mittels gentechnologischer Methoden dahingehend zu verändern, daß sie ein oder mehrere pflanzliche Gene für die Synthese von Phytoalexinen katalysierende Proteine, deren Expression natürlicherweise nicht oder nicht wesentlich durch Ozon und/oder Pathogene induziert wird, durch Fusion des erfindungsgemäßen Promotors oder eines Fragments davon mit derartigen pflanzlichen Genen Pathogen- bzw. Ozon- induzierbar ausprägen.
Ebenso können pflanzliche Zellen mittels gentechnologischer Methoden dahingehend verändert werden, daß sie durch Einfügen der erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekule oder mindestens eines Fragments davon in solche Pflanzen bzw. Pflanzenzellen, die diese DNA-Sequenzen natürlicherweise nicht enthalten, eine Ozon- und/oder Pathogen-induzierbare Merkmalsausprägung aufweisen.
Es ist ebenso eine Aufgabe der Erfindung, neue Pflanzen und Pflanzenzellen bereitzustellen, die sich durch eine Ozon- und/oder Pathogen-induzierbare Expression von Genen auszeichnen, die entweder natürlicherweise nicht in diesen Pflanzen, bzw. Pflanzenzellen vorliegen oder die natürlicherweise nicht über den erfindungsgemäßen Promotor oder Fragmente davon verfügen. Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen für die PMT codierenden DNA-Sequenz sowie der Bereitstellung des für die Ozon- und/oder Pathogen-Induktion verantwortlichen Promotors oder Fragmenten davon, die eine durch Ozon und/oder Pathogene induzierbare Genexpression der durch sie kontrollierten Abwehrgene in Pflanzen und pflanzlichen Zellen ermöglichen, gelöst.
Gegenstand der Erfindung sind somit transgene Pflanzen, die die erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsauremolekule, Promotoren oder chimären Nukleinsauremolekule integriert in das pflanzliche Genom vorliegend enthalten. Bei diesen Pflanzen kann es sich im Prinzip im jede beliebige Pflanze handeln. Vorzugsweise ist es eine monokotyle oder dikotyle Nutzpflanze. Beispiele für monokotyle Pflanzen sind Pflanzen, die zu den Gattungen Avena (Hafer), Triticum (Weizen), Seeale (Roggen), Hordeum (Gerste), Oryza (Reis), Panicum, Pennisetum, Setaria, Sorghum (Hirse), Zea (Mais) und dergleichen gehören. Dikotyle Nutzpflanzen umfassen unter anderem Baumwolle, Leguminosen wie Hülsenfrüchte und insbesondere Alfalfa, Sojabohne, Raps, Tomate, Zuckerrübe, Kartoffel, Zierpflanzen sowie Bäume. Weitere Nutzpflanzen können Obst (insbesondere Äpfel, Birnen, Kirschen, Weintrauben, Citrus, Ananas und Bananen), Ölpalmen, Tee-, Kakao- und Kaffeesträucher, Tabak, Sisal sowie bei Heilpflanzen Rauwolfia und Digitales umfassen. Besonders bevorzugt sind die Getreide Weizen, Roggen, Hafer, Gerste, Reis, Mais und Hirse, Zuckerrübe, Raps, Soja, Tomate, Kartoffel und Tabak.
Gegenstand der Erfindung ist ferner Vermehrungsmaterial von erfindungsgemäßen Pflanzen, beispielsweise Samen, Früchte, Stecklinge, Knollen, Wurzelstücke usw., sowie Teile dieser Pflanzen wie Pflanzenzellen, Protoplasten und Kalli.
Die Pflanzenzellen umfassen differenzierte und undifferenzierte Pflanzenzellen einschließlich Protoplasten, in denen die erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäuremoleküle, Promotoren oder chimären Nukleinsauremolekule integriert in das pflanzliche Genom oder als autonome Moleküle (einschließlich transiente Transformation) vorliegen.
Bei einer weiteren Ausfuhrungsform betrifft die Erfindung Wirtszellen, insbesondere prokaryontische und eukaryontische Zellen, die mit einem erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül, einem erfindungsgemäßen Promotor oder einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert bzw. infiziert wurden, und Zellen, die von derartigen Wirtszellen abstammen und die beschriebenen Nukleinsauremolekule oder Vektoren enthalten. Die Wirtszellen können Bakterien oder Pilzzellen sowie pflanzliche oder tierische Zellen sein.
Der vorliegenden Erfindung liegt außerdem die Aufgabe zugrunde, Verfahren zur Herstellung von Pflanzen bzw. Pflanzenzellen aufzuzeigen, die eine erhöhte Pathogen- und/oder Ozon- induzierbare Krankheitsresistenz aufweisen. Diese
Aufgabe wird durch Verfahren gelöst, mit deren Hilfe die Erzeugung neuer Pflanzen bzw. Pflanzenzellen möglich ist, bei denen natürlicherweise keine pflanzlichen Abwehrgene gegen Ozon sowie Pathogene vorliegen bzw. die gewünschte Abwehrgenexpression nicht in ausreichendem Maß vorliegt und/oder die keine bzw. keine ausreichende, natürlicherweise vorkommende Ozon- und/oder Pathogen- induzierbare Genexpression aufweisen.
Zur Erzeugung solcher neuer Pflanzen bzw. Pflanzenzellen bieten sich verschiedene Methoden an. Zum einen können Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit Hilfe herkömmlicher gentechnologischer Transformationsmethoden derart verändert werden, daß die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen bzw. Promotoren in das pflanzliche Genom integriert werden, so daß stabile Transformanten erzeugt werden. Erfindungsgemäß werden Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhter Pathogen- und/oder Ozon-induzierbarer Krankheitsresistenz durch ein Verfahren hergestellt, bei dem ein oder mehrere Abwehrgene, vorzugsweise Gene, die für die Synthese von Phytoalexinen katalysierende Proteine codieren, in Form der erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsauremolekule, die den erfindungsgemäßen Promotor und eine für PMT codierende Sequenz umfassen, oder in Form der erfindungsgemäßen chimären Nukleinsauremolekule, die den erfindungsgemäßen Promotor und ein oder mehrere Abwehrgene und vorzugsweise Gene umfassen, die für die Synthese von Phytoalexinen katalysierende Proteine codieren, eingeführt werden.
Alternativ werden Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhter Pathogen- und/oder Ozon-induzierbarer Krankheitsresistenz durch ein Verfahren hergestellt, bei dem ein oder mehrere Abwehrgene, bevorzugt Gene, die für die Synthese von Phytoalexinen katalysierende Proteine codieren, zwar natürlicherweise vorliegen, aber nicht durch Ozon und/oder Pathogene induzierbar sind, durch Einführung des erfindungsgemäßen Promotors oder von funktionellen Fragmenten davon induzierbar gemacht werden.
Bei der Einführung der erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsauremolekule, umfassend den erfindungsgemäßen Promotor und eine für PMT codierende Sequenz, umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere folgende Schritte:
(a) soweit erforderlich das Einbringen der für eine Stilbensynthase codierenden DNA-Sequenz in eine Pflanzenzelle, falls in der Pflanzenzelle keine oder keine ausreichende STS-Genaktivität vorliegt (durch die Stilbensynthase wird
Pinosylvin bereitgestellt, das als Substrat für die PMT dient, welche durch die DNA-Sequenz der erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsauremolekule codiert wird), (b) das Einbringen des erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäuremoleküls in die Pflanzenzelle, und ggf.
(c) das Regenerieren vollständig transformierter Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen, und ggf.
(d) das Gewinnen der gewünschten Pflanzenteile einschließlich der Samen der so erhaltenden Pflanzen.
Bevorzugt wird das rekombinante PMT-Enzym in einer solchen Menge exprimiert, daß durch die Methylierung von Pinosylvin ein zumindest teilweiser Schutz gegenüber Ozon und/oder durch pathogene Organismen verursachte Erkrankungen der Pflanzen bewirkt wird. Es kann ausreichend sein, daß lediglich die funktionellen Teile des rekombinanten Proteins exprimiert werden, um einen derartigen Schutz zu bewirken.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das rekombinante Protein oder ein funktioneller Teil davon zur Methylierung von Pinosylvin oder einem Derivat von Pinosylvin benutzt, wobei sich dieser Anwendungszweck auch auf pharmazeutische Einsatzgebiete oder sonstige Gebiete erstrecken kann, bei denen einen Methylierung von Pinosylvin von hoher Spezifität erforderlich ist.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, vorteilhafte Verwendungen der erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekule oder der erfindungsgemäßen Promotoren aufzuzeigen. Die Erfindung umfaßt daher Verwendungen der erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekule bzw. der erfindungsgemäßen Promotoren zur Erzeugung der vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Pflanzen und Pflanzenzellen, die sich aufgrund der Anwesenheit der erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekule durch eine Ozon- und/oder Pathogen-induzierte Merkmalsausprägung von nicht-transgenen Pflanzen und Pflanzenzellen unterscheiden.
Des weiteren umfaßt die Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekule bzw. der erfindungsgemäßen Promotoren oder von Fragmenten davon zur Auffindung und Identifizierung von Ozon- und/oder Pathogen-responsiven Nukleinsäureelementen in pflanzlichen Genen.
Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls Nukleinsauremolekule oder Fragmente davon, die mit einer der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen hybridisieren. Der Begriff "Hybridisierung" bedeutet im Rahmen dieser Erfindung eine Hybridisierung unter konventionellen Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, beschrieben sind.
Nukleinsauremolekule, die mit den erfindungsgemäßen Molekülen hybridisieren, können beispielsweise aus genomischen oder aus cDNA-Bibliotheken isoliert werden.
Die Identifizierung und Isolierung derartiger Nuleinsäuremoleküle kann dabei unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekule oder Teilen dieser Moleküle bzw. der reversen Komplemente dieser Moleküle erfolgen, beispielsweises mittels Hybridisierung nach Standardverfahren (siehe beispielsweise Sambrook et al, supra).
Somit betrifft die Erfindung ebenfalls die Verwendung einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz oder von Teilen davon zur Identifizierung und Isolierung homologer Sequenzen aus Pflanzen oder anderen Organismen.
Als Hybridisierungssonde können beispielsweise Nukleinsauremolekule verwendet werden, die exakt oder im wesentlichen die erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekule oder Teile dieser Sequenzen aufweisen. Bei den als
Hybridisierungssonde verwendeten Fragmenten kann es sich auch um synthetische Fragmente handeln, die mit Hilfe der gängigen Synthesetechniken hergestellt wurden und deren Sequenz im wesentlichen mit der eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls übereinstimmt. Hat man Gene identifiziert und isoliert, die mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen hybridisieren, ist eine
Bestimmung der Sequenz und eine Analyse der Eigenschaften erforderlich. Hierzu stehen dem Fachmann eine Reihe von molekularbiologischen, biochemischen und biotechnologischen Standardverfahren zur Verfügung.
Die mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen hybridisierenden Moleküle umfassen auch Fragmente, Derivate und allelische Varianten der vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen, die eine Ozon- und/oder Pathogen-responsive Sequenz, in aktiver oder inaktivierter Form, enthalten. Der Ausdruck "Derivat" bedeutet in diesem Zusammenhang, daß die Sequenzen dieser Moleküle sich von den Sequenzen der vorstehend beschriebenen Nukleinsauremolekule an einer oder mehrerer Positionen unterscheiden und einen hohen Grad an Homologie zu diesen Sequenzen aufweisen. Homologie bedeutet dabei eine Sequenzidentiät von mindestens 40%, insbesondere eine Identität von mindestens 60%, vorzugsweise über 80% und besonders bevorzugt über 90%. Die Abweichungen zu den vorstehend beschriebenen Nukleinsäuremolekülen können dabei durch Deletion, Addition, Substitution, Insertion oder Rekombination entstanden sein.
Bei den Nukleinsäuremolekülen, die homolog zu den vorstehend beschriebenen
Molekülen sind und Derivate dieser Moleküle darstellen, handelt es sich in der Regel um Variationen dieser Moleküle, die Modifikationen darstellen, die diesselbe biologische Funktion ausüben. Es kann sich dabei sowohl um natürlicherweise auftretende Variationen handeln, beispielsweise um Sequenzen aus anderen Organismen, oder um Mutationen, wobei diese Modifikationen auf natürliche Weise aufgetreten sein können oder durch gezielte Mutagenese eingeführt wurden. Ferner kann es sich bei den Variationen um synthetisch hergestellte Sequenzen handeln. Bei den allelischen Varianten kann es sich sowohl um natürlich auftretende als auch um synthetisch hergestellte oder durch rekombinante DNA-Techniken erzeugte Varianten handeln.
Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen bzw. deren Zellen stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E. coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC- Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltende Plasmid wird für die Transformation von E. co/z'-Zellen verwendet. Transformierte E. co/z'-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet und anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysemethode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch- molekularbiologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation können die Plasmid-DNA gespalten und gewonnene DNA-Fragmente mit anderen DNA- Sequenzen verknüpft werden. Jede Plasmid-DNA-Sequenz kann in den gleichen oder anderen Plasmiden kloniert werden.
Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl bekannter Techniken zur Verfügung, wobei der Fachmann die jeweils geeignete Methode ohne Schwierigkeiten ermitteln kann. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, den direkten Gentransfer isolierter DNA in Protoplasten, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten. Dabei können sowohl stabile als auch transiente Transformanten erzeugt werden.
Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden per se keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Ähnliches gilt für den direkten Gentransfer. Es können einfache Plasmide wie beispielsweise pUC- Derivate verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig. Dem Fachmann sind die gängigen Selektionsmarker bekannt und es stellt für ihn kein Problem dar, einen geeigneten Marker auszuwählen. Gebräuchliche Seklektionsmarker sind solche, die den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G418, Bleomycin, Hygromycin, Methotrexat, Glyphosat, Streptomycin, Sulfonyl-Harnstoff, Gentamycin oder Phosphinotricin und dergleichen vermitteln.
Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden beispielsweise für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der im Ti- und Ri- Plasmid enthaltenen T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden.
Werden für die Transformationen Agrobakterien verwendet, muß die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären oder in einem binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri- Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir- Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA-Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al. (1978), Molecular and General Genetics 163, 181-187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzlich T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet.
Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 120 515 beschrieben worden.
Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (beispielsweise Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeignetem Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die Regeneration der Pflanzen erfolgt nach üblichen Regenerationsmethoden unter Verwendung bekannter Nährmedien. Die so erhaltenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden.
Andere Möglichkeiten der Einführung fremder DNA unter Verwendung des biolistischen Verfahrens oder durch Protoplasten-Transformation sind dem Fachmann bekannt (vgl. L. Willmitzer (1993) Transgenic Plants in: Biotechnology, A Multi- Volume Comprehensive Treatise (Herausgeber: HJ. Rehm et al.), Band 2, 627-659, VCH Weinheim, Deutschland).
Während die Transformation dikotyler Pflanzen bzw. derer Zellen über Ti-Plasmid- Vektorsysteme mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens wohl etabliert ist, weisen neuere Arbeiten daraufhin, daß auch monokotyle Pflanzen bzw. deren Zellen der Transformation mittels auf Agrobakterien basierender Vektoren sehr wohl zugänglich sind (siehe u.a. Chan et al. (1993), Plant Mol. Biol. 22, 491-506).
Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen bzw. deren Zellen sind die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes (Wan und Lemaux (1994) Plant Physiol. 104, 37-48; Vasil et al. (1993) Bio/Technology 11, 1553-1558; Ritala et al. (1994) Plant Mol. Biol. 24, 317-325; Spencer et al. (1990), Theor. Appl. Genet. 79, 625-631), die Protoplasten-Transformation, die Elektroporation von partiell permeabilisierten Zellen sowie die Einbringung von DNA mittels Glasfasern. Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al. (1986), Plant Cell Reports 5, 81-84). Die resultierenden Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen besitzen die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften.
Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um sicherzustellen, daß das phänotypische Merkmal stabil beibehalten und vererbt wird. Auch sollten Samen geerntet werden, um sicherzustellen, daß der entsprechende Phänotyp oder andere Eigenarten erhalten geblieben sind.
Ebenso können nach üblichen Methoden transgene Linien bestimmt werden, die für die neuen Nukleinsauremolekule homozygot sind und ihr phänotypisches Verhalten hinsichtlich einer vorhandenen bzw. nicht vorhandenen Ozon- und/oder Pathogen- Responsivität untersucht und mit dem von hemizygoten Linien verglichen werden.
Selbstverständlich können Pflanzenzellen, die die erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekule enthalten, auch als Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten, Kalli, Suspensionskulturen und dergleichen) weiterkultiviert werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekule oder Teile dieser Moleküle bzw. der reversen Komplemente dieser Moleküle zur Identifizierung und Isolierung homologer Moleküle, die Ozon- und/Pathogen-responsive Elemente umfassen, aus Pflanzen oder anderen Organismen. Die Definition des Begriffes "Homologie" ist vorstehend angegeben. Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der vorliegenden Erfindung, ohne diese in irgendeiner Weise einzuschränken.
Beispiele:
Beispiel 1 : Pflanzen- und Pilzmaterial
Sieben Jahre alte Kiefernsetzlinge wurden von der Baumschule Bauchery, Crouy- sur-Cosson, Loir et Cher, Frankreich bezogen und für weitere fünf Monate in einem Gewächshaus gezüchtet. Nach den experimentellen Behandlungen wurden die Bäume zurück in das Gewächshaus gebracht, und nach einem Jahr wurde deren
Überlebensrate bestimmt. Der Pilz Leptographium wingfieldii stammt aus der INRA- Sammlung (Orleans, Frankreich) und wurde ursprünglich aus dem Borkenkäfer Tomicus piniperda isoliert. Er wurde durch eine Monospurenkultur weiter gereinigt und im Dunkeln bei 22°C auf Malz-Agar gezüchtet (Lieutier et. al. (1989), Ann. Sei. For. 46, 201-216). Die Kulturen wurden bei 4 °C mit einem jährlichen Durchlauf auf Baumstämmen der schottischen Kiefer bei 22 °C aufbewahrt, um ihre Aktivität aufrecht zu erhalten.
Beispiel 2: Ozonbehandlung
Die Setzlinge wurden sechs Tage lang in Klimakammern akklimatisiert (Thiel et al. (1996), J. Plant Physiol. 148, 456-463). Die Lichtdauer betrug 14 Stunden pro Tag (PAR: 1300 μE m"2 s"1; UV-A: 22,5 Wm'2; UV-B: 0,45 MEDh"1); die Tages-/ Nachttemperaturen betrugen 22 °C bzw. 16 °C und die relativen Feuchtigkeiten bei Tag bzw. bei Nacht betrugen 70% bzw. 85%. Die Setzlinge wurden mit Ozon (0,15 oder 0,3 μl l"1 ) zehn Stunden täglich für eine Dauer von zwei Tagen behandelt. In allen RT-PCR-Experimenten wurden ausschließlich einzelne Banden bei 1,15 kb für PMT, 1,17 kb für STS und 0,8 kb für cab detektiert. Mit cab-Primern durchgeführt RT-PCR Kontrollexperimente zeigten ein gleichbleibendes Niveau an cab-Transkripten in nicht Ozon-behandelten Geweben und eine Abnahme dieser Transkripte in Geweben, die 0,15 bzw. 0,3 μl l"1 Ozon ausgesetzt waren.
In Kontrollbäumen, die ozonfreier Luft ausgesetzt waren, waren STS- oder PMT- Transcripte in den Nadeln und dem Phloem fast nicht detektierbar. Zwei zehnstündige Perioden Ozonbegasung waren ausreichend, um die STS-und PMT- Transkript-Niveaus in Nadeln von Bäumen der schottischen Kiefer dramatisch zu erhöhen. Die Begasung mit 0,15 μl l"1 Ozon resultierte in einem ersten Peak der STS- Transkripte nach sechs Stunden Aussetzung, gefolgt von einem weiteren Anstieg 48 Stunden nach dem Beginn der Behandlung, während die PMT-Transcripte zunächst bis 24 Stunden nach dem Beginn der Begasung auf dem Kontrollniveau blieben und erst dann begannen, sich zu akkumulieren. Die Aussetzung an 0,3 μl l"1 Ozon führte zu einem weiteren Anstieg der beiden Transkriptniveaus und blieb in den Nadeln auf einem hohen Niveau. Im Gegensatz dazu wurden die Mengen an STS- und PMT- mRNA im Phloem nicht wesentlich durch Ozon beeinflußt.
Beispiel 3 : Beimpfungen
48 Stunden nach dem Beginn der Ozonbegasung wurden zwei sterile Beimpfungen und zwei Pilzbeimpfungen bei jedem Baum in jedem Raum durchgeführt. Gemäß der von Wright beschriebenen Methode (Phytopathol. 23, 487-588 (1933)) wurden kalibrierte Agar-Disks (Durchmesser 3 mm) einer drei Wochen alten, sporulierenden Leptographium wingfieldii-Kultuτ in Höhe des Kambiums in den Baum eingeführt. Scheinbeimpfungen ohne Pilz wurden mit sterilen Malz-Agar-Disks (Durchmesser 3 mm) durchgeführt. Die Beimpfungen wurden an zwei unterschiedlichen Höhen des Stammes mit einem Abstand von mindestens 20 cm durchgeführt. Ein 4 cm (horizontal) x 7 cm (vertikal) großes Rechteck um die jeweilige Infektionsstelle des Phloem-Gewebes wurde entfernt und für die RNA-Analayse verwendet, nachdem ein 1 cm x 2 cm großes Rechteck des Phloem-Gewebes, das direkt um den Infektionspunkt lag, entfernt wurde.
Die Scheinbeimpfung führte zu einer Akkumulierung beider Transkripte am Tag 5 (drei Tage nach der Beimpfung). Die SJS mRNA zeigte eine progressive Anhäufung bis zum Tag 9 (120 ng ng"1 cDNA), nahm dann langsam ab und war nach 16 Tagen immer noch auf einem hohen Niveau. Die P T-mRNA nahm progressiv nach Tag 5 (50 ng ng"1 cDNA) ab, um am Ende des Experiments wieder auf dem Kontrollniveau zu sein.
Die zwei Kinetiken als Reaktion auf die Scheinbeimpfung wurde durch eine vorangehende Ozonbegasung stark beeinflußt. 0,15 μl 1 _1 Ozon führten zu einer dramatischen Abnahme des STS mRNA-Reaktionsmusters. Die R TmRNA- Reaktionskurve wurde ebenfalls erniedrigt. Eine Vorbehandlung mit 0,3 μl l"1 Ozon führte zu einem Peak an SJS-Transkripten am selben 9. Tag wie bei der Scheinbeimpfung alleine, verlängerte jedoch die Akkumulierung bis zum 16. Tag. Die R T-Transcripte zeigten eine progressive Anhäufung bis zum Tag 16 (75 ng ng"1 cDNA).
Die Pilzbeimpfung führte zu vorübergehenden Peaks an STS- und R T-Transkripten nach 5 (200 ng ng"1 cDNA) bzw. 9 (130 ng ng"1 cDNA) Tagen nach Beginn des Experiments. Durch die Ozonbegasung mit 0,15 μl l"1 nahm der Peak der STS- Transkript- Akkumulierung leicht ab und verzögerte den Peak an RΛJT-Transcripten bis Tag 16 (110 ng ng"1 cDNA). Die Ozonbegasung mit 0,3 μl l"1 verlängerte den Peak von S7S auf ein stabiles Niveau von 150 ng ng"1 cDNA, während die Menge an R T-Transkripten bis 16 Tage nach Beginn des Experiments auf 170 ng ng"1 cDNA anstieg. Durch die Pilze wurde der Peak an S7S- und R T-Transkriptmengen, der während der Beimpfung auftrat, etwa verdoppelt, wobei er für STS vier Tage früher auftrat. Die S S- und P T-Transkriptmengen zeigten ähnliche Reaktionen auf Ozon. Bei 0,15 μl l"1 trat eine wesentliche Abnahme auf, während bei 0,3 μl l"1 die Peakhöhe verlängert wurde oder geringfügig zunahm.
Die dosisabhängige Anhäufung nach Ozoninduktion von STS- und PMT- Transkripten in Nadeln stimmt gut mit früher gefundenen Anstiegen von
Stilbengehalten, SJS- und R T-Enzymaktivitäten und STS-Transcripten in
Setzlingen der schottischen Kiefer überein (Rosemann et al, supra; Zinser et al.
(1998), Planta 204, 169-176). Der Vergleich dieser Daten liegt nahe, das die
Stilbenmetaboliten auf der Ebene der Transkription reguliert werden.
Ozon induziert keine STS- und P T-mRNA in Phloem, was andeutet, daß kein systematischer Ozoneffekt vorliegt.
Verwundungen führten zu vorübergehenden Induktionen der SDS- und PMT- Transcripte, die durch Pilze während der ersten Woche nach der Impfung anstiegen. Die Stilbene PS und PSM wurden im Reaktionsbereich nur in Phloem dedektiert, das verwundet bzw. durch einen mit dem Borkenkäfer verwandten Pilz beimpft wurde, was mit der vorgeschlagenen Stilbeninvolvierung in die Baumresistenz übereinstimmt (Lieutier et al. supra; Bois und Lieutier (1997), Plant Physiol. Biochem. 35, 819-825). Die Ozonbehandlung führt zu einem vorübergehenden Anstieg an STS- und PMT-mRNA in den Nadeln, was eine Ähnlichkeit zwischen dem ozon- und pathogen-induzierten Anstieg an Transkripten aufzeigt. Beispiel 4: Gesamt-RNA-Extraktion
Lyophilisierte Nadeln (70 bis 90 mg) unter Verwerfung der aktuellen Jahresblüte sowie lyophilisiertes Phloem-Gewebe (100 mg) wurden zu einem feinen Pulver gemahlen, und die Gesamt-RNA wurde auf herkömmliche Weise isoliert.
Beispiel 5: Extraktion der genomischen DNA
Die genomische DNA wurde aus den Nadeln von ausgewachsenen schottischen Kiefern gemäß des Protokolls 1 in Csaikl el. al (Plant Mol. Biol. Rep. 16, 69-86 (1998)) extrahiert.
Beispiel 6: Isolierung des genomischen PMT-Klons
Die Promotor-Sequenz wurde erhalten, in dem genspezifische reverse Primer aus der PMT cDNA-Sequenz (Deutsche Patentanmeldung DE-A-198 36 774; Ernst et al. (1999) Forest Biotechnology, University of Oxford, 11.-16. Juli 1999; Ernst et al. (1999) IUFRO Conference, University of Munich, 12.-17. Sept. 1999) gemäß dem durch Cormack und Somssich beschriebenen Verfahrens (Gene 194, 273 bis 276 (1997)) entwickelt wurden. 1,5 μg der genomischen DNA der schottischen Kiefer wurden mit 20 Einheiten EcoRI vollständig verdaut. Die DNA wurde fünf Minuten lang auf Eis mit 2 Volumeneinheiten Isopropanol ausgefällt, mit 70 %igem Ethanol gewaschen und in 15 μl H O wieder suspendiert. Nach einer fünfminutigen Inkubation bei 90°C wurde die DNA bei 37°C mit 0,5 mM dATP und 1,5 mM CoCl2 in Puffer 1,5 Stunden lang polyadenyliert. Als Puffer diente dabei 20 μl terminaler Transferase (TdT)-Puffer (Röche) mit 50 Einheiten TdT. Die Reaktion wurde durch fünfminütige Erwärmung der Probe bei 72 °C beendet.
Die erste Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde mit einem Zehntel des Volumens der polyadenylierten DNA (150 ng), 100 pmol des Gen-spezifischen Primers 1 (5'- TCCCCGAGTTCCATGCCCAGAA-3'), 100 pmol des universal-T17-Primers (5'- GTAAAACGACGGCCAGTCGACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'), 200 μM dNTPs und 5 Einheiten AGS-Gold™ DNA-Polymerase (AGS) in 100 μl 1 x AGSGold™- Puffer durchgeführt, wobei die Wärmezyklus-Bedingungen einen anfänglichen Denaturierungsschritt bei 94 °C für 1 Minute, gefolgt von 35 Zyklen von 1 Minute Denaturierung bei 94 °C, Primer-Anheftung bei 60 °C für 1 Minute, und 3 Minuten Verlängerung bei 72 °C mit einem abschließenden zehnminütigen Verlängerungsschritt bei 72 °C umfaßten.
Die zweite PCR wurde unter Verwendung von 1 μl des ersten PCR-Produkts unter denselben Bedingungen wie bei der ersten PCR durchgeführt, außer daß 100 pmol des Gen-spezifischen Primers 2 (5'-GCCGATCCCATTTCGAATCC-3') und 100 pmol des Universal-Primers (5'- GTAAAACGACGGCCAGT-3') verwendet wurden. Das PCR-Endprodukt wurde gereinigt und in den pGEM-T- Vektor (Promega) entsprechend den Anweisungen des Herstellters kloniert . Die Plasmide wurden kommerziell sequenziert (MWG).
Beispiel 7: RT-PCR- Analyse
Die Gesamt-RNA ( 5 μg) aus Kiefernadeln oder Phloem-Gewebe wurden mit DNasel verdaut und durch 200 Einheiten Superscript II RT (Live Technologies) 1 Stunde lang bei 42 °C revers transkribiert, wobei ein entsprechender Puffer, 10 mM DTT, 0,4 mM eines jeden dNTP's, 100 nM oligo-dTι2-18-Primer (Life Technologies) und 10 Einheiten RNase-Inhibitor (Lfve Technologies) zugegeben wurden.
Die cDNA wurde gemäß des von Kiefer et. al. (supra) beschriebenen Verfahrens quantifiziert, und 10 ng wurden für die PCR mit 2,5 Einheiten 7α^-Polymerase (Amersham Pharmacia Biotech), einem entsprechenden Puffer, 0,2 mM eines jeden dNTP's und 0,2 μ 3'-und 5'-Primern verwendet. Die Amplifizierung wurde während 35 Zyklen von 1 Minute Denaturierung bei 94 °C, 1 Minute Primer-Anheftung bei 58 °C (R T-und cαb-Primer) oder 62 °C (STS-Primer) und 2 Minuten Verlängerung bei 72 °C durchgeführt. Die Reaktionsprodukte wurden durch Elektrophorese mittels eines l%igen Agarosegels analysiert, und unter UV-Licht nach Ethidiumbromid- Anfärbung sichtbar gemacht und unter Verwendung des Picogreen-Verfahrens (Molecure Probes) quantifiziert. Die Echtheit der PCR-Produkte wurde durch zwei gerichtete partielle Sequenzierungen unter Verwendung der Thermo Sequenase-Kits (Amersham Pharmacia Biotech) überprüft.
Abbildungen:
Abbildung 1 (= SEQ ID No. 1)
Nukleotidsequenz des PMT-Gens aus Pinus sylvestris und die davon abgeleitete Proteinsequenz: Die vorhergesagte Transkriptionsstartsstelle wird als +1 bezeichnet. Konservierte eukaryotische Promotorelemente (CAP-Signal, TATA-, CATA- ,CAAT- und GC-Boxen) und potentielle pflanzenregulatorische Elemente (G- und H-Boxen) sind unterstrichen, und Myb-responsive Elemente (MREs) sind übergelegt. Elicitor-regulatorische Elemente (W-Boxen) sind fett gedruckt und der SV40-Enhancer ist kursiv gedruckt.

Claims

P A T E N T A N S P R Ü C H E
1. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, umfassend a) regulatorische Sequenzen eines in Pflanzen aktiven Promotors, der eine durch Pathogene und/oder Ozon induzierbare Genexpression vermittelt; und b) operativ damit verknüpft eine DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Pinosylvin-3-O-methyltransferase (PMT) kodiert.
2. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei der Promotor und/oder die DNA-Sequenz aus der Kiefer (Pinus sylvestris) isoliert ist.
3. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, umfassend die in Sequenz SEQ ID No. 1 angegebene Promotorsequenz oder Fragmente davon, die eine Pathogen- und/oder Ozon-responsive Expression einer damit operativ verbundenen kodierenden Region vermitteln.
4. Isolierter Promotor eines Pinosylvin-3-O-methyltransferase (PMT)-Gens oder Fragmente davon, die eine Pathogen- und/oder Ozon induzierbare Genexpression in Pflanzenzellen vermitteln.
5. Promotor nach Anspruch 4, isoliert aus Kiefer (Pinus sylvestris).
6. Promotor wie in SEQ ID No. 1 angegeben.
7. Chimäres Nukleinsäuremolekül, umfassend den Promotor nach einem der Ansprüche 4 bis 6 oder Fragmente davon.
8. Chimäres Nukleinsauremolekule nach Anspruch 7, das mindestens eine operativ mit dem Promotor verknüpfte DNA-Sequenz umfasst, die für ein Abwehrgen, insbesondere für ein die Synthese von Phytoalexinen katalysierendes Protein codiert.
9. Chimäres Nukleinsauremolekule nach Anspruch 8, wobei die DNA-Sequenz für ein Protein kodiert, das natürlicherweise nicht Pathogen- und/oder Ozoninduzierbar ist.
10. Vektoren, welche einen Promotor oder ein Nukleinsäuremolekül nach einem der vorangehenden Ansprüche enthalten.
11. Transgene Pflanzen, welche einen Promotor, ein Nukleinsäuremolekül oder einen Vektor nach einem der vorangehenden Ansprüche enthalten, sowie Teile dieser Pflanzen und deren Vermehrungsmaterial, wie Protoplasten, Pflanzenzellen, Kalli, Samen, Knollen oder Stecklinge usw., sowie die Nachkommen dieser Pflanzen.
12. Dikotyle Pflanzen nach Anspruch 11, insbesondere Nutzpflanzen, wie Sojabohne, Raps, Tomate, Zuckerrübe, Kartoffel, Baumwolle, Tabak sowie Zierpflanzen oder Bäume.
13. Monokotyle Pflanzen nach Anspruch 11 , insbesondere Getreide wie Hafer, Weizen, Roggen, Gerste, Reis, Hirse oder Mais.
14. Transgene Pflanzenzellen, einschließlich Protoplasten, welche einen
Promotor, ein Nukleinsäuremolekül oder einen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 10 enthalten.
15. Pflanzenzellen nach Anspruch 14, in denen aufgrund der Einführung des Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 3, eines Promotors nach einem der Ansprüche 4 bis 6 oder eines chimären Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 7 bis 10 oder mindestens eines Fragments davon eine Ozon- und/oder Pathogen-induzierbare Expression eines natürlicherweise nicht über die entsprechende DNA-Sequenz verfugenden Gens erfolgen kann.
16. Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzenzellen bzw. transgener Pflanzen mit erhöhter Pathogen- und/oder Ozon-induzierbarer Krankheitsresistenz, bei dem ein Abwehrgen, insbesondere ein Gen für ein die Synthese von
Phytoalexinen katalysierendes Protein, in Form der Nukleinsauremolekule nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder in Form der Nukleinsauremolekule nach Anspruch 8 oder 9 eingeführt wird.
17. Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzenzellen bzw. transgener
Pflanzen mit erhöhter Pathogen- und/oder Ozon-induzierbarer Krankheitsresistenz, bei dem ein Abwehrgen, insbesondere ein Gen für ein die Synthese von Phytoalexinen katalysierendes Protein, unter Kontrolle eines Promotors nach einem der Ansprüche 4 bis 6 oder von Fragmenten davon, die eine durch Ozon und/oder Pathogene induzierbare Expression vermitteln, steht.
18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, wobei das durch das Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3 kodierte Protein in einer solchen Menge exprimiert wird, daß durch die Methylierung von Pinosylvin ein zumindest teilweiser Schutz gegenüber durch pathogene Organismen und/oder Ozon verursachte Erkrankungen der Pflanzen bewirkt wird.
19. Verfahren zur Erzeugung von Ozon- und/oder Pathogen-induzierbarer Merkmalsausprägung in transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen durch Übertragen des Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 3, eines Promotors nach einem der Ansprüche 4 bis 6 oder eines chimären Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 7 bis 9 oder mindestens eines Fragments davon aufpflanzen bzw. Pflanzenzellen.
20. Verwendung des Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 7 bis 10 oder eines Fragments davon zur Erzeugung erhöhter Pathogen- und/oder Ozon-induzierbarer Krankheitsresistenz in transgenen Pflanzen.
21. Verwendung des Promotors nach einem der Ansprüche 4 bis 6 oder eines Fragments davon zur Erzeugung von Ozon- und/oder Pathogen-induzierbarer Merkmalsausprägung in transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen.
22. Verwendung des Promotors nach einem der Ansprüche 4 bis 6 oder eines Fragments davon zur Expression heterologer pflanzlicher Abwehrgene.
23. Verwendung des Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 7 bis 10 oder eines Fragments davon und/oder des Promotors nach einem der
Ansprüche 4 bis 6 oder eines Fragments davon zur Auffindung und Identifizierung von Ozon- und/oder Pathogen-responsiven Nukleinsäureelementen in pflanzlichen Genen.
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