DE60035892T2

DE60035892T2 - Gene und verfahren zur wachstumsmanipulation

Info

Publication number: DE60035892T2
Application number: DE60035892T
Authority: DE
Inventors: Gurmukh S Columbia JOHAL; Dilbag S Urbandale MULTANI; Steven P Del Mar BRIGGS
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc; University of Missouri System
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc; University of Missouri System
Priority date: 1999-11-12
Filing date: 2000-11-10
Publication date: 2008-05-08
Anticipated expiration: 2020-11-11
Also published as: DE60035892D1; AU1364201A; HUP0302908A2; EP1228226B1; CA2391368C; WO2001034819A2; US7612256B2; US7276584B1; EP1228226A2; HUP0302908A3; US7041874B2; WO2001034819A3; US20070079397A1; AU783458B2; CA2391368A1; ATE369431T1; US20020162142A1; ES2288879T3; MXPA02004715A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die genetische Manipulation von Organismen, insbesondere Pflanzen, mit Genen, die das Wachstum und die Entwicklung kontrollieren. Die Erfindung betrifft ferner Gene, die das Wachstum kontrollieren, einschließlich homologer und mutanter Formen, die dadurch codierten Proteine und Pflanzen, die mit diesen Genentransformiert sind.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Zwergwüchsige Pflanzen hatten eine große Auswirkung auf die Landwirtschaft. Zwergwüchsige Varietäten von Weizen werden in Nordamerika weithin verwendet, sowohl aufgrund eines verringerten Potentials zum Niederliegen als auch aufgrund hoher Erträge. Zwergwüchsige Obstbäume werden ebenfalls großflächig verwendet und ermöglichen es Landwirten, mehr Früchte pro Acre ("acre") zu produzieren, wodurch das wirtschaftliche Ertragspotential erhöht wird. Es gibt weitere Vorteile, die, ausgehend von der Verwendung von zwergwüchsigen Nutzpflanzen und zwergwüchsigen Obstbäumen, realisiert werden können, einschließlich Verringerungen der erforderlichen Mengen an Pestiziden und Düngemitteln, höherer Pflanzdichten und verringerter Arbeitskosten.
Angesichts der gegenwärtigen Trends zu sowohl Wachstum der menschlichen Bevölkerung als auch Verringerung des zur Landwirtschaft geeigneten Landes ist die Erhöhung der landwirtschaftlichen Produktivität eine Herausforderung höchster Bedeutung und wird dies weiterhin bleiben. Zwergwüchsige Nutzpflanzen und Obstbäume sind wichtige Bestandteile unseres landwirtschaftlichen Produktionssystems gewesen und werden dies weiter sein. Eine erhöhte Verwendung zwergwüchsiger Nutzpflanzen und zwergwüchsiger Obstbäume kann dabei helfen, die landwirtschaftlichen Produktionserfordernisse der Zukunft zu erfüllen. Jedoch sind kommerziell annehmbare zwergwüchsige Varietäten nicht für alle Nutzpflanzen verfügbar.
Zusätzlich zur Verwendung zwergwüchsiger Pflanzen zur Kontrolle der Pflanzengröße werden synthetische Chemikalien routinemäßig auf bestimmte wirtschaftlich bedeutende Pflanzenarten zur Verringerung des Wachstums angewendet. Pflanzenwachstumsregulatoren, die als Wachstumsverzögerer bekannt sind, werden verwendet, um die Stamm- bzw. Stängel- bzw. Halmstreckung ("stem elongation") bei einer Vielzahl von Nutzpflanzen, einschließlich Baumwolle, Weinstöcke, Obstbäume, Erdnüsse, Weizen, und Zierpflanzen, wie Azaleen, Chrysanthemen, Hortensien bzw. Hydrangeas, Weihnachtssterne bzw. Poinsettien, und vielen Beetpflanzen zu verringern. Alle der üblicherweise verwendeten Wachstumsverzögerer sind Inhibitoren der Gibberellinbiosynthese und beschränken das Stamm- bzw. Stängel- bzw. Halm- oder Schösslingswachstum, indem sie die Verlängerung bzw. das Streckungswachstum ("elongation") verringern. In den Vereinigten Staaten ist der am umfangreichsten verwendete Wachstumsverzögerer Mepiquatchlorid, der zur Verwendung auf Baumwolle zugelassen ist. Vorteile, die der Verwendung von Mepiquatchlorid auf Baumwolle zugeschrieben werden, umfassen eine erhöhte Ausbeute, eine verbesserte Entlaubung, eine verbesserte Stresstoleranz, eine gleichförmigere Bestandsreife und die Fähigkeit zur früheren Ernte. Zuvor ist der Wachstumsverzögerer Daminozid in den Vereinigten Staaten zur Verwendung auf Äpfeln, Trauben und Erdnüssen unter den Marken ALAR und KYLAR zugelassen worden, wurde jedoch wegen Bedenken hinsichtlich der menschlichen Gesundheit von der Anwendung auf Nahrungsmittelkulturen ausgenommen. Trotz der Nachfragen von landwirtschaftlichen Produzenten nach einem Produkt zum Ersetzen von Diaminozid gibt es in den Vereinigten Staaten keine Wachstumsverzögerer, die zur Anwendung auf Trauben, Obstbäumen und Erdnüssen zugelassen sind. Diaminozid wird jedoch weithin auf bestimmte Nichtnahrungspflanzenarten angewendet.
Es ist wahrscheinlich, dass die Entdeckung der molekularen Mechanismen, die Pflanzenwachstumsvorgänge, wie Zellteilung und Zellelongation kontrollieren, bei der Entwicklung neuer Pflanzenvarietäten mit verkleinerter Statur und neuen Verfahren zur Verringerung des Pflanzenwachstums helfen wird. Derartige neue Pflanzenvarietäten und Verfahren können für Landwirte wie auch für Gartenbauer im Hinblick auf die Umwelt günstige Alternativen zur Verwendung synthetischer wachstumsverzögernder Chemikalien bereitstellen.
Das Längenwachstum bzw. die Elongation von Pflanzenzellen und -organen ist einer der kritischsten Parameter des Pflanzenwachstums und der Pflanzenentwicklung. Die Regulation dieses Merkmals bei Pflanzen ist jedoch ein sehr komplizierter Vorgang, da sowohl äußere als auch innere Faktoren darauf Einfluss nehmen. Der wichtigste äußere Reiz ist Licht, mit seiner normalerweise reprimierbaren oder negativen Wirkung auf die Zellelongation (Quail, P.H., (1995), Science, 268:675-680; Kende et al., (1997), Plant Cell, 9:1197-1210). Die inne re bzw. interne Kontrolle der Zellelongation wird durch eine Anzahl von Chemikalien vermittelt, die normalerweise als Pflanzenwachstumsregulatoren oder -hormone bezeichnet werden (Kende et al., (1997), Plant Cell, 9:1197-1210). Unter den klassischen Pflanzenhormonen fördern sowohl Auxine als auch Gibberelline (GAs) die Zellelongation, während gezeigt wurde, dass Zytokinine und Abszisinsäure jeweils eine negative Wirkung auf die Zellelongation haben (Kende et al., (1997), Plant Cell, 9:1197-1210). Vor kurzem ist eine weitere Klasse von Pflanzenwachstumsregulatoren, bezeichnet als Brassinosteroide, identifiziert worden, die das Pflanzenwachstum ebenfalls auf dramatische Weise fördern (Yokota, T., (1997), Trends Plant Sci., 2:137-143, Azpiroz et al., (1998), Plant Cell, 10:219-230; Choe et al,. (1998), Plant Cell, 10:231-243). Jedoch bleiben die Mechanismen, durch die Pflanzenhormone entweder einzeln oder konzertiert zur Kontrolle der Zellelongation wirken, unklar.
Ein Weg, die Mechanismen, die die Zellelongation vermitteln, zu verstehen, ist es, Mutanten, bei denen dieser Aspekt des Pflanzenwachstums beeinträchtigt ist, zu studieren (Klee et al., (1991), Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 42:529-551). Zahlreiche derartige Mutanten sind über die meisten Pflanzenarten, einschließlich Mais, hinweg identifiziert worden, in denen mehr als 25 Einzelgenmutationen, die die Pflanzenstatur beeinflussen, charakterisiert worden sind (Coe et al,. (1988), in: Corn & Corn Improvement, G.F. Sprague (Hrsg.) Madison, WI; Sheridan, W.F., (1988), Annu. Rev. Genet., 22:353-385). Diese zwergwüchsigen Mutanten werden als GA-abhängig angesehen, hauptsächlich weil GA das einzige Phytohormon ist, dessen Rolle bei der Regulation der Größe in Mais in überzeugender Weise etabliert worden ist (Phinney et al., (1985), Curr. Top. Plant Biochem. Physiol., 4:67-74; Fujioka et al., (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:9031-9035). Beide Typen von Mutanten, GA-reaktive und GA-nicht-rekative, sind in dieser Sammlung von Maismutanten gefunden worden. Während Gene für eine Zahl von GA-reaktiven Mutanten kloniert worden sind und gefunden wurde, dass sie mit der GA-Biosynthese zusammenhängen (Sensen et al,. (1995), Plant Cell, 7:75-84; Winkler et al., (1995), Plant Cell, 7:1307-1317) ist nichts über die Natur der Defekte bei GA-nicht-reaktiven Maismutanten bekannt.
Ein Typ von GA-nicht-reaktiven zwergwüchsigen Mutanten, die eine große Aufmerksamkeit seitens Maisgenetikern und -züchtern erhalten haben, wird brachytisch bzw. zwergwüchsig durch Internodienverkürzung ("brachytic") genannt. Diese Zwergformen sind durch Internodien von wesentlich verringerter Länge relativ zum Wildtyp gekennzeichnet, wobei keine (Aus-) Wirkung auf die Größe oder Zahl an anderen Organen, einschließlich der Blätter, des Kolbens bzw. der Ähre und der Fahne besteht (Kempton, J.H., (1920), J. Hered., 11:111-115). Es gibt drei bekannte brachytische Mutationen im Mais, br1, br2 und br3, wobei alle von diesen rezessiv sind (Coe et al., (1988) in: Corn & Corn Improvement, G.F. Sprague (Hrsg.) Madison, WI; Sheridan, W.F., (1988), Annu. Rev. Genet., 22:353-385). Wegen des kommerziellen Interesses an br2 zur Verstärkung der Pflanzenproduktivität (Pendleton et al., (1961), Crop Sci., 1:433-435; Duvick, D.N., (1977), Maydica, 22:187-196; Djisbar et al., (1987), Maydica, 32:107-123, Russel, W.A., (1991), Adv. Agron., 46:245-298) ist diese Zwergform am genauesten charakterisiert worden. Abhängig vom genetischen Hintergrund sind Pflanzen, die hinsichtlich br2 homozygot rezessiv sind, um 30-70% kürzer als ihre normalen Verwandten. Diese Verringerung der Pflanzengröße liegt ausschließlich an einer Verringerung der Länge der Stängel (Stamm) -Internodien. Zusätzlich zu ihrer Zwergwüchsigkeit leiden unter Gewächshausbedingungen gezüchtete br2-Mutanten oft an "buggy whip", einem krankheitsähnlichen Zustand, bei dem die sich entfaltenden Blätter im Blattquirl einer Nekrose unterliegen und miteinander verklebt bleiben. Dieser Zustand resultiert oft im Absterben der Wachstumsspitze der Pflanze.
Um mit dem Bedarf an einer erhöhten landwirtschaftlichen Produktion Schritt zu halten, werden neue Ziele zur gentechnischen Veränderung von agrikulturellen Pflanzen zur Verbesserung der agronomischen Merkmale benötigt. Die Aufklärung der molekularen Mechanismen der Zellteilung und -elongation wird für agrikulturelle Wissenschaftler neu zu manipulierende bzw. zu verändernde Ziele bereitstellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Bereitgestellt werden Zusammensetzungen und Verfahren zum Exprimieren von Genen, die für P-Glycoproteine der Erfindung codieren, in Pflanzen. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen Nukleotidsequenzen, die für P-Glycoproteine der Erfindung codieren. Insbesondere stellt die Erfindung Nukleotidsequenzen für das br2-Gen von Mais bereit. Die Sequenzen der Erfindung sind nützlich beim Transformieren von Pflanzen bezüglich gewebebevorzugter oder konstitutiver Expression und finden Verwendung in Verfahren zum Kontrollieren des Wachstums von Pflanzen, insbesondere von Stamm- bzw. Stängel- bzw. Halmwachstum.
Die Erfindung stellt bereit:
ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:

(a) einer in SEQ ID NO: 1 angegebenen Nukleotidsequenz;
(b) einer in SEQ ID NO: 2 angegebenen Nukleotidsequenz;
(c) einer Nukleotidsequenz, bestehend aus wenigstens 30 zusammenhängenden Nukleotiden der in SEQ ID NO: 1 angegebenen Sequenz, wobei die Nukleotidsequenz für ein P-Glycoprotein codiert, das Pflanzenwachstum kontrolliert;
(d) einer Nukleotidsequenz, bestehend aus wenigstens 30 zusammenhängenden Nukleotiden der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Sequenz, wobei die Nukleotidsequenz für ein P-Glycoprotein codiert, das Pflanzenwachstum kontrolliert;
(e) einer Nukleotidsequenz, die für die in SEQ ID NO: 3 angegebene Aminosäuresequenz codiert;
(f) einer Nukleotidsequenz, die für wenigstens 58 zusammenhängende Aminosäuren der in SEQ ID NO: 3 angegebenen Aminosäuresequenz codiert, wobei die Nukleotidsequenz für ein P-Glycoprotein codiert, das Pflanzenwachstum kontrolliert;
(g) einer Nukleotidsequenz, umfassend wenigstens 70% Identität zu der in SEQ ID NO: 1 angegebenen Sequenz, wobei die Nukleotidsequenz für ein P-Glycoprotein codiert, das Pflanzenwachstum kontrolliert;
(h) einer Nukleotidsequenz, umfassend wenigstens 70% Identität zu der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Nukleotidsequenz, wobei die Nukleotidsequenz für ein P-Glycoprotein codiert, das Pflanzenwachstum kontrolliert;
(i) einer Nukleotidsequenz, die zu der Nukleotidsequenz von einer beliebigen von (a)-(h) komplementär ist; und
(j) einer Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleotidsequenz von (a) oder (b) oder der komplementären Sequenz von (a) oder (b) hybridisiert, wobei die stringenten Bedingungen Hybridisierung in einer Lösung, umfassend 50% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS, bei 37°C und einen Waschschritt in 0,1 X SSC bei 60°C umfassen und die Nukleotidsequenz für ein P-Glycoprotein codiert, das Pflanzenwachstum kontrolliert; und – ein Verfahren zur Modifizierung des Wachstums einer Pflanze, wobei das Verfahren Transformieren einer Pflanze mit einer Nukleotidsequenz, die für ein P-Glycoprotein codiert, umfasst, wobei das P-Glycoprotein zum Kontrollieren des Wachstums einer Pflanze wirkt, wobei die Nukleotidsequenz mit einem Promotor, der zum Steuern der Expression der Sequenz in der Pflanze fähig ist, funktionell verknüpft ist; wobei die Nukleotidsequenz eine erfindungsgemäße Sequenz ist.

Expressionskassetten, die erfindungsgemäße Sequenzen umfassen, werden ebenfalls bereitgestellt.
Weiterhin werden transformierte Pflanzen, Pflanzengewebe, Pflanzenzellen und Samen davon bereitgestellt.
Isolierte Proteine, die durch die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen codiert werden, werden bereitgestellt. Demnach stellt die Erfindung ebenfalls bereit:

– ein isoliertes Protein, umfassend ein Mitglied, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einem Polypeptid, das die in SEQ ID NO: 3 angegebene Aminosäuresequenz umfasst; (b) einem Polypeptid, das aus wenigstens 58 zusammenhängenden Aminosäuren der in SEQ ID NO: 3 angegebenen Aminosäuresequenz besteht, wobei das Polypeptid ein P-Glycoprotein ist, das Pflanzenwachstum kontrolliert; und (c) einem Polypeptid, das durch eine in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 angegebene Nukleotidsequenz codiert wird; (d) einem Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die wenigstens 70% Identität zu der Aminosäuresequenz von (a) umfasst, wobei das Polypeptid ein P-Glycoprotein ist, das Pflanzenwachstum kontrolliert.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUR
1 erläutert schematisch den 7,0 kb großen genomischen XhoI-Mais-Klon, der den Großteil des Br2-Gens enthält. Orte von Mu-Element-Insertionen sind für die br2-3-, br2-6- und br2-9-Allele, sowie für das neue Transposon in br2-5 angegeben.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die Kontrolle des Stamm- bzw. Stängel- bzw. Halmwachstums in Pflanzen. Somit werden transformierte Pflanzen, Pflanzenzellen, Pflanzengewebe und Samen, umfassend erfindungsgemäße Nukleinsäuren, bereitgestellt.
Erfindungsgemäße Zusammensetzungen umfassen die nativen Nukleotidsequenzen für das P-Glycoprotein-Gen des Mais-Br2-Lokus und die betreffende Aminosäuresequenz für das dadurch codierte P-Glycoprotein, sowie Fragmente und Varianten davon. Die Br2-Sequenzen sind in den SEQ ID NOS: 1-3 angegeben. Die Sequenzen oder die entsprechenden Antisense- bzw. Gegensinn-Sequenzen finden Verwendung beim Modulieren der Expression eines P-Glycoproteins in einer Pflanze oder einer Pflanzenzelle. Das heißt, die codierenden Sequenzen können zur Erhöhung der Expression verwendet werden, während Antisense-Sequenzen zur Verringerung der Expression verwendet werden können.
In einer Ausführungsform der Erfindung finden die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen Verwendung in Verfahren zum Modifizieren des Pflanzenwachstums. Dazu können die erfindungsgemäßen Sequenzen in Expressionskassetten oder Nukleotidkonstrukten verwendet werden, funktionell verknüpft mit einem beliebigen aus einer Vielzahl von Pflanzenpromotoren. Aspekte des Pflanzenwachstums, die durch die erfindungsgemäßen Verfahren beeinflusst werden können, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Pflanzengröße; die Größe, Form und Zahl von Zellen und Organen; die Zellteilungsrate; die Zellelongationsrate; die Wachstumsrate der Pflanze, ihrer Organe, Gewebe und Zellen; die zeitliche Abstimmung ("timing") und Lokalisierung der Organinitiation; die Lebensdauer und dergleichen.
Die Erfindung offenbart Verfahren zur Verringerung des Pflanzenwachstums, die als Alternativen zur Anwendung synthetischer wachstumsverzögernder Chemikalien auf Pflanzen Anwendung finden. Diese Verfahren stellen umweltverträgliche ("environmentally safe") Alternativen zu herkömmlichen Mitteln der Verzögerung des/der Stamm- bzw. Stängel- bzw. Halmstreckung oder -Wachstums mit synthetischen Chemikalien bereit. Bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwenden Pflanzen, die mit Gewebe-bevorzugten Promotoren, insbesondere Stamm- bzw. Stängel- bzw. Halm-bevorzugten Promotoren, funktionell verknüpft mit erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen, transformiert sind.
Erfindungsgemäße Verfahren umfassen die Transformation von Pflanzen mit erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen zur Verringerung des Pflanzenwachstums. Die Nukleotidsequenzen können entweder in Sinn- bzw. Sense- oder Gegensinn- bzw. Antisense-Orientierung verwendet werden, um den Spiegel eines endogenen P-Glycoproteins, das das Wachstum einer Pflanze kontrolliert, zu supprimieren. Durch Reduzieren des Spiegels eines derartigen P-Glycoproteins, insbesondere eines P-Glycoproteins, das das Stamm- oder Stängelwachstum kontrolliert, in einer Pflanze, kann eine Pflanze mit verringerter bzw. verkleinerter Statur, eine zwergwüchsige Pflanze, erzeugt werden. Zwergwüchsige Pflanzen mit verbesserten agronomischen Merkmalen, wie z.B. einem verringerten Potential zum Niederlegen, einer erhöhten Wasserverwendungseffizienz, einem reduzierten bzw. verkürzten Lebenszyk lus, einer erhöhten Ernteeffizienz und einem erhöhten Ertrag pro Flächeneinheit, werden mittels dieser Verfahren erhalten. Die erfindungsgemäßen Verfahren können die Notwendigkeit des Pfropfens von Trieben von Obstbäumen auf verzwergende Unterlagen zur Erzeugung von zwergwüchsigen Obstbäumen eliminieren.
Die erfindungsgemäßen Verfahren finden Verwendung in der Erzeugung von zwergwüchsigen Variationen von Nutzpflanzen. In einer Ausführungsform der Erfindung wird eine zwergwüchsige Basmati-Reispflanze erzeugt, indem die Pflanze mit einer erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz transformiert wird. Basmatireis, bekannt für seinen aromatischen Duft, seine schlanken, länglichen Körner und seine relativ kurze Kochzeit, ist der bevorzugte Reistyp der Mehrheit der Bevölkerung auf dem indischen Subkontinent. Während kommerziell annehmbare zwergwüchsige Kultivare für andere Reistypen entwickelt worden sind, sind frühere Versuche, kommerziell annehmbare Varietäten von Basmatireis mittels traditioneller Pflanzenzüchtungsverfahren zu erzeugen, gescheitert. Während zwergwüchsige Pflanzen bei derartigen Versuchen erhalten wurden, wurden einige der unterscheidenden Kornmerkmale, die Konsumenten bei Basmatireis erwarten, in den zwergwüchsigen Pflanzen nicht beibehalten. Die erfindungsgemäßen Verfahren stellen ein Mittel zur Herstellung zwergwüchsiger Basmatireispflanzen bereit, die ein Korn produzieren, das die von den Konsumenten gewünschten Merkmale besitzt.
Die gewünschten zwergwüchsigen Basmatireispflanzen werden hergestellt, indem eine nicht-zwergwüchsige Basmatireispflanze mit einer erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz, funktionell verknüpft mit einem Promotor, der die Expression in einer Pflanze steuert, transformiert wird. Während die Auswahl von Promotoren vom gewünschten Ergebnis abhängt, sind die bevorzugten Promotoren Gewebe-bevorzugte Promotoren, insbesondere Stamm- bzw. Stängel- bzw. Halm-bevorzugte Promotoren. Durch Co-Suppression oder Antisense-Suppression produzieren derartige Pflanzen verringerte Spiegel von wenigstens einem P-Glycoprotein, das das Wachstum der Reispflanze, insbesondere das Stängel- bzw. Halmwachstum, kontrolliert.
Mit "mutantem Phänotyp" ist ein beliebiger Nicht-Wildtyp-, nicht-typischer oder Nicht-Standardphänotyp gemeint, der als Ergebnis einer genetischen Veränderung im Genom eines Organismus auftritt. Wenn unter Bezug auf domestizierte Pflanzen und Tiere verwendet, ist ein "mutanter Phänotyp" ein beliebiger Phänotyp, der vom typischen Phänotyp der be stimmten domestizierten Züchtung oder kultivierten Varietät, aus der der mutierte Phänotyp entstammt, wesentlich verschieden ist.
Mit "mutante Pflanze" ist eine Pflanze mit einem mutanten Phänotyp gemeint. Mit "mutantes Allel" ist ein Allel eines Gens gemeint, das dazu fähig ist, einen "mutanten Phänotyp" zu verursachen.
Mit "zwergwüchsig" ist atypisch klein gemeint. Mit "zwergwüchsige Pflanze" ist eine atypisch kleine Pflanze gemeint. Im Allgemeinen weist eine derartige "zwergwüchsige Pflanze" eine Statur oder Größe auf, die von der einer typischen Pflanze um näherungsweise 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% oder mehr verringert ist. Im Allgemeinen, aber nicht ausschließlich, ist eine derartige zwergwüchsige Pflanze im Vergleich zur typischen Pflanze durch eine verringerte Halm-, Stängel- oder Stammlänge gekennzeichnet.
Mit "Nukleotidmolekül" ist ein Molekül gemeint, zusammengesetzt aus Nukleotiden, die kovalent aneinander gebunden sind. Nukleotide umfassen sowohl Ribonukleotide als auch Desoxyribonukleotide. "Nukleotidmolekül" umfasst einzelsträngige und doppelsträngige Formen von sowohl DNA als auch RNA. "Nukleotidmoleküle" können natürlicherweise vorkommend, synthetisch oder eine Kombination von beiden sein. Die lineare Anordnung von Nukleotiden in einem "Nukleotidmolekül" wird als eine "Nukleotidsequenz" bezeichnet und wird hierin, sofern nicht anders angegeben, von links nach rechts entsprechend der 5'-nach-3'-Richtung angegeben. Aufgrund der komplementären Natur der entgegengesetzten Stränge eines doppelsträngigen Nukleotidmoleküls umfasst eine erfindungsgemäße Nukleotidsequenz weiterhin ihre komplementäre Antisense-Sequenz.
Erfindungsgemäße Zusammensetzungen umfassen native Nukleotidsequenzen für Gene, codierend für Mehrwirkstoffresistenz-ähnliches-Gen-codierte P-Glycoproteine ("multidrug-resistance-like-gene-encoded P-glycoproteins"), Homologe von Mehrwirkstoffresistenz-ähnliches-Gen-codierten P-Glycoproteinen, Antisense-Sequenzen, sowie Fragmente und Varianten und Fragmente davon. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung isolierte Nukleinsäuremoleküle bereit, umfassend Nukleotidsequenzen, die für die in SEQ ID NO: 3 angegebenen Aminosäuresequenzen codieren. Ferner werden Polypeptide bereitgestellt, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, codiert durch ein hierin beschriebenes Nukleinsäuremolekül, z.B. jene, die in SEQ ID NOS: 1 und 2 angegeben sind, und Fragmente und Varianten davon.
Die Erfindung umfasst isolierte oder im Wesentlichen gereinigte Nukleinsäure- oder Proteinzusammensetzungen. Ein "isoliertes" oder "gereinigtes" Nukleinsäuremolekül oder Protein oder ein biologisches aktiver Teil davon ist im Wesentlichen frei von anderem zellulären Material oder Kulturmedium, wenn es mittels Rekombinationstechniken produziert wird, oder im Wesentlichen frei von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien, wenn es chemisch synthetisiert wird. Vorzugsweise ist eine "isolierte" Nukleinsäure frei von Sequenzen (vorzugsweise Protein-codierenden Sequenzen), die die Nukleinsäure natürlicherweise in der genomischen DNA des Organismus, aus dem die Nukleinsäure stammt, flankieren (d.h. Sequenzen, die an den 5'- und 3'-Enden der Nukleinsäure lokalisiert sind). Zum Beispiel kann das isolierte Nukleinsäuremolekül in zahlreichen Ausführungsformen weniger als näherungsweise 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb der Nukleotidsequenzen enthalten, die das Nukleinsäuremolekül in genomischer DNA der Zelle, aus der die Nukleinsäure stammt, natürlicherweise flankieren. Ein Protein, das im Wesentlichen frei von zellulärem Material ist, umfasst Zubereitungen von Protein mit weniger als etwa 30%, 20%, 10%, 5% (bezogen auf das Trockengewicht) an kontaminierendem Protein. Wenn das erfindungsgemäße Protein oder ein biologisch aktiver Teil davon rekombinant hergestellt wird, macht das Kulturmedium vorzugsweise weniger als näherungsweise 30%, 20%, 10% oder 5% (bezogen auf das Trockengewicht) der chemischen Vorläufer oder Chemikalien, die nicht das Protein von Interesse sind, aus.
Fragmente und Varianten der offenbarten Nukleotidsequenzen und der dadurch codierten Proteine sind auch von der vorliegenden Erfindung umfasst. Mit "Fragment" ist ein Teil der Nukleotidsequenz oder ein Teil der Aminosäuresequenz und folglich das dadurch codierte Protein gemeint. Fragmente einer Nukleotidsequenz können für Proteinfragmente, die die biologische Aktivität des nativen erfindungsgemäßen P-Glycoproteins beibehalten, und folglich ein oder mehrere Funktionen des nativen P-Glycoproteins, wie z.B. Transmembrantransporteraktivität und ATP-Bindung, beibehalten, codieren.
Ein Fragment einer P-Glycoproteingen-Nukleotidsequenz, die für einen biologisch aktiven Teil eines P-Glycoproteins der Erfindung codiert, wird für wenigstens 15, 25, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200 oder 1.300 zusammenhängende Aminosäuren oder für bis zur Gesamtzahl von Aminosäuren, die in einem Volllängen-P-Glycoprotein der Erfindung vorhanden ist (z.B. 1.394 Aminosäuren für SEQ ID NO: 3), codieren. Fragmente einer P-Glycoproteingen-Nukleotidsequenz, die als Hybridisierungssonden für PCR-Primer verwendbar sind, müssen im Allgemeinen nicht einen biologisch aktiven Teil eines P-Glycoproteins codieren.
Ein biologisch aktiver Teil eines P-Glycoproteins kann hergestellt werden durch Isolieren eines Teils von einer der erfindungsgemäßen P-Glycoproteingen-Nukleotidsequenzen, Exprimieren des codierten Teils des P-Glycoproteins, z.B. mittels rekombinanter Expression in vitro, und Bewertung bzw. Feststellung der Aktivität des Teils des P-Glycoproteins. Nukleinsäuremoleküle, die Fragmente einer P-Glycoproteingen-Nukleotidsequenz sind, umfassen wenigstens 30, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 500, 700, 1.000, 1.500, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000 oder 8.000 Nukleotide oder bis zur Zahl der Nukleotide, die in einer hierin offenbarten Volllängen-P-Glycoprotein-Nukleotidsequenz vorhanden sind (z.B. 8.036 und 4.653 Nukleotide für die SEQ ID NOS: 1 bzw. 2).
Mit "Varianten" sind im Wesentlichen ähnliche Sequenzen gemeint. Für Nukleotidsequenzen umfassen konservative Varianten jene Sequenzen, die wegen der Degeneriertheit des genetischen Codes für die Aminosäuresequenz von einem der erfindungsgemäßen P-Glycoprotein-Polypeptide codieren. Natürlicherweise vorkommende allelische Varianten, wie jene, können durch Verwendung gut bekannter molekularbiologischer Techniken, wie z.B. mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) und Hybridisierungstechniken, wie unten dargelegt, identifiziert werden. Variante Nukleotidsequenzen umfassen auch synthetisch abgeleitete Nukleotidsequenzen, wie z.B. jene, die mittels Anwendung von ortsspezifischer Mutagenese erzeugt werden, die aber noch für ein erfindungsgemäßes P-Glycoprotein-Protein codieren. Im Allgemeinen werden Varianten einer bestimmten Nukleotidsequenz der Erfindung wenigstens 70%, im Allgemeinen wenigstens näherungsweise 75%, 80%, 85%, vorzugsweise wenigstens näherungsweise 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% und stärker bevorzugt wenigstens näherungsweise 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der bestimmten Nukleotidsequenz aufweisen, wie mittels Sequenzalignmentprogrammen, hierin andernorts beschrieben, unter Verwendung von Standard- bzw. Defaultparametern, bestimmt.
Mit "variantes" Protein ist ein Protein gemeint, das von dem nativen Protein durch Deletion (sogenannte Trunkierung) oder Addition von einer oder mehreren Aminosäuren zum N-terminalen und/oder C-terminalen Ende des nativen Proteins; Deletion oder Addition von einer oder mehreren Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen im nativen Protein oder Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen im nativen Protein abgeleitet ist. Variante Proteine, die von der vorliegenden Erfindung umfasst sind, sind biologisch aktiv, d.h. sie besitzen weiterhin die gewünschte biologische Aktivität des nativen Proteins, d.h. Transporteraktivität oder ATP-Bindungsaktivität, wie hierin beschrieben. Derartige Varianten können z.B. aus einem genetischen Polymorphismus oder aus einer menschlichen Manipulation resultieren. Biologisch aktive Varianten gemäß der Erfindung werden wenigstens 70%, im Allgemeinen wenigstens näherungsweise 75%, 80%, 85%, vorzugsweise wenigstens näherungsweise 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, und stärker bevorzugt wenigstens näherungsweise 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zur Aminosäuresequenz für das native Protein aufweisen, wie mittels Sequenzalignmentprogrammen, hierin andernorts beschrieben, unter Verwendung von Defaultparametern bestimmt. Eine biologisch aktive Variante eines erfindungsgemäßen Proteins kann sich von diesem Protein durch nur 1-15 Aminosäurereste, nur 1-10, z.B. 6-10, nur 5, nur 4, 3, 2 oder sogar 1 Aminosäurerest unterscheiden.
Die erfindungsgemäßen Proteine können auf zahlreiche Weisen, einschließlich Aminosäuresubstitutionen, -deletionen, -trunkierungen und -insertionen, verändert sein. Verfahren für derartige Manipulationen sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt. Zum Beispiel können Aminosäuresequenzvarianten der P-Glycoproteine durch Mutationen in der DNA hergestellt werden. Verfahren zur Mutagenese und für Nukleotidsequenzänderungen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Siehe z.B. Kunkel, (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488-492; Kunkel et al., (1987), Methods in Enzymol., 154:367-382; US-Patent Nr. 4,873,192 ; Walker und Gaastra, Hrsg., (1983), Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York) und die darin genannten Referenzen. Eine Anleitung hinsichtlich geeigneter Aminosäuresubstitutionen, die die biologische Aktivität des Proteins von Interesse nicht beeinträchtigen, kann im Modell von Dayhoff et al., (1978), Atlas of Protein Sequence and Structure, (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.) gefunden werden. Konservative Substitutionen, wie z.B. der Austausch einer Aminosäure durch eine andere mit ähnlichen Eigenschaften, können bevorzugt sein.
Somit umfassen die erfindungsgemäßen Gene und Nukleotidsequenzen sowohl die natürlicherweise auftretenden Sequenzen als auch mutante Formen. Gleichermaßen umfassen die erfindungsgemäßen Proteine sowohl natürlicherweise auftretende Proteine als auch Variationen und modifizierte Formen davon. Derartige Varianten werden die gewünschte Transportaktivität weiterhin besitzen. Offensichtlicherweise dürfen die Mutationen, die in der für die Variante codierenden DNA gemacht werden, die Sequenz nicht aus dem Leseraster ver schieben und werden vorzugsweise keine komplementären Regionen schaffen, die eine sekundäre mRNA-Struktur bzw. mRNA-Sekundärstruktur erzeugen könnten. Siehe die EP-Patentanmeldung, Veröffentlichungsnummer 75.444.
Es wird nicht angenommen, dass die Deletionen, Insertionen und Substitutionen der Proteinsequenzen, die hierin umfasst sind, radikale Veränderungen der Merkmale des Proteins erzeugen. Wenn es jedoch schwierig ist, die genaue Wirkung der Substitution, Deletion oder Insertion vor der Durchführung vorherzusagen, wird der Fachmann auf dem Gebiet verstehen, dass die Wirkung mittels Routine-Screeningassays bewertet wird.
Variante Nukleotidsequenzen und Proteine umfassen auch Nukleotidsequenzen und Proteine, stammend aus einer mutagenen und Rekombinations-erzeugenden ("recombinogenic") Verfahrensweise, wie z.B. DNA-Shuffling. Mit einer derartigen Verfahrensweise können ein oder mehrere verschiedene P-Glycoprotein-codierende Sequenzen manipuliert werden, um eine variante Nukleotidsequenz zu schaffen, die für ein variantes P-Glycoprotein codiert, das die gewünschten Eigenschaften besitzt. Auf diese Weise werden Bibliotheken von rekombinanten Polynukleotiden erzeugt aus einer Population Sequenz-verwandter Polynukleotide, umfassend Sequenzregionen, die eine wesentliche Sequenzidentität aufweisen und die in vitro oder in vivo homolog rekombiniert werden können. Zum Beispiel können unter Anwendung dieser Herangehensweise Sequenzmotive, die für eine Domäne von Interesse codieren, zwischen das erfindungsgemäße P-Glycoproteingen und andere bekannte P-Glycoproteingene eingebracht bzw. eingeschoben ("shuffled") werden, um ein neues Gen zu erhalten, das für ein Protein mit einer verbesserten Eigenschaft von Interesse, wie z.B. einer erhöhten K_m im Falle eines Enzyms, codiert. Strategien für ein derartiges DNA-Shuffling sind auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe z.B. Stemmer, (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:10747-10751; Stemmer, (1994), Nature, 370:389-391; Crameri et al., (1997), Nature Biotech., 15:436-438; Moore et al. (1997), J. Mol. Biol., 272:336-347; Zhang et al., (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:4504-4509; Crameri et al., (1998), Nature, 391:288-291; und die US-Patente Nrn. 5,605,793 und 5,837,458 .
Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen können verwendet werden, um entsprechende Sequenzen aus anderen Organismen, insbesondere Pflanzen, spezieller anderen Monokotylen, zu isolieren. Auf diese Weise können Verfahren, wie PCR, Hybridisierung und dergleichen verwendet werden, um derartige Sequenzen auf der Basis ihrer Sequenzhomologie mit den hierin angegebenen Sequenzen zu identifizieren. Sequenzen, isoliert auf der Basis ihrer Sequenzidentität mit den gesamten Sequenzen, die hierin angegeben sind oder mit Fragmenten davon sind von der vorliegenden Erfindung umfasst. Derartige Sequenzen umfassen Sequenzen, die Orthologe der offenbarten Sequenzen sind. Mit "Orthologe" sind Gene gemeint, die von einem gemeinsamen anzestralen Gen abgeleitet sind bzw. abstammen und die als Ergebnis der Artbildung in unterschiedlichen Arten gefunden werden. Gene, die in verschiedenen Arten gefunden werden, werden als Orthologe angesehen, wenn ihre Nukleotidsequenzen und/oder ihre codierten Proteinsequenzen eine wesentliche Identität, wie hierin andernorts definiert, gemeinsam haben. Funktionen von Orthologen sind zwischen Arten oft in hohem Maße konserviert.
Bei einer PCR-Herangehensweise können Oligonukleotidprimer zur Verwendung in PCR-Reaktionen zum Amplifizieren entsprechender DNA-Sequenzen aus cDNA oder genomischer DNA, extrahiert aus einem beliebigen Organismus von Interesse, konzipiert ("designed") werden. Verfahren zum Konzipieren von PCR-Primern und zum PCR-Klonieren sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt und sind offenbart in Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). Siehe auch Inns et al., Hrsg., (1990), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Inns und Gelfand, Hrsg., (1995), PCR Strategies (Academic Press, New York); und Innis und Gelfand, Hrsg. (1999), PCR Methods Manual (Academic Press, New York). Bekannte Verfahren der PCR umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Verfahren unter Verwendung gepaarter Primer, ineinander geschachtelter bzw. "nested" Primer, einzelner spezifischer Primer, degenerierter Primer, Gen-spezifischer Primer, Vektor-spezifischer Primer, partiell fehlgepaarter Primer und dergleichen.
Bei Hybridisierungstechniken wird eine gesamte oder ein Teil einer bekannten Nukleotidsequenz als Sonde verwendet, die selektiv mit anderen entsprechenden Nukleotidsequenzen hybridisiert, die in einer Population klonierter genomischer DNA-Fragmente oder cDNA-Fragmente (d.h. genomische oder cDNA-Bibliotheken) aus einem gewählten Organismus vorhanden sind. Die Hybridierungssonden können genomische DNA-Fragmente, cDNA-Fragmente, RNA-Fragmente oder andere Oligonukleotide sein, und können mit einer detektierbaren Gruppe, wie ³²P oder einem anderen detektierbaren Marker markiert sein. Somit können z.B. Sonden zur Hybridisierung hergestellt werden durch Markierung synthetischer Oligonukleotide auf der Basis der P-Glycoproteingen-Nukleotidsequenzen der Erfindung.
Verfahren zur Herstellung von Sonden zur Hybridisierung und zur Konstruktion von cDNA- und genomischen Bibliotheken sind allgemein auf dem Fachgebiet bekannt und sind offenbart sind Sambrook et al,. (1989), Molecular Cloning: A Laborstory Manual (2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laborstory Press, Plainview, New York).
Zum Beispiel kann eine gesamte Br2-Sequenz, die hierin offenbart ist, oder können ein oder mehrere Teile davon als Sonde verwendet werden, die dazu fähig ist, mit entsprechenden P-Glycoprotein-Gensequenzen und -Messenger-RNAs spezifisch zu hybridisieren. Um eine spezifische Hybridisierung unter einer Vielfalt von Bedingungen zu erreichen, umfassen derartige Sonden Sequenzen, die unter P-Glycoprotein-Gensequenzen einzigartig sind und sind vorzugsweise wenigstens näherungsweise 10 Nukleotide lang und stärker bevorzugt wenigstens näherungsweise 20 Nukleotide lang. Derartige Sonden können verwendet werden, um entsprechende P-Glycoprotein-Gensequenzen aus einer gewählten Pflanze mittels PCR zu amplifizieren. Diese Technik kann zum Isolieren weiterer codierender Sequenzen aus einer gewünschten Pflanze oder als ein diagnostischer Assay zum Feststellen des Vorhandenseins von codierenden Sequenzen in einer Pflanze verwendet werden. Hybridisierungstechniken umfassen das Hybridierungsscreening von ausplattierten DNA-Bibliotheken (entweder Plaques oder Kolonien; siehe z.B. Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning: A Laborstory Manual (2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laborstory Press, Plainview, New York).
Die Hybridisierung derartiger Sequenzen kann unter stringenten Bedingungen durchgeführt werden. Mit "stringenten Bedingungen" oder "stringenten Hybridisierungsbedingungen" sind Bedingungen gemeint, unter denen eine Sonde mit ihrer Zielsequenz in einem detektierbaren größeren Ausmaß als mit anderen Sequenzen hybridisieren wird (z.B. wenigstens zweifach über dem Hintergrund). Stringente Bedingungen sind sequenzabhängig und werden unter verschiedenen Umständen unterschiedlich sein. Durch Kontrollieren der Stringenz der Hybridisierungs- und/oder Waschbedingungen können Zielsequenzen, die 100% komplementär zur Sonde sind, identifiziert werden (homologe Durchmusterung mittels Sonde bzw. "homologous probing"). Alternativ können die Stringenzbedingungen angepasst werden, um etwas Fehlpaarung in den Sequenzen zu ermöglichen, so dass geringere Grade der Ähnlichkeit bzw. Similarität detektiert werden (heterologe Durchmusterung mittels Sonde bzw. "heterologous probing"). Im Allgemeinen ist eine Sonde weniger als näherungsweise 1000 Nukleotide lang, vorzugsweise weniger als 500 Nukleotide lang.
Typischerweise werden stringente Bedingungen jene sein, bei denen die Salzkonzentration weniger als näherungsweise 1,5 M Na-Ionen-, typischerweise näherungsweise 0,01 bis 1,0 M Na-Ionenkonzentrationen (oder andere Salze) bei pH 7,0 bis 8,3 ist und bei denen die Temperatur wenigstens näherungsweise 30°C für kurze Sonden (z.B. 10 bis 50 Nukleotide) und wenigstens näherungsweise 60°C für lange Sonden (z.B. größer als 50 Nukleotide) ist. Stringente Bedingungen können auch durch Zugabe von destabilisierenden Mitteln, wie z.B. Formamid, erzielt werden. Beispielhafte Bedingungen niedriger Stringenz umfassen Hybridisierung mit einer Pufferlösung von 30 bis 35% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS (Natriumdodecylsulfat) bei 37°C und einen Waschschritt in 1X bis 2X SSC (20X SSC = 3,0 M NaCl/0,3 M Trinatriumcitrat) bei 50 bis 55°C. Beispielhafte Bedingungen moderater bzw. mäßiger Stringenz umfassen Hybridisierung in 40 bis 45% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS bei 37°C und einen Waschschritt in 0,5X bis 1X SSC bei 55 bis 60°C. Beispielhafte Bedingungen hoher Stringenz umfassen eine Hybridisierung in 50% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS bei 37°C und einen Waschschritt in 0,1X SSC bei 60 bis 65°C. Die Dauer der Hybridisierung beträgt im Allgemeinen weniger als näherungsweise 24 Stunden, üblicherweise näherungsweise 4 bis näherungsweise 12 Stunden.
Die Spezifität ist eine typische Funktion der Waschschritte nach der Hybridisierung, wobei die kritischen Faktoren die Ionenstärke und Temperatur der abschließenden Waschlösung sind. Für DNA-DNA-Hybride kann die T_m aus der Gleichung von Meinkoth und Wahl, (1984), Anal. Biochem., 138:267-284: T_m = 81,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (% GC) – 0,61 (% Form.) – 500/L; worin M die Molarität der einwertigen Kationen ist; % GC der prozentuale Anteil von Guanosin- und Cytosinnukleotiden in der DNA ist, % Form. der prozentuale Anteil von Formamid in der Hybridisierungslösung ist und L die Länge des Hybrids in Basenpaaren ist. Die T_m ist die Temperatur (unter definierter Ionenstärke und unter definiertem pH), bei der 50% einer komplementären Zielsequenz mit einer perfekt übereinstimmenden bzw. gepaarten Sonde hybridisiert werden. Die T_m wird um näherungsweise 1°C für je 1% Fehlpaarung verringert; somit können die T_m, die Hybridisierungs- und/oder die Waschbedingungen angepasst werden, um mit Sequenzen der gewünschten Identität zu hybridisieren. Wenn z.B. Sequenzen mit > 90% Identität gesucht werden, kann die T_m um 10°C verringert werden. Im Allgemeinen sind stringente Bedingungen so gewählt, dass sie näherungsweise 5°C niedriger sind als der thermische Schmelzpunkt (T_m) für die spezifische Sequenz und ihr Komplement bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH. Jedoch können streng stringente Bedingungen eine Hybridisierung und/oder einen Waschschritt bei 1, 2, 3 oder 4°C unter dem thermischen Schmelzpunkt (T_m) verwenden; moderat bzw. mäßig stringente Bedingungen können eine Hybridisierung und/oder einen Waschschritt bei 6, 7, 8, 9 oder 10°C unter dem thermischen Schmelzpunkt (T_m) verwenden; Bedingungen geringer Stringenz können eine Hybridisierung und/oder einen Waschschritt bei 11, 12, 13, 14, 15 oder 20°C unter dem thermischen Schmelzpunkt (T_m) verwenden. Unter Verwendung der Gleichung, der Hybridisierungs- und Waschzusammensetzungen und der gewünschten T_m werden Durchschnittsfachleute auf dem Gebiet verstehen, dass Variationen in der Stringenz der Hybridisierungs- und/oder Waschlösungen inhärent beschrieben sind. Falls der gewünschte Grad der Fehlpaarung in einer T_m von weniger als 45°C (wässrige Lösung) oder 32°C (Formamidlösung) resultiert, ist es bevorzugt, die SSC-Konzentration zu erhöhen, so dass eine höhere Temperatur verwendet werden kann. Eine umfangreiche Anleitung hinsichtlich der Hybridisierung von Nukleinsäuren wird gefunden in Tijssen, (1993), Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Teil I, Kapitel 2 (Elsevier, New York); und Ausubel et al., Hrsg., (1995), Current Protocols in Molecular Biology, Kapitel 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). Siehe Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).
Somit sind isolierte Sequenzen, die für P-Glycoproteine codieren und unter stringenten Bedingungen mit den hierin offenbarten P-Glycoprotein-Gensequenzen oder mit Fragmenten davon hybridisieren, von der vorliegenden Erfindung umfasst. Derartige Sequenzen werden wenigstens näherungsweise 70% bis 75%, näherungsweise 80% bis 85% und sogar 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr homolog sein mit den offenbarten Sequenzen. Das heißt, die Sequenzidentität von Sequenzen kann variieren, wobei wenigstens näherungsweise 70% bis 75%, näherungsweise 80% bis 85% und sogar wenigstens näherungsweise 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität gezeigt werden.
Die folgenden Begriffe werden verwendet, um die Sequenzbeziehungen zwischen zwei oder mehr Nukleinsäuren oder Polynukleotiden zu beschreiben: (a) "Referenzsequenz", (b) "Vergleichsfenster", (c) "Sequenzidentität", (d) "Prozentsatz der Sequenzidentität" und (e) "wesentliche Identität".

(a) Wie hierin verwendet, ist eine "Referenzsequenz" eine definierte Sequenz, verwendet als eine Grundlage bzw. Basis für einen Sequenzvergleich. Eine Referenzsequenz kann eine Teilmenge oder die Gesamtheit einer spezifizierten Sequenz sein; z.B. als ein Abschnitt einer Volllängen-cDNA- oder -Gensequenz, oder die komplette cDNA- oder Gensequenz.
(b) Wie hierin verwendet, bezieht sich ein "Vergleichsfenster" ("comparison window") auf einen zusammenhängenden und spezifizierten Abschnitt einer Polynukleotidsequenz, wobei die Polynukleotidsequenz im Vergleichsfenster Additionen oder Deletionen (d.h. Lücken) im Vergleich zur Referenzsequenz (die keine Additionen oder Deletionen umfasst) für ein optimales Alignment der zwei Sequenzen umfassen kann. Im Allgemeinen ist das Vergleichsfenster wenigstens 20 zusammenhängende Nukleotide lang und kann gegebenenfalls 30, 40, 50, 100 oder mehr Nukleotide lang sein. Fachleute auf dem Gebiet verstehen, dass zum Vermeiden einer hohen Ähnlichkeit mit einer Referenzsequenz aufgrund des Einschließens von Lücken in die Polynukleotidsequenz, typischerweise eine Gap Penalty bzw. Lückenstrafe eingeführt und von der Zahl der Übereinstimmungen subtrahiert wird.

Verfahren zum Alignment von Sequenzen zum Vergleich sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Somit kann die Bestimmung der prozentualen Identität zwischen zwei beliebigen Sequenzen unter Verwendung eines mathematischen Algorithmus bewerkstelligt werden. Nicht-einschränkende Beispiele für derartige mathematische Algorithmen sind der Algorithmus von Myers und Miller, (1988) CABIOS 4:11-17; der lokale Homologie-Algorithmus von Smith et al,. (1981), Adv. Appl. Math., 2:482; der Homologie-Alignment-Algorithmus von Needleman und Wunsch, (1970), J. Mol. Biol., 48:443-453; das Suche-nach-Ähnlichkeit-Verfahren von Pearson und Lipman, (1988), Proc. Natl. Acad. Sci., 85:2444-2448; der Algorithmus von Karlin und Altschul, (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 872264, modifiziert wie in Karlin und Altschul, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877.
Computer-Implementierungen dieser mathematischen Algorithmen können zum Vergleich von Sequenzen zur Bestimmung der Sequenzidentität verwendet werden. Derartige Implementierungen umfassen, ohne Beschränkung darauf: CLUSTAL im PC/Gene-Programm (erhältlich von Intelligenetics, Mountain View, Kalifornien); das ALIGN-Programm (Version 2.0) und GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA im Wisconsin-Genetics-Softwarepaket, Version 8 (erhältlich von Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA). Alignments unter Verwendung dieser Programme können unter Verwendung der Default-Parameter bzw. Standard-Parameter durchgeführt werden. Das CLUSTAL-Programm ist gut beschrieben von Higgins et al., (1988), Gene, 73:237-244 (1988); Higgins et al., (1989), CABIOS, 5:151-153; Corpet et al., (1988), Nucleic Acids Res., 16:10881-90; Huang et al., (1992), CABIOS, 8:155-65; und Pearson et al., (1994), Meth. Mol. Biol., 24:307-331. Das ALIGN-Programm basiert auf dem Algorithmus von Myers und Miller (1988), supra. Beim ALIGN-Programm können PAM120 weight residue-Tabelle, eine Gap Length Penalty von 12 und eine Gap Penalty von 4 beim Vergleichen von Aminosäuresequenzen verwendet werden. Die BLAST-Programme von Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol., 215:403 basieren auf dem Algorithmus von Karlin und Altschul (1990), supra. BLAST-Nukleotidrecherchen können mit dem BLASTN-Programm, Score = 100, Wordlength = 12 durchgeführt werden, um Nukleotidsequenzen zu erhalten, die mit einer Nukleotidsequenz, die für ein erfindungsgemäßes Protein codiert, homolog sind. BLAST-Proteinrecherchen können mit dem BLASTX-Programm, Score = 50, Wordlength = 3, durchgeführt werden, um Aminosäuresequenzen zu erhalten, die mit einem erfindungsgemäßen Protein oder Polypeptid homolog sind. Um lückige Alignments ("gapped alignments") für Vergleichszwecke zu erhalten, kann Gapped BLAST (in BLAST 2.0) eingesetzt werden, wie in Altschul et al., (1997), Nucleic Acids Res., 25:3389 beschrieben. Alternativ kann PSI-BLAST (in BLAST 2.0) verwendet werden, um eine schrittweise Recherche durchzuführen, die entfernte Verwandtschaften zwischen Molekülen detektiert. Siehe Altschul et al., (1997), supra. Bei Verwendung von BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST können die Default-Parameter der jeweiligen Programme (z.B. BLASTN für Nukleotidsequenzen, BLASTX für Proteine) verwendet werden. Siehe http://www.ncbi.hlm.nih.gov. Ein Alignment kann auch manuell mittels Untersuchung durchgeführt werden.
Sofern nicht anders angegeben, beziehen sich die hierin angegebenen Sequenzidentitäts/Ähnlichkeits-Werte auf den Wert, der unter Verwendung von GAP Version 10 erhalten wurde, wobei die folgenden Parameter verwendet wurden: % Identität unter Verwendung eines Gap Weight von 50 und eines Length Weight von 3; % Ähnlichkeit ("% similarity") unter Verwendung eines Gap Weight von 12 und eines Length Weight von 4, oder eines gleichwertigen Programms. Mit "gleichwertiges Programm" ist ein beliebiges Sequenzvergleichsprogramm gemeint, das für zwei beliebige fragliche Sequenzen ein Alignment erzeugt, das identische Nukleotid- oder Aminosäurerestpaarungen und eine identische prozentuale Sequenzidentität aufweist, verglichen mit dem durch das bevorzugte Programm erzeugten entsprechenden Alignment.
GAP verwendet den Algorithmus von Needleman und Wunsch, (1970), J. Mol. Biol. 48:443-453, um das Alignment von zwei vollständigen Sequenzen zu finden, das die Zahl von Paarungen maximiert und die Zahl von Lücken minimiert. GAP betrachtet alle möglichen Alignments und Lückenpositionen und erzeugt das Alignment mit der größten Zahl gepaarter Basen und den wenigsten Lücken. Es ermöglicht es, eine Lückenerzeugungsstrafe bzw. "Gap Creation Penalty" und eine Lückenverlängerungsstrafe bzw. "Gap Extension Penalty" in Einheiten gepaarter Basen vorzusehen. GAP muss für jede Lücke, die es einfügt, einen Gewinn aus einer Gap-Creation-Penalty-Zahl erzielen. Falls eine Gap-Extension-Penalty größer als Null gewählt wird, muss GAP zusätzlich für jede eingefügte Lücke einen Gewinn aus der Länge der Lücke mal der Gap-Extension-Penalty erzielen. Standard-Gap-Creation-Penalty-Werte und -Gap-Extension-Penalty-Werte in Version 10 des Wisconsin Genetics Softwarepakets für Proteinsequenzen sind 8 bzw. 2. Für Nukleotidsequenzen ist die Standard-Gap-Creation-Penalty 50, während die Standard-Gap-Extension-Penalty 3 ist. Die Gap-Creation- und Gap-Extension-Penalties können als ganze Zahl ausgedrückt werden, ausgewählt aus der Gruppe ganzer Zahlen, bestehend aus 0 bis 200. Zum Beispiel können die Gap-Creation- und Gap-Extension-Penalties somit 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 oder größer sein.
GAP stellt ein Mitglied der Familie bester Aligments dar. Es kann viele Mitglieder dieser Familie geben, aber kein Mitglied weist eine bessere Qualität auf. GAP zeigt vier Gütefaktoren ("figures of merit") für Alignments an: Qualität ("quality"), Verhältnis ("ratio"), Identität ("identity") und Ähnlichkeit ("similarity"). Die Qualität ist die zum Angleichen der Sequenzen maximierte Metrik. Das Verhältnis ist die Qualität, geteilt durch die Anzahl der Basen im kürzeren Abschnitt. Die prozentuale Identität ist der Prozentsatz der Symbole, die tatsächlich übereinstimmen. Die prozentuale Ähnlichkeit ist der prozentuale Anteil der Symbole, die ähnlich sind. Symbole, die gegenüber von Lücken sind, werden ignoriert. Eine Ähnlichkeit wird bewertet, wenn der Bewertungsmatrixwert für ein Paar von Symbolen größer als oder gleich 0,50, die Ähnlichkeitsschwelle, ist. Die in Version 10 des Wisconsin Genetics-Softwarepakets verwendete Bewertungsmatrix ist BLOSUM62 (siehe Henikoff und Henikoff, (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915).

(c) Wie hierin verwendet, bezieht sich "Sequenzidentität" oder "Identität" im Kontext von zwei Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen auf die Reste in den zwei Sequenzen, die die gleichen sind, wenn über ein spezifiziertes Vergleichsfenster hinweg auf eine maximale Entsprechung angeglichen wird. Wenn der Prozentsatz der Sequenzidentität unter Bezug auf Proteine verwendet wird, ist es anerkannt, dass sich Restpositionen, die nicht identisch sind, oft durch konservative Aminosäuresubstitutionen unterscheiden, wobei Aminosäurereste durch andere Aminosäurereste mit ähnlichen chemischen Eigenschaften (z.B. Ladung oder Hydrophobizität) ersetzt sind und daher die funktionellen Eigenschaften des Moleküls nicht ändern. Wenn sich Sequenzen durch konservative Substitutionen unterscheiden, kann die prozentuale Sequenzidentität nach oben angepasst werden, um hinsichtlich der konservativen Natur der Substitution zu korrigieren. Von Sequenzen, die sich durch derartige konservative Substitutionen unterscheiden, wird gesagt, dass sie "Sequenzähnlichkeit" oder "Ähnlichkeit" aufweisen. Mittel zur Durchführung dieser Anpassung sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt. Typischerweise umfasst dies die Bewertung einer konservativen Substitution als teilweise statt vollständige Fehlpaarung, wodurch der Prozentsatz der Sequenzidentität erhöht wird. Wenn einer identischen Aminosäure eine Bewertung von 1 und einer nicht-konservativen Substitution eine Bewertung von Null gegeben wird, wird einer konservativen Substitution somit z.B. eine Bewertung zwischen Null und 1 gegeben. Die Bewertung der konservativen Substitutionen wird berechnet, z.B. wie es im Programm PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Kalifornien) implementiert ist.
(d) Wie hierin verwendet, meint "Prozentsatz der Sequenzidentität" den Wert, der durch Vergleichen zweier optimal angeglichener Sequenzen über ein Vergleichsfenster hinweg bestimmt wird, wobei der Anteil der Polynukleotidsequenz im Vergleichsfenster Additionen oder Deletionen (d.h. Lücken), verglichen mit der Referenzsequenz (die keine Additionen oder Deletionen umfasst), für ein optimales Alignment der zwei Sequenzen umfassen kann. Der Prozentsatz wird durch Bestimmung der Zahl von Positionen, an denen die identische Nukleinsäurebase oder der identische Aminosäurerest in beiden Sequenzen auftritt, unter Erhalt der Zahl übereinstimmender bzw. gepaarter Positionen, Teilen der Zahl übereinstimmender Positionen durch die Gesamtzahl an Positionen im Vergleichsfenster und Multiplizieren des Ergebnisses mit 100 berechnet, wobei der Prozentsatz der Sequenzidentität erhalten wird.
(e) (i) Der Begriff "wesentliche Identität" von Polynukleotidsequenzen bedeutet, dass ein Polynukleotid eine Sequenz umfasst, die wenigstens 70% Sequenzidentität, vorzugsweise wenigstens 80%, stärker bevorzugt wenigstens 90% und, am stärksten bevorzugt, wenigstens 95%, verglichen mit einer Referenzsequenz unter Verwendung eines der beschriebenen Alignment-Programme unter Verwendung von Standardparametern aufweist. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, dass diese Werte in geeigneter Weise angepasst werden können, um eine entsprechende Identität von Proteinen, codiert durch zwei Nukleotidsequenzen, festzustellen, indem die Codon-Degeneriertheit, Aminosäureähnlichkeit, Leserasterpositionierung und dergleichen berücksichtigt werden. Eine wesentliche Identität von Aminosäuresequenzen für diese Zwecke bedeutet normalerweise eine Sequenzidentität von wenigstens 60%, stärker bevorzugt wenigstens 70%, 80%, 90% und am stärksten bevorzugt wenigstens 95%.

Ein weiteres Anzeichen dafür, dass Nukleotidsequenzen im Wesentlichen identisch sind, ist es, wenn zwei Moleküle miteinander unter stringenten Bedingungen hybridisieren. Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen so gewählt, dass sie näherungsweise 5°C niedriger sind als der thermische Schmelzpunkt (T_m) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH. Jedoch umfassen stringente Bedingungen Temperaturen im Bereich von näherungsweise 1°C bis näherungsweise 20°C unter dem T_m, abhängig vom gewünschten Grad der Stringenz, wie hierin an anderer Stelle ausgewiesen. Nukleinsäuren, die miteinander unter stringenten Bedingungen nicht hybridisieren, sind noch im Wesentlichen identisch, wenn die Polypeptide, für die sie codieren, im Wesentlichen identisch sind. Dies kann z.B. auftreten, wenn eine Kopie einer Nukleinsäure unter Verwendung der maximalen Codon-Degeneriertheit, die vom genetischen Code zugelassen wird, geschaffen wird. Ein Anzeichen dafür, dass zwei Nukleinsäuresequenzen im Wesentlichen identisch sind, ist es, wenn das von der ersten Nukleinsäure codierte Polypeptid immunologisch kreuzreaktiv ist mit dem von der zweiten Nukleinsäure codierten Polypeptid.

(e) (ii) Der Begriff "wesentliche Identität" im Kontext eines Peptids weist darauf hin, dass ein Peptid eine Sequenz mit wenigstens 70% Sequenzidentität zu einer Referenzsequenz, vorzugsweise 80%, stärker bevorzugt 85%, am stärksten bevorzugt wenigstens 90% oder 95% Sequenzidentität zu der Referenzsequenz über ein spezifiziertes Vergleichsfenster hinweg umfasst. Vorzugsweise wird ein optimales Alignment durchgeführt unter Verwendung des Homologie-Alignment-Algorithmus von Needleman et al,. (1970), J. Mol. Biol., 48:443. Ein Anzeichen dafür, dass zwei Peptidsequenzen im Wesentlichem identisch sind, ist, dass ein Peptid immunologisch reaktiv ist mit Antikörpern, erzeugt gegen das zweite Peptid. Somit ist ein Peptid z.B. im Wesentlichen identisch zu einem zweiten Peptid, wenn sich die zwei Peptide nur durch eine konservative Substitution unterscheiden. Peptide, die "im Wesentlich ähnlich" sind, haben Sequenzen wie oben bemerkt gemeinsam, abgesehen davon, dass sich Restpositionen, die nicht identisch sind, durch konservative Aminosäureänderungen unterscheiden können.

Die Verwendung des Begriffs "Nukleotidkonstrukte" hierin soll die vorliegende Erfindung nicht auf Nukleotidkonstrukte, die DNA umfassen, beschränken. Durchschnittsfachleute auf dem Gebiet werden erkennen, dass Nukleotidkonstrukte, insbesondere Polynukleotide und Oligonukleotide, bestehend aus Ribonukleotiden und Kombinationen von Ribonukleotiden und Desoxyribonukleotiden, ebenfalls in den hierin offenbarten Verfahren eingesetzt werden können. Somit umfassen die erfindungsgemäßen Nukleotidkonstrukte alle Nukleotidkonstrukte, die in den erfindungsgemäßen Verfahren zum Transformieren von Pflanzen eingesetzt werden können, einschließlich, aber ohne Beschränkung darauf, jener, bestehend aus Desoxyribonukleotiden, Ribonukleotiden und Kombinationen davon. Solche Desoxyribonukleotide und Ribonukleotide umfassen sowohl natürlich vorkommende Moleküle als auch synthetische Analoga. Die erfindungsgemäßen Nukleotidkonstrukte umfassen auch alle Formen von Nukleotidkonstrukten, einschließlich, aber ohne Beschränkung darauf, einzelsträngiger Formen, doppelsträngiger Formen, Haarnadelstrukturen ("hairpins"), Stamm- und -Schleife-Strukturen und dergleichen.
Ferner wird anerkannt, dass die erfindungsgemäßen Verfahren ein Nukleotidkonstrukt verwenden können, das dazu fähig ist, in einer transformierten Pflanze die Expression von wenigstens einem Protein oder wenigstens einer RNA, wie z.B. einer Antisense-RNA, die zu wenigstens einem Teil einer mRNA komplementär ist, zu steuern. Typischerweise besteht ein derartiges Nukleotidkonstrukt aus einer codierenden Sequenz für ein Protein oder eine RNA, funktionell verknüpft mit 5'- und 3'-Transkriptionsregulationsregionen. Alternativ wird anerkannt, dass die erfindungsgemäßen Verfahren ein Nukleotidkonstrukt einsetzen können, das in einer transformierten Pflanze nicht dazu fähig ist, die Expression eines Proteins oder einer RNA zu steuern.
Zusätzlich wird anerkannt, dass erfindungsgemäße Verfahren nicht vom Einbau des gesamten Nukleotidkonstrukts, umfassend eine P-Glycoprotein-Nukleotidsequenz, in das Genom abhängen, nur, dass die Pflanze oder Zelle davon als Ergebnis der Einführung des Nukleotidkonstrukts in eine Zelle verändert ist. In einer Ausführungsform der Erfindung kann das Genom nach der Einführung des Nukleotidkonstrukts in eine Zelle verändert sein. Zum Beispiel kann das Nukleotidkonstrukt oder ein beliebiger Teil davon in das Genom der Pflanze inkorporieren. Veränderungen am Genom gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen, sind aber nicht beschränkt darauf, Additionen, Deletionen und Substitutionen von Nukleotiden im Genom. Während die erfindungsgemäßen Verfahren nicht von Additionen, Deletionen oder Substitutionen einer bestimmten Zahl von Nukleotiden abhängen, wird anerkannt, dass derartige Additionen, Deletionen oder Substitutionen wenigstens ein Nukleotid umfassen.
Die erfindungsgemäßen Nukleotidkonstrukte umfassen auch Nukleotidkonstrukte, die in Verfahren zur Änderung oder Mutation einer genomischen Nukleotidsequenz in einem Organismus eingesetzt werden können, einschließlich, aber ohne Beschränkung darauf, chimäre Vektoren, chimäre Mutationsvektoren, chimäre Reparaturvektoren, gemischte-Duplex-Oligonukleotide, selbst-komplementäre chimäre Oligonukleotide und rekombinationserzeugende Oligonukleobasen. Derartige Nukleotidkonstrukte und Verfahren zur Verwendung, wie z.B. Chimeraplastie, sind auf dem Fachgebiet bekannt. Die Chimeraplastie umfasst die Verwendung derartiger Nukleotidkonstrukte zum Einführen ortsspezifischer Veränderungen in die Sequenz der genomischen DNA innerhalb eines Organismus. Siehe die US-Patente Nrn. 5,565,350 ; 5,731,181 ; 5,756,325 ; 5,760,012 ; 5,795,972 und 5,871,984 . Siehe auch WO 98/49350 , WO 99/07865 , WO 99/25821 und Beetham et al., (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:8774-8778.
Die erfindungsgemäßen Nukieotidsequenzen werden in Expressionskassetten zur Expression in der interessierenden Pflanze bereitgestellt. Die Kassette wird 5'- und 3'-Regulatorsequenzen, funktionell verknüpft mit einer erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz, umfassen. Mit "funktionell verknüpft" ist eine funktionelle Verknüpfung zwischen einem Promotor und einer zweiten Sequenz gemeint, wobei die Promotorsequenz die Transkription der DNA-Sequenz, entsprechend der zweiten Sequenz, initiiert und vermittelt. Im Allgemeinen bedeutet funktionell verknüpft, dass die Nukleinsäuresequenzen zusammenhängend und, wo zum Verknüpfen zweier Protein-codierender Regionen nötig, zusammenhängend und im gleichen Leseraster sind. Die Kassette kann zusätzlich wenigstens ein weiteres Gen enthalten, mit dem der Organismus co-transformiert werden soll. Alternativ kann das weitere Gen/können die weiteren Gene auf mehrfachen Expressionskassetten bereitgestellt werden.
Eine solche Expressionskassette wird mit einer Vielzahl von Restriktions- (Spalt) stellen zur Insertion der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz unter der Transkriptionsregulation der Regulatorregionen bereitgestellt. Die Expressionskassette kann weiterhin selektierbare Markergene enthalten.
Die Expressionskassette wird in der 5'-3'-Richtung der Transkription eine Transkriptions- und Translationsinitiationsregion, eine erfindungsgemäße Nukleotidsequenz und eine Transkriptions- und Translationsterminationsregion, funktionell in Pflanzen, umfassen. Die Transkriptionsinitiationsregion, der Promotor, kann bezüglich des Pflanzenwirts nativ oder analog oder fremd oder heterolog sein. Weiterhin kann der Promotor die natürliche Sequenz oder alternativ eine synthetische Sequenz sein. Mit "fremd" ist gemeint, dass die Transkriptionsinitiationsregion nicht in der nativen Pflanze gefunden wird, in die die Transkriptionsinitiationsregion eingeführt wird.
Während es bevorzugt sein kann, die Sequenzen unter Verwendung heterologer Promotoren zu exprimieren, können die nativen Promotorsequenzen verwendet werden. Derartige Konstrukte würden die Expressionslevel in der Pflanze oder Pflanzenzelle verändern. Somit wird der Phänotyp der Pflanze oder Pflanzenzelle verändert.
Die Terminationsregion kann bezüglich der Transkriptionsinitiationsregion nativ sein, kann bezüglich der funktionell verknüpften DNA-Sequenz von Interesse nativ sein oder kann aus einer anderen Quelle abgeleitet sein. Zweckdienliche Terminationsregionen sind ausgehend vom Ti-Plasmid von A. tumefaciens verfügbar, z.B. die Octopinsynthase- und Nopalinsynthease-Terminationsregionen. Siehe auch Guerineau et al., (1991), Mol. Gen. Genet., 262:141-144; Proudfoot, (1991), Cell, 64:671-674; Sanfacon et al., (1991), Genes Dev., 5:141-149; Mogen et al., (1990), Plant Cell, 2:1261-1272; Munroe et al,. (1990), Gene, 91:151-158; Ballas et al., (1989), Nucleic Acids Res., 17:7891-7903; und Joshi et al., (1987), Nucleic Acid Res., 15:9627-9639.
Wo zweckdienlich, kann das Genkönnen die Gene für eine erhöhte Expression in der transformierten Pflanze optimiert sein. Das heißt, die Gene können unter Verwendung Pflanzen-bevorzugter bzw. von Pflanzen bevorzugten Codons für eine verbesserte Expression synthetisiert sein. Im Stand der Technik sind Verfahren zum Synthetisieren Pflanzen-bevorzugter Gene verfügbar. Siehe z.B. die US-Patente Nrn. 5,380,831 und 5,436,391 , und Murray et al., (1989), Nucleic Acids Res., 17:477-498.
Weitere Sequenzmodifikationen sind dafür bekannt, die Genexpression in einem zellulären Wirt zu verstärken. Diese umfassen die Eliminierung von Sequenzen, codierend für störende bzw. fehlerhafte Polyadenylierungssignale, Exon-Intron-Spleißstellen-Signale, Transposon-ähnliche Wiederholungen und andere derartige gut charakterisierte Sequenzen, die für die Genexpression schädlich sein können. Der G-C-Gehalt der Sequenz kann auf Level angepasst werden, die für einen gegebenen zellulären Wirt durchschnittlich sind, wie unter Bezugnahme auf bekannte Gene, die in der Wirtszelle exprimiert werden, berechnet. Wenn möglich, wird die Sequenz so modifiziert, dass vorhergesagte Haarnadel-mRNA-Sekundärstrukturen vermieden werden.
Die Expressionskassetten können weiterhin 5'-Leadersequenzen in dem Expressionskassettenkonstrukt enthalten. Derartige Leadersequenzen können so wirken, dass sie die Translation steigern. Translationsleader sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen: Picornavirus-Leader, z.B. den EMCV-Leader (Encephalomyocarditis-5'-nicht-codierende-Region) (Elroy-Stein et al., (1989), PNAS USA, 86:6126-6130); Potyvirus-Leader, z.B. den TEV-Leader (Tabakätzvirus) (Allison et al., (1986); den MDMV-Leader (Maisverzwergungsmosaikvirus); Virology, 154:9-20) und das humane Immunoglobulin-Schwerkettenbindungsprotein (BiP), (Macejak et al,. (1991), Nature, 353:90-94), den nicht-translatierten Leader aus der Hüllprotein-mRNA von Alfalfamosaikvirus (AMV RNA 4) (Jobling et al. (1987), Nature 325:622-625); den Tabakmosaikvirus-Leader (TMV) (Gallie et al., (1989), in Molecular Biology of RNA, Hrsg. Cech (Liss, New York), S. 237-256); und "maize chlorotic mottloe virus"-Leader (MCMV) (Lommel et al,. (1991), Virology, 81:382-385). Siehe auch Della-Cioppa et al., (1987), Plant Physiol., 84:965-968. Andere Verfahren zur Verstärkung der Translation können ebenfalls eingesetzt werden, z.B. Introns, und dergleichen.
Beim Herstellen der Expressionskassette können die verschiedenen DNA-Fragmente manipuliert werden, um so dafür zu sorgen, dass die DNA-Sequenzen in der entsprechenden Orientierung und, soweit erforderlich, im entsprechenden Leseraster sind. Hierbei können Adaptoren oder Linker eingesetzt werden, um die DNA-Fragmente zu verbinden, oder andere Manipulationen können beteiligt sein, um zweckdienliche Restriktionsstellen, eine Entfernung überflüssiger DNA, eine Entfernung von Restriktionsstellen oder dergleichen bereitzustellen. Zu diesem Zweck können in vitro-Mutagenese, Primerreparatur, Restriktion, Anlagerung bzw. Annealing, Resubstitutionen, z.B. Transitionen und Transversionen, eingesetzt werden.
Es ist anerkannt, dass mit den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen Antisense-Konstrukte, die zu wenigstens einem Teil der Boten-RNA (mRNA) für die P-Glycoprotein-Gensequenzen komplementär sind, konstruiert werden können. Antisense-Nukleotide sind so konstruiert, dass sie mit der entsprechenden mRNA hybridisieren. Modifikationen der Antisense-Sequenzen können durchgeführt werden, solange die Sequenzen mit der entsprechenden mRNA hybridisieren und die Expression dieser stören. Auf diese Weise können Antisensekonstrukte verwendet werden, die 70%, vorzugsweise 80% und stärker bevorzugt 85% Sequenzidentität zu den entsprechenden Zielsequenzen aufweisen. Ferner können Teile der Antisense-Nukleotide verwendet werden, um die Expression des Zielgens zu unterbrechen. Im Allgemeinen können Sequenzen von wenigstens 50 Nukleotiden, 100 Nukleotiden, 200 Nukleotiden oder mehr verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen können auch in der Sense-Orientierung zum Supprimieren der Expression endogener Gene in Pflanzen verwendet werden. Verfahren zum Supprimieren der Genexpression in Pflanzen unter Verwendung von Nukleotidsequenzen in der Sense-Orientierung, auch als Co-Suppressionsverfahren bekannt, sind auf dem Fachgebiet bekannt. Die Verfahren umfassen im Allgemeinen das Transformieren von Pflanzen mit einem Nukleotidkonstrukt, umfassend einen Promotor, der die Expression in einer Pflanze steuert, funktionell verknüpft mit wenigstens einem Teil einer Nukleotidsequenz, die dem Transkript des endogenen Gens entspricht. Typischerweise weist eine derartige Nukleotidsequenz eine wesentliche Sequenzidentität mit der Sequenz des Transkripts des endogenen Gens auf, vorzugsweise mehr als näherungsweise 65% Sequenzidentität, stärker bevorzugt mehr als näherungsweise 85% Sequenzidentität und am stärksten bevorzugt mehr als näherungsweise 95% Sequenzidentität. Siehe die US-Patente Nrn. 5,283,184 und 5,034,323 .
Im Allgemeinen wird die Expressionskassette ein selektierbares Markergen zur Selektion transformierter Zellen umfassen. Selektierbare Markergene werden zur Selektion transformierter Zellen oder Gewebe eingesetzt. Markergene umfassen Gene, codierend für eine Antibiotikaresistenz, wie z.B. jene, die für Neomycin-Phosphotransferase II (NEO) und Hygromycin-Phosphotransferase (HPT) codieren, sowie Gene, die eine Resistenz gegenüber herbiziden Verbindungen, wie Glufosinat-Ammonium, Bromoxynil, Imidazolinonen und 2,4-Dichlorphenoxyacetat (2,4-D), verleihen. Siehe allgemein Yarranton, (1992), Curr. Opin. Biotech., 3:506-511; Christopherson et al., (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6314-6318; Yao et al., (1992), Cell, 71:63-72; Reznikoff, (1992), Mol. Microbiol., 6:2419-2422; Barkley et al., (1980) in The Operon, S. 177-220; Hu et al., (1987), Cell, 48:555-566; Brown et al., (1987), Cell, 49:603-612; Figge et al., (1988), Cell, 52:713-722; Deuschle et al., (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:5400-5404; Fuerst et al,. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:2549-2553; Deuschle et al., (1990), Science, 248:480-483; Gossen, (1993), Ph. D. Thesis, University of Heidelberg; Reines et al., (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1917-1921; Laboes et al., (1990), Mol. Cell. Biol., 10:3343-3356; Zambretti et al., (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:3952-3956; Baim et al., (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5072-5076; Wyborski et al., (1991), Nucleic Acids Res., 19:4647-4653; Rillen und Wissman, (1989), Topics Mol. Struc. Biol., 10:143-162; Degenkolb et al., (1991), Antimicrob. Agents Chemother., 35:1591-1595; Kleinschnidt et al., (1988), Biochemistry, 27:1094-1104; Bonin, (1993), Ph. D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen et al., (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551; Oliva et al., (1992), Antimicrob. Agents Chemother., 36:913-919; Hlavka et al., (1985), Handbook of Experimental Pharmacology, Band 78, (Springer Verlag, Berlin); Gill et al., (1988), Nature, 334:721-724.
Die obige Liste selektierbarer Markergene soll nicht einschränkend sein. Ein beliebiges selektierbares Markergen kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Eine Zahl von Promotoren kann in der Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Promotoren können auf der Basis der gewünschten Zeitabstimmung ("timing"), der gewünschten Lokalisierung und dem gewünschten Level der Expression der P-Glycoprotein-Gene in einer Pflanze ausgewählt werden. Konstitutive, Gewebe-bevorzugte, Pathogen-induzierbare, Wund-induzierbare und chemisch regulierbare Promotoren können in der Ausführung der Erfindung verwendet werden.
Derartige konstitutive Promotoren umfassen z.B. die Kernpromotoren des Rsyn7-Promotors und andere konstitutive Promotoren, offenbart in WO 99/43838 und dem US-Patent Nr. 6,072,050 ; den Kern-CaMV 35S-Promotor (Odell et al,. (1985), Nature, 313:810-812); den Reis-Actin- (McElroy et al., (1990), Plant Cell, 2:163-171); den Ubiquitin- (Christensen et al., (1989), Plant Mol. Biol., 12:619-632 und Christensen et al., (1992), Plant Mol. Biol., 18:675-689); den pEMU- (Last et al., (1991), Theor. Appl. Genet., 81:581-588); den MAS- (Velten et al., (1984, EMBO J., 3:2723-2730); den ALS-Promotor ( US-Anmeldung, Aktenzeichen 08/409,297 , und US-Patent Nr. 5,659,026 ) und dergleichen. Andere konstitutive Promotoren umfassen z.B. (jene die offenbart sind in den) US-Patenten Nrn. 5,608,149 ; 5,608,144 ; 5,604,121 ; 5,569,597 ; 5,466,785 ; 5,399,680 ; 5,268,463 und 5,608,142 .
Gewebe-bevorzugte Promotoren können eingesetzt werden, um eine verstärkte P-Glycoprotein-Expression innerhalb eines bestimmten Pflanzengewebes zu targetieren. Gewebe-bevorzugte Promotoren umfassen Gene, die offenbart sind in) Yamamoto et al., (1997), Plant J., 12(2):255-265; Kawamata et al., (1997), Plant Cell Physiol., 38(7):792-803; Hansen et al., (1997), Mol. Gen Genet., 254(3):337-343; Russell et al., (1997), Transgenic Res., 6(2):157-168; Rinehart et al., (1996), Plant Physiol., 112(3):1331-1341; Van Camp et al., (1996), Plant Physiol., 112(2):525-535; Canevascini et al., (1996), Plant Physiol., 112(2):513-524; Yamamoto et al., (1994), Plant Cell Physiol., 35(5):773-778; Lam, (1994) Results Probl. Cell Differ., 20:181-196; Orozco et al., (1993), Plant Mol Biol., 23(6):1129-1138; Matsuoka et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(20):9586-9590 und Guevara-Garcia et al., (1993), Plant J., 4(3):495-505. Derartige Promotoren können, sofern nötig, für eine schwache Expression modifiziert werden.
Blatt-bevorzugte Promotoren umfassen Gene, die offenbart sind in) Yamamoto et al., (1997) Plant 1, 12(2):255-265; Kawamata et al., (1997) Plant Cell Physiol., 38(7):792-803; Hansen et al., (1997), Mol. Gen. Genet., 254(3):337-343; Russell et al., (1997), Transgenic Res., 6(2):157-168; Rinehart et al., (1996), Plant Physiol., 112(3):1331-1341; Van Camp et al., (1996), Plant Physiol., 112(2):525-535; Canevascini et al., (1996), Plant Physiol., 112(2):513-524; Yamamoto et al., (1994), Plant Cell Physiol., 35(5):773-778; Lam, (1994) Results Probl. Cell Differ., 20:181-196; Orozco et al., (1993), Plant Mol. Biol., 23(6):1129-1138; Matsuoka et al., (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(20):9586-9590; und Guevara-Garcia et al., (1993), Plant J., 4(3):495-505.
Wurzel-bevorzugte Promotoren sind bekannt und können aus den vielen über die Literatur verfügbaren ausgewählt oder de novo aus zahlreichen kompatiblen Arten isoliert werden. Siehe z.B. Hire et al., (1992), Plant Mol. Biol., 20(2):207-218 (Sojabohnenwurzelbevorzugtes Glutaminsynthetasegen); Keller und Baumgartner, (1991), Plant Cell, 3(10):1051-1061 (Wurzel-bevorzugtes Kontrollelement im GRP 1.8-Gen der Gartenbohne ("French bean")); Sanger et al., (1990), Plant Mol. Biol., 14(3):433-443 (Wurzel-bevorzugter Promotor des Mannopinsynthase (MAS) -Gens von Agrobacterium tumefaciens); und Miao et al., (1991), Plant Cell, 3(1):11-22 (Volllängen-cDNA-Klon, codierend für zytosolische Glutaminsynthetase (GS), welche in Wurzeln und Wurzelknötchen von Sojabohnen exprimiert wird). Siehe auch Bogusz et al., (1990), Plant Cell, 2(7):633-641, wo zwei Wurzelbevorzugte Promotoren, isoliert aus Hämoglobingenen aus der Stickstoff-fixierenden Nicht- Leguminose Parasponia andersonii und der damit verwandten Nicht-Stickstoff-fixierenden Nicht-Leguminose Trema tomentosa, beschrieben sind. Die Promotoren dieser Gene waren mit einem β-Glucuronidase-Reportergen verknüpft und wurden sowohl in die Nicht-Leguminose Nicotiana tabacum als auch die Leguminose Lotus corniculatus eingeführt und in beiden Fällen wurde die Wurzel-bevorzugte Promotoraktivität beibehalten. Leach und Aoyagi, (1991), beschrieben ihre Analyse der Promotoren der hochgradig exprimierten Wurzelinduzierenden Gene rolC und rolD von Agrobacterium rhizogenes (siehe Plant Science (Limerick), 79(1):69-76). Sie folgerten, dass Enhancer und Gewebe-bevorzugte DNA-Determinanten in jenen Promotoren dissoziiert bzw. aufgeteilt sind. Teert et al., (1989), verwendete eine Genfusion mit lacZ, um zu zeigen, dass das Agrobacterium-T-DNA-Gen, codierend für Octopinsynthase, insbesondere in der Epidermis der Wurzelspitze aktiv ist und dass das TR2'-Gen in der intakten Pflanze Wurzel-bevorzugt ist und durch Verwundung in Blattgewebe stimuliert wird, eine besonders wünschenswerte Kombination von Merkmalen zur Verwendung bei einem insektiziden oder larviziden Gen (siehe EMBO J., 8(2):343-350). Das TR1'-Gen, fusioniert mit nptII (Neomycinphosphotransferase II), zeigte ähnliche Merkmale. Weitere Wurzel-bevorzugte Promotoren umfassen den VfENOD-GRP3-Gen-Promotor (Kuster et al., (1995), Plant Mol. Biol., 29(4):759-772); und den rolB-Promotor (Capana et al., (1994), Plant Mol. Biol., 25(4):681-691). Siehe auch die US-Patente Nrn. 5,837,876 ; 5,750,386 ; 5,633,363 ; 5,459,252 ; 5,401,836 ; 5,110,732 ; und 5,023,179 .
Im Allgemeinen wird es günstig sein, das Gen, ausgehend von dem induzierbaren Promotor, insbesondere ausgehend von einem Pathogen-induzierbaren Promotor, zu exprimieren. Derartige Promotoren umfassen jene aus Pathogenese-abhängigen Proteinen (PR-Proteine), die nach Infektion durch einen pathogenen Organismus induziert werden; z.B. PR-Proteine, SAR-Proteine, beta-1,3-Glucanase, Citinase, usw. Siehe z.B. Redolfi et al., (1983), Neth. J. Plant Pathol., 89:245-254; Uknes et al., (1992), Plant Cell, 4:645-656; und Van Loon, (1985), Plant Mol. Virol., 4:111-116. Siehe auch die ebenfalls anhängigen Anmeldungen mit dem Titel "Inducible Maize Promotors", US-Anmeldung Aktenzeichen Nr. 60/076,100 , eingereicht am 26. Februar 1998, und US-Anmeldung Aktenzeichen Nr. 60/079,648 , eingereicht am 27. März 1998, wobei diese beiden der PCT-Anmeldung WO 99/43819 entsprechen, die am 2. September 1999 veröffentlicht wurde.
Von Interesse sind Promotoren, die lokal bei oder nahe der Stelle der Pathogeninfektion exprimiert werden. Siehe z.B. Marineau et al., (1987), Plant Mol. Biol., 9:335-342; Matton et al., (1989), Molecular Plant-Microbe Interactions, 2:325-331; Somsisch et al., (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:2427-2430; Somsisch et al., (1988), Mol. Gen. Genet., 2:93-98; und Yang, (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:14972-14977. Siehe auch Chen et al., (1996), Plant J., 10:955-966; Zhang et al., (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:2507-2511; Warner et al., (1993), Plant J., 3:191-201; Siebertz et al., (1989), Plant Cell, 1:961-968; US-Patent Nr. 5,750,386 (Nematoden-induzierbar), und die darin zitierten Referenzen. Von besonderem Interesse ist der induzierbare Promotor für das Mais-PRms-Gen, dessen Expression durch den pathogenen Organismus Fusarium moniliforme induziert wird (siehe z.B. Cordero et al., (1992), Physiol. Mol. Plant Path., 41:189-200).
Weiterhin kann, da Pathogene durch Wunden oder Insektenschädigung in Pflanzen, eindringen, ein Wund-induzierbarer Promotor in den erfindungsgemäßen Konstrukten verwendet werden. Derartige Wund-induzierbare Promotoren umfassen: Kartoffel-Proteinaseinhibitor (pin II) -Gen (Ryan, (1990), Ann. Rev. Phytopath., 28:425-449); Duan et al., (1996), Nature Biotechnology, 14:494-498); wun1 und wun2, US-Patent Nr. 5,428,148 ; win1 und win2 (Stanford et al., (1989), Mol. Gen. Genet., 215:200-208); Systemin (McGurl et al., (1992), Science, 225:1570-1573); WIP1 (Rohmeier et al., (1993), Plant Mol. Biol., 22:783-792; Eckelkamp et al., (1993), FEBS Letters, 323:73-76); MPI-Gen (Corderok et al., (1994), Plant J., 6(2):141-150) und dergleichen.
Chemisch regulierte Promotoren können verwendet werden, um die Expression eines Gens in einer Pflanze durch die Anwendung eines exogenen chemischen Regulators zu modulieren. Abhängig vom Ziel kann der Promotor ein Chemikalien-induzierbarer Promotor sein, wobei die Anwendung der Chemikalie die Genexpression induziert, oder ein Chemikalienreprimierbarer Promotor, wobei die Anwendung der Chemikalie die Genexpression reprimiert. Chemisch-induzierbare Promotoren sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen, ohne Beschränkung darauf, den Mais-IN2-2-Promotor, der durch Benzolsulfonamidherbizidgegenmittel aktiviert wird, den Mais-GST-Promotor, der durch hydrophobe elektrophile Verbindungen aktiviert wird, die als Vorlaufherbizide verwendet werden, und den Tabak-PR-1a-Promotor, der durch Salicylsäure aktiviert wird. Andere chemisch regulierte Promotoren von Interesse umfassen Steroid-reaktive Promotoren (siehe z.B. den Glucokortikoid-induzierbaren Promotor in Schena et al., (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:10421-10425 und McNellis et al., (1998), Plant J., 14(2):247-257) und Tetracyclin-induzierbare und Tetracyclin reprimierbare Promotoren (siehe z.B. Gatz et al., (1991), Mol. Gen. Genet., 227:229-237, und die US-Patente Nrn. 5,814,618 und 5,789,156 ).
Transformationsprotokolle sowie Protokolle zum Einführen von Nukleotidsequenzen in Pflanzen in Abhängigkeit vom Typ der Pflanze oder Pflanzenzelle, d.h. Monokotyle oder Dikotyle, die zur Transformation targetiert wird, variieren. Geeignete Verfahren zum Einführen von Nukleotidsequenzen in Pflanzenzellen und nachfolgende Insertion in das Pflanzengenom umfassen Mikroinjektion (Crossway et al., (1986), Biotechniques, 4:320-334), Elektroporation (Riggs et al., (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:5602-5606), Agrobacteriumvermittelte Transformation (Townsend et al., US-Patent Nr. 5,563,055 ; Zhao et al., US-Patent Nr. 5,981,840 ), direkten Gentransfer (Paszkowski et al., (1984), EMBO J., 3:2717-2722) und ballistische Partikelbeschleunigung (siehe z.B. Sanford et al., US-Patent Nr. 4,945,050 ; Tomes et al., (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment" in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, Hrsg. Gamborg und Phillips (Springer-Verlag, Berlin); und McCabe et al., (1988), Biotechnology, 6:923-926). Siehe auch Weissinger et al., (1988), Ann. Rev. Genes., 22:421-477; Sanford et al., (1987), Particulate Science and Technology, 5:27-37 (Zwiebel); Christou et al., (1988), Plant Physiol., 87:671-674 (Sojabohne); McCabe et al., (1988), Bio/Technology, 6:923-926 (Sojabohne); Finer und McMullen, (1991), In vitro Cell Dev. Biol., 27P:175-182 (Sojabohne); Singh et al., (1998), Theor. Appl. Genet., 96:319-324 (Sojabohne); Datta et al., (1990), Biotechnology, 8:736-740 (Reis); Klein et al., (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4305-4309 (Mais); Klein et al., (1988), Biotechnology, 6:559-563 (Mais); Tomes, US-Patent Nr. 5,240,855 ; Buising et al., US-Patente Nrn. 5,322,783 und 5,324,646 ; Tomes et al., (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment" in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, Hrsg. Gamborg (Springer-Verlag, Berlin) (Mais); Klein et al., (1988), Plant Physiol., 91:440-444 (Mais); Fromm et al., (1990), Biotechnology, 8:833-839 (Mais); Hooykaas-Van Slogteren et al., (1984), Nature (London), 311:763-764; Bytebier et al., (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985), in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, Hrsg. Chapman et al. (Longman, New York), S. 197-209 (Pollen); Kaeppler et al., (1990), Plant Cell Reports, 9:415-418 und Kaeppler et al., (1992), Theor. Appl. Genet., 84:560-566 (Whisker-vermittelte Transformation); D'Halluin et al., (1992), Plant Cell, 4:1495-1505 (Elektroporation); Li et al., (1993), Plant Cell Reports, 12:250-255 und Christou und Ford, (1995), Annals of Botany, 75:407-413 (Reis); Osjoda et al., (1996), Nature Biotechnology, 14:745-750 (Mais über Agrobacterium tumefaciens).
Alternativ können die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen in einen Organismus eingeführt werden, und es kann ihm ermöglicht werden, eine Rekombination mit homologen Regionen des Genoms des Organismus zu durchlaufen. Derartige Herangehensweisen der homologen Rekombination sind Durchschnittsfachleuten auf dem Gebiet gut bekannt und können eingesetzt werden, um erfindungsgemäße Sequenzen stabil in einen Organismus einzubauen. Ferner können derartige Strategien eingesetzt werden, um "Knockout-Mutationen" in ein spezifisches Gen eines Organismus einzuführen, das eine wesentliche Homologie mit erfindungsgemäßen Sequenzen aufweist. Eine "Knockout-Mutation" ist eine beliebige Mutation in der Sequenz eines Gens, die die Funktion oder den Spiegel des Produkts, das durch das Gen codiert wird, eliminiert oder wesentlich verringert. Verfahren, die eine Transformation eines Organismus, gefolgt von homologer Rekombination, zum stabilen Integrieren der erfindungsgemäßen Sequenzen in das Genom des Organismus umfassen, sind von der Erfindung umfasst. Die Erfindung betrifft insbesondere Verfahren, bei denen erfindungsgemäße Sequenzen verwendet werden, um das Wachstum eines Organismus zu verändern. Derartige Verfahren umfassen die Verwendung von erfindungsgemäßen Sequenzen, um die Funktion oder Synthese eines P-Glypoproteins, das das Wachstum eines Organismus kontrolliert, zu stören bzw. damit zu interferieren.
Die Zellen, die transformiert worden sind, können gemäß herkömmlicher Weisen zu Pflanzen gezogen werden. Siehe z.B. McCormick et al., (1986), Plant Cell Reports, 5:81-84. Diese Pflanzen können dann gezogen bzw. gezüchtet werden und entweder mit dem gleichen transformierten Stamm oder unterschiedlichen Stämmen bestäubt werden, und die resultierende Hybride, die eine konstitutive Expression des gewünschten phänotypischen Merkmals aufweist, kann identifiziert werden. Zwei oder mehr Generationen können gezüchtet werden, um sicherzustellen, dass die konstitutive Expression des gewünschten phänotypischen Merkmals stabil aufrechterhalten und vererbt wird. Dann können Samen geerntet werden, um sicherzustellen, dass die konstitutive Expression des gewünschten phänotypischen Merkmals erzielt worden ist. Die vorliegende Erfindung kann zur Transformation einer beliebigen Pflanzenart verwendet werden, einschließlich, aber ohne Beschränkung darauf, Mais (Zea mays), Brassica sp. (z.B. B. napus, B. rapa, B. juncea), insbesondere jene Brassica-Arten, die als Quellen von Samenöl nützlich sind, Alfalfa (Medicago sativa), Reis (Oryza sativa), Rog gen (Secale cereale), Sorghum (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), Hirse (z.B. Perlhirse (Pennisetum glaucum), Rispenhirse (Panicum miliaceum), Kolbenhirse (Setaria italica), Fingerhirse (Eleusine Coracana)), Sonnenblume (Helianthus annuus), Saflor (Carthamus tinctorius), Weizen (Triticum aestivum), Sojabohne (Glycine max), Tabak (Nicotiana tabacum), Kartoffel (Solanum tuberosum), Erdnüsse (Arachis hypogaea), Baumwolle (Gossypium barbadens, Gossypium hirsutum), Süßkartoffel (Ipomoea batatus), Cassava bzw. Maniok (Manihot esculenta), Kaffee (Coffea spp.), Kokosnuß (Cocos nucifera), Ananas (Ananas comosus), Citrusbäume (Citrus spp.), Kakao (Theobroma cacao), Tee (Camellia sinensis), Banane (Musa spp.), Avocado (Persea americana), Feige (Ficus casica), Guave (Psidium guajava), Mango (Mangifera indica), Olive (Olea europaea), Papaya (Carica papaya), Cashew bzw. Kaschubaum (Anacardium occidentale), Macadamia (Macadamia integrifolia), Mandel (Prunus amygdalus), Zuckerrüben (Beta vulgaris), Zuckerrohr (Saccharum spp.), Hafer, Gerste, Gemüse, Zierpflanzen und Koniferen.
Gemüse umfassen Tomaten (Lycopersicon esculentum), Salat (z.B. Lactuca sativa), Gartenbohnen (Phaseolus vulgaris), Limabohnen (Phaseolus limensis), Erbsen (Lathyrus spp.) und Mitglieder der Gattung Cucumis, wie z.B. Gurke (C. sativus), Cantaloupe- (C. cantalupensis) und Zucker- bzw. Honigmelone (C. melo). Zierpflanzen umfassen Azaleen (Rhododendron spp.), Hortensie bzw. Hydrangea (Macrophylla hydrangea), Hibiskus (Hibiscus rosasanensis), Rosen (Rosa spp.), Tulpen (Tulipa spp.), Narzissen (Narcissus spp.), Petunien (Petunia hybrida), Nelke (Dianthus caryophyllus), Poinsettia (Euphorbia pulcherrima) und Chrysantheme. Koniferen, die in der Ausführung der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, umfassen z.B. Kiefern wie die Weihrauchkiefer (Pinus taeda), Slash Pine (Pinus elliotii), Gelbkiefer (Pinus ponderosa), Drehkiefer (Pinus contorta) und Montereykiefer (Pinus radiata); Douglasie (Pseudotsuga menziesti); Westliche bzw. Westamerikanische Hemlocktanne (Tsuga canadensis); Sitkafichte (Picea glauca); Küstenmammutbaum (Sequoia sempervirens); Echte Tannen, wie die Purpurtanne ("silver fir") (Abies amabilis) und die Balsamtanne (Abies balsamea); und Zedern, wie den Riesenlebensbaum (Thuja plicata) und die Nutka-Scheinzypresse (Chamaecyparis nootkatensis). Vorzugsweise sind erfindungsgemäße Pflanzen Nutzpflanzen (z.B. Reis, Getreide bzw. Mais, Alfalfa, Sonnenblume, Brassica, Sojabohne, Baumwolle, Saflor, Erdnuss, Sorghum, Weizen, Hirse, Tabak usw.), stärker bevorzugt Getreide- bzw. Mais-, Reis- und Sorghumpflanzen.
Die folgenden Beispiele werden zum Zwecke der Erläuterung und nicht zum Zwecke der Einschränkung bereitgestellt.
BEISPIEL 1
Kartierung der Lokalisierung von br2 auf dem Chromosom 1 L
Vorangehende genetische Studien haben aufgedeckt, dass br2 auf dem Maischromosom 1L innerhalb von 0,1 cM von hm1 lokalisiert war. In einer F₂-Population von 1500 Pflanzen zwischen dem br2-rekombinanten mutanten Teststamm ("br2 recombinant mutant tester") (br2br2Hm1Hm1) und Pr (eine Mais-Inzüchtung, homozygot rezessiv am hm1-Lokus; Br2hm1hm1) wurde nur eine Rekombinante (hm1hm1br2br2) zwischen br2 und hm1 gefunden. Jedoch wurde die Orientierung dieser zwei Gene in Bezug auf das jeweils andere nicht festgestellt. Um zu untersuchen, ob br2 proximal oder distal zu hm1 ist, wurde die Nachkommenschaft der obigen Rekombinanten und wurden ihre Vorfahren mittels RFLP genotypisiert, und zwar unter Verwendung von Sonden aus dem hm1-Gen, sowie zweier RFLP-Marker, PIO200644 und P10200044. Diese DNA-Marker flankieren hm1, wobei PIO200644 und PIO200044 5 cM proximal bzw. distal zu hm1 kartieren (Johal et al., (1992), Science, 258:985-987). Das P10200044-Allel des rekombinanten Teststammes war das gleiche wie das des ursprünglichen br2-Teststammes, wohingegen die hm1- und PIO200644-Allele rekombiniert hatten, was darauf hinweist, dass br2 zwischen hm1 und PIO200044 lokalisiert ist.
BEISPIEL 2
Transposon-Markierung und Klonierung von br2
Um das Wildtyp-Br2-Gen zu klonieren, wurde eine gerichtete (targetierte) Markierungs- bzw. Tagging-Herangehensweise angewendet, in der der Robertson-Mutator (Mu) als das genetische Mutagen verwendet wurde (Robertson, (1978), Mutation Res., 51:21-28; Walbot, (1992), Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 43:49-82). Kreuzungen wurden zwischen Mu-enthaltenden Br2/Br2-Weibchen und dem rekombinanten Mutantenteststamm (beschrieben in Beispiel 1), enthaltend das br2-Referenz (br2-ref) -Allel, durchgeführt. Eine Gesamtzahl von 90.000 Hybridpflanzen aus der resultierenden F1-Population wurden in das Feld ausgepflanzt, wobei 35 zwergwüchsige Pflanzen erhalten wurden. Diese mutmaßlichen br2-Mutanten wurden durch Kreuzung mit B73 (eine Inzucht) -Weibchen sowie durch Rückkreuzung auf den br2-Teststamm vermehrt. Der letztere Satz von Kreuzungen, die im Wesentlichen die Allelie zwischen br2-ref und den neuen brachytischen Mutantenallelen testeten, wurde durchgeführt, um zu evaluieren, welche der 35 neuen Mutanten vererblich und nicht durch Umweltfaktoren verursacht waren. Die brachytische Statur der Maispflanzen kann von Pflanzen nachgeahmt werden, die von Stewart-Welkekrankheit ("Stewart's wilt") befallen sind, eine bakterielle Erkrankung, die durch Erwinia stewartii verursacht wird. Die aus dem Allelietest erhaltenen Ergebnisse ermöglichten letztendlich die Auswahl von 11 echten br2-Mutanten, die mit br2-1 bis br2-11 bezeichnet wurden.
Im Bestreben, diese potentiell Mu-markierten Mutanten zur Co-Segregationsanalyse voranzutreiben, wurde die Auskreuzungs-Nachkommenschaft jeder Mutante mit B73 mit Sonden aus hm1 und PIO10200044 genotypisiert. Dies half bei der Identifizierung von Pflanzen aus jeder Nachkommenschaft, die das markierte mutante Allel geerbt hatten. Einige derartige Pflanzen wurden mit dem br2-Teststamm rückgekreuzt und dies resultierte in der Produktion von Populationen aus jeder Mutante, die (im Verhältnis von) 1:1 auf Pflanzen aufspalteten bzw. segregierten, die das markierte mutante Allel enthielten und denen dieses fehlte. Da nur die brachytischen Pflanzen aus diesen Populationen das markierte mutante Allel enthielten, verminderte dieses Rückkreuzungsschema den Bedarf an der Verwendung von molekularen Markern zur Verfolgung der Vererbung der markierten Allele.
Eine DNA-Gel-Blotanalyse wurde angewendet, um nach Mu-Elementen zu suchen, die diese Mutantenallele verursacht haben können. Die brachytischen und hohen bzw. groß gewachsenen Pflanzen aus jeder Familie wurden miteinander auf einem Southern-Blot verglichen, hybridisiert mit jedem der neun Mu-Elemente (Gennetzen et al., (1993), Crit. Rev. Plant Sci., 12:57-95). Diese Analyse resultierte in der Identifizierung eines Mu8-hybridisierenden Restriktionsfragments aus jeder der beiden Mutanten, br2-5 und br2-6, die mit dem Mutantenallel in mehr als 80 Nachkommenschaftspflanzen vollständig aufspalteten. Während die Größe des Mu8-hybridisierenden XhoI-Fragments – 7,5 kb im Mutantenallel von br2-5 betrug, war sie – 9,0 kb in br2-6. Ein – 9,0 kb großes XhoI-Restriktionsfragment, das mit dem Mutantenallel von br2-6 co-segregierte bzw. co-aufspaltete, hybridisierte jedoch eigenartigerweise auch mit einer Mu7-spezifischen Sonde. Nach Klonierung wurde jedoch bemerkt, dass sowohl die Mu8- als auch die Mu7-spezifische Sonde mit dem gleichen XhoI-Restriktionsfragment hybridisierten. Das 7,5 kb-große XhoI-Fragment, das mit Mu8 in br2-5 hybridisierte, wurde ebenfalls kloniert. Beide Klone wurden nachfolgend subkloniert und partiell sequenziert.
Sequenzvergleiche zeigten, dass beide Endsequenzen und die XhoI-Stellen dieser Klone identisch waren, was darauf hinweist, dass sie aus der gleichen Region des Maisgenoms hervorgegangen waren. Die Vergleiche zeigten auch, dass die Mu8-homologen Regionen der beiden Subklone sowohl hinsichtlich der Größe als auch der Sequenz identisch waren, was drauf hinweist, dass die Quelle des Restriktionsfragmentlängenmorphismus an einer Variation an anderer Stelle innerhalb der Klone lag. Weitere Sequenzanalysen zeigten die Quellen des Polymorphismus. In br2-6 wurde eine Insertion eines 2,1 kb-großen Mu7-Elements, 510 bp stromabwärts der 5'-Ende-XhoI-Stelle, gefunden (1). Diese Insertion liegt im Exon 1, und es wird, trotzdem sie nur neun bp von der Exon/Intron-Verbindungsstelle entfernt ist, erwartet, dass sie die Funktion des br2-Gens unterbricht. In br2-5 wurde eine neue Insertion im Intron 4 entdeckt (1). Diese Insertion, die Merkmale eines transposierbaren Elements aufweist, kann die Funktion des Gens gestört haben oder nicht.
Die Mu8-homologe Region beider Klone, die sich über die Nukleotide 4569 bis 5472 (880 bp) ab dem 5'-Ende erstreckt, stimmte überein mit den Nukleotiden 276 bis 1163 von Mu8 und die zwei (Sequenzen) zeigten eine Sequenzidentität von 94%. Es wurde jedoch festgestellt, dass die Mu8-homologe DNA in keinem der Klone von terminalen invertierten Sequenzwiederholungen (TIRs) von Mu flankiert wurde, was Fragen hinsichtlich der Quelle oder des Ursprungs dieser DNA aufwirft. Dass sie nicht aus einem Mu8-Insertionsereignis resultierte, wurde offensichtlich als eine BLAST-Analyse mit dieser Sequenz durchgeführt wurde. Die Homologierecherche zeigte klar, dass die Mu8-homologe Region des klonierten Gens dessen bona-fide-Teil ("bona fide part") ist. Offensichtlich wurde diese Sequenz auf irgendeine Weise durch ein Mu-Element entführt, das später unter Erzeugung des Elements Nr. 8 (Mu8) des Mutatorsystems rekombinierte.
Um festzustellen, ob das br2-Gen kloniert worden war oder stattdessen ein natürlicher Polymorphismus, der eng mit br2 verbunden war, wurde eine Reverse-Genetics-Herangehensweise verwendet, die eine PCR umfasst, die auf der Identifikation von Mu-Insertionen in weiteren Mutationen eines Kandidatengens beruht. Diese Herangehensweise, die zuvor eingesetzt worden war, um die Klonierung zweier separater Gene, lls1 (Grat' et al., (1997), Cell, 89:25-31) und Les22 (Hu et al., (1998), Plant Cell, 10:1095-1105), zu verifizieren, basiert auf der Prämisse, dass bei unabgängigen Mutationen mehrfache Mu-Insertionen in der Nachbarschaft eines klonierten Gens nur gefunden werden können, falls die Insertionen ursächlich an der Erzeugung dieser Mutationen beteiligt sind (Walbot, (1992), Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 43:49-82).
Zur Durchführung dieses Experiments wurden zwei gegensätzlich orientierte Genspezifische Primer, ausgehend von der Region 5' der Mu7-Insertion in br2-6 konzipiert. Diese Region des Gens wurde targetiert, da Mu-Elemente dazu neigen, im 5'-Ende von Genen zu inserieren bzw. insertieren (Gennetzen et al., (1993), Crit. Rev. Plant Sci., 12:57-95). Jeder Primer wurde in Kombination mit einem Mu TIR-spezifischen Primer verwendet, um DNA unter Verwendung einer PCR aus jeder der anderen neun br2-Mutanten zu amplifizieren. Amplifikationsprodukte, die mit einer Gen-spezifischen Sonde aus dem 5'-Ende hybridisierten, wurden aus der DNA von zwei Mutanten, br2-3 und br2-9, erhalten. Diese PCR-Produkte wurden kloniert und sequenziert und zeigten, dass Mu-Elemente in br2-3 und br2-9 bei den Positionen 269 bzw. 394 Nukleotide ab der Mu7-Insertionsstelle in br2-6, insertiert hatten. Somit wurden drei Insertionen, die innerhalb von 400 Nukleotiden des jeweils anderen waren, in drei unabhängigen br2-Mutanten identifiziert. Diese Ergebnisse deuteten stark darauf hin, dass br2 kloniert worden war. Die Tatsache, dass das Mu7/Mu8-hybridisierende 9,0 kb-große XhoI-Fragment in den Nachkommen von br2-6 fehlte, untermauerte diese Interpretation weiter.
Ein weiteres Beweisstück für die korrekte Klonierung von br2 kam aus der molekularen Analyse von zwei hohen bzw. groß gewachsenen Revertanten, wobei beide von diesen aus(gehend) von br2-Rest-Allel isoliert wurden. Diese Revertanten wurden während eines Experiments identifiziert, das durchgeführt wurde, um einen neuen Mais-Teststamm mit vier rezessiven genetischen Markern, nämlich hm1, br2, hm2 (ein Duplikat von hm1, das erwachsenen Pflanzen eine Resistenz gegen C. carbonum-Rasse 1 verleiht; Multani et al., (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:1686-1691), und bk2 (Pflanzen, die hinsichtlich dieses Gens rezessiv sind, haben brüchige Stängel und Blätter; Coe et al., (1988), Corn & Corn Improvement, G.F. Sprague (Hrsg.), Madison, WI) zu erzeugen. Somit waren diese hohen Revertanten mit hm1, hm2 und bk2 markiert, wobei alle von diesen im Mais-Keimplasma selten sind. Eine Southern-Blot-Analyse wurde durchgeführt, um zu untersuchen, ob diese Revertanten einen DNA-Polymorphismus an oder nahe der klonierten Region durchgemacht hatten. Die DNA dieser Revertanten wurde mit einer Anzahl von Enzymen restriktionskartiert und mit der des Vorfahrens und einer Anzahl von Mais-Inzuchten, einschließlich aller die für C. carbonum anfällig sind, verglichen. Ein einzigartiger RFLP wurde in beiden Revertanten detektiert, der in ihrem Vorfahren sowie in allen Mais-Inzuchten, die in diesem Versuch untersucht wurden, fehlte. Da dieser Polymorphismus in beiden Revertanten identisch ist, weisen diese Ergebnis se darauf hin, dass diese Revertanten entweder das Ergebnis des gleichen molekularen Ereignisses sind oder dass ein ähnliches molekulares Ereignis für die funktionelle Reversion des br2-ref-Allels erforderlich ist. Es ist unwahrscheinlich, dass diese Revertanten das Ergebnis einer Pollenkontamination waren, da beide Revertanten brüchig und für C. carbonum-Rasse 1 anfällig waren und da sie auch die gleichen hm1- und hm2-RFLPs wie die ihres Vorfahren besaßen. Die genaue molekulare Natur des Ereignisses/der Ereignisse, das/die zu diesen Revertanten führt/führen, bleibt zu untersuchen, wie auch die Natur der Mutation im br2-ref-Allel.
BEISPIEL 3
Identität des Br2-Gens und des Proteins, für das es codiert
Um die molekulare Natur von Br2 festzustellen, wurden beide XhoI-Klone vollständig sequenziert. Dies ermöglichte die Erstellung ("compilation") eines näherungsweise 7,0 kb-großen Bereichs der genomischen Region des br2-Lokus, der/die mehr als 90% der Br2-codierenden Region zu enthalten scheint (SEQ ID NO: 1). Als diese Sequenz einer BLAST-Analyse unterworfen wurde, wurde gezeigt, dass das vorhergesagte br2-Protein eine ausgedehnte Sequenz- und Strukturähnlichkeit mit den Mehrfachwirkstoff-Resistenz (MDR)-ähnliches-Gen-codierten P-Glycoproteinen ("multidrug-resistance (MDR)-like gene-encoded P-glycoproteins") (Gottesman et al., (1995), Annu. Rev. Genet., 29:607-649; Borst et al., (1997), Trends Genet., 13:217-222; Croop, (1998), Methods Enzym., 292:101-116) aufwies. Die Produkte der MDR-ähnlichen Gene gehören zur Familie der ATP-Bindungskassetteenthaltenden (ABC) Transporter, die die ATP-getriebene transmembrane Translokation einer großen Vielfalt von Substraten vermitteln (Gottesman et al., (1995), Annu. Rev. Genet., 29:607-649; Higgins, (1992), Annu. Rev. Cell Biol., 8:67-113). Mehr als 67% Aminosäuresequenzidentität wurde zwischen br2 und dem vorhergesagten Protein des Arabidopsis-P-Glycoprotein-Gens, AtPGP1 (Dudler et al., (1992), J. Biol. Chem., 267:5882-5888) beobachtet. AtPGP1, das das erste aus Pflanzen klonierte P-Glycoprotein war, wurde auf der Grundlage seiner Homologie mit dem humanen MDR1-Gen isoliert, mit dem es eine Identität von 41 % aufweist (Dudler et al., (1992), J. Biol. Chem., 267:5882-5888). Seither sind drei andere P-Glycoprotein-Gene aus Arabidopsis (Dudler et al., (1998), Methods Enzym., 292:162-173), Gerste (Davies et al., (1997), Gene, 199:195-202) und Kartoffel (Wang et al., (1996), Plant Mol. Biol., 31:683-687) kloniert worden. Jedoch wurden alle diese Gene auf molekulare Weise identifiziert und in keinem Fall, einschließlich AtPGP1, ist bekannt, was die tatsächliche Funktion/die tatsächlichen Funktionen dieser Gene in planta sein könnte(n). Somit ist BR2 das erste Pflanzen-P-Glycoprotein, bei dem es einen klaren Beweis für seine Funktion gibt. Ferner ist BR2 das erste P-Glycoprotein aus einem beliebigen Organismus, bei dem bekannt ist, dass es an der Kontrolle des Wachstums oder der Entwicklung eines Organismus beteiligt ist.
BR2 kann auch an Abwehrreaktionen von Pflanzen gegen Pathogene beteiligt sein. Bei Wachstum bzw. Züchtung unter Gewächshausbedingungen zeigen br2-Mutanten eine erhöhte Inzidenz von "Buggy Whip", ein krankheitsartiger nekrotischer Zustand der Wachstumsspitze, der bakterieninduzierte Nekrosen nachahmt. Die Beteiligung von P-Glycoproteinen an der Verteidigung gegen ein Toxin, produziert durch einen Pseudomonas aeruginosa-Starrirn, der sowohl Pflanzen als auch Tiere infiziert, ist vor kurzem gezeigt worden (Mahajan-Miklos et al., (1999), Cell, 96:47-56).
Im Gegensatz zum Arabidopsis-AtPGP1-Gen, das 10 Exons und 9 Introns enthält, enthält das Mais-Br2-Gen 5 Exons und 4 Introns, obwohl die Positionen und Exon/Intron-Grenzen dieser 4 Introns mit den entsprechenden Introns aus dem Arabidopsis-AtPGP1-Gen identisch sind. Die strukturelle Organisation der Gersten- und Kartoffel-P-Glyoprotein-Gene ist noch nicht aufgeklärt worden. SEQ ID NO: 2 gibt die Vollängen-Br2-cDNA wieder, die aus 10-Tage-alten B73-Sämlingen in vier überlappenden Teilen mittels einer Kombination von RT-PCR und 3'-RACE isoliert worden war.
Eine BLAST-Analyse der Br2-Gensequenz (SEQ ID NO: 1) zeigte, dass Br2 am engsten mit einer mRNA-Sequenz für ein Kartoffel-P-Glycoprotein (EMBL-Zugangsnummer: Y10099) verwandt war. Unter Nichtbeachtung der Mu8-homologen Region von Br2 (SEQ ID NO: 1) war der längste Bereich der Nukleotidsequenzidentität 29 Nukleotide mit einer mRNA-Sequenz aus einem Maus-Mehrfachwirkstoffresistenzprotein (GenBank-Zugangsnummer M 14757).
BEISPIEL 4
Transformation von Mais mittels Partikelbombardierung und Regeneration von transgenen Pflanzen
Unreife Maisembryonen aus Gewächshausspenderpflanzen werden mit einem Plasmid, enthaltend eine erfindungsgemäße P-Glycoprotein-Nukleotidsequenz in funktioneller Verknüpfung mit einem Promotor, der die Expression in einer Pflanze steuert, und das selektierbare Markergen PAT (Wohlleben et al., (1998), Gene, 70:25-37), welches eine Resistenz gegenüber dem Herbizid Bialaphos verleiht, bombardiert. Alternativ wird das selektierbare Markergen auf einem separaten Plasmid bereitgestellt. Die Transformation wird wie folgt durchgeführt. Die Rezepte für Medien folgen nachstehend.
Herstellung von Zielgewebe
Die Kolben werden enthüllt und in 30 %iger Clorox-Bleiche plus 0,5% Micro-Detergens für 20 Minuten oberflächensterilisiert und 2 mal mit sterilem Wasser gewaschen. Die unreifen Embryonen werden exzidiert und mit der Embryoachsenseite nach unten (Schildchenseiten nach oben) zu 25 Embryonen pro Platte für 4 Stunden auf 560Y-Medium gegeben und dann innerhalb der 2,5-cm-Zielzone in Vorbereitung der Partikelbombardierung aufgereiht.
Herstellung bzw. Vorbereitung der DNA
Ein Plasmidvektor, umfassend die erfindungsgemäße P-Glycoprotein-Nukleotidsequenz in funktioneller Verknüpfung mit dem Pflanzenpromotor von Interesse, wird hergestellt. Diese Plasmid-DNA plus Plasmid-DNA, enthaltend einen PAT-selektierbaren Marker, wird auf Wolframpellets mit 1,1 μm (mittlerer Durchmesser) präzipitiert, wobei eine CaCl₂-Präzipitationsverfahrensweise wie folgt verwendet wird:
100 μl vorbereitete Wolframpartikel in Wasser
10 μl (1 μg) DNA in Tris-EDTA-Puffer (1 μg Gesamt-DNA)
100 μl 2,5 M CaCl₂
10 μl 0,1 M Spermidin
Jedes Reagens wird sequenziell zu der Wolframpartikelsuspension gegeben, während diese auf einem Mehrröhrchen-Vortexer ("multitube vortexer") gehalten wird. Das endgültige Gemisch wird kurz (ultra)schallbehandelt und unter konstanter Vortexbehandlung für 10 Minuten inkubieren gelassen. Nach der Präzipitationszeitdauer werden die Röhrchen kurz zentrifugiert, die Flüssigkeit wird entfernt, es wird mit 500 ml 100% Ethanol gewaschen und für 30 Sekunden zentrifugiert. Wiederum wird die Flüssigkeit entfernt und 105 μl 100% Ethanol werden zu dem endgültigen Wolframpartikelpellet gegeben. Für die Partikelkanonenbombardierung werden die Wolfram/DNA-Partikel kurz (ultra)schallbehandelt und 10 μl werden auf das Zentrum jedes Macrocarriers aufgetüpfelt und für etwa 2 Minuten vor der Bombarierung trocknen gelassen.
Partikelkanonenbehandlung
Die Proben werden auf Level bzw. Stufe #4 in der Partikelkanone mit der Bezeichnung #HE34-1 oder #HE34-2 bombardiert. Alle Proben erhalten einen einzelnen Schuss bei 650 PSI, wobei eine Gesamtzahl von zehn Aliquoten aus jedem Röhrchen vorbereiteter Partikel/DNA entnommen wird.
Nachfolgende Behandlung
Nach der Bombardierung werden die Embryonen für 2 Tage auf 560Y-Medium gehalten, dann auf 560R-Selektionsmedium, enthaltend 3 mg/Liter Bialaphos, transferiert und alle zwei Wochen subkultiviert. Nach näherungsweise 10 Wochen der Selektion werden selektionsresistente Kallusklone auf 288J-Medium transferiert, um die Pflanzenregeneration zu initiieren. Nach der Reifung somatischer Embryonen (2-4 Wochen) werden gut entwickelte somatische Embryonen auf Medium zur Keimung transferiert und in den beleuchteten Kulturraum transferiert. Näherungsweise 7-10 Tage später werden sich entwickelnde Pflänzchen auf hormonfreies 272V-Medium in Röhrchen für 7-10 Tage transferiert, bis die Pflänzchen gut etabliert sind. Die Pflanzen werden dann auf Einsätze in Multitopfpaletten (entsprechend einem 2,5''-Topf), enthaltend Topferde, transferiert und für 1 Woche in einer Wachstumskammer wachsen gelassen, nachfolgend weitere 1-2 Wochen im Gewächshaus wachsen gelassen und dann auf Töpfe vom Typ "Classic 600" (1,6 Gallonen) transferiert und bis zur Reife wachsen gelassen. Die Pflanzen werden hinsichtlich eines zwergwüchsigen Phänotyps oder eines anderen Phänotyps, der mit der Expression der erfindungsgemäßen P-Glycoprotein-Nucleotidsequenzen assoziiert ist, überwacht und bewertet.
Bombardierungs- und Kulturmedien
Das Bombardierungsmedium (560V) umfasst 4,0 g/l N6-Basalsalze (SIGMA C-1416), 1,0 ml/l Eriksson-Vitamin-Mischung (1000X SIGMA-1511), 0,5 mg/l Thiamin-HCl, 120,0 g/l Saccharose, 1,0 mg/l 2,4-D und 2,88 g/l L-Prolin (Volumen nach Einstellung auf pH 5,8 mit KOH mit D-I H₂O eingestellt); 2,0 g/l Gelrite (nach Einstellung des Volumens mit D-I H₂O zugegeben) und 8,5 mg/l Silbernitrat (zugegeben nach Sterilisierung des Mediums und Abkühlung auf Raumtemperatur). Das Selektionsmedium (560R) umfasst 4,0 g/l N6-Basalsalze (SIGMA C-1416), 1,0 ml/l Eriksson-Vitamin-Mischung (1000X SIGMA-1511), 0,5 mg/l Thiamin-HCl, 30,0 g/l Saccharose und 2,0 mg/l 2,4-D (Volumen nach Einstellung auf pH 5,8 mit KOH mit D-I H₂O eingestellt), 3,0 g/l Gelrite (nach Einstellung des Volumens mit D-I H₂O zugegeben) und 0,85 mg/l Silbernitrat und 3,0 mg/l Bialaphos (beide nach Sterilisierung des Mediums und Abkühlung auf Raumtemperatur zugegeben).
Das Pflanzenregenerationsmedium (288J) umfasst 4,3 g/l MS-Salze (GIBCO 11117-074), 5,0 ml/l MS-Vitamine-Stammlösung (0,100 g Nicotinsäure, 0,02 g/l Thiamin-HCl, 0,10 g/l Pyridoxin-HCl und 0,40 g/l Glycin, Volumen mit filtriertem D-I H₂O eingestellt) (Murashige und Skoog, (1962), Physiol. Plant, 15:473), 100 mg/l Myoinosit, 0,5 mg/l Zeatin, 60 g/l Saccharose und 1,0 ml/l an 0,1 mM Abszisinsäure (Volumen nach Einstellung des pH auf 5,6 mit filtriertem D-I H₂O aufgefüllt); 3,0 g/l Gelrite (nach Einstellung des Volumens mit D-I H₂O zugegeben); und 1,0 mg/l Indolessigsäure und 3,0 mg/l Bialaphos (nach Sterilisierung des Mediums und Abkühlung auf 60°C zugegeben). Das hormonfreie Medium (272V) umfasst 4,3 g/l MS-Salze (GIBCO 11117-074), 5,0 ml/l MS-Vitamine-Stammlösung (0,100 g/l Nicotinsäure, 0,02 g/l Thiamin-HCl, 0,10 g/l Pyridoxin-HCl und 0,40 g/l Glycin, Volumen mit filtriertem D-I H₂O eingestellt), 0,1 g/l Myoinosit und 40,0 g/l Saccharose (Volumen nach Einstellung des pH auf 5,6 mit D-I H₂O eingestellt) und 6 g/l Bacto-Agar (nach Einstellung des Volumens mit filtriertem D-I H₂O zugegeben), sterilisiert und abgekühlt auf 60°C.
BEISPIEL 5
Agrobacterium-vermittelte Transformation von Mais und Regeneration transgener Pflanzen
Zur Agrobacterium-vermittelten Transformation von Mais mit einer erfindungsgemäßen P-Glycoprotein-Nukleotidsequenz wird vorzugsweise die Methode von Zhao verwendet ( US-Patent Nr. 5,981,840 und PCT-Patentveröffentlichung WO 98/32326 ; die Inhalte dieser Druckschriften sind hiermit durch Bezugnahme aufgenommen). Kurz gesagt, werden unreife Embryonen aus Mais isoliert, und die Embryonen werden mit einer Suspension von Agrobacterium kontaktiert, wobei die Bakterien dazu fähig sind, die erfindungsgemäße Glycoprotein-Nukleotidsequenz auf wenigstens eine Zelle von wenigstens einem der unreifen Embryonen zu übertragen (Stufe 1: die Infektionsstufe). In dieser Stufe werden die unreifen Embryonen vorzugsweise in eine Agrobacterium-Suspension eingetaucht, um die Inokulation zu initiieren. Die Embryonen werden eine Zeit lang mit dem Agrobacterium co-kultiviert (Stufe 2: die Co-Kultivierungsstufe). Vorzugsweise werden die unreifen Embryonen nach der Infektionsstufe auf festem Medium kultiviert. Nach dieser Co-Kultivierungszeitdauer wird eine optionale "Ruhe"-Stufe in Erwägung gezogen. In dieser Ruhestufe werden die Embryonen in Gegenwart wenigstens eines Antibiotikums, von dem bekannt ist, dass es das Wachstum von Agrobacterium hemmt, ohne Zugabe eines Selektionsmittels für Pflanzentransformanten kultiviert (Stufe 3: Ruhestufe). Vorzugsweise werden die unreifen Embryonen auf festem Medium mit Antibiotikum, jedoch ohne ein Selektionsmittel, zum Eliminieren von Agrobacterium und für eine Ruhephase für die infizierten Zellen kultiviert. Als Nächstes werden die inokulierten Embryonen auf Medium, enthaltend ein Selektionsmittel, transferiert und wachsender transformierter Kallus wird gewonnen (Stufe 4: die Selektionsstufe). Vorzugsweise werden die unreifen Embryonen auf einem festen Medium mit einem Selektionsmittel kultiviert, was in selektivem Wachstum transformierter Zellen resultiert. Der Kallus wird dann zu Pflanzen regeneriert (Stufe 5: die Regenerationsstufe) und vorzugsweise werden auf Selektivmedium gezüchtete Kalli auf festem Medium kultiviert, um die Pflanzen zu regenerieren.
Obwohl die vorstehende Erfindung mittels Erläuterung und Beispiel zu Zwecken des deutlichen Verständnisses beschrieben worden ist, wird offensichtlich sein, dass gewisse Änderungen und Modifikationen innerhalb des Rahmens der angehängten Ansprüche durchgeführt werden können. SEQUENZLISTE

Claims

Isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einer in SEQ ID NO: 1 angegebenen Nukleotidsequenz; (b) einer in SEQ ID NO: 2 angegebenen Nukleotidsequenz; (c) einer Nukleotidsequenz, bestehend aus wenigstens 30 zusammenhängenden Nukleotiden der in SEQ ID NO: 1 angegebenen Sequenz, wobei die Nukleotidsequenz für ein P-Glycoprotein codiert, das Pflanzenwachstum kontrolliert; (d) einer Nukleotidsequenz, bestehend aus wenigstens 30 zusammenhängenden Nukleotiden der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Sequenz, wobei die Nukleotidsequenz für ein P-Glycoprotein codiert, das Pflanzenwachstum kontrolliert; (e) einer Nukleotidsequenz, die für die in SEQ ID NO: 3 angegebene Aminosäuresequenz codiert; (f) einer Nukleotidsequenz, die für wenigstens 58 zusammenhängende Aminosäuren der in SEQ ID NO: 3 angegebenen Aminosäuresequenz codiert, wobei die Nukleotidsequenz für ein P-Glycoprotein codiert, das Pflanzenwachstum kontrolliert; (g) einer Nukleotidsequenz, umfassend wenigstens 70% Identität zu der in SEQ ID NO: 1 angegebenen Sequenz, wobei die Nukleotidsequenz für ein P-Glycoprotein codiert, das Pflanzenwachstum kontrolliert; (h) einer Nukleotidsequenz, umfassend wenigstens 70% Identität zu der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Nukleotidsequenz, wobei die Nukleotidsequenz für ein P-Glycoprotein codiert, das Pflanzenwachstum kontrolliert; (i) einer Nukleotidsequenz, die zu der Nukleotidsequenz von einer beliebigen von (a)-(h) komplementär ist; und (j) einer Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleotidsequenz von (a) oder (b) oder der komplementären Sequenz von (a) oder (b) hybridisiert, wobei die stringenten Bedingungen Hybridisierung in einer Lösung, umfassend 50% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS, bei 37°C und einen Waschschritt in 0,1 X SSC bei 60°C umfassen und die Nukleotidsequenz für ein P-Glycoprotein codiert, das Pflanzenwachstum kontrolliert.
Expressionskassette, umfassend die Nukleotidsequenz nach Anspruch 1, worin die Nukleotidsequenz mit einem Promotor, der Expression in einer Pflanzenzelle steuert, funktionell verknüpft ist.
Expressionskassette nach Anspruch 2, worin der Promotor aus der Gruppe, bestehend aus Gewebe-bevorzugten, Stamm- bzw. Stängel-bevorzugten, konstitutiven, chemisch regulierbaren und pathogen-bevorzugten Promotoren ausgewählt ist.
Pflanze, die transformiert ist und in ihr Genom eine Nukleotidsequenz nach Anspruch 1, die mit einem Promoter, der Expression in einer Pflanzenzelle steuert, funktionell verknüpft ist, stabil eingebaut hat.
Pflanze nach Anspruch 4, wobei der Promotor aus der Gruppe, bestehend aus Gewebe-bevorzugten, Stamm- bzw. Stängel-bevorzugten, konstitutiven, chemisch regulierbaren und pathogen bevorzugten Promotoren ausgewählt ist.
Pflanze nach Anspruch 4, wobei die Nukleotidsequenz mit dem Promotor für die Produktion von Antisense-Transkripten funktionell verknüpft ist.
Pflanze nach Anspruch 4, wobei die Pflanze eine Monocotyle ist.
Pflanze nach Anspruch 7, wobei die Monocotyle aus der Gruppe, bestehend aus Mais, Weizen, Reis, Basmatireis, Sorghum, Roggen, Hirse und Gerste ausgewählt ist.
Pflanze nach Anspruch 4, wobei die Pflanze eine Dicotyle ist.
Pflanze nach Anspruch 9, wobei die Dicotyle aus der Gruppe, bestehend aus Sojabohnen, Sonnenblumen, Saflor, Alfalfa, Brassica sp., Baumwolle, Erdnüssen und Obstbäumen ausgewählt ist.
Transformierter Samen von einer der Pflanzen nach den Ansprüchen 4-10, wobei der Samen in sein Genom eine Nukleotidsequenz nach Anspruch 1, die mit einem Promotor, der Expression in einer Pflanzenzelle steuert, funktionell verknüpft ist, stabil eingebaut hat.
Verfahren zum Modifizieren des Wachstums einer Pflanze, wobei das Verfahren Transformieren einer Pflanze mit einer Nukleotidsequenz, die für ein P-Glycoprotein codiert, umfasst, wobei das P-Glycoprotein zum Kontrollieren des Wachstums einer Pflanze wirkt, wobei die Nukleotidsequenz mit einem Promotor, der zum Steuern der Expression der Sequenz in der Pflanze fähig ist, funktionell verknüpft ist; wobei die Nukleotidsequenz wie in Anspruch 1 definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Promotor aus der Gruppe, bestehend aus Gewebe-bevorzugten, Stamm- bzw. Stängel-bevorzugten, konstitutiven, chemisch regulierbaren und pathogen-bevorzugten Promotoren ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Höhe der Pflanze verringert wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Nukleotidsequenz mit dem Promotor für die Produktion von Antisense-Transkripten funktionell verknüpft ist.
Pflanzenzelle, die transformiert ist und in ihr Genom eine Nukleotidsequenz nach Anspruch 1, die mit einem Promotor, der Expression in einer Pflanzenzelle steuert, funktionell verknüpft ist, stabil eingebaut hat.
Isoliertes Protein, umfassend ein Mitglied, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einem Polypeptid, das die in SEQ ID NO: 3 angegebene Aminosäuresequenz umfasst; (b) einem Polypeptid, das aus wenigstens 58 zusammenhängenden Aminosäuren der in SEQ ID NO: 3 angegebenen Aminosäuresequenz besteht, wobei das Polypeptid ein P-Glycoprotein ist, das Pflanzenwachstum kontrolliert; und (c) einem Polypeptid, das durch eine in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 angegebene Nukleotidsequenz codiert wird; (d) einem Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die wenigstens 70% Identität zu der Aminosäuresequenz von (a) umfasst, wobei das Polypeptid ein P-Glycoprotein ist, das Pflanzenwachstum kontrolliert.