CN101715490B - 谷胱甘肽及γ-谷氨酰半胱氨酸的制造方法 - Google Patents
谷胱甘肽及γ-谷氨酰半胱氨酸的制造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101715490B CN101715490B CN200880019101.6A CN200880019101A CN101715490B CN 101715490 B CN101715490 B CN 101715490B CN 200880019101 A CN200880019101 A CN 200880019101A CN 101715490 B CN101715490 B CN 101715490B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna
- protein
- gsh
- gene
- gamma
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/005—Amino acids other than alpha- or beta amino acids, e.g. gamma amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
根据本发明,提供以下的谷胱甘肽及γ-谷氨酰半胱氨酸的制造方法。一种谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的制造方法,其中包括:在培养基中培养微生物,在该培养基中生成并累积谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸,以及从培养物中收集谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸,所述微生物中以下具有将细胞内的谷胱甘肽转运到细胞外的活性的蛋白质的活性、以及参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的生物合成的蛋白质的活性高于亲本株。[1]具有序列号1~26中任何一者所示的氨基酸序列的蛋白质;[2]具有序列号1~26中任何一者所示的氨基酸序列缺失、取代或添加1个以上氨基酸后的氨基酸序列,并且具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质;[3]具有与序列号1~26中任何一者所示的氨基酸序列有80%以上同源性的氨基酸序列,并且具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质。
Description
技术领域
本发明涉及谷胱甘肽及γ-谷氨酰半胱氨酸的制造方法。
背景技术
已知谷胱甘肽(γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸)是在生物体内广泛存在的物质,除作为辅酶发挥作用外,还在肝脏中具有解毒作用。因此,谷胱甘肽作为医药品、健康食品及化妆品等的产品、原料或中间体广泛应用。
另外,γ-谷氨酰半胱氨酸(γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸)是如上所述的谷胱甘肽的生物合成的中间体,并且是期望具有与半胱氨酸同样的食品风味改善效果、用作生活方式疾病和阿尔茨海默氏病的治疗剂的硫醇化合物之一。
已知谷胱甘肽是通过在大肠杆菌(Escherichia coli)中,利用γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSHI)将L-谷氨酸及L-半胱氨酸转化为γ-谷氨酰半胱氨酸后,利用谷胱甘肽合成酶(GSHII)在γ-谷氨酰半胱氨酸上添加甘氨酸而生物合成的,编码GSHI的gshA基因和编码GSHII的gshB基因从大肠杆菌中获得(非专利文献1及2)。
作为谷胱甘肽的制造方法,已知酶法和发酵法。作为酶法,已知在L-谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸及表面活性剂的存在下,使用大肠 杆菌的菌体作为酶源的方法(专利文献1及2)。作为发酵法,已知使用酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)及产朊假丝酵母菌(Candida utilis)的野生株或突变株、以及用gshA基因及gshB基因转化得到的大肠杆 菌、酿酒酵母及乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的重组株的方法(非专利文献3及4),但该发酵法中,谷胱甘肽均在菌体内累积。
另一方面,有报道称大肠杆菌的野生株在对数生长后期,有极少的谷胱甘肽暂时在菌体外累积(非专利文献5)。
此外,已知γ-谷氨酰转肽酶的活性降低或丧失的大肠杆菌的突变株与野生株相比,培养基中的谷胱甘肽的累积量增加(非专利文献6及7),并且还已知γ-谷氨酰转肽酶基因(ggt基因)及编码谷胱甘肽的摄取蛋白质的yliAB基因的缺陷株与ggt基因单独缺陷株相比,谷胱甘肽的累积量进一步增加(非专利文献8)。
另外,还已知ybiK基因编码的蛋白质调节谷胱甘肽向菌体内的摄取(非专利文献9),以及ybiK基因与yliABCD基因形成操纵子(非专利文献8)。
已知大肠杆菌的cydDC基因编码的蛋白质具有将细胞内的谷胱甘肽转移到周质的活性(非专利文献10),但并不知道使该蛋白质的活性升高时,培养基中的谷胱甘肽的累积量会增加。
另外,大肠杆菌的yceE基因、marA基因、marB基因、acrA基因、acrB基因、emrA基因、emrB基因、emrE基因、ydhC基因、ydeA基因、emrK基因、emrY基因、emrD基因、yajR基因、yegB基因、yidY基因、yieO基因及yjiO基因被预测为药剂转运基因,并且对若干个基因确认了该活性(非专利文献19)。
已知ygeD基因是溶血磷脂转运基因(非专利文献11)。已知bcr基因是双环霉素抗性基因(非专利文献12)。已知cmr基因是氯霉素抗性基因(非专利文献13)。已知marR基因是多种抗生素抗性基因(非专利文献14)。已知evgA基因是药物外排基因(非专利文献15)。ydeE基因的功能未知。
如上所述,编码具有将细胞内的谷胱甘肽转运至细胞外的活性的蛋白质的基因尚且未知。
作为γ-谷氨酰半胱氨酸的制造方法,报道了利用谷胱甘肽合成酶基因被破坏或弱化的酵母突变株进行制造的方法(非专利文献16~18),但在该发酵法中,γ-谷氨酰半胱氨酸在菌体内累积。
专利文献1:日本特开昭60-27396号公报
专利文献2:日本特开昭60-27397号公报
非专利文献1:Appl.Environ.Microbiol.,44,1444(1982)
非专利文献2:Agric.Biol.Chem.,47,1381(1983)
非专利文献3:Appl.Microbiol.Biotechnol.,66,233(2004)
非专利文献4:Appl.Microbiol.Biotechnol.,24,375(1986)
非专利文献5:J.Bacteriol.,168,109(1986)
非专利文献6:Appl.Environ.Microbiol.,47,653(1984)
非专利文献7:J.Bacteriol.,169,3926(1987)
非专利文献8:J.Bacteriol.,187,5861(2005)
非专利文献9:FEMS Microbiol.Letters,209,81(2002)
非专利文献10:J.Biol.Chem,280,32254(2005)
非专利文献11:J.Biol.Chem,280,12028(2005)
非专利文献12:Gene,127,117(1993)
非专利文献13:J.Bacteriol.,178,3188(1996)
非专利文献14:J.Bacteriol.,175,1484(1993)
非专利文献15:Microbiology,149,2819(2003)
非专利文献16:Agr.Biol.Chem.,54,3145(1990)
非专利文献17:Molecular Biology of the Cell,8,1699(1997)
非专利文献18:Biochinica et Biophysica Acta,1395,315(1998)
非专利文献19:J.Bacteriol.,183,5803(2001)
发明内容
本发明的目的在于,提供高效的谷胱甘肽及γ-谷氨酰半胱氨酸的制造方法。
本发明涉及以下(1)~(16)。
(1)一种谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的制造方法,其中包括:在培养基中培养微生物,在该培养基中生成并累积谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸,以及从培养物中收集谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸,所述微生物中以下[1]~[3]中任一项所述的、具有将细胞内的谷胱甘肽转运到细胞外的活性(以下称为谷胱甘肽转运活性)的蛋白质的活性、以及参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的生物合成的蛋白质的活性高于亲本株,
具有序列号1~26中任何一者所示的氨基酸序列的蛋白质;
具有序列号1~26中任何一者所示的氨基酸序列缺失、取代或添加1个以上氨基酸后的氨基酸序列,并且具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质;
具有与序列号1~26中任何一者所示的氨基酸序列有80%以上同源性的氨基酸序列,并且具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质。
(2)上述(1)所述的制造方法,其中,微生物是使用以下[1]~[3]中任一项所述的DNA对亲本株进行转化而得到的微生物,
编码上述(1)的[1]~[3]中任一项所述的蛋白质的DNA;
具有序列号27~46中任何一者所示的碱基序列中的编码区的碱基序列的DNA;
在严格条件下与具有同序列号27~46中任何一者所示的碱基序列中的编码区的碱基序列互补的碱基序列的DNA杂交,并且编码具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的DNA。
(3)如上述(1)或(2)所述的制造方法,其中,参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的生物合成的蛋白质为γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSHI)或谷胱甘肽合成酶(GSHII)。
(4)如上述(3)所述的制造方法,其中,GSHI及GSHII为以下[1]~[3]中任一项所述的蛋白质,
具有序列号47或48所示的氨基酸序列的蛋白质;
具有序列号47或48所示的氨基酸序列缺失、取代或添加1个以上氨基酸后的氨基酸序列,并且具有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性或谷胱甘肽合成酶活性的蛋白质;
具有与序列号47或48所示的氨基酸序列有80%以上同源性的氨基酸序列,并且具有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性或谷胱甘肽合成酶活性的蛋白质。
(5)如上述(1)~(3)中任一项所述的制造方法,其中,微生物是使用编码GSHI或GSHII的DNA进行转化而得到的微生物。
(6)如上述(5)所述的制造方法,其中,编码GSHI及GSHII的DNA为以下[1]~[4]中任一项所述的DNA,
编码上述(4)的[1]~[3]中任一项所述的蛋白质的DNA;
具有序列号49或50所示的碱基序列的DNA;
具有序列号49或50所示的碱基序列中的编码区的碱基序列的DNA;
在严格条件下与具有同序列号49或50所示的碱基序列中的编码区的碱基序列互补的碱基序列的DNA杂交,并且编码具有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性或谷胱甘肽合成酶活性的蛋白质的DNA。
(7)如上述(1)~(6)中任一项所述的制造方法,其中,微生物是具有谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸分解活性的蛋白质的活性低于亲本株或丧失的微生物。
(8)如上述(7)所述的制造方法,其中,具有谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸分解活性的蛋白质是γ-谷氨酰转肽酶。
(9)如上述(8)所述的制造方法,其中,γ-谷氨酰转肽酶为以下[1]或[2]所述的蛋白质,
具有序列号51所示的氨基酸序列的蛋白质;
具有与序列号51所示的氨基酸序列有80%以上同源性的氨基酸序列,并且具有γ-谷氨酰转肽酶活性的蛋白质。
(10)如上述(7)所述的制造方法,其中,具有谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸分解活性的蛋白质的活性低于亲本株或丧失的微生物是具有编码γ-谷氨酰转肽酶的基因发生缺陷的染色体DNA的微生物。
(11)如上述(10)所述的制造方法,其中,编码γ-谷氨酰转肽酶的基因为以下[1]~[4]中任一项所述的DNA,
编码上述(9)的[1]或[2]所述的蛋白质的DNA;
具有序列号52所示的碱基序列的DNA;
具有序列号52所示的碱基序列中的编码区的碱基序列的DNA;
在严格条件下与具有同序列号52所示的碱基序列中的编码区的碱基序列互补的碱基序列的DNA杂交,并且编码具有γ-谷氨酰转肽酶活性的蛋白质的DNA。
(12)如上述(1)~(11)中任一项所述的制造方法,其中,微生物是具有参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的摄取的活性(以下,称为谷胱甘肽摄取活性)的蛋白质的活性低于亲本株或丧失的微生物。
(13)如上述(12)所述的制造方法,其中,具有谷胱甘肽摄取活性的蛋白质为以下[1]或[2]所述的蛋白质,
具有序列号53~57中任何一者所示的氨基酸序列的蛋白质;
具有与序列号53~57中任何一者所示的氨基酸序列有80%以上同源性的氨基酸序列,并且具有谷胱甘肽摄取活性的蛋白质。
(14)如上述(12)所述的制造方法,其中,微生物是具有编码具有谷胱甘肽摄取活性的蛋白质的基因发生缺陷的染色体DNA的微生物。
(15)如上述(14)所述的制造方法,其中,编码具有谷胱甘肽摄取活性的蛋白质的基因为以下[1]~[4]中任一项所述的DNA,
编码上述(13)的[1]或[2]所述的蛋白质的DNA;
具有序列号58所示的碱基序列的DNA;
具有序列号58所示的碱基序列中的任何一个编码区的碱基序列的DNA;
在严格条件下与具有同序列号58所示的碱基序列中的任何一个编码区的碱基序列互补的碱基序列的DNA杂交,并且编码具有谷胱甘肽摄取活性的蛋白质的DNA。
(16)如上述(1)~(15)中任一项所述的制造方法,其中,微生物为属于埃希氏菌(Escherichia)属的微生物。
发明效果
根据本发明,能够高效且廉价地制造谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸。
具体实施方式
1.本发明的制造方法中使用的微生物
(1)具有将细胞内的谷胱甘肽转运到细胞外的活性的蛋白质的活性高于亲本株的微生物
具有将细胞内的谷胱甘肽转运到细胞外的活性(以下,称为谷胱甘肽转运活性)的蛋白质的活性高于亲本株的微生物是指:(a)通过改变亲本株的染色体DNA上存在的编码具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的基因而得到的、i)该蛋白质的比活性高于亲本株的微生物、及ii)具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的产量高于亲本株的微生物;以及(b)用编码具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的DNA转化亲本株而得到的微生物。另外,本说明书中的亲本株可以是野生株,也可以是突变株,是作为变异或转化对象的原株。作为该亲本株,例如当微生物为大肠杆菌时,可以列举:大肠杆菌K-12株、B株、B/r株的野生株、或其突变株;作为该突变株,可以列举:大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌ATCC12435、大肠杆菌W1485、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌No.49、大肠杆 菌W3110、大肠杆菌NY49、大肠杆菌MP347、大肠杆菌NM522、大 肠杆菌BL21、大肠杆菌ME8415等。
作为具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质,可以列举:
具有序列号1~26中任何一者所示的氨基酸序列的蛋白质;
具有序列号1~26中任何一者所示的氨基酸序列缺失、取代或添加1个以上氨基酸后的氨基酸序列,并且具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质;
具有与序列号1~26中任何一者所示的氨基酸序列有80%以上同源性的氨基酸序列,并且具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质等。
上述中,具有缺失、取代或添加1个以上氨基酸残基后的氨基酸序列,并且具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质可以如下获得:使用分子克隆实验指南(MolecularCloning,A Laboratory Manual),第3版,冷泉港实验室出版社(1989)(以下,简称为分子克隆第3版)、最新分子生物学实验方法汇编(CurrentProtocols in Molecular Biology),约翰威立父子出版公司(1987-1997)(以下,简称为最新分子生物学实验方法汇编(カレント·プロトコ一ルズ·イン·モレキユラ一·バイオロジ一))、Nucleic AcidsResearch,10,6487(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6409(1982)、Gene,34,315(1985)、Nucleic Acids Research,13,4431(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488(1985)等中所述的定点突变导入法,在例如编码具有序列号1~26中任何一者所示的氨基酸序列的蛋白质的DNA中导入定点突变。
缺失、取代或添加的氨基酸残基的数量没有特别限制,是通过上述定点突变法等公知的方法能够缺失、取代或添加的程度的数量,为1~几十个,优选1~20个,更优选1~10个,进一步优选1~5个。
序列号1或2所示的氨基酸序列缺失、取代或添加1个以上的氨基酸是指,可以在同一序列中的任意位置缺失、取代或添加1个或多个氨基酸残基。
作为能够缺失或添加氨基酸残基的位置,可以列举例如:序列号1~26中任何一者所示的氨基酸序列的N末端侧及C末端侧的10个氨基酸残基。
缺失、取代或添加可以同时发生,取代或添加的氨基酸为天然型或非天然型均可。作为天然型氨基酸,可以列举例如:L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸等。
以下表示可以相互取代的氨基酸的例子。同一组中所含的氨基酸可以相互取代。
A组:亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、O-甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸
B组:天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸
C组:天冬酰胺、谷氨酰胺
D组:赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2,4-二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸
E组:脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸
F组:丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸
G组:苯丙氨酸、酪氨酸
另外,作为具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质,可以列举:具有与序列号1~26中任何一者所示的氨基酸序列的同源性为80%以上、优选90%以上、更优选95%以上、进一步优选97%以上、特别优选98%以上、最优选99%以上的氨基酸序列,并且具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质。
氨基酸序列、碱基序列的同源性可以使用Karlin和Altschul的BLAST算法[Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1973)]或FASTA[MethodsEnzymol.,183,63(1990)]来确定。基于该BLAST算法,开发出了称为BLASTN、BLASTX的程序[J.Mol.Biol.,215,403(1990)]。基于BLAST通过BLASTN分析碱基序列时,将参数设为例如:分数(Score)=100、字长(wordlength)=12。另外,基于BLAST通过BASTX分析氨基酸序列时,将参数设为例如:分数(score)=50、字长(wordlenght)=3。使用BLAST和GappedBLAST程序时,使用各程序的默认参数。这些分析方法的具体方法已经众所周知。
具有序列号1~26中任何一者所示的氨基酸序列缺失、取代或添加1个以上氨基酸残基后的氨基酸序列的蛋白质是具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质,这可以通过例如下述方法确认:使用DNA重组法制作表达想要确认活性的蛋白质的转化子,并使用标记的谷胱甘肽及能够从该转化子制得的内翻外囊泡[J.Biol.Chem.,277,49841(2002)]的方法[J.Biol.Chem.,280,32254(2005)]。
作为上述(a)的i)的具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的比活性高于亲本株的微生物,可以列举如下微生物:含有突变型蛋白质,所述蛋白质具有在亲本株含有的该蛋白质的氨基酸序列中取代1个以上的氨基酸、优选1~10个氨基酸、更优选1~5个氨基酸、进一步优选1~3个氨基酸后的氨基酸序列,因此与亲本株的具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质相比活性提高。
作为上述(a)的ii)的具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的产量高于亲本株的微生物,可以列举如下微生物:含有在亲本株的染色体DNA上存在的编码该蛋白质的基因的转录调控区或启动子区的碱基序列中取代1个以上碱基、优选1~10个碱基、更优选1~5个碱基、进一步优选1~3个碱基后的启动子区,因此与亲本株的具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的产量相比,该蛋白质的产量提高。
作为上述(b)的用编码具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的DNA转化亲本株而得到的微生物,可以列举使用如下DNA转化亲本株而得到的微生物:
编码上述[1]~[3]中任一项所述的蛋白质的DNA;
具有序列号27~46中任何一者所示的碱基序列中的编码区的碱基序列的DNA;或者
在严格条件下与具有同序列号27~46中任何一者所示的碱基序列中的编码区的碱基序列互补的碱基序列的DNA杂交,并且编码具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的DNA。
作为该微生物,可以列举:i)在染色体DNA上、以及ii)在染色体外具有外源性的编码具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的DNA的微生物。即,i)的微生物,在亲本株不具有编码具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的DNA时,是在染色体DNA上具有1个或2个以上新导入的该DNA的微生物,在亲本株本来具有编码具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的DNA时,是在染色体DNA上具有包括新导入的该DNA在内的2个以上编码具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的DNA的微生物。ii)的微生物是在质粒DNA上具有编码具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的DNA的微生物。
上述中所说的“杂交”是指,DNA与具有特定碱基序列的DNA或该DNA的一部分杂交。因此,该具有特定碱基序列的DNA或其一部分是能够用作Northern或Southern印记分析的探针,或者能够用作PCR分析的寡核苷酸引物的DNA。作为用作探针的DNA,可以列举至少100个碱基以上、优选200个碱基以上、更优选500个碱基以上的DNA;作为用作引物的DNA,可以列举至少10个碱基以上、优选15个碱基以上的DNA。
DNA杂交实验的方法已经熟知,例如如果是本领域技术人员,则可以根据本说明书决定杂交的条件。该杂交条件除根据分子克隆第2版、第3版(2001年)、Methods for General and Molecular Bacteriology,ASM出版社(1994)、Immunology methods manual,美国学术出版社(分子)的记载之外,还可以根据多种其它标准教科书的记载来进行。
上述严格条件优选为如下条件:将固定有DNA的过滤器和探针DNA在含有50%甲酰胺、5×SSC(750mmol/l氯化钠、75mmol/l柠檬酸钠)、50mmol/l磷酸钠(pH7.6)、5×邓哈特(Denhardt′s)溶液、10%硫酸葡聚糖及20μg/l变性鲑鱼精DNA的溶液中,在42℃下孵育一夜后,在例如约65℃的0.2×SSC溶液中洗涤该过滤器,但也可以使用严格度更低的条件。严格条件的改变可以通过调节甲酰胺的浓度(甲酰胺的浓度越低则严格度越低)、改变盐浓度及温度条件来实现。作为低严格条件,可以列举例如:在含有6×SSCE(20×SSCE为3mol/l氯化钠、0.2mol/l磷酸二氢钠、0.02mol/l EDTA、pH7.4)、0.5%SDS、30%甲酰胺、100μg/l变性鲑鱼精DNA的溶液中,在37℃下孵育一夜后,使用50℃的1×SSC、0.1%SDS溶液进行洗涤的条件。另外,作为严格度更低的条件,可以列举在上述低严格条件中,使用高盐浓度(例如5×SSC)的溶液进行杂交后进行洗涤的条件。
上述各种条件也可以通过添加或改变用于抑制杂交试验的背景的封闭试剂来进行设定。为了使条件合适,上述封闭试剂的添加也可以伴有杂交条件的改变。
作为能够在上述严格条件下进行杂交的DNA,可以例举例如:使用上述BLAST、FASTA等基于上述参数等进行计算时,与具有序列号27~46中任何一者所示的碱基序列中的编码区的碱基序列的DNA有至少90%以上、优选95%以上、更优选97%以上、进一步优选98%以上、特别优选99%以上同源性的DNA。
(2)参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的生物合成的蛋白质的活性高于亲本株的微生物
参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的生物合成的蛋白质的活性高于亲本株的微生物是指:(a)通过改变亲本株的染色体DNA上存在的编码参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的生物合成的蛋白质的基因而得到的、i)该蛋白质的比活性高于亲本株的微生物、及ii)参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的生物合成的蛋白质的产量高于亲本株的微生物;以及(b)用编码参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的生物合成的蛋白质的DNA转化亲本株而得到的微生物。
该亲本株与上述(1)含义相同,可以例示相同的菌株。
参与谷胱甘肽的生物合成的蛋白质是指参与由L-谷氨酸、L-半胱氨酸及甘氨酸生成谷胱甘肽的反应的蛋白质,作为该蛋白质,可以列举例如γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶及谷胱甘肽合成酶。参与γ-谷氨酰半胱氨酸的生物合成的蛋白质是指参与由L-谷氨酸及L-半胱氨酸生成γ-谷氨酰半胱氨酸的反应的蛋白质,作为该蛋白质,可以列举例如γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶。
参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的生物合成的蛋白质的活性高于亲本株的微生物,可以是γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶或谷胱甘肽合成酶的活性、或者γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶及谷胱甘肽合成酶两者的活性高于亲本株的微生物。
参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的生物合成的蛋白质及编码该蛋白质的DNA,只要是具有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性或谷胱甘肽合成酶活性的蛋白质及编码具有该活性的蛋白质的DNA,则均能够用于本发明。
作为参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的生物合成的蛋白质,可以列举:
具有序列号47或48所示的氨基酸序列的蛋白质;
具有序列号47或48所示的氨基酸序列缺失、取代或添加1个以上氨基酸后的氨基酸序列,并且具有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性或谷胱甘肽合成酶活性的蛋白质;及
与序列号47或48所示的氨基酸序列有80%以上的同源性,并且具有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性或谷胱甘肽合成酶活性的蛋白质。
上述中,具有缺失、取代或添加1个以上氨基酸残基后的氨基酸序列,并且具有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性或谷胱甘肽合成酶活性的蛋白质,可以通过与上述(1)同样的方法得到,可以列举具有缺失、取代或添加同样数量的氨基酸残基后的氨基酸序列的蛋白质。
允许缺失、取代或添加的氨基酸残基的位置、种类等与上述(1)相同。
另外,作为参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的生物合成的蛋白质,可以列举具有与序列号47或48所示的氨基酸序列有80%以上的同源性、优选90%以上、更优选95%以上、进一步优选97%以上、特别优选98%以上、最优选99%以上同源性的氨基酸序列,并且具有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性或谷胱甘肽合成酶活性的蛋白质。
氨基酸序列、碱基序列的同源性与上述(1)含义相同。
作为确认具有序列号47或48所示的氨基酸序列缺失、取代或添加1个以上氨基酸后的氨基酸序列的蛋白质是具有谷胱甘肽合成酶活性或γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的蛋白质的方法,可以列举例如如下方法:使用DNA重组法制作表达想要确认活性的蛋白质的转化子,并使用该转化子制造该蛋白质后,使该蛋白质、以及γ-谷氨酰半胱氨酸及甘氨酸、或L-谷氨酸及L-半胱氨酸存在于水性介质中,通过HPLC等分析该水性介质中是否生成、累积了谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸。
作为上述(a)的i)的参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的生物合成的蛋白质的比活性高于亲本株的微生物,可以列举如下微生物:含有突变型蛋白质,所述蛋白质具有在亲本株含有的该蛋白质的氨基酸序列中取代1个以上的氨基酸、优选1~10个氨基酸、更优选1~5个氨基酸、进一步优选1~3个氨基酸后的氨基酸序列,因此与亲本株的参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的生物合成的蛋白质相比活性提高。
作为上述(a)的ii)的参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的生物合成的蛋白质的产量高于亲本株的微生物,可以列举如下微生物:含有在亲本株的染色体DNA上存在的编码该蛋白质的DNA的转录调控区或启动子区的碱基序列中取代1个以上碱基、优选1~10个碱基、更优选1~5个碱基、进一步优选1~3个碱基后的启动子区,因此与亲本株的参与谷胱甘肽生物合成的蛋白质的产量相比,该蛋白质的产量提高。
作为用编码参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的生物合成的蛋白质的DNA进行转化而得到的转化子,可以列举使用如下DNA进行转化而得到的微生物:
编码上述[7]~[9]中任一项所述的蛋白质的DNA;
具有序列号49或50所示的碱基序列的DNA;
具有序列号49或50所示的碱基序列中的编码区的碱基序列的DNA;或者
在严格条件下与具有同序列号49或50所示的碱基序列中的编码区的碱基序列互补的碱基序列的DNA杂交,并且编码具有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性或谷胱甘肽合成酶活性的蛋白质的DNA。
作为该微生物,可以列举:i)在染色体DNA上、以及ii)在染色体外具有外源性的编码参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的生物合成的蛋白质的DNA的微生物。即,i)的微生物,在亲本株不具有编码参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的生物合成的蛋白质的DNA时,是在染色体DNA上具有1个或2个以上新导入的该DNA的微生物,在亲本株本来具有编码参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的生物合成的蛋白质的DNA时,是在染色体DNA上具有包括新导入的该DNA在内的2个以上编码参与谷胱甘肽生物合成的蛋白质的DNA的微生物。ii)的微生物是在质粒DNA上具有编码参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的生物合成的蛋白质的DNA的微生物。
上述中所说的“杂交”与上述(1)含义相同。
作为能够在上述严格条件下进行杂交的DNA,可以例举例如:使用上述BLAST、FASTA等基于上述参数等进行计算时,与序列号49或50所示的碱基序列有至少90%以上、优选95%以上、更优选97%以上、进一步优选98%以上、特别优选99%以上同源性的DNA。
(3)谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的分解活性低于亲本株或丧失的微生物
作为本发明中使用的谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的分解活性低于亲本株或丧失的微生物,可以列举:通过在染色体DNA上的编码参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸分解的蛋白质的基因的碱基序列中导入碱基的缺失、取代或添加而得到的、(a)与导入碱基取代等之前的亲本株相比,谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的分解活性降低至80%以下、优选50%以下、更优选30%以下、进一步优选20%以下、特别优选10%以下、最优选0%的微生物;以及(b)与导入碱基取代等之前的亲本株相比,该基因的转录量或者参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸分解的蛋白质的产量降低至80%以下、优选50%以下、更优选30%以下、进一步优选20%以下、特别优选10%以下、最优选0%的微生物。可以更优选列举编码参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸分解的蛋白质的基因的一部分或全部发生缺陷的微生物,进一步优选列举该基因中的编码区全部发生缺陷的微生物。
参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸分解的蛋白质,可以是参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸分解的任意步骤的蛋白质,可以优选列举:γ-谷氨酰转肽酶及γ-谷氨酰-γ-氨基丁酸水解酶[YcjL蛋白质:J.Bacteriol.,280,4602(2005)]等。
作为γ-谷氨酰转肽酶,可以列举:
具有序列号51所示的氨基酸序列的蛋白质;及
具有与序列号51所示的氨基酸序列有80%以上、优选90%以上、更优选95%以上、进一步优选97%以上、特别优选98%以上、最优选99%以上同源性的氨基酸序列,并且具有γ-谷氨酰转肽酶活性的蛋白质等。
氨基酸序列、碱基序列的同源性与上述(1)含义相同。
作为编码γ-谷氨酰转肽酶的基因,可以列举如下DNA:
编码上述[14]或[15]中任一项的蛋白质的DNA;
具有序列号52所示的碱基序列的DNA;
具有序列号52所示的碱基序列中的编码区的碱基序列的DNA;及
在严格条件下与具有同序列号52所示的碱基序列中的编码区的碱基序列互补的碱基序列的DNA杂交,并且编码具有γ-谷氨酰转肽酶活性的蛋白质的DNA等。
本说明书中的基因是指,除蛋白质的编码区之外,还可以包含转录调控区及启动子区等的DNA。
作为转录调控区,可以列举由染色体DNA上编码区的5’末端上游侧100个碱基、优选50个碱基构成的DNA,作为启动子区,可以列举与-10及-35区域相当的区域。
在编码具有谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸分解活性的蛋白质的基因中导入碱基的缺失、取代或添加,只要是使该蛋白质的活性低于亲本株或丧失的碱基的缺失、取代或添加,则碱基的种类及数量没有限制,作为碱基的缺失,可以列举如下缺失:启动子及转录调控区优选10个碱基以上、更优选20个碱基以上、进一步优选全部区域缺失;编码区优选10个碱基以上、更优选20个碱基以上、进一步优选100个碱基以上、特别优选200个碱基以上、最优选编码区全部缺失。
作为碱基的取代,可以列举如下取代:取代编码区的5’末端起第150个以内的碱基、优选第100个以内的碱基、更优选第50个以内的碱基、特别优选第30个以内的碱基、最优选第20个以内的碱基从而导入无义密码子。
作为碱基的添加,可以列举如下添加:在编码区的5’末端起第150个以内的碱基、优选第100个以内的碱基、更优选第50个以内的碱基、特别优选第30个以内的碱基、最优选第20个以内的碱基后,添加50个碱基以上、优选100个碱基以上、更优选200个碱基以上、进一步优选500个碱基以上、特别优选1kb以上的DNA片段,可以特别优选列举插入氯霉素抗性基因及卡那霉素抗性基因等。
所得微生物是谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的分解活性低于亲本株或丧失的微生物,可以通过使用公知的方法测定谷胱甘肽的分解活性低于亲本株的比例来进行确认。
上述中所说的“杂交”与上述(1)含义相同。
作为能够在上述严格条件下进行杂交的DNA,可以例举例如:使用上述BLAST、FASTA等基于上述参数等进行计算时,与序列号9所示的碱基序列有至少90%以上、优选95%以上、更优选97%以上、进一步优选98%以上、特别优选99%以上同源性的DNA。
(4)参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的摄取的蛋白质的活性低于亲本株或丧失的微生物
作为具有与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的摄取相关的活性(以下,简称为谷胱甘肽摄取活性)的蛋白质的活性低于亲本株或丧失的微生物,可以列举:通过在染色体DNA上的编码具有谷胱甘肽摄取活性的蛋白质的任何一个基因的碱基序列中导入碱基的缺失、取代或添加而得到的、(a)与导入碱基取代等之前的亲本株相比,谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的摄取活性降低至80%以下、优选50%以下、更优选30%以下、进一步优选20%以下、特别优选10%以下、最优选0%的微生物;以及(b)与导入碱基取代等之前的亲本株相比,编码具有谷胱甘肽摄取活性的蛋白质的任何一个基因的转录量或具有谷胱甘肽摄取活性的蛋白质的产量降低至80%以下、优选50%以下、更优选30%以下、进一步优选20%以下、特别优选10%以下、最优选0%的微生物。可以更优选列举编码具有谷胱甘肽摄取活性的蛋白质的基因的一部分或全部发生缺陷的微生物,进一步优选列举编码具有谷胱甘肽摄取活性的蛋白质的基因全部发生缺陷的微生物。
作为具有谷胱甘肽摄取活性的蛋白质,可以列举:
具有序列号53~57中任何一者所示的氨基酸序列的蛋白质;及
具有与序列号53~57中任何一者所示的氨基酸序列有80%以上、优选90%以上、更优选95%以上、进一步优选97%以上、特别优选98%以上、最优选99%以上同源性的氨基酸序列,并且具有谷胱甘肽摄取活性的蛋白质等。
氨基酸序列、碱基序列的同源性与上述(1)含义相同。
作为编码具有谷胱甘肽摄取活性的蛋白质的基因,可以列举如下DNA:
编码上述[20]或[21]中任一项的蛋白质的DNA;
具有序列号58所示的碱基序列的DNA;
具有序列号58所示的碱基序列中的任何一个编码区的碱基序列的DNA;及
在严格条件下与具有同序列号58所示的碱基序列中的任何一个编码区的碱基序列互补的碱基序列的DNA杂交,并且编码谷胱甘肽摄取蛋白质的DNA等。
上述基因、转录调控区及启动子与上述(3)含义相同。
在编码具有谷胱甘肽摄取活性的蛋白质的基因中导入碱基的缺失、取代或添加,只要是使该蛋白质的活性低于亲本株或丧失的碱基的缺失、取代或添加,则碱基的种类及数量没有限制,可以列举导入与上述(3)相同的碱基的缺失、取代或添加。
所得微生物是谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的摄取活性低于亲本株或丧失的微生物,可以通过使用标记的谷胱甘肽的摄取活性测定法[J.Bacteriol.,186,343(2004)]测定谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的摄取活性低于亲本株的比例来进行确认。
上述中所说的“杂交”与上述(1)含义相同。
作为能够在上述严格条件下进行杂交的DNA,可以例举例如:使用上述BLAST、FASTA等基于上述参数等进行计算时,与序列号58所示的碱基序列中的任何一个编码区的碱基序列有至少90%以上、优选95%以上、更优选97%以上、进一步优选98%以上、特别优选99%以上同源性的DNA。
本发明中使用的微生物,只要是具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的活性、及参与谷胱甘肽的生物合成的蛋白质的活性高于亲本株的微生物,则可以是任意的微生物,可以优选列举原核生物,更优选列举细菌,进一步优选列举属于埃希氏菌属的微生物,特别优选列举大肠杆菌。
2.本发明中使用的微生物的制备
(1)具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的活性高于亲本株的微生物的制备
具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的活性高于亲本株的微生物中,比活性高于亲本株的具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的微生物可以如下得到:通过将编码具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的DNA供给在体外使用诱变剂的诱变处理或易错PCR(Error-prone PCR)等,在该DNA中导入突变,然后使用公知的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,97,6640(2000)],使该突变DNA取代亲本株的染色体DNA上存在的导入突变前的编码具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的DNA,由此制作表达该突变DNA的变异体,使用上述内翻外囊泡的方法比较亲本株和变异体的谷胱甘肽转运活性。
另外,具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的活性高于亲本株的微生物中,该蛋白质的产量比亲本株的产量提高的微生物可以通过如下方法确认:通过将具有编码亲本株含有的具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的基因的转录调控区和启动子区、例如该蛋白质的起始密码子上游侧200bp、优选100bp的碱基序列的DNA,供给体外的诱变处理或易错PCR等,在该DNA中导入突变,然后使用公知的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,97,6640(2000)],使该突变DNA取代亲本株的染色体DNA上存在的导入突变前的编码具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的基因的转录调控区和启动子区,由此制作具有突变型转录调控区或启动子区的变异体,通过RT-PCR或Northern杂交等,比较亲本株和变异体的编码具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的基因的转录量,或者,通过SDS-PAGE等比较亲本株和变异体的编码具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的产量。
另外,通过将亲本株的编码具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的基因的启动子区取代为公知的强启动子序列,也能够得到与亲本株相比具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的产量提高的微生物。
作为这样的启动子,可以列举在大肠杆菌中发挥功能的trp启动子(P trp )、lac启动子(P lac )、PL启动子、PR启动子、PSE启动子等大肠杆菌、噬菌体等来源的启动子、SPO1启动子、SPO2启动子、penP启动子等。另外,还可以列举2个P trp 串联的启动子、tac启动子、lacT7启动子、letI启动子等人工构建的启动子。
下面,对编码具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的DNA的获得方法和用该DNA转化亲本株而得到的微生物的制备方法进行详细说明。
(a)编码具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的DNA的获得
编码具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的DNA,例如可以如下获得:使用能够基于上述1(1)的编码具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的DNA的碱基序列进行设计的探针DNA,对微生物、优选大肠杆菌的染色体DNA文库进行Southern杂交,或者,使用能够基于该碱基序列进行设计的引物DNA,以微生物、优选大肠杆菌的染色体DNA为模板进行PCR[PCR Protocols,美国学术出版社(1990)]。
另外,在各种基因序列数据库中,检索与上述1(1)的编码具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的DNA的碱基序列有80%以上、优选90%以上、更优选95%以上、进一步优选97%以上、特别优选98%以上、最优选99%以上同源性的序列,基于该检索所得到的碱基序列,通过上述方法也能够由具有该碱基序列的微生物的染色体DNA、cDNA文库等获得编码具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的DNA。
将获得的DNA直接或者用适当的限制性内切酶等酶切后,通过常法整合到载体中,将得到的重组体DNA导入宿主细胞,然后使用常用的碱基序列分析方法、例如双脱氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,74,5463(1977)]或使用3700 DNA分析仪(美国应用生物系统公司制)等碱基序列分析装置进行分析,由此能够确定该DNA的碱基序列。
作为上述载体,可以列举:pBluescriptII KS(+)(Stratagene公司制)、pDIRECT[Nucleic Acids Res.,18,6069(1990)]、pCR-ScriptAmpSK(+)(Stratagene公司制)、pT7Blue(Novagen公司制)、pCR II(英杰生命技术有限公司制)及pCR-TRAP(ジ一ンハンタ一公司制)等。
作为宿主细胞,可以列举属于埃希氏菌属的微生物等。作为属于埃希氏菌属的微生物,可以列举例如:大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌ATCC12435、大肠杆菌W1485、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌No.49、大肠杆菌W3110、大肠杆菌NY49、大肠杆菌MP347、大肠杆菌NM522、大肠杆菌BL21、大肠杆菌ME8415等。
作为重组体DNA的导入方法,只要是在宿主细胞中导入DNA的方法均可以使用,可以列举例如:使用钙离子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,69,2110(1972)]、原生质体法(日本特开昭63-248394)、电穿孔法[ucleic Acids Res.,16,6127(1988)]等。
碱基序列确定后的结果是,在获得的DNA为部分长度时,通过使用该部分长度DNA作为探针,对染色体DNA文库进行Southern杂交法等,能够得到全长DNA。
另外,基于所确定的DNA的碱基序列,通过使用PerseptiveBiosystems公司制8905型DNA合成装置等进行化学合成,也能够得到目标DNA。
作为如上得到的DNA,可以列举例如:编码具有序列号1~26中任何一者所示的氨基酸序列的蛋白质的DNA、和具有序列号27~46中任何一者所示的碱基序列的DNA。
(b)用表达具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的质粒载体转化的微生物的获得
基于通过上述(a)的方法得到的编码具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的DNA,根据需要制备包含编码具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的部分的适当长度的DNA片段。另外,通过取代碱基,使编码具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的部分的碱基序列成为最适合在宿主细胞中表达的密码子,能够得到产率提高的转化子。
通过将该DNA片段插入到适当表达载体的启动子的下游,制作重组体DNA。
通过将该重组体DNA导入适合该表达载体的宿主细胞中,能够得到具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的活性高于宿主细胞、即亲本株的转化子。
作为宿主细胞,可以使用微生物,优选原核生物,更优选细菌,进一步优选属于埃希氏菌属的微生物,最优选大肠杆菌。
作为表达载体,可以使用在上述宿主细胞中能够自主复制或能够整合到染色体中、并且在能够转录编码具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的DNA的位置含有启动子的表达载体。
使用原核生物作为宿主细胞时,具有编码具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的DNA的重组体DNA优选为,在原核生物中能够自主复制,并且由启动子、核糖体结合序列、编码具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的DNA、转录终止序列构成的重组体DNA。也可以含有调控启动子的基因。
作为表达载体,可以例示:pColdI(宝生物工程有限公司制)、pCDF-1b、pRSF-1b(均为Novagen公司制)、pMAL-c2x(纽英伦生物技术有限公司制)、pGEX-4T-1(GE Healthcare Bio-Sciences公司制)、pTrcHis(英杰生命技术有限公司制)、pSE280(英杰生命技术有限公司制)、pGEMEX-1(普洛麦格生物技术有限公司制)、pQE-30(凯杰生物技术有限公司制)、pET-3(Novagen公司制)、pKYP10(日本特开昭58-110600)、pKYP200[Agric.Biol.Chem.,48,669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.,53,277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,82,4306(1985)]、pBluescriptIISK(+)、pBluescriptII KS(-)(Stratagene公司制)、pTrS30[由大肠杆菌JM109/pTrS30(FERMBP-5407)制备]、pTrS32[由大肠杆菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)制备]、pPAC31(WO98/12343)、pUC19[Gene,33,103(1985)]、pSTV28(宝生物工程有限公司制)、pUC118(宝生物工程有限公司制)、pPA1(日本特开昭63-233798)等。
作为启动子,只要能在大肠杆菌等宿主细胞中发挥功能,则可以是任何启动子。可以列举例如:trp启动子(P trp )、lac启动子(P lac )、PL启动子、PR启动子、PSE启动子等大肠杆菌、噬菌体等来源的启动子、SPO1启动子、SPO2启动子、penP启动子等。另外,还可以使用2个P trp 串联的启动子、tac启动子、lacT7启动子、letI启动子等人工改变设计的启动子等。
另外,也可以使用用于在属于芽孢杆菌(Bacillus)属的微生物中表达的xylA启动子[Appl.Microbiol.Biotechnol.,35,594-599(1991)]、用于在属于棒状杆菌(Corynebacterium)属的微生物中表达的P54-6启动子[Appl.Microbiol.Biotechnol.,53,674-679(2000)]等。
优选使用将作为核糖体结合序列的Shine-Dalgarno序列与起始密码子之间调节为适当距离(例如6~18个碱基)的质粒。
使编码具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的DNA结合在表达载体上而得到的重组体DNA中,不一定必须有转录终止序列,但优选紧邻结构基因之后设置转录终止序列。
作为这样的重组体DNA,可以列举例如:后述的pCYD1、pBcr2、pYgeD2、pYceE2、pCmr、pMarRAB、pAcrAB、pEmrAB、pEmrE、pYdhC、pYdeE、pYdeA、pEmrKY、pEmrD、pYajR、pYegB、pYidY、pYieO和pYjiO。
作为该重组体DNA的宿主,可以列举属于埃希氏菌(Escherichia)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、短杆菌(Brevibacterium)属或棒状杆菌(Corynebacterium)属等的微生物,例如大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌ATCC12435、大肠杆菌W1485、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌No.49、大肠杆菌W3110、大肠杆菌NY49、大肠杆菌MP347、大肠杆菌NM522、大肠杆菌BL21、大肠杆菌ME8415、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC33712、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)、Brevibacterium immariophilumATCC 14068、解糖短杆菌_(Brevibacterium saccharolyticum)ATCC14066、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC14067、乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC13869、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC14297、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC13870等。作为更优选的宿主,可以列举大肠杆菌。
(c)编码具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的DNA整合到染色体DNA中的微生物的获得
通过将由上述(a)的方法得到的编码具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的DNA整合到染色体DNA的任意位置上,能够得到具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的活性高于亲本株的微生物。
作为将编码具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的DNA整合到微生物的染色体DNA的任意位置上的方法,可以列举利用同源重组的方法,在使用大肠杆菌作为宿主、即亲本株时,可以列举Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,97,6640(2000)中记载的方法。
(2)参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的生物合成的蛋白质的活性高于亲本株的微生物的制备
参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的生物合成的蛋白质的活性高于亲本株的微生物中,比活性高于亲本株的该蛋白质的微生物以及该蛋白质的产量高于亲本株的微生物与上述(1)同样,可以如下得到:通过将编码参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的生物合成的蛋白质的DNA供给在体外的诱变处理或易错PCR等能够得到突变型酶基因,用该突变型酶基因取代亲本株的基因。
将得到的具有突变型酶基因的微生物和亲本株分别在液体培养基中培养,用公知的方法测定培养物中所含的谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的量并进行比较,由此能够确认参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的生物合成的蛋白质的活性高于亲本株。
下面,对编码参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的生物合成的蛋白质的DNA的获得方法和用该DNA转化亲本株而得到的微生物的制备方法进行详细说明。
(a)编码参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的生物合成的蛋白质的DNA的获得
编码作为参与谷胱甘肽和γ-谷氨酰半胱氨酸生物合成的蛋白质的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的DNA、以及编码作为参与谷胱甘肽生物合成的蛋白质的谷胱甘肽合成酶的DNA,可以根据上述1(2)的编码参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸生物合成的蛋白质的DNA的碱基序列,通过与上述2(1)(a)同样的方法得到。
作为能够通过上述方法得到的DNA,可以列举:编码具有序列号47所示的氨基酸序列的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、并且具有序列号49所示的碱基序列的DNA,以及编码具有序列号48所示的氨基酸序列的谷胱甘肽合成酶、并且具有序列号50所示的碱基序列的DNA。
(b)用表达参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的生物合成的蛋白质的质粒载体转化的微生物的获得
表达γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶或谷胱甘肽合成酶的质粒载体,可以使用上述2(2)中得到的编码γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的DNA、或编码谷胱甘肽合成酶的DNA,通过与上述2(1)(b)同样的方法得到。
作为能够通过上述方法得到的表达参与γ-谷氨酰半胱氨酸或谷胱甘肽的生物合成的蛋白质的质粒载体,可以列举例如:后述的表达γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的pGH1、以及表达γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶两种酶的pGH3。
(c)编码参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸生物合成的蛋白质的DNA整合到染色体DNA中的微生物的获得
通过将由上述2(2)(a)的方法得到的编码参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的生物合成的蛋白质的DNA整合到染色体DNA的任意位置上,能够得到参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的生物合成的蛋白质的活性高于亲本株的微生物。
整合到染色体DNA中的编码参与谷胱甘肽的生物合成的蛋白质的DNA,可以是编码γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的DNA和编码谷胱甘肽合成酶的DNA两种DNA,也可以是其中任何一种DNA。
将DNA整合到微生物的染色体DNA的任意位置上,可以通过与上述2(1)(c)同样的方法进行。
另外,公知的编码比活性提高的突变型γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的DNA[Appl.Envir.Microbiol.,44,1444(1982)、J.Gen.Microbiol.,128,1047(1982)]、或突变型谷胱甘肽合成酶[J.Biol.Chem.,263,11646(1988)、Biochemistry,31,2259(1992)],也可以用于本发明的制造方法。
(d)增强了底物供给的微生物的获得
通过增强参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸生物合成的蛋白质活性高的微生物的、选自L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸的氨基酸的生产能力,能够进一步增强该微生物的谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的生物合成能力。
作为增强微生物的选自L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸的氨基酸的生产能力的方法,可以列举如下方法,这些公知的方法可以单独或组合使用:
i)削弱或消除至少一种调控上述任何一种氨基酸的生物合成的机制的方法;
ii)增强表达至少一种参与上述任何一种氨基酸的生物合成的酶的方法;
iii)增加至少一个参与上述任何一种氨基酸的生物合成的酶基因的拷贝数的方法;
iv)削弱或阻断至少一条从上述任何一种氨基酸的生物合成通路分出的、生成该氨基酸以外的代谢产物的代谢通路的方法;和
v)筛选与亲本株相比对上述任何一种氨基酸的类似物的抗性高的细胞株的方法等。
上述i)的具体方法记载于Agric.Biol.Chem.,43,105-111(1979)、J.Bacteriol.,110,761-763(1972)和Appl.Microbiol.Biotechnol.,39,318-323(1993)等中。上述ii)的具体方法记载于Agric.Biol.Chem.,43,105-111(1979)和J.Bacteriol.,110,761-763(1972)等中。上述iii)的具体方法记载于Appl.Microbiol.Biotechnol.,39,318-323(1993)和Agric.Biol.Chem.,39,371-377(1987)等中。上述iv)的具体方法记载于Appl.Environ.Microbiol.,38,181-190(1979)和Agric.Biol.Chem.,421773-1778(1978)等中。上述v)的具体方法记载于Agric.Biol.Chem.,36,1675-1684(1972)、Agric.Biol.Chem.,41,109-116(1977)、Agric.Biol.Chem.,37,2013-2023(1973)和Agric.Biol.Chem.,51,2089-2094(1987)等中。可以参考上述文献等制备具有生产上述氨基酸的能力的微生物。
另外,关于利用上述i)~v)中的任何一种方法或组合方法制备具有生产上述氨基酸的能力的微生物的方法,记载在Biotechnology 2nd ed.,Vol.6,Products of Primary Metabolism(VCH VerlagsgesellschaftmbH,Weinheim,1996)section 14a,14b、Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology,79,1-35(2003)、以及氨基酸发酵,学会出版中心,相田浩等(1986)中,通过参考上述文献等,能够制备具有生产上述氨基酸的能力的微生物。
作为具有生产L-谷氨酸的能力的微生物的具体制备方法,可以列举例如:制备α-酮戊二酸脱氢酶(SucA蛋白质)活性降低或丧失的大肠 杆菌的方法[Mol.Gen.Genet.,105,182(1969)]、以及制备组成性表达苹果酸合成酶(AceB蛋白质)、异柠檬酸裂合酶(AceA蛋白质)、异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶(AceK蛋白质)操纵子的大肠杆菌的方法[J.Bacteriol.96,2185(1968)](日本特开平5-244970号)。
作为具有生产L-半胱氨酸的能力的微生物的具体制备方法,可以列举例如下述方法:通过将大肠杆菌的编码丝氨酸乙酰基转移酶的基因中与该酶的第256个蛋氨酸对应的密码子取代为编码异亮氨酸的密码子,制备表达与野生型酶相比L-半胱氨酸引起的反馈抑制降低的突变型丝氨酸乙酰基转移酶的大肠杆菌[J.Gen.Microb.,133,515(1987)]。
作为具有生产甘氨酸的能力的微生物的具体制备方法,可以列举例如制备甘氨酸分解酶活性低于亲本株或丧失的大肠杆菌的方法[Mol.Gen.Genet.,192,15(1983)]。
(3)谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的分解活性低于亲本株或丧失的微生物的获得
下面,对γ-谷氨酰转肽酶的活性低于亲本株或丧失的微生物的获得进行说明,但其它参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸分解的蛋白质的活性低于亲本株或丧失的微生物也能够通过同样的方法获得。
(a)编码γ-谷氨酰转肽酶的基因的获得
编码γ-谷氨酰转肽酶的基因,例如可以根据上述1(3)的编码γ-谷氨酰转肽酶的基因的碱基序列,通过与上述2(1)(a)相同的方法获得。
作为能够通过上述方法得到的基因,可以列举编码具有序列号51所示的氨基酸序列的γ-谷氨酰转肽酶、并且具有序列号52所示的碱基序列的基因。
(b)γ-谷氨酰转肽酶的活性降低或丧失的微生物的获得
γ-谷氨酰转肽酶的活性低于亲本株或丧失的微生物,可以通过如下方法获得:用UV照射、诱变剂等对微生物进行诱变处理后,筛选γ-谷氨酰转肽酶的活性低于亲本株或丧失的菌株的方法;或者在微生物染色体DNA上编码γ-谷氨酰转肽酶的基因的碱基序列中导入碱基的缺失、取代或添加的方法等。
在编码γ-谷氨酰转肽酶的基因的碱基序列中导入碱基的缺失、取代或添加的位置如上述1(3)所述。
作为在微生物的染色体DNA的基因中导入碱基的缺失、取代或添加的方法,可以列举利用同源重组的方法。作为一般的利用同源重组的方法,可以列举使用同源重组用质粒的方法,该质粒可以如下制备:使用能够通过上述2(3)(a)获得的编码γ-谷氨酰转肽酶的基因,制备导入了碱基的缺失、取代或添加的突变基因,并将其与在期望导入碱基缺失等的宿主细胞内不能自主复制的、具有抗药性基因的质粒DNA连接,作为大肠杆菌中常用的利用同源重组的方法,可以列举利用λ噬菌体的同源重组系统来导入碱基的缺失、取代或添加的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97,6641-6645(2000)]。
所得微生物是谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的分解活性低于亲本株或丧失的微生物,可以通过使用公知的方法测定谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的分解活性低于亲本株的比例来进行确认。
(4)谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的摄取活性低于亲本株或丧失的微生物的获得
(a)编码具有谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸摄取活性的蛋白质的基因的获得
编码具有谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸摄取活性的蛋白质的基因,例如可以根据上述1(4)的编码具有谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸摄取活性的蛋白质的基因的碱基序列,通过与上述2(1)(a)相同的方法获得。
作为能够通过上述方法得到的基因,可以列举:编码参与具有序列号53~57所示的氨基酸序列的谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸摄取的蛋白质、并且具有序列号58所示的碱基序列的DNA,以及含有该碱基序列中的编码区的DNA。
(b)谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的摄取活性低于亲本株或丧失的微生物的获得
谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的摄取活性低于亲本株或丧失的微生物与上述2(3)(b)相同,可以通过如下方法获得:用UV照射、诱变剂等对微生物进行诱变处理后,筛选谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的摄取活性低于亲本株或丧失的菌株的方法;或者在微生物染色体DNA上编码具有谷胱甘肽摄取活性的蛋白质的基因的碱基序列中导入碱基的缺失、取代或添加的方法等。
作为在微生物的染色体DNA上的基因中导入碱基的缺失、取代或添加的方法,可以列举上述2(3)(b)的方法。
所得微生物是谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的摄取活性低于亲本株或丧失的微生物,可以通过使用标记的谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的摄取活性测定法[J.Bacteriol.,186,343(2004)]测定谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的摄取活性低于亲本株的比例来进行确认。
3.本发明的谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的制造方法
作为本发明的谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的制造方法,可以列举具有如下特征的谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的制造方法:在培养基中培养具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的活性高于亲本株、并且参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸生物合成的蛋白质的活性高于亲本株的微生物,在该培养基中生成并累积谷胱甘肽,以及从培养物中收集谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸。
本发明的制造方法中使用的培养基,只要含有碳源、氮源、无机盐、维生素等本发明中使用的微生物的增殖及谷胱甘肽的生物合成所必需的营养素,则可以是合成培养基、天然培养基中的任何一种。
另外,可以根据需要在培养基中添加选自L-谷氨酸、L-半胱氨酸及甘氨酸的氨基酸。作为在培养基中添加的量,以各氨基酸计为0.1~100g/l、优选1~50g/l、更优选5~20g/l。
作为碳源,只要是能够被使用的微生物利用的碳源则可以是任意碳源,可以列举:葡萄糖、果糖等糖类;乙醇、甘油等醇类;醋酸等有机酸类等。
作为氮源,可以列举:氨、硫酸铵等铵盐、胺等氮化物、蛋白胨、大豆水解物等天然氮源等。
作为无机盐,可以列举:磷酸钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、碳酸钾等。
作为维生素,可以列举生物素、硫胺等。还可以根据需要添加本发明的微生物生长所需的物质(例如,如果是氨基酸营养缺陷型微生物则需要氨基酸)。
培养优选在振荡培养、通气搅拌培养等有氧条件下进行。培养温度为20~50℃、优选20~42℃、更优选28~38℃。培养时的pH为5~9,优选6~7.5。培养时间为5小时~5天,优选16小时~3天。
培养物中累积的谷胱甘肽可以通过通常的纯化方法来收集。例如,可以在培养结束后通过离心分离等除去培养物中的菌体、固形物,然后通过离子交换、浓缩、分级结晶来进行收集。
下面,利用实施例具体地说明本发明,但本发明并不限于下述实施例。
实施例1
γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶或谷胱甘肽合成酶表达质粒的构建
使用Perseptive Biosystems公司制8905型DNA合成仪,基于具有序列号49所示的碱基序列、编码大肠杆菌的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的基因(gshA基因),合成具有序列号59和60所示的碱基序列的DNA,并且基于具有序列号50所示的碱基序列、编码大肠杆菌的谷胱甘肽合成酶的基因(gshB基因)的碱基序列,合成具有序列号61和62所示的碱基序列的DNA。
以大肠杆菌W3110株的染色体DNA为模板,分别使用具有序列号59和60、以及序列号61和62所示的碱基序列的DNA作为引物组,进行PCR。PCR如下进行:制备含有0.1μg染色体DNA、0.5μmol/L各引物、2.5单位Pfu DNA聚合酶、4μL Pfu DNA聚合酶用×10缓冲液、200μmol/L各dNTP的反应液40μL,以94℃下1分钟、55℃下2分钟、72℃下2分钟为1个步骤,反复进行30次。
通过使用序列号59和60的PCR,得到相当于gshA基因片段的约1.6kb的片段(以下,称为gshA基因扩增片段),通过使用序列号61和62的反应,得到相当于gshB基因片段的约1.0kb的片段(以下,称为gshB基因扩增片段)。
将上述得到的gshA基因扩增片段用ClaI和BamHI酶切、并将gshB基因扩增片段用BglII和BamHI酶切后,使用GENECLEAN II试剂盒,纯化各扩增片段。
同样地,将含有trp启动子的表达载体pTrS30用ClaI和BamHI酶切后,纯化4.5kb的DNA片段。
将上述得到的gshA基因扩增片段与4.5kb的DNA片段使用连接试剂盒(ligation kit)进行连接。
使用得到的连接DNA转化大肠杆菌NM522株,以氨苄青霉素抗性为指标筛选转化子。
根据公知的方法从该转化子中提取质粒,确认得到了在trp启动子下游连接有gshA基因的表达载体,将该质粒命名为pGH1。
将pGH1用BamHI酶切后,通过与上述同样的方法纯化约6.1kb的DNA片段。将该DNA片段在60℃下进行30分钟碱性磷酸酶(大肠杆菌C75,宝生物工程有限公司制)处理,由此进行脱磷酸化。
将上述得到的gshB基因扩增片段与碱性磷酸酶处理后的6.1kb的DNA片段使用连接试剂盒进行连接。
使用得到的连接DNA转化大肠杆菌NM522株,以氨苄青霉素抗性为指标筛选转化子。
根据公知的方法从该转化子中提取质粒,确认得到了在gshA基因的下游正向插入有gshB基因的质粒,将该质粒命名为pGH3。
实施例2
编码具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的基因的表达质粒的构建
(1)cydDC基因表达质粒的构建
与上述实施例1同样,使用DNA合成仪,基于具有序列号27所示的碱基序列的大肠杆菌的cydD基因和cydC基因(以下,称为cydD-cydC基因),分别合成具有序列号63和64所示的碱基序列的DNA。
以大肠杆菌W3110株的染色体DNA为模板,使用具有序列号63和64所示的碱基序列的DNA作为引物组,进行PCR。PCR如下进行:制备含有0.1μg染色体DNA、0.5μmol/L各引物、2.5单位Pfu DNA聚合酶、4μL Pfu DNA聚合酶用×10缓冲液、200μmol/L各dNTP的反应液40μL,以94℃下1分钟、55℃下2分钟、72℃下4分钟为1个步骤,反复进行30次。
通过该PCR,得到相当于cydD-cydC基因片段的约3.7kb的片段(以下,称为cydD-cydC基因扩增片段)。
将得到的cydD-cydC基因扩增片段用HindIII和BamHI酶切后,使用GENECLEAN II试剂盒进行纯化。
将具有pACYC184的复制起点且含有氯霉素抗性基因的质粒载体pSTV29(宝生物工程有限公司制)用HindIII和BamHI酶切后,通过与上述相同的方法纯化3.0kb的DNA片段。
将上述得到的3.7kb的cydD-cydC基因扩增片段与3.0kb的DNA片段使用连接试剂盒进行连接。
使用得到的连接DNA转化大肠杆菌NM522株,以氯霉素抗性为指标筛选转化子。
根据公知的方法从该转化子中提取质粒,确认得到了cydD-cydC基因表达载体,将该质粒命名为pCYD1。
(2)bcr基因、ygeD基因和yceE基因表达质粒的构建
与上述实施例1同样,使用DNA合成仪,基于具有序列号28所示的碱基序列的大肠杆菌的bcr基因,合成具有序列号65和66所示的碱基序列的DNA,基于具有序列号29所示的碱基序列的大肠杆菌的ygeD基因,合成具有序列号67和68所示的碱基序列的DNA,并且基于具有序列号30所示的碱基序列的大肠杆菌的yceE基因,合成具有序列号69和70所示的碱基序列的DNA。
以大肠杆菌W3110株的染色体DNA为模板,bcr基因片段的扩增使用上述的具有序列号65和66所示的碱基序列的DNA作为引物组,ygeD基因片段的扩增使用上述的具有序列号67和68所示的碱基序列的DNA作为引物组,yceE基因片段的扩增使用上述的具有序列号69和70所示的碱基序列的DNA作为引物组,分别进行PCR。
PCR除了使用的引物DNA各自不同之外,在与上述(2)同样的条件下进行。
通过该PCR,得到相当于各基因片段的约1.2kb的片段(以下,分别称为bcr基因扩增片段、ygeD基因扩增片段和yceE基因扩增片段)。
将得到的bcr基因扩增片段用HindIII和SacI酶切、将ygeD基因扩增片段和yceE基因扩增片段用ClaI和BamHI酶切后,使用GENECLEAN II试剂盒分别进行纯化。
将含有trp启动子的表达载体pTrS30用HindIII和SacI、或者ClaI和BamHI酶切后,通过与上述相同的方法纯化各4.5kb的DNA片段。
将bcr基因扩增片段与上述得到的pTrS30的HindIII和SacI酶切片段使用连接试剂盒进行连接。另外,ygeD基因扩增片段和yceE基因扩增片段,使用连接试剂盒与上述得到的pTrS30的ClaI和BamHI酶切片段分别连接。
使用得到的各连接DNA转化大肠杆菌NM522株,以氨苄青霉素抗性为指标筛选转化子。
根据公知的方法从该转化子中提取质粒,确认得到了在trp启动子(以下,记为Ptrp)的下游含有bcr基因、ygeD基因或yceE基因的表达载体,分别命名为pBcr1、pYgeD1和pYceE1。
接着,将pBcr1用EcoRI和SacI酶切、将pYgeD1和pYceE1用EcoRI和BamHI酶切后,使用GENECLEAN试剂盒分别纯化在Ptrp的下游配置有各基因的约1.6kb的DNA片段(分别称为Ptrp-bcr基因、Ptrp-ygeD基因和Ptrp-yceE基因)。
将具有pACYC184的复制起点且含有氯霉素抗性基因的质粒载体pSTV28(宝生物工程有限公司制)用EcoRI和SacI、或者EcoRI和BamHI酶切后,通过与上述相同的方法纯化3.0kb的DNA片段。
使用连接试剂盒,将上述得到的含有Ptrp-bcr基因的约1.6kb的DNA片段与pSTV28的EcoRI和SacI酶切片段连接,并且将含有Ptrp-ygeD基因或Ptrp-yceE基因的约1.6kb的DNA片段与pSTV28的EcoRI和BamHI酶切片段连接。
使用得到的连接DNA转化大肠杆菌NM522株,以氯霉素抗性为指标筛选转化子。
根据公知的方法从该转化子中提取质粒,确认得到了bcr、ygeD和yceE基因表达载体,将这些质粒分别命名为pBcr2、pYgeD2和pYceE2。
(3)cmr基因、marR-marA-marB基因、acrA-acrB基因、emrA-emrB基因、emrE基因、ydhC基因、ydeE基因、ydeA基因、evgA-emrK-emrY基因、emrD基因、yajR基因、yegB基因、yidY基因、yieO基因和yjiO基因表达质粒的构建
与上述(1)同样,使用DNA合成仪,基于cmr基因,marR、marA和marB基因(以下,称为marR-marA-marB基因),acrA和acrB基因(下面称为acrA-acrB基因),emrA和emrB基因(以下,称为emrA-emrB基因),emrE基因,ydhC基因,ydeE基因,ydeA基因、evgA、emrK和emrY基因(以下,称为evgA-emrK-emrY基因),emrD基因,yajR基因,yegB基因,yidY基因,yieO基因以及yjiO基因的各碱基序列,合成用于扩增这些基因的引物DNA。为了扩增各基因而使用的引物DNA的碱基序列如表1所示。
表1
扩增基因名称及其碱基序列 | 引物DNA的碱基序列 |
cmr基因、序列号31 | 序列号71、72 |
marR-marA-marB基因、序列号32 | 序列号73、74 |
acrA-acrB基因、序列号33 | 序列号75、76 |
emrA-emrB基因、序列号34 | 序列号77、78 |
emrE基因、序列号35 | 序列号79、80 |
ydhC基因、序列号36 | 序列号81、82 |
ydeE基因、序列号37 | 序列号83、84 |
ydeA基因、序列号38 | 序列号85、86 |
evgA-emrK-emrY基因、序列号39 | 序列号87、88 |
emrD基因、序列号41 | 序列号89、90 |
yajR基因、序列号42 | 序列号91、92 |
yegB基因、序列号43 | 序列号93、94 |
yidY基因、序列号44 | 序列号95、96 |
yieO基因、序列号45 | 序列号97、98 |
yjiO基因、序列号46 | 序列号99、100 |
以大肠杆菌W3110株的染色体DNA为模板,使用具有上述表1的序列号所示的碱基序列的2种DNA作为引物组,分别进行PCR。
PCR除了使用的引物DNA不同之外,在与上述(2)同样的条件下进行。
通过该PCR,得到作为cmr基因的约1.3kb的DNA片段(以下,称为cmr基因扩增片段),作为marR-marA-marB 基因的约1.0kb的DNA片段(以下,称为marR-marA-marB基因扩增片段),作为acrA-acrB基因的约4.4kb的DNA片段(以下,称为acrA-acrB基因扩增片段),作为emrA-emrB基因的约2.8kb的DNA片段(以下,称为emrA-emrB基因扩增片段),作为emrE基因的约0.4kb的DNA片段(以下,称为emrE基因扩增片段),作为ydhC基因的约1.3kb的DNA片段(以下,称为ydhC基因扩增片段),作为ydeE基因的约1.2kb的DNA片段(以下,称为ydeE基因扩增片段),作为ydeA基因的约1.2kb的DNA片段(以下,称为ydeA基因扩增片段),作为evgA-emrK-emrY基因的约3.4kb的DNA片段(以下,称为evgA-emrK-emrY基因扩增片段),作为emrD基因的约1.2kb的DNA片段(以下,称为emrD基因扩增片段),作为yajR基因的约1.4kb的DNA片段(以下,称为yajR基因扩增片段),作为yegB基因的约1.5kb的DNA片段(以下,称为yegB基因扩增片段),作为yidY基因的约1.2kb的DNA片段(以下,称为yidY基因扩增片段),作为yieO基因的约1.5kb的DNA片段(以下,称为yieO基因扩增片段),作为yjiO基因的约1.3kb的DNA片段(以下,称为yjiO基因扩增片段)。
将上述得到的cmr基因扩增片段用EcoRI和SalI酶切,将acrA-acrB基因扩增片段用SphI和SalI酶切,将marR-marA-marB、emrA-emrB、emrE、ydhC、ydeE、ydeA、evgA-emrK-emrY各基因扩增片段用EcoRI和BamHI酶切,将emrD、yajR、yegB、yidY、yieO、yjiO各基因扩增片段用EcoRI和PstI酶切,然后使用GENECLEAN II纯化各扩增片段。
接着,将质粒载体pSTV28用EcoRI和SalI、SphI和SalI、EcoRI和BamHI酶切后,纯化各约3.0kb的DNA片段。
使用连接试剂盒,将cmr基因扩增片段与pSTV28的EcoRI和SalI酶切片段连接,将acrA-acrB基因扩增片段与pSTV28的SphI和SalI酶切片段连接,将marR-marA-marB基因扩增片段、emrA-emrB基因扩增片段、emrE基因扩增片段、ydhC基因扩增片段、ydeE基因扩增片段、ydeA基因扩增片段、evgA-emrK-emrY基因扩增片段各基因扩增片段与pSTV28的EcoRI和BamHI酶切片段连接,并且将emrD基因扩增片段、yajR基因扩增片段、yegB基因扩增片段、yidY基因扩增片段、yieO基因扩增片段、yjiO基因扩增片段各基因扩增片段与pSTV28的EcoRI和PstI酶切片段连接。
使用得到的各连接DNA转化大肠杆菌NM522株,以氯霉素抗性为指标筛选转化子。
根据公知的方法从该转化子中提取质粒,确认得到了各自的基因表达载体,将这些质粒DNA分别命名为pCmr、pMarRAB、pAcrAB、pEmrAB、pEmrE、pYdhC、pYdeE、pYdeA、pEmrKY、pEmrD、pYajR、pYegB、pYidY、pYieO和pYjiO。
实施例3
使用具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的活性强于亲本株、且参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸生物合成的蛋白质的活性高于亲本株的微生物制造谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶
使用实施例1和实施例2(1)中构建的质粒pGH1、pGH3和pCYD1转化大肠杆菌JM101株,以氨苄青霉素和氯霉素抗性为指标筛选转化子。
将得到的转化株接种到装有含有50μg/ml氨苄青霉素和25μg/ml氯霉素的8ml LB培养基的试管中,在28℃下培养17小时。将得到的培养物以1%的量添加到装有含有100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml氯霉素及氨基酸的8ml培养基(磷酸氢二钾16g/L、磷酸二氢钾14g/L、硫酸铵4g/L、柠檬酸(酐)5g/L、酪蛋白氨基酸(Difco公司制)4g/L、五水合硫代硫酸钠2g/L、葡萄糖20g/l、维生素B1 10mg/L、七水合硫酸镁2g/L、七水合硫酸铁50mg/L、七水合硫酸锰10mg/L,使用10mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2。葡萄糖和七水合硫酸镁在另外蒸煮后添加)的试管中,在28℃下培养24小时。
将得到的培养物离心分离,利用HPLC法分析其上清中的产物。
利用HPLC法的分析如下进行:使用Nucleosil 100-5C18 4.6mm×150mm(250mm)(GL Science)作为分离柱,使用0.4%(w/v)庚烷磺酸、20%(v/v)乙腈溶液(用磷酸调节pH至2.0)作为洗脱液,在流速1.0ml/分钟、温度40℃、检测波长210nm下进行。分析结果示于表2。另外,表中的GLT表示谷胱甘肽,GC表示γ-谷氨酰半胱氨酸。
表2
菌株 | 表达增强基因 | GLT(mg/l) | GC(mg/l) |
JM101/pTrS30,pSTV29JM101/pTrS30,pCYD1JM101/pGH1,pSTV29JM101/pGH1,pCYD1JM101/pGH3,pSTV29JM101/pGH3,pCYD1 | 无cydD,cydCgshAgshA,cydD,cydCgshA,gshBgshA,gshB,cydD,cydC | 00102147200262 | 0023852330 |
如上所述,通过增强参与谷胱甘肽的生物合成的蛋白质的活性,即使在对数生长期以后也能使谷胱甘肽在培养基中累积。另外,通过进一步增强cydD和cydC基因的表达,培养基中的谷胱甘肽的累积量进一步增加,由此可知cydD和cydC基因编码的蛋白质具有谷胱甘肽转运活性。
实施例4
使用具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的活性和参与谷胱甘肽的生物合成的蛋白质的活性高于亲本株的微生物制造谷胱甘肽
使用选自实施例1中构建的质粒pGH1和pGH3、以及实施例2(2)和(3)中构建的质粒pBcr2、pYgeD2、pYceE2、pCmr、pMarRAB、pAcrAB、pEmrAB、pEmrE、pYdhC、pYdeE、pYdeA、pEmrKY、pEmrD、pYajR、pYegB、pYidY、pYieO、pYjiO和pSTV28中的质粒转化大肠杆菌JM101株,以氨苄青霉素和氯霉素抗性为指标筛选转化子。
将得到的转化子用与实施例3同样的方法培养,测定培养基中谷胱甘肽的浓度。结果示于表3。另外,表中的GLT表示谷胱甘肽。
表3
菌株名称 | 表达增强基因 | GLT(mg/l) |
JM101/pGH3,pSTV28JM101/pGH3,pBcr2JM101/pGH3,pYgeD2JM101/pGH3,pYceE2JM101/pGH3,pCmrJM101/pGH3,pMarRABJM101/pGH3,pAcrABJM101/pGH3,pEmrABJM101/pGH3,pEmrEJM101/pGH3,pYdhCJM101/pGH3,pYdeEJM101/pGH3,pYdeAJM101/pGH3,pEmrKYJM101/pGH3,pEmrDJM101/pGH3,pYajRJM101/pGH3,pYegBJM101/pGH3,pYidYJM101/pGH3,pYieOJM101/pGH3,pYjiO | gshA,gshBgshA,gshB,bcrgshA,gshB,ygeDgshA,gshB,yceEgshA,gshB,cmrgshA,gshB,marR,marA,marBgshA,gshB,acrA,acrBgshA,gshB,emrA,emrBgshA,gshB,emrEgshA,gshB,ydhCgshA,gshB,ydeEgshA,gshB,ydeAgshA,gshB,evgA,emrK,emrYgshA,gshB,emrDgshA,gshB,yajRgshA,gshB,yegBgshA,gshB,yidYgshA,gshB,yieOgshA,gshB,yjiO | 160838432442540453253340784577769600593563562492503453286 |
如上所述,在参与谷胱甘肽的生物合成的蛋白质的活性高的菌株中,通过增强bcr基因、ygeD基因、yceE基因、cmr基因、marR-marA-marB基因、acrA-acrB基因、emrA-emrB基因、emrE基因、ydhC基因、ydeE基因、ydeA基因、evgA-emrK-emrY基因、emrD基因、yajR基因、yegB基因、yidY基因、yieO基因或yjiO基因的表达,培养基中的谷胱甘肽的累积量进一步增加,由此可知上述基因编码的蛋白质与cydD和cydC基因产物同样,具有谷胱甘肽转运活性。
实施例5
γ-谷氨酰转肽酶基因缺陷的微生物的制作
大肠杆菌的染色体DNA上的特定基因缺陷的菌株,通过利用λ噬菌体的同源重组系统的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97,6641-6645(2000)]来制作。
下面记载的质粒pKD46、pKD3和pCP20是从美国耶鲁大学大肠杆菌保藏中心(The Coli Genetic Stock Center)获得含有上述质粒的大肠杆菌菌株,利用公知的方法从这些菌株中提取上述质粒后使用。
(1)ggt基因缺陷用DNA片段的克隆
为了使大肠杆菌K12株的染色体DNA上存在的、具有序列号52所示的碱基序列的γ-谷氨酰转肽酶基因(ggt基因)发生缺陷,使用上述DNA合成仪,合成具有下述碱基序列的DNA:与大肠杆菌K12株的染色体DNA上位于ggt基因上游和下游的400~500bp所构成的碱基序列同源的碱基序列、及酵母来源的Flp重组酶(Flp recombinase)识别的碱基序列。
即,作为用于扩增ggt基因缺陷用DNA片段的引物组,分别合成具有序列号101和102、以及103和104所示的碱基序列的DNA。接着,使用上述合成DNA作为引物组,以大肠杆菌W3110株的染色体DNA为模板进行PCR。PCR如下进行:使用含有0.1μg染色体DNA、0.5μmol/L各引物、2.5单位Pfu DNA聚合酶、4μL Pfu DNA聚合酶用×10缓冲液、200μmol/L各脱氧NTP的反应液40μL,以94℃下1分钟、55℃下2分钟、72℃下1分钟为1个步骤,反复进行30次。
通过该PCR,得到作为目标产物的ggt基因缺陷用的上游和下游区域的同源序列片段(分别称为上游DNA片段、下游DNA片段)。
接着,使用上述的上游DNA片段、下游DNA片段和HindIII酶切后的pKD3作为模板,使用具有序列号101和104所示的碱基序列的DNA作为引物组,通过同源重组双交换PCR(cross-over PCR)法[J.Bacteriol.,179,6228-6237(1997)],在中心部插入pKD3的氯霉素抗性基因部分,得到3个DNA片段连接而成的DNA片段(ggt基因缺陷用DNA片段)。
(2)γ-谷氨酰转肽酶基因缺陷的大肠杆菌的制作
将大肠杆菌JM101株用pKD46转化后,以氨苄青霉素抗性为指标筛选转化子,将该转化子命名为大肠杆菌JM101/pKD46。
通过电脉冲法,向在10mmol/L L-阿拉伯糖和50μg/ml氨苄青霉素的存在下培养得到的大肠杆菌JM101/pKD46中导入上述得到的ggt基因缺陷用DNA片段,以氯霉素抗性为指标,筛选在大肠杆菌JM101/pKD46的染色体DNA上通过同源重组整合有该DNA片段的转化子(大肠杆菌JM101/pKD46ggt::cat)。
将大肠杆菌JM101/pKD46ggt::cat接种到含有25mg/L氯霉素的LB琼脂培养基上,在42℃下培养14小时后,分离单菌落。将得到的各菌落复制到含有25mg/L氯霉素的LB琼脂培养基以及含有100mg/L氨苄青霉素的LB琼脂培养基中,在37℃下培养,以氯霉素抗性和氨苄青霉素敏感性为指标筛选pKD46丢失株(大肠杆菌JM101ggt::cat)。
接着,将上述得到的大肠杆菌JM101ggt::cat用pCP20转化,以氨苄青霉素抗性为指标筛选转化子,由此得到含有pCP20的pKD46丢失株(大肠杆菌JM101/pCP20ggt::cat)。
将上述得到的大肠杆菌JM101/pCP20ggt::cat接种到未添加药剂的LB琼脂培养基上,在42℃下培养14小时后,分离单菌落。将得到的各菌落复制到未添加药剂的LB琼脂培养基、含有25mg/L氯霉素的LB琼脂培养基以及含有100mg/L氨苄青霉素的LB琼脂培养基中,在30℃下培养,筛选几株显示氯霉素敏感性和氨苄青霉素敏感性的菌株。
由上述筛选的各菌株分别制备染色体DNA,使用基于染色体DNA上位于ggt基因外侧的DNA的碱基序列设计的DNA作为引物组,以染色体DNA为模板进行PCR。PCR如下进行:使用含有0.1μg染色体DNA、0.5μmol/L各引物、2.5单位Pfu DNA聚合酶、4μL Pfu DNA聚合酶用×10缓冲液、200μmol/L各脱氧NTP的反应液40μL,以94℃下1分钟、55℃下2分钟、72℃下3分钟为1个步骤,反复进行30次。
以导入有上述PCR中不含ggt基因的短扩增片段的菌株作为ggt基因缺陷株,命名为大肠杆菌JGT2。
实施例6
编码具有谷胱甘肽摄取活性的蛋白质的基因缺陷的微生物的制作
(1)基因缺陷用DNA片段的克隆
为了使大肠杆菌K12株的染色体DNA上存在的、具有序列号58所示的碱基序列、并且编码具有谷胱甘肽摄取活性的蛋白质的基因(ybiK-yliA-yliB-yliC基因)发生缺陷,使用上述DNA合成仪,合成与大 肠杆菌K12株的染色体DNA上位于ybiK-yliA-yliB-yliC基因上游和下游的400~500bp所构成的碱基序列同源的碱基序列。
即,由于ybiK、yliA、yliB和yliC基因形成操纵子,因此,作为用于使编码具有谷胱甘肽摄取活性的蛋白质的基因缺陷的引物组,合成用于扩增ybiK基因上游区域的、具有序列号105和106所示的碱基序列的DNA,并且作为用于扩增yliC基因下游区域的引物组,合成具有序列号107和108所示的碱基序列的DNA。
接着,使用上述合成DNA作为引物组,通过与实施例5(1)同样的方法,得到ybiK-yliA-yliB-yliC基因缺陷用的上游和下游区域的同源序列片段(分别称为上游DNA片段、下游DNA片段),然后,使用该上游DNA片段、下游DNA片段和HindIII酶切后的pKD3作为模板,使用具有序列号105和108所示的碱基序列的DNA作为引物组,通过同源重组双交换PCR法,在中心部插入pKD3的氯霉素抗性基因部分,得到3个DNA片段连接而成的DNA片段(ybiK-yliA-yliB-yliC基因缺陷用DNA片段)。
(2)编码具有谷胱甘肽摄取活性的蛋白质的基因缺陷的微生物的制作
将大肠杆菌JM101株和实施例5(2)得到的大肠杆菌JGT2分别用pKD46转化后,以氨苄青霉素抗性为指标筛选转化子,将这些转化子分别命名为大肠杆菌JM101/pKD46和大肠杆菌JGT2/pKD46。
接着,通过电脉冲法,在大肠杆菌JM101/pKD46和大肠杆菌JGT2/pKD46中导入上述(1)得到的ybiK-yliA-yliB-yliC基因缺陷用DNA片段,得到在大肠杆菌JM101/pKD46和大肠杆菌JGT2/pKD46的染色体DNA上通过同源重组整合有ybiK-yliA-yliB-yliC基因缺陷用DNA片段的转化子(大肠杆菌JM101/pKD46ybiK-yliC::cat和大肠杆菌JGT2/pKD46ybiK-yliC::cat)。
然后,通过进行与实施例5(2)同样的操作,得到pKD46丢失、且氯霉素抗性基因从染色体DNA上脱落的菌株,分别命名为大肠杆菌JBK19和大肠杆菌JGTBK1。表4表示各基因缺陷株中缺陷基因的名称。
表4
菌株名称 | 缺陷基因 |
JM101JGT2JBK19JGTBK1 | 无ggtybiK-yliA-yliB-yliCggt,ybiK-yliA-yliB-yliC |
实施例7
使用丧失了谷胱甘肽分解活性和谷胱甘肽摄取活性的大肠杆菌评价谷胱甘肽和γ-谷氨酰半胱氨酸的生产率
使用实施例1和2(1)构建的质粒pGH1、pGH3和pCYD1转化实施例5和6得到的、编码具有γ-谷氨酰转肽酶或谷胱甘肽摄取活性的蛋白质的基因缺陷株,以氨苄青霉素和氯霉素抗性为指标筛选转化株。
将得到的转化株用与实施例3同样的方法培养,测定培养基中谷胱甘肽和γ-谷氨酰半胱氨酸的浓度。结果示于表5。
表5
菌株名称 | 缺陷基因 | 表达增强基因 | GLT(mg/l) | GC(mg/l) |
JGT2JGT2/pCYD1JGT2/pGH1JGT2/pGH1,pCYD1JGT2/pGH3JGT2/pGH3,pCYD1 | ggtggtggtggtggtggt | 无cydD,cydCgshAgshA,cydD,cydCgshA,gshBgshA,gshB,cydD,cydC | 004582108177 | 005119900 |
JBK19JBK19/pCYD1JBK19/pGH1JBK19/pGH1,pCYD1JBK19/pGH3JBK19/pGH3,pCYD1 | ybiK-yliA-yliB-yliCybiK-yliA-yliB-yliCybiK-yliA-yliB-yliCybiK-yliA-yliB-yliCybiK-yliA-yliB-yliCybiK-yliA-yliB-yliC | 无cydD,cydCgshAgshA,cydD,cydCgshA,gshBgshA,gshB,cydD,cydC | 007072334337 | 008415300 |
JGTBK1JGTBK1/pCYD1JGTBK1/pGH1JGTBK1/pGH1,pCYD1JGTBK1/pGH3JGTBK1/pGH3,pCYD1 | ggt,ybiK-yliA-yliB-yliCggt,ybiK-yliA-yliB-yliCggt,ybiK-yliA-yliB-yliCggt,ybiK yliA yliB yliCggt,ybiK-yliA-yliB-yliCggt,ybiK-yliA-yliB-yliC | 无cydD,cydCgshAgshA,cydD,cydCgshA,gshBgshA,gshB,cydD,cydC | 00100240694756 | 0026217600 |
如上所述,可知在参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的生物合成的蛋白质的活性和具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的活性增强的微生物中,通过进一步使其丧失谷胱甘肽分解活性和/或谷胱甘肽摄取蛋白质的活性,培养基中的谷胱甘肽和γ-谷氨酰半胱氨酸的累积量进一步增加。
序列表自由文本
序列号59-人工序列的说明:合成DNA
序列号60-人工序列的说明:合成DNA
序列号61-人工序列的说明:合成DNA
序列号62-人工序列的说明:合成DNA
序列号63-人工序列的说明:合成DNA
序列号64-人工序列的说明:合成DNA
序列号65-人工序列的说明:合成DNA
序列号66-人工序列的说明:合成DNA
序列号67-人工序列的说明:合成DNA
序列号68-人工序列的说明:合成DNA
序列号69-人工序列的说明:合成DNA
序列号70-人工序列的说明:合成DNA
序列号71-人工序列的说明:合成DNA
序列号72-人工序列的说明:合成DNA
序列号73-人工序列的说明:合成DNA
序列号74-人工序列的说明:合成DNA
序列号75-人工序列的说明:合成DNA
序列号76-人工序列的说明:合成DNA
序列号77-人工序列的说明:合成DNA
序列号78-人工序列的说明:合成DNA
序列号79-人工序列的说明:合成DNA
序列号80-人工序列的说明:合成DNA
序列号81-人工序列的说明:合成DNA
序列号82-人工序列的说明:合成DNA
序列号83-人工序列的说明:合成DNA
序列号84-人工序列的说明:合成DNA
序列号85-人工序列的说明:合成DNA
序列号86-人工序列的说明:合成DNA
序列号87-人工序列的说明:合成DNA
序列号88-人工序列的说明:合成DNA
序列号89-人工序列的说明:合成DNA
序列号90-人工序列的说明:合成DNA
序列号91-人工序列的说明:合成DNA
序列号92-人工序列的说明:合成DNA
序列号93-人工序列的说明:合成DNA
序列号94-人工序列的说明:合成DNA
序列号95-人工序列的说明:合成DNA
序列号96-人工序列的说明:合成DNA
序列号97-人工序列的说明:合成DNA
序列号98-人工序列的说明:合成DNA
序列号99-人工序列的说明:合成DNA
序列号100-人工序列的说明:合成DNA
序列号101-人工序列的说明:合成DNA
序列号102-人工序列的说明:合成DNA
序列号103-人工序列的说明:合成DNA
序列号104-人工序列的说明:合成DNA
序列号105-人工序列的说明:合成DNA
序列号106-人工序列的说明:合成DNA
序列号107-人工序列的说明:合成DNA
序列号108-人工序列的说明:合成DNA
产业上的利用可能性
根据本发明,能够高效且廉价地制造谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸。
Claims (15)
1.一种谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的制造方法,其中包括:在培养基中培养细菌,在该培养基中生成并累积谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸,以及从培养物中收集谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸,
所述细菌中以下[1]所述的具有将细胞内的谷胱甘肽转运到细胞外的活性(以下称为谷胱甘肽转运活性)的蛋白质的活性、以及参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的生物合成的蛋白质的活性高于亲本株,所述参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的生物合成的蛋白质为γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSHI)和/或谷胱甘肽合成酶(GSHII),
所述细菌是使用编码GSHI和/或GSHII的DNA对亲本株进行转化而得到的细菌、或者是通过改变亲本株的染色体DNA上存在的编码GSHI和/或GSHII的基因而得到的、i)GSHI和/或GSHII的比活性高于亲本株的细菌、或ii)GSHI和/或GSHII的产量高于亲本株的细菌,并且
所述细菌是使用编码[1]所述的蛋白质的DNA对亲本株进行转化而得到的细菌、或者是通过改变亲本株的染色体DNA上存在的编码[1]所述的蛋白质的基因而得到的、i)[1]所述的蛋白质的比活性高于亲本株的细菌、或ii)[1]所述的蛋白质的产量高于亲本株的细菌,
[1]由序列号3所示的氨基酸序列构成的蛋白质。
2.如权利要求1所述的制造方法,其中,所述细菌是使用编码GSHI和/或GSHII的DNA对亲本株进行转化而得到的细菌、或者是通过改变亲本株的染色体DNA上存在的编码GSHI和/或GSHII的基因而得到的、i)GSHI和/或GSHII的比活性高于亲本株的细菌、或ii)GSHI和/或GSHII的产量高于亲本株的细菌,并且
所述细菌是使用以下[1]所述的DNA对亲本株进行转化而得到的细菌,
[1]由序列号28所示的碱基序列中的编码区的碱基序列构成的DNA。
3.如权利要求1或2所述的制造方法,其中,GSHI及GSHII为以下[1]所述的蛋白质,
[1]由序列号47或48所示的氨基酸序列构成的蛋白质。
4.如权利要求1或2所述的制造方法,其中,编码GSHI及GSHII的DNA为以下[1]所述的DNA,
[1]编码权利要求3的[1]所述的蛋白质的DNA。
5.如权利要求4所述的制造方法,其中,编码GSHI及GSHII的DNA为以下[1]或[2]所述的DNA,
[1]由序列号49或50所示的碱基序列构成的DNA;
[2]由序列号49或50所示的碱基序列中的编码区的碱基序列构成的DNA。
6.如权利要求1所述的制造方法,其中,细菌是具有谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸分解活性的蛋白质的活性低于亲本株或丧失的细菌,所述具有谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸分解活性的蛋白质是γ-谷氨酰转肽酶。
7.如权利要求6所述的制造方法,其中,γ-谷氨酰转肽酶为以下[1]所述的蛋白质,
[1]由序列号51所示的氨基酸序列构成的蛋白质。
8.如权利要求6所述的制造方法,其中,具有谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸分解活性的蛋白质的活性低于亲本株或丧失的细菌是具有编码γ-谷氨酰转肽酶的基因发生缺陷的染色体DNA的细菌。
9.如权利要求8所述的制造方法,其中,编码γ-谷氨酰转肽酶的基因为以下[1]所述的DNA,
[1]编码权利要求7的[1]所述的蛋白质的DNA。
10.如权利要求9所述的制造方法,其中,编码γ-谷氨酰转肽酶的基因为以下[1]或[2]所述的DNA,
[1]由序列号52所示的碱基序列构成的DNA;
[2]由序列号52所示的碱基序列中的编码区的碱基序列构成的DNA。
11.如权利要求1所述的制造方法,其中,细菌是具有参与谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的摄取的活性(以下,称为谷胱甘肽摄取活性)的蛋白质的活性低于亲本株或丧失的细菌,所述具有谷胱甘肽摄取活性的蛋白质为以下[1]所述的蛋白质,
[1]由序列号53~57中任何一者所示的氨基酸序列构成的蛋白质。
12.如权利要求11所述的制造方法,其中,细菌是具有编码具有谷胱甘肽摄取活性的蛋白质的基因发生缺陷的染色体DNA的细菌。
13.如权利要求12所述的制造方法,其中,编码具有谷胱甘肽摄取活性的蛋白质的基因为以下[1]所述的DNA,
[1]编码权利要求11的[1]所述的蛋白质的DNA。
14.如权利要求13所述的制造方法,其中,编码具有谷胱甘肽摄取活性的蛋白质的基因为以下[1]或[2]所述的DNA,
[1]由序列号58所示的碱基序列构成的DNA;
[2]由序列号58所示的碱基序列中的任何一个编码区的碱基序列构成的DNA。
15.如权利要求1所述的制造方法,其中,细菌为属于埃希氏菌属的细菌。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007099957 | 2007-04-06 | ||
JP099957/2007 | 2007-04-06 | ||
PCT/JP2008/056759 WO2008126784A1 (ja) | 2007-04-06 | 2008-04-04 | グルタチオンおよびγ-グルタミルシステインの製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101715490A CN101715490A (zh) | 2010-05-26 |
CN101715490B true CN101715490B (zh) | 2014-02-05 |
Family
ID=39863883
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN200880019101.6A Active CN101715490B (zh) | 2007-04-06 | 2008-04-04 | 谷胱甘肽及γ-谷氨酰半胱氨酸的制造方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8647839B2 (zh) |
EP (2) | EP2489741B1 (zh) |
JP (1) | JP6018357B2 (zh) |
CN (1) | CN101715490B (zh) |
WO (1) | WO2008126784A1 (zh) |
Families Citing this family (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5978579B2 (ja) * | 2010-09-22 | 2016-08-24 | 味の素株式会社 | γ‐Glu‐X‐Yの製造方法 |
JP2012100622A (ja) * | 2010-11-12 | 2012-05-31 | Kaneka Corp | グルタチオンの製造方法 |
JP6020875B2 (ja) * | 2012-02-20 | 2016-11-02 | 株式会社カネカ | グルタチオンの製造方法 |
DE102013209274A1 (de) | 2013-05-17 | 2014-11-20 | Wacker Chemie Ag | Mikroorganismus und Verfahren zur fermentativen Überproduktion von Gamma-Glutamylcystein und Derivaten dieses Dipeptids |
DE102013218232A1 (de) | 2013-09-11 | 2015-03-12 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Gamma-Glutamyl-cystein und Derivaten dieses Dipeptids |
DE102013219016A1 (de) | 2013-09-20 | 2015-03-26 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Gamma-Glutamylcystein und Derivaten dieses Dipeptids |
JP6582997B2 (ja) * | 2014-01-31 | 2019-10-02 | 味の素株式会社 | 変異型グルタミン酸−システインリガーゼ、及び、γ−グルタミルバリルグリシンの製造法 |
WO2015133547A1 (ja) * | 2014-03-05 | 2015-09-11 | 味の素株式会社 | γ-グルタミルバリン合成酵素、及び、γ-グルタミルバリルグリシンの製造法 |
JPWO2016017631A1 (ja) * | 2014-07-29 | 2017-04-27 | 株式会社カネカ | γ−グルタミルシステイン及びグルタチオンの製造方法 |
KR101677328B1 (ko) * | 2014-08-12 | 2016-11-18 | 씨제이제일제당 (주) | O-포스포세린 생산 미생물 및 이를 이용한 o-포스포세린 또는 l-시스테인 생산 방법 |
CN105581344A (zh) * | 2015-12-16 | 2016-05-18 | 开平牵牛生化制药有限公司 | 一种含还原型谷胱甘肽的益生菌产品及其制备方法 |
WO2017159555A1 (ja) | 2016-03-17 | 2017-09-21 | 協和発酵バイオ株式会社 | 還元型グルタチオンの結晶及びその製造方法 |
WO2018084165A1 (ja) * | 2016-11-01 | 2018-05-11 | 株式会社カネカ | 改変型酵素およびその利用 |
US20230304061A1 (en) * | 2020-04-28 | 2023-09-28 | Kaneka Corporation | Microorganism that produces useful substance and method for producing useful substance |
US20240117298A1 (en) * | 2020-12-17 | 2024-04-11 | Kaneka Corporation | Microorganism that produces useful substance and method for producing useful substance |
CN112646768B (zh) * | 2020-12-31 | 2023-05-23 | 上海青平药业有限公司 | 一种重组谷氨酸棒杆菌及谷胱甘肽的制备方法 |
CN115197954A (zh) * | 2021-04-14 | 2022-10-18 | 上海凯赛生物技术股份有限公司 | 用于发酵生产1,5-戊二胺的重组dna、菌株及其用途 |
WO2023196276A1 (en) * | 2022-04-04 | 2023-10-12 | Children's National Medical Center | Preparation of gamma l-glutamyl l-cysteine and bis gamma l-glutamyl cycstine |
Family Cites Families (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS58110600A (ja) | 1981-12-25 | 1983-07-01 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | ヒトβ型インタ−フエロン遺伝子を含む組みかえ体プラスミド |
JPS6027397A (ja) | 1983-07-22 | 1985-02-12 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | グルタチオンの製造方法 |
JPS6027396A (ja) | 1983-07-22 | 1985-02-12 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | グルタチオンの製法 |
JPS63233798A (ja) | 1986-10-09 | 1988-09-29 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 5′−グアニル酸の製造法 |
JP2545078B2 (ja) | 1987-04-06 | 1996-10-16 | 協和醗酵工業株式会社 | 核酸関連物質の製造法 |
JPH01228473A (ja) * | 1988-03-08 | 1989-09-12 | Hikari Kimura | 新規な組み換え体dnaおよびグルタチオンの製造法 |
PH30131A (en) | 1991-08-07 | 1997-01-21 | Ajinomoto Kk | Process for producing l-glutamic acid by fermentation |
JPH062739A (ja) | 1992-06-16 | 1994-01-11 | Mitsubishi Motors Corp | クランク軸へのフライホイール取付構造 |
DE4407625A1 (de) | 1993-03-13 | 1994-09-15 | Luk Getriebe Systeme Gmbh | Einheit zur Drehrichtungsumkehr |
JPH06324839A (ja) | 1993-05-14 | 1994-11-25 | Toshiba Corp | 表示装置のカーソル制御手段 |
CA2237849C (en) | 1996-09-17 | 2009-06-16 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Processes for producing sugar nucleotides and complex carbohydrates |
US6610836B1 (en) * | 1999-01-29 | 2003-08-26 | Genome Therapeutics Corporation | Nucleic acid amino acid sequences relating to Klebsiella pneumoniae for diagnostics and therapeutics |
MXPA02004715A (es) * | 1999-11-12 | 2002-09-02 | Pioneer Hi Bred Int | Genes y metodos para manipulacion del crecimiento. |
US20020022718A1 (en) * | 1999-12-23 | 2002-02-21 | Forsyth R. Allyn | Genes identified as required for proliferation of E. coli |
US20020143163A1 (en) * | 2000-08-29 | 2002-10-03 | The University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Gene conferring resistance to the antibacterial 4,5-dihydroxy-2-cyclopenten-1-one (DHCP), the protein encoded by same, and applications thereof |
AU2002306849A1 (en) * | 2001-03-21 | 2002-10-08 | Elitra Pharmaceuticals, Inc. | Identification of essential genes in microorganisms |
WO2004113373A1 (en) * | 2003-06-21 | 2004-12-29 | University Of Sheffield | Overexpression of the cyddc transporter |
-
2008
- 2008-04-04 WO PCT/JP2008/056759 patent/WO2008126784A1/ja active Application Filing
- 2008-04-04 EP EP12165601.1A patent/EP2489741B1/en active Active
- 2008-04-04 CN CN200880019101.6A patent/CN101715490B/zh active Active
- 2008-04-04 JP JP2009509318A patent/JP6018357B2/ja active Active
- 2008-04-04 US US12/594,928 patent/US8647839B2/en active Active
- 2008-04-04 EP EP08739865A patent/EP2143804A4/en not_active Withdrawn
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
Hideyuki Suzuki et al.The yliA,-B,-C,and -D Genes of Escherichia coli K-12 Encode a Novel Glutathione Importer with an ATP-Binding Cassette.《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》.2005,第187卷(第17期),5861-5867. |
Hideyuki Suzuki et al.The yliA,-B,-C,and-D Genes of Escherichia coli K-12 Encode a Novel Glutathione Importer with an ATP-Binding Cassette.《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》.2005,第187卷(第17期),5861-5867. * |
JP平1-228473A 1989.09.12 |
Yin Li et al.Glutathione:a review on biotechnological production.《Appl Microbiol Biotechnol》.2004,第66卷233-242. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP6018357B2 (ja) | 2016-11-02 |
EP2489741B1 (en) | 2016-06-08 |
US20100203592A1 (en) | 2010-08-12 |
EP2143804A1 (en) | 2010-01-13 |
EP2143804A4 (en) | 2010-05-12 |
EP2489741A1 (en) | 2012-08-22 |
WO2008126784A1 (ja) | 2008-10-23 |
JPWO2008126784A1 (ja) | 2010-07-22 |
CN101715490A (zh) | 2010-05-26 |
US8647839B2 (en) | 2014-02-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101715490B (zh) | 谷胱甘肽及γ-谷氨酰半胱氨酸的制造方法 | |
CN1973042B (zh) | 二肽的制造方法 | |
JP5662167B2 (ja) | L−アミノ酸の製造法 | |
JP4173777B2 (ja) | 微生物株、プラスミド、微生物株の製造方法及びホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸の製造方法 | |
CN101151369B (zh) | 二肽的结晶及其制备方法 | |
JP6766426B2 (ja) | cycA遺伝子を過剰発現した腸内細菌科の細菌を用いたL−イソロイシンの製造方法 | |
JP2003169668A (ja) | L−システイン生産菌及びl−システインの製造法 | |
EP3611253A1 (en) | Method for producing theanine | |
Anderhuber et al. | High-level biosynthesis of norleucine in E. coli for the economic labeling of proteins | |
CN104164381A (zh) | 通过发酵过量生产γ-谷氨酰半胱氨酸和该二肽的衍生物的微生物和方法 | |
CN101715484B (zh) | 二肽的制造方法 | |
EP4230723A1 (en) | Polypeptide with aspartate kinase activity and use thereof in production of amino acid | |
JP2012183048A (ja) | 4−ヒドロキシ安息香酸関連物質の製造法 | |
JP2012125170A (ja) | チオール化合物高生産微生物 | |
JP6086678B2 (ja) | ホモアミノ酸の製造法 | |
JP4376038B2 (ja) | 生育が向上した微生物菌株 | |
JP5860287B2 (ja) | L−アミノ酸の製造法 | |
JP6133010B2 (ja) | アミノ酸の製造法 | |
WO2021261564A1 (ja) | ジペプチドの製造法 | |
Müller et al. | Bacterial abl-like genes: production of the archaeal osmolyte N ÀacetylÀbÀlysine by homologous overexpression | |
JP2022045001A (ja) | バリオールアミン及びボグリボースの製造方法 | |
JP2022001556A (ja) | 蛋白質及び3−ヒドロキシイソ吉草酸の製造方法 | |
TWI450964B (zh) | 甲烷古菌之相容質Nε-乙醯基-β-賴胺酸生合成基因及其應用 | |
JP2010081848A (ja) | グルコサミンの製造法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |