JP6133010B2 - アミノ酸の製造法 - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
また、NADHを補酵素として利用し、2−オキソイソ吉草酸にアミノ基を転移してL−バリンを生成する活性(以下、NVDH活性という。)を有する蛋白質は既知であるが(非特許文献2)、該蛋白質をコードするDNAでエシェリヒア属に属する微生物を形質転換し、該形質転換体を嫌気もしくは微好気条件化で培養し、L−バリンを製造する方法についても、これまでに報告されていない。
(1)NVDH活性が親株より高く、かつL−バリンを生産する能力を有する微生物を、嫌気または微好気条件で培地に培養し、L−バリンを該培地中に生成、蓄積させ、培養物中からL−バリンを採取することを特徴とする、L−バリンの製造法。
(2)微生物が、下記の[1]〜[6]のいずれかに記載のDNAで親株を形質転換して得られる微生物である、上記(1)記載の製造法。
[1]配列番号2、4および6のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNA
[2]配列番号2、4および6のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつNVDH活性を有する蛋白質をコードするDNA
[3]配列番号2、4および6のいずれかで表されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつNVDH活性を有する蛋白質をコードするDNA
[4]配列番号1、3および5のいずれかで表される塩基配列からなるDNA
[5]配列番号1、3および5のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつNVDH活性を有する蛋白質をコードするDNA
[6]配列番号1、3および5のいずれかで表される塩基配列と80%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつNVDH活性を有する蛋白質をコードするDNA
(3)微生物が、親株が有する乳酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸・ギ酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼおよびホスフォトランスアセチラーゼからなる群より選ばれる1以上の酵素の活性を親株より低下させた微生物または該活性を喪失させた微生物である、上記(1)または(2)記載の製造法。
(4)微生物が、L−バリンの生合成に関与する1つ以上の酵素の活性が増強された微生物である、上記(1)〜(3)のいずれか1項に記載の製造法。
(5)微生物が、エシェリヒア属に属する微生物である、上記(1)〜(4)のいずれか1項に記載の製造法。
(6)嫌気または微好気条件が、培地中の酸化還元電位が−100mV以下の条件である、上記(1)〜(5)のいずれか1項に記載の製造法。
1.本発明で用いられる微生物
本発明で用いられる微生物は、親株よりNVDH活性が高く、かつL-バリンを生産する能力を有する微生物である。
NVDH遺伝子の発現量が増大した微生物としては、3)該遺伝子のプロモーター部分が改変、または4)該遺伝子のコピー数が増大した微生物を挙げることができる。該遺伝子のコピー数が増大した微生物としては、親株を該遺伝子で形質転換することにより、5)染色体上のコピー数が増大した微生物、または6)プラスミドDNAとして染色体DNA外に該遺伝子を保有させた微生物を挙げることができる。
本発明で用いられる微生物は、いずれの属に属する微生物であっても良いが、好ましくは原核生物、より好ましくは偏性嫌気細菌および通性嫌気細菌、さらに好ましくは通性嫌気細菌、特に好ましくはエシェリヒア属に属する微生物を挙げることができる。
2.NVDH活性を有する蛋白質
NVDH活性を有する蛋白質としては、各種データベース中に、該活性を有すると登録されている蛋白質、該蛋白質と高い同一性(例えば80%以上の同一性)があると記載されている蛋白質をあげることができるが、具体的には、
[1]配列番号2、4および6のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、[2]配列番号2、4および6のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつNVDH活性を有する蛋白質、および、
[3]配列番号2、4および6のいずれかで表されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつNVDH活性を有する蛋白質、
などをあげることができる。
配列番号2、4および6のいずれかで表されるアミノ酸配列において1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、1または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されていてもよい。
欠失、置換または付加は同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、L−アラニン、L−アスパラギン、L−アスパラギン酸、L−グルタミン、L−グルタミン酸、グリシン、L−ヒスチジン、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リジン、L−アルギニン、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−プロリン、L−セリン、L−スレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン、L−バリン、L−システインなどがあげられる。
A群:ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2−アミノブタン酸、メチオニン、O-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
B群:アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2−アミノアジピン酸、2−アミノスベリン酸
C群:アスパラギン、グルタミン
D群:リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3−ジアミノプロピオン酸
E群:プロリン、3−ヒドロキシプロリン、4−ヒドロキシプロリン
F群:セリン、スレオニン、ホモセリン
G群:フェニルアラニン、チロシン
また、本発明で用いられるNVDH活性を有する蛋白質としては、配列番号2、4および6のいずれかで表されるアミノ酸配列との同一性が80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の同一性を有している蛋白質を挙げることができる。
3.NVDH活性を有する蛋白質をコードするDNA
NVDH活性を有する蛋白質をコードするDNAとしては、上記2に記載のNVDH活性を有する蛋白質をコードするDNAを挙げることができ、具体的には、
[4][1]〜[3]のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNA、
[5]配列番号1、3および5のいずれかで表される塩基配列からなるDNA、
[6]配列番号1、3および5のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつNVDH活性を有する蛋白質をコードするDNA、および、
[7]配列番号1、3および5のいずれかで表される塩基配列と80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつNVDH活性を有する蛋白質をコードするDNA、
などをあげることができる。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なDNAとしては、例えばBLASTやFASTA等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号1、3および5のいずれかで表される塩基配列と少なくとも90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAをあげることができる。
4.本発明の製造法に用いられるDNAの調製
本発明の製造法に用いられる、NVDH活性を有する蛋白質をコードするDNAは、バチルス(Bacillus)属およびサーモアクチノマイセス(Thermoactinomyces)属に属する微生物より調製することができる。
ゲノム情報を基に、バチルス属に属する微生物のbcd遺伝子付近の塩基配列に基づいたプライマーを調製し、該ゲノムDNAを鋳型として、PCR〔PCR Protocols, Academic Press(1900)〕を行うことにより、バチルス属に属する微生物由来のNVDH活性を有する蛋白質をコードするDNAを含む断片を取得することができる。同様に、サーモアクチノマイセス属に属する微生物のleudhまたはpdh遺伝子付近の塩基配列に基づいたプライマーを調製し、該ゲノムDNAを鋳型として、PCRを行うことにより、サーモアクチノマイセス属に属する微生物由来のNVDH活性を有する蛋白質をコードするDNAを含む断片を取得することができる。
取得したDNAをそのまま、あるいは適当な制限酵素等で切断後常法によりベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば3730xl・DNAシークエンサー(アプライドバイオシステムス社製)等を用いたジデオキシ法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463(1977)〕により該DNAの塩基配列を決定する。
配列番号1、3および5で表される塩基配列を有するDNAとしては、蛋白質のコーディング領域に加え、転写調節領域およびプロモーター領域などを含むDNAをあげることができる。
5.本発明の製造法に用いられる微生物の造成
本発明の製造法に用いられる、NVDH活性が親株より高く、かつL−バリンを生産する能力を有する微生物は、例えば、L−バリンを生産する能力を有するエシェリヒア属に属する微生物(下記に詳細を記載する。)を親株として、上記4の方法で得られるDNAを該親株に導入する方法(下記7.に詳細を記載する。)、などにより造成することができる。
(I)栄養要求性変異株、L−バリンのアナログ耐性変異株または代謝制御変異株を取得し、かつL−バリン生産能を有する変異株を選択する方法としては、例えば、親株または野生株を通常の変異処理、すなわちX線や紫外線の照射、またはN−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性または代謝制御変異を示し、かつL−バリン生産能を有するものを選択することによって得ることができる。
(II−a)L−バリンの生合成に関与する酵素をコードするDNAを、親株の染色体DNA上に1以上導入する方法としては、相同組換えを利用した方法をあげることができる。一般的な相同組換えを利用した方法としては、L−バリンの生合成に関与する酵素をコードするDNA断片を、当該DNA断片を導入したい宿主細胞内では自律複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドDNAまたは直鎖状DNAと連結して作製できるDNAを用いる方法をあげることができる。
該微生物の染色体DNA上への、L−バリンの生合成に関与する酵素をコードするDNAの導入は、例えば、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的として利用して行うことができる。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。
染色体DNA上の、L−バリンの生合成に関与する酵素をコードするDNA断片を導入した周辺の領域の塩基配列を決定することや、該DNA断片の一部をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション等により、染色体DNA上の目的の位置に当該DNA断片が導入されたことを確認することができる。
発現ベクターとしては、エシェリヒア・コリを宿主とする場合、pTrc99a(lablife社製)、pBTrp2、pBTac1、pBTac2(いずれもロシュ・ダイアグノスティックス社製)、pKK233−2(GEヘルスケア社製)、pKK223−3(GEヘルスケア社製)、pSE280(インビトロジェン社製)、pGEMEX−1(プロメガ社製)、pQE−8(キアゲン社製)、pQE−30(キアゲン社製)、pKYP10(特開昭58−110600)、pKYP200〔Agric.Biol.Chem.,48,669(1984)〕、pLSA1〔Agric.Biol.Chem.,53,277(1989)〕、pGEL1〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,4306(1985)〕、pBluescript II SK+(ストラタジーン社製)、pBluescript II SK−(ストラタジーン社製)、pTrs30(FERM BP−5407)、pTrs32(FERM BP−5408)、pGHA2(FERM BP−400)、pGKA2(FERM BP−6798)、pTerm2(特開平3−22979、US4686191、US4939094、US5160735)、pEG400〔J.Bacteriol.,172,2392(1990)〕、pGEX(GEヘルスケア社製)、pETシステム(ノバジェン社製)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pTrxFus(インビトロジェン社製)、pMAL−c2(New England Biolabs社製)、pUC18〔gene,33,103(1985)〕、pUC19〔Gene,33,103(1985)〕、pSTV29(タカラバイオ社製)、pSTV28(タカラバイオ社製)、pUC118(タカラバイオ社製)、pPA1(特開昭63−233798)等が挙げられる。
目的とするDNAの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。
このような組換え株の例としては、ilvGおよびilvB遺伝子の発現が増強された組換え株を挙げることができる。
6.ピルビン酸またはホスホエノールピルビン酸の代謝酵素活性が低下した微生物
本発明で用いる、L−バリンを生産する能力を有する微生物は、上記した方法で造成した上でさらに、親株が有する乳酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸・ギ酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼおよびホスフォトランスアセチラーゼから選ばれる1以上の酵素、好ましくは、乳酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸・ギ酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼおよびホスフォトランスアセチラーゼから選ばれる2以上の酵素、より好ましくは、乳酸デヒドロゲナーゼならびにピルビン酸・ギ酸リアーゼ、およびフマル酸レダクターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼおよびホスフォトランスアセチラーゼから選ばれる1以上の酵素の活性を親株より低下させた微生物、または該活性を喪失させた微生物であってもよい。
上記において、酵素の活性を親株より低下させるとは、親株が該活性を有する場合に、1)該蛋白質の発現量を親株より減少させること、または2)該蛋白質の比活性を低下させることであり、酵素の活性を喪失させるとは、該活性を完全に喪失させることである。
該蛋白質の発現量を親株より減少させる方法としては、例えば、該蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター領域やシャインダルガルノ(SD)配列等の発現調節配列を、上記(II−a)に記載した相同組換えを利用した方法により改変すること、などによって達成され、該蛋白質の比活性を親株より低下させる方法は、該蛋白質のコーディング領域に同様の手法により変異を導入することなどにより達成される。
7.上記4の方法で得られるDNAをL−バリンを生産する能力を有するエシェリヒア属に属する微生物に導入する方法
上記4の方法で得られるDNAを、L−バリンを生産する能力を有するエシェリヒア属に属する微生物に導入する方法としては、上記(II−a)に記載した相同組換えを利用した方法により、上記5に記載の方法で造成した親株の染色体DNA上に、1以上の上記4の方法で得られるDNAを導入する方法、または、上記(II−b)に記載した方法により、上記4の方法で得られるDNAを含有する自律複製型の組換え体DNAで、上記5に記載の方法で造成した微生物を形質転換する方法が挙げられる。
8.本発明のL−バリンの製造法
上記5に記載した方法で造成される微生物を培地で培養して、L−バリンを該培地中に生成蓄積させ、培養物からL−バリンを採取することにより、L−バリンを製造することができる。
本発明において、嫌気または微好気条件とは、培地中のORPが−100mV以下、好ましくは−200mV以下の条件で培養することを意味する。嫌気または微好気条件は、例えば、培地への通気量や培養装置の攪拌数を低下させること、培養容器を密閉して無通気で培養すること、炭酸ガス等の不活性ガスを培地に通気すること等により、培地中の溶存酸素濃度を調整することによって達成される。
本発明においては、全培養期間を通じて嫌気又は微好気条件で培養してもよいが、培養期間を、微生物を増殖させる培養期と、L−バリンを生産させる培養期に分け、それぞれ異なる培地又は条件で培養を行ってもよい。例えば、通気および攪拌下で細菌を増殖させた後、嫌気または微好気条件下でL−バリンを生産させてもよい。
培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができる。合成培地又は天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌株が利用可能であるものならばいずれの種類を用いてもよい。
培養終了後の培養物からL−アミノ酸を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば、培養物から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって採取される。L−バリンが析出するような条件下で培養した場合、培養液中に析出したL−バリンは、遠心分離又は濾過等により採取することができる。この場合、培地中に溶解しているL−バリンを晶析した後に、併せて単離してもよい。
(1)ilvG遺伝子発現の増強
L−バリンの生産性を向上させる目的で、大腸菌由来のilvG遺伝子の開始コドン上流に、trcプロモーターを挿入した株を、以下の方法で造成した。
配列番号28および29で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットとし、常法により得られたエシェリヒア・コリK-12株を由来とするBW25113株のゲノムDNAを鋳型にPCRを行い、ilvG遺伝子の開始コドン付近から、その上流約1100bpの領域を増幅した。
上記のPCRにより増幅された、ilvG遺伝子の上流約1100bpのDNA断片、ilvG遺伝子の下流約1120bpのDNA断片、およびクロラムフェニコール耐性遺伝子(cat)およびレバンスクラーゼ遺伝子(sacB)を含有するDNA断片(以下、cat-sacB断片という。)を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号28および31で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットとし、PCRを行った。
反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約4.8kbのDNA断片をWizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いて分離し、cat-sacB断片が挿入されたilvB周辺領域を含むDNA断片を得た。
次に、ilvG遺伝子の開始コドン上流にtrcプロモーターを挿入するため、配列番号32、33および34で表される塩基配列からなるDNAを、ilvG遺伝子のフレームシフトを解消するために、配列番号35、36および37で表される塩基配列からなるDNAを合成した。
次に、上記で得られたilvG遺伝子がcat遺伝子およびsacB遺伝子に置換された構造をもつ株に、trcプロモーターが挿入されたilvG遺伝子を含むDNA断片をエレクトロポレーションにより導入した。
上記のようにしてilvG遺伝子の開始コドン上流にtrcプロモーターが挿入され、かつilvG遺伝子のフレームシフトが解消された、BG pKD46株を取得した。
(2)ilvB遺伝子発現の増強
L−バリンの生産性を向上させる目的で、BG pKD46株のilvB遺伝子の開始コドン上流にtrcプロモーターを挿入した株を、以下の方法で造成した。
次に、配列番号38および42で表される塩基配列からなるDNA、配列番号45及び41で表される塩基配列からなるDNAをそれぞれプライマーセットとして用い、BW25113株のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、増幅産物を取得した。また、配列番号43および44で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットとして用い、pTrc99aを鋳型としてPCRを行い、trcプロモーター領域を含む増幅産物を取得した。
精製したそれぞれの増幅産物を等モルの比率で混合し、これを鋳型として配列番号38および41で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットに用いてPCRを行い、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約 2.2 kbのDNA断片を分離し、ilvB遺伝子の開始コドンの上流にtrcプロモーターが挿入されたDNA断片を得た。
(3)ピルビン酸またはホスホエノールピルビン酸の代謝酵素の欠損
上記したOSK pKD46株において、有機酸またはエタノールを生成する酵素を欠損させるため、以下の方法により、ldhA、pflB、frdA、adhE、ackA、またはpta遺伝子を欠損させた。
次に、OSK pKD46株に、cat-sacB断片の挿入されたldhA周辺領域を含むDNA断片をエレクトロポレーションにより導入し、得られた形質転換体を、実施例1の(1)に記載の方法により選択し、ldhA遺伝子がcat遺伝子およびsacB遺伝子に置換された構造をもつOSK pKD46株を取得した。
精製したそれぞれの増幅産物を等モルの比率で混合し、これを鋳型として配列番号46および49で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットに用いてPCRを行い、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供してDNA断片を分離し、ldhA遺伝子が欠損したldhA周辺領域を含むDNA断片を得た。
pflB遺伝子の欠損については、上記ldhA遺伝子を欠損する際に用いた配列番号46〜51で表されるDNAを、配列番号52〜57で表されるDNAにそれぞれ代えて用いること以外は、上記ldhA遺伝子を欠損する際に用いたのと同じ方法を用いることで、pflB遺伝子が欠損したOSKΔpflB pKD46株を取得した。
adhE遺伝子の欠損については、上記ldhA遺伝子を欠損する際に用いた配列番号46〜51で表されるDNAを、配列番号64〜69で表されるDNAにそれぞれ代えて用いること以外は、上記ldhA遺伝子を欠損する際に用いたのと同じ方法を用いることで、adhE遺伝子が欠損したOSKΔadhE pKD46株を取得した。
次に、OSKΔldhA pKD46株からpflB、adhE、frdA、またはackAならびにpta遺伝子を欠損させた株を作製した。それぞれの遺伝子の欠損は、OSK pKD46株に対する方法と同様に行った。取得した菌株は、それぞれOSKΔldhAΔpflB pKD46株、OSKΔldhAΔfrdA pKD46株、OSKΔldhAΔadhE pKD46株、およびOSKΔldhAΔpta-ack pKD46株と命名した。
また、OSKΔldhAΔfrdA pKD46株からadhE遺伝子を欠損させた株を作製した。該遺伝子の欠損はOSK pKD46株に対する方法と同様に行った。取得した菌株は、OSKΔldhAΔfrdAΔadhE pKD46株と命名した。
pKD46プラスミドは温度感受性の複製起点を有するために、42℃で生育させることにより、プラスミドを容易に脱落させることができる。OSK pKD46株を42℃で培養し、アンピシリン感受性を示す株、すなわちpKD46が脱落したOSK株を取得した。
(1)枯草菌のbcd遺伝子発現プラスミドの造成
以下の方法で、NVDH活性を有する蛋白質をコードするbcd遺伝子の発現プラスミドを造成した。
バチルス・サブチリス168株の染色体DNAを鋳型として、配列番号76および77で表わされる塩基配列からなるDNAをプライマーセットに用いてPCRを行い、bcd遺伝子断片を増幅した。得られた遺伝子断片及びpTrc99a(Pharmacia社製)をEcoRI及びBamHIで切断し、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離した後、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いて、制限酵素消化DNA断片をそれぞれ回収した。
得られた連結体DNAを用いてエシェリヒア・コリ DH5α株(タカラバイオ製)を形質転換し、アンピシリン耐性を指標に形質転換体を選択した。
選択した形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出した。制限酵素を用いてその構造を解析することにより、bcd遺伝子が連結された発現ベクターが取得されていることを確認し、pTrc99a-BsLeuDHと名付けた。
(2)サーモアクチノマイセス・インターメディウスのleudh遺伝子発現プラスミドの造成
以下の方法で、NVDH活性を有する蛋白質をコードするleudh遺伝子の発現プラスミドを造成した。
サーモアクチノマイセス・インターメディウスの染色体DNAを鋳型として、配列番号78および79で表わされる塩基配列からなるDNAをプライマーセットに用いてPCRを行い、leudh遺伝子断片を増幅した。得られた遺伝子断片及びpTrc99a(Pharmacia社製)をEcoRI及びBamHIで切断し、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離した後、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いて、制限酵素消化DNA断片をそれぞれ回収した。
得られた連結体DNAを用いてエシェリヒア・コリ DH5α株(タカラバイオ製)を形質転換し、アンピシリン耐性を指標に形質転換体を選択した。
選択した形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出した。制限酵素を用いてその構造を解析することにより、leudh遺伝子が連結された発現ベクターが取得されていることを確認し、pTrc99a-TiLeuDHと名付けた。
(3)サーモアクチノマイセス・インターメディウスのpdh遺伝子発現プラスミドの造成
以下の方法で、NVDH活性を有する蛋白質をコードするpdh遺伝子の発現プラスミドを造成した。
サーモアクチノマイセス・インターメディウスの染色体DNAを鋳型として、配列番号80および81で表わされる塩基配列からなるDNAをプライマーセットに用いてPCRを行い、pdh遺伝子断片を増幅した。得られた遺伝子断片及びpTrc99a(Pharmacia社製)をNcoI及びKpnIで切断し、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離した後、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いて、制限酵素消化DNA断片をそれぞれ回収した。
得られた連結体DNAを用いてエシェリヒア・コリ DH5α株(タカラバイオ製)を形質転換し、アンピシリン耐性を指標に形質転換体を選択した。
選択した形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出した。制限酵素を用いてその構造を解析することにより、pdh遺伝子が連結された発現ベクターが取得されていることを確認し、pTrc99a-TiPheDHと名付けた。
(4)L−バリン生産菌へのNVDH活性を有する蛋白質をコードする組換え体DNAの導入
pTrc99a-BsLeuDHでOSK株を形質転換し、OSK BsleuDH株を取得した。
また、pTrc99a-TiPheDH でOSKΔldhAΔpflB株を形質転換し、OSKΔldhAΔpflB TiPheDH株を取得した。
尚、pTrc99a-BsLeuDH 、pTrc99a-TiLeuDH、或いはpTrc99a-TiPheDHは、それぞれの挿入遺伝子がtrcプロモーター下で発現するように設計されており、IPTG等により該遺伝子の発現を誘導することができる。
(1)L−バリン生産に対する微好気条件の効果
OSKΔldhAΔpflB BsLeuDH株を、アンピシリン(100mg/L)を含有するLBプレート培地に植菌して、30℃で一晩培養した。プレート1/2枚分の菌体を、2 L容三角フラスコ中300 mlの種培地(20g/L グルコース、10g/L ハイニュートAM、10g/L 酵母エキス、2.5g/L 塩化ナトリウム、10 g/L 炭酸カルシウム、pH 7.4に水酸化ナトリウムで調整し、オートクレーブを用いて122℃20分で殺菌後、アンピシリンを終濃度100 mg/Lとなるように別添加)に植菌し、30℃にて攪拌速度220rpmで好気的に24時間培養した。上記の培養液100 mlを、3 L容ジャーファーメンター中900 mlのL−バリン生産培地(4g/L KH2PO4、5.7g/L K2HPO4、4g/L (NH4)2HPO4、0.017g/L CaCl2・2H2O、0.134g/L 無水ベタイン、0.0058g/L チアミン塩酸塩、0.0002g/L CoCl2・6H2O、0.0001g/L CuCl2・6H2O、0.0002g/L ZnCl2、0.0002g/L Na2MoO4・2H2O、0.0001g/L H3BO3、5g/L 酵母エキス、40g/L グルコース、0.25g/L MgSO4・7H2O、オートクレーブを用いて122℃20分で殺菌後、アンピシリンを終濃度100 mg/Lとなるように別添加、更にIPTGを終濃度1 mMとなるように別添加)に植菌し、36℃、通気量(空気流速)0.5vvm制御下にてORP制御を利用して、グルコースを完全に消費するまで培養した。この間、18%濃度のアンモニア水溶液を使用して、ジャーファーメンター槽内のpHを7.0に常時維持した。ORPは、撹拌数を最大1200 rpm、最小を50 rpmとして設定値を維持するように制御した。培地中に含まれるL−バリンは島津製作所製のHPLCを用いて分析した。グルコースはグルコアナライザーGA05(アットウィル製)を利用して測定した。
また、以降の実施例における評価では、上記の培地及び培養工程(2 L容ジャーファーメンターを使用)の下、撹拌数50 rpmで行った。
(2)leudh遺伝子またはpdh遺伝子の発現が微好気条件下のL−バリン生産に及ぼす効果
pTrc99aでOSK株およびOSKΔldhAΔpflB株を形質転換し、それぞれOSK pTrc99a株およびOSKΔldhAΔpflB pTrc99a株を取得した。
その結果、微好気条件下においてleudh遺伝子またはpdh遺伝子を発現させた株は、該遺伝子を発現させていない対照株と比べ、培養液中のL−バリンの濃度の向上が見られた(表3)。
<3−1>1遺伝子欠損の効果
ldhA、pflB、frdA、adhE、ackA-pta遺伝子のうち、1遺伝子(但しarkA-ptaは2遺伝子)の欠損がL−バリン生産に及ぼす効果を検証した。
その結果、微好気条件下においてldhA、pflBまたはackA-pta遺伝子を欠損させた株は、該遺伝子を欠損させていない対照株(OSK BsLeuDH株)と比べ、培養液中のL−バリンの濃度の向上が見られた(表4)。
OSKΔldhA BsLeuDH株、OSKΔpflB BsLeuDH株、OSKΔldhAΔpflB BsLeuDH株、OSKΔldhAΔfrdA BsLeuDH株、OSKΔldhAΔadhE BsLeuDH株、OSKΔldhAΔpta-ack BsLeuDH株を実施例3の(1)に記した方法で培養し、L−バリン生産を評価した。
その結果、微好気条件下でldhAおよびpflB遺伝子、ldhAおよびfrdA遺伝子、またはldhA及びackA-pta遺伝子を欠損させた株は、1遺伝子のみを欠損させた対照株(OSKΔldhA BsLeuDH株、OSKΔpflB BsLeuDH株)と比べ、培養液中のL−バリンの濃度の向上が見られた。
OSKΔldhAΔpflB BsLeuDH株、OSKΔldhAΔfrdA BsLeuDH株、OSKΔldhAΔpflBΔfrdA BsLeuDH株、OSKΔldhAΔpflBΔadhE BsLeuDH株、OSKΔldhAΔpflBΔfrdAΔackA-pta BsLeuDH株、OSKΔldhAΔpflBΔadhEΔackA-pta BsLeuDH株、OSKΔldhAΔfrdAΔadhEΔackA-pta BsLeuDH株、およびOSKΔldhAΔpflBΔfrdAΔadhEΔackA-pta BsLeuDH株を実施例3の(1)に記した方法で培養し、L−バリン生産を評価した。
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Claims (3)
- NADHを補酵素として利用し、2−オキソイソ吉草酸にアミノ基を転移してL−バリンを生成する活性(以下、NVDH活性という。)を有し、かつL−バリンを生産する能力を有する、下記の[1]〜[4]のいずれかに記載のDNAで親株を形質転換して得られるエシェリヒア属に属する微生物を、培地中の酸化還元電位が−100mV以下の条件で培地に培養し、L−バリンを該培地中に生成、蓄積させ、培養物中からL−バリンを採取することを特徴とする、L−バリンの製造法。
[1]配列番号2、4および6のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNA
[2]配列番号2、4および6のいずれかで表されるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつNVDH活性を有する相同蛋白質をコードするDNA
[3]配列番号1、3および5のいずれかで表される塩基配列からなるDNA
[4]配列番号1、3および5のいずれかで表される塩基配列と95%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつNVDH活性を有する相同蛋白質をコードするDNA - エシェリヒア属に属する微生物が、親株が有する乳酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸・ギ酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼおよびホスフォトランスアセチラーゼからなる群より選ばれる1以上の酵素の活性を親株より低下させた微生物または該活性を喪失させた微生物である、請求項1記載の製造法。
- エシェリヒア属に属する微生物が、L−バリンの生合成に関与する1つ以上の酵素の活性が増強された微生物である、請求項1または2記載の製造法。
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