JPH1023896A - 組換えプラスミド、それにより形質転換された大腸菌、その培養物及びそれを用いたアミノ酸又はその誘導体の製造方法 - Google Patents
組換えプラスミド、それにより形質転換された大腸菌、その培養物及びそれを用いたアミノ酸又はその誘導体の製造方法Info
- Publication number
- JPH1023896A JPH1023896A JP8217060A JP21706096A JPH1023896A JP H1023896 A JPH1023896 A JP H1023896A JP 8217060 A JP8217060 A JP 8217060A JP 21706096 A JP21706096 A JP 21706096A JP H1023896 A JPH1023896 A JP H1023896A
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- escherichia coli
- dehydrogenase
- amino acid
- plasmid
- pfdh
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 アミノ酸及びその誘導体を容易に製造するた
めに用いることのできる組換えプラスミド、それにより
形質転換された大腸菌及びそれを用いたアミノ酸又はそ
の誘導体の製造方法を提供する。 【解決手段】 ＮＡＤ+ 依存性ギ酸デヒドロゲナーゼを
コードする遺伝子と、ＮＡＤＨ依存性アミノ酸デヒドロ
ゲナーゼをコードする遺伝子とを含有してなる組換えプ
ラスミド。
めに用いることのできる組換えプラスミド、それにより
形質転換された大腸菌及びそれを用いたアミノ酸又はそ
の誘導体の製造方法を提供する。 【解決手段】 ＮＡＤ+ 依存性ギ酸デヒドロゲナーゼを
コードする遺伝子と、ＮＡＤＨ依存性アミノ酸デヒドロ
ゲナーゼをコードする遺伝子とを含有してなる組換えプ
ラスミド。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ギ酸デヒドロゲナ
ーゼを用いた共役反応に利用される組換えプラスミド、
それにより形質転換された大腸菌、その培養物及びそれ
を用いたアミノ酸又はその誘導体の製造方法に関するも
のである。
ーゼを用いた共役反応に利用される組換えプラスミド、
それにより形質転換された大腸菌、その培養物及びそれ
を用いたアミノ酸又はその誘導体の製造方法に関するも
のである。
【０００２】
【従来の技術】従来、アミノ酸及び天然には存在しない
その誘導体を製造する一つの方法として、α−ケト酸、
アンモニウム塩及び補酵素ＮＡＤＨをアミノ酸デヒドロ
ゲナーゼに作用させることにより製造する方法がある。
このようなＮＡＤＨが関与する酵素反応は工業的製造方
法に適用するために、ＮＡＤ+ を元のＮＡＤＨに再生す
るための反応と共役させた形で行われている。しかし、
通常のＮＡＤ+ 依存性デヒドロゲナーゼを用いた共役反
応においては、反応液中に少なくとも２系列の生成物が
存在することになり、その分離がきわめて難しいという
問題点があった。そこで、ＮＡＤ+ 依存性デヒドロゲナ
ーゼとして、ギ酸デヒドロゲナーゼを用いて共役反応を
行う方法が提案されている（特公平７−５９１９８号公
報）。この方法によれば、共役反応を充分進行させるこ
とにより、原料のギ酸アンモニウムが殆ど残存せず、さ
らに、ギ酸から生成する二酸化炭素は気体として反応系
外に散逸するので、反応液中にはＮＡＤＨ依存性酵素に
よる生成物のみが残り、その分離が非常に容易であると
いう利点がある。
その誘導体を製造する一つの方法として、α−ケト酸、
アンモニウム塩及び補酵素ＮＡＤＨをアミノ酸デヒドロ
ゲナーゼに作用させることにより製造する方法がある。
このようなＮＡＤＨが関与する酵素反応は工業的製造方
法に適用するために、ＮＡＤ+ を元のＮＡＤＨに再生す
るための反応と共役させた形で行われている。しかし、
通常のＮＡＤ+ 依存性デヒドロゲナーゼを用いた共役反
応においては、反応液中に少なくとも２系列の生成物が
存在することになり、その分離がきわめて難しいという
問題点があった。そこで、ＮＡＤ+ 依存性デヒドロゲナ
ーゼとして、ギ酸デヒドロゲナーゼを用いて共役反応を
行う方法が提案されている（特公平７−５９１９８号公
報）。この方法によれば、共役反応を充分進行させるこ
とにより、原料のギ酸アンモニウムが殆ど残存せず、さ
らに、ギ酸から生成する二酸化炭素は気体として反応系
外に散逸するので、反応液中にはＮＡＤＨ依存性酵素に
よる生成物のみが残り、その分離が非常に容易であると
いう利点がある。
【０００３】一方、特公平５−３２０２４号公報には、
バチルス由来の耐熱性のＬ−アラニン脱水素酵素の遺伝
子を有するプラスミドで形質転換された大腸菌が開示さ
れている。
バチルス由来の耐熱性のＬ−アラニン脱水素酵素の遺伝
子を有するプラスミドで形質転換された大腸菌が開示さ
れている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかし、ＮＡＤＨ依存
性酵素による目的生成物合成反応とギ酸デヒドロゲナー
ゼによる補酵素の再生産を効率良く行うためには、それ
ぞれの酵素をそれぞれの供給源から反応液中に添加しな
ければならないため、繁雑な精製工程が必要であるとい
う問題点があった。本発明は、アミノ酸又はその誘導体
を容易に製造するために用いることのできる組換えプラ
スミド、それにより形質転換された大腸菌及びその培養
物を提供することを目的とするものである。また、本発
明は、アミノ酸又はその誘導体を容易に効率よく製造す
ることのできるアミノ酸又はその誘導体の製造方法を提
供することを目的とするものである。
性酵素による目的生成物合成反応とギ酸デヒドロゲナー
ゼによる補酵素の再生産を効率良く行うためには、それ
ぞれの酵素をそれぞれの供給源から反応液中に添加しな
ければならないため、繁雑な精製工程が必要であるとい
う問題点があった。本発明は、アミノ酸又はその誘導体
を容易に製造するために用いることのできる組換えプラ
スミド、それにより形質転換された大腸菌及びその培養
物を提供することを目的とするものである。また、本発
明は、アミノ酸又はその誘導体を容易に効率よく製造す
ることのできるアミノ酸又はその誘導体の製造方法を提
供することを目的とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
な課題を解決するために鋭意検討の結果、ＮＡＤ+ 依存
性ギ酸デヒドロゲナーゼ及びＮＡＤＨ依存性アミノ酸デ
ヒドロゲナーゼの遺伝子を有する組換えプラスミドによ
り形質転換された大腸菌から得られた培養物を用いるこ
とにより、容易にアミノ酸及び天然に存在しないアミノ
酸誘導体を製造することができるということを見い出
し、本発明に到達した。すなわち、第一の発明は、ＮＡ
Ｄ+ 依存性ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子
と、ＮＡＤＨ依存性アミノ酸デヒドロゲナーゼをコード
する遺伝子とを含有してなる組換えプラスミドを要旨と
するものである。また、第二の発明は、上記の組換えプ
ラスミドで形質転換された大腸菌を要旨とするものであ
る。さらに、第三の発明は、上記の大腸菌を培養して得
た培養物を要旨とするものである。また、第四の発明
は、上記の培養物の存在下に、α−ケト酸とギ酸アンモ
ニウムとを反応させることを特徴とするアミノ酸又はそ
の誘導体の製造方法を要旨とするものである。
な課題を解決するために鋭意検討の結果、ＮＡＤ+ 依存
性ギ酸デヒドロゲナーゼ及びＮＡＤＨ依存性アミノ酸デ
ヒドロゲナーゼの遺伝子を有する組換えプラスミドによ
り形質転換された大腸菌から得られた培養物を用いるこ
とにより、容易にアミノ酸及び天然に存在しないアミノ
酸誘導体を製造することができるということを見い出
し、本発明に到達した。すなわち、第一の発明は、ＮＡ
Ｄ+ 依存性ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子
と、ＮＡＤＨ依存性アミノ酸デヒドロゲナーゼをコード
する遺伝子とを含有してなる組換えプラスミドを要旨と
するものである。また、第二の発明は、上記の組換えプ
ラスミドで形質転換された大腸菌を要旨とするものであ
る。さらに、第三の発明は、上記の大腸菌を培養して得
た培養物を要旨とするものである。また、第四の発明
は、上記の培養物の存在下に、α−ケト酸とギ酸アンモ
ニウムとを反応させることを特徴とするアミノ酸又はそ
の誘導体の製造方法を要旨とするものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の組換えプラスミドは、ＮＡＤ+ 依存性ギ酸デヒ
ドロゲナーゼをコードする遺伝子と、ＮＡＤＨ依存性ア
ミノ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子とを含有し
ており、これらの遺伝子はプロモーターの下流に同一転
写方向に組込まれている。
本発明の組換えプラスミドは、ＮＡＤ+ 依存性ギ酸デヒ
ドロゲナーゼをコードする遺伝子と、ＮＡＤＨ依存性ア
ミノ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子とを含有し
ており、これらの遺伝子はプロモーターの下流に同一転
写方向に組込まれている。
【０００７】本発明に用いられるＮＡＤ+ 依存性ギ酸デ
ヒドロゲナーゼをコードする遺伝子としては、マイコバ
クテリウム・バッカエ（Mycobacterium vaccae）由来の
遺伝子が挙げられ、具体的には、マイコバクテリウム・
バッカエ（Mycobacterium vaccae）Ｎ１０株由来の遺伝
子が挙げられる。
ヒドロゲナーゼをコードする遺伝子としては、マイコバ
クテリウム・バッカエ（Mycobacterium vaccae）由来の
遺伝子が挙げられ、具体的には、マイコバクテリウム・
バッカエ（Mycobacterium vaccae）Ｎ１０株由来の遺伝
子が挙げられる。
【０００８】このような微生物からギ酸デヒドロゲナー
ゼ遺伝子をクローニングする方法としては、例えば、シ
ュードモナス属（Pseudomanas sp. ）由来のギ酸デヒド
ロゲナーゼの保存領域のアミノ酸配列〔バイオケミカル
アンド バイオフィジカルリサーチ コミュニケーシ
ョン（Biochemical and Biophysical Research Communi
cation）, Vol.192, No.2; 976-981(1993)〕に基づき、
プライマーを設計、合成し、このプライマーを用いてＰ
ＣＲ反応を行い、ＤＮＡ断片を増幅させる。次に、増幅
させたＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、当初に設定した
アミノ酸配列をコードしていることを確認した後、この
ＤＮＡ断片をプローブとして、ギ酸デヒドロゲナーゼ遺
伝子を含む染色体ＤＮＡの制限酵素切断産物に対してサ
ザンハイブリダイゼーションを行えばよい。このとき、
目的とするギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断
片のおおよその大きさを２〜３Kbp に限定することが好
ましい。
ゼ遺伝子をクローニングする方法としては、例えば、シ
ュードモナス属（Pseudomanas sp. ）由来のギ酸デヒド
ロゲナーゼの保存領域のアミノ酸配列〔バイオケミカル
アンド バイオフィジカルリサーチ コミュニケーシ
ョン（Biochemical and Biophysical Research Communi
cation）, Vol.192, No.2; 976-981(1993)〕に基づき、
プライマーを設計、合成し、このプライマーを用いてＰ
ＣＲ反応を行い、ＤＮＡ断片を増幅させる。次に、増幅
させたＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、当初に設定した
アミノ酸配列をコードしていることを確認した後、この
ＤＮＡ断片をプローブとして、ギ酸デヒドロゲナーゼ遺
伝子を含む染色体ＤＮＡの制限酵素切断産物に対してサ
ザンハイブリダイゼーションを行えばよい。このとき、
目的とするギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断
片のおおよその大きさを２〜３Kbp に限定することが好
ましい。
【０００９】このようにして得られたマイコバクテリウ
ム・バッカエ（Mycobacterium vaccae）Ｎ１０株由来の
ギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を組み込
んだプラスミドの一例がpFDHである。このプラスミドpF
DHを保有するエシェリチア・コリJM109 (pFDH)株は、平
成７年１２月１８日付けで、工業技術院生命工学工業技
術研究所に寄託されている。その寄託番号は、ＦＥＲＭ
Ｐ−１５３５２である。
ム・バッカエ（Mycobacterium vaccae）Ｎ１０株由来の
ギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を組み込
んだプラスミドの一例がpFDHである。このプラスミドpF
DHを保有するエシェリチア・コリJM109 (pFDH)株は、平
成７年１２月１８日付けで、工業技術院生命工学工業技
術研究所に寄託されている。その寄託番号は、ＦＥＲＭ
Ｐ−１５３５２である。
【００１０】本発明においてクローン化したマイコバク
テリウム・バッカエ（Mycobacterium vaccae）Ｎ１０株
由来のギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は１２００塩基対
（推定アミノ酸４００個）から構成されている。また、
本発明に用いられるＮＡＤＨ依存性アミノ酸デヒドロゲ
ナーゼをコードする遺伝子としては、バチルス・ステア
ロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus ）由
来のアラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子、サーモアクチノ
ミセス・インターミディアス（Thermoactinomyces inte
rmedius ）由来のロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子、フ
ェニルアラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子等が挙げられ
る。
テリウム・バッカエ（Mycobacterium vaccae）Ｎ１０株
由来のギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は１２００塩基対
（推定アミノ酸４００個）から構成されている。また、
本発明に用いられるＮＡＤＨ依存性アミノ酸デヒドロゲ
ナーゼをコードする遺伝子としては、バチルス・ステア
ロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus ）由
来のアラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子、サーモアクチノ
ミセス・インターミディアス（Thermoactinomyces inte
rmedius ）由来のロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子、フ
ェニルアラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子等が挙げられ
る。
【００１１】これらの遺伝子をクローニングする方法と
しては、これらの遺伝子をコードする染色体ＤＮＡを制
限酵素で処理したものをプラスミドに挿入し、このプラ
スミドによって形質転換された大腸菌を直接酵素源とし
て用いるか、あるいはリゾチームなどで溶菌し、得られ
た細胞内容物を用いて酵素活性を測定する直接活性発現
を指標とした検索により行うことができる。
しては、これらの遺伝子をコードする染色体ＤＮＡを制
限酵素で処理したものをプラスミドに挿入し、このプラ
スミドによって形質転換された大腸菌を直接酵素源とし
て用いるか、あるいはリゾチームなどで溶菌し、得られ
た細胞内容物を用いて酵素活性を測定する直接活性発現
を指標とした検索により行うことができる。
【００１２】このようにして得られたバチルス・ステア
ロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus ）由
来のアラニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含
むＤＮＡ断片を組み込んだプラスミドの一例がpICR3 で
ある。このプラスミドｐＩＣＲ３を保有するエシェリチ
ア・コリＣ６００−ｐＩＣＲ３は、昭和５９年２月１４
日付けで、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託さ
れている。その寄託番号は、ＦＥＲＭＰ−７４４７であ
る。また、サーモアクチノミセス・インターミディアス
（Thermoactinomyces intermedius ）由来のロイシンデ
ヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を
組み込んだプラスミドの一例がpULDH2である。このプラ
スミドpULDH2を保有する微生物としてエシェリチア・コ
リJM109/pULDH2が挙げられる。また、サーモアクチノミ
セス・インターミディアス（Thermoactinomyces interm
edius ）由来のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼをコ
ードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を組み込んだプラスミ
ドの一例がpKPDH1である。このプラスミドpKPDH1を保有
する微生物としてエシェリチア・コリJM109/pKPDH1が挙
げられる。
ロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus ）由
来のアラニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含
むＤＮＡ断片を組み込んだプラスミドの一例がpICR3 で
ある。このプラスミドｐＩＣＲ３を保有するエシェリチ
ア・コリＣ６００−ｐＩＣＲ３は、昭和５９年２月１４
日付けで、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託さ
れている。その寄託番号は、ＦＥＲＭＰ−７４４７であ
る。また、サーモアクチノミセス・インターミディアス
（Thermoactinomyces intermedius ）由来のロイシンデ
ヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を
組み込んだプラスミドの一例がpULDH2である。このプラ
スミドpULDH2を保有する微生物としてエシェリチア・コ
リJM109/pULDH2が挙げられる。また、サーモアクチノミ
セス・インターミディアス（Thermoactinomyces interm
edius ）由来のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼをコ
ードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を組み込んだプラスミ
ドの一例がpKPDH1である。このプラスミドpKPDH1を保有
する微生物としてエシェリチア・コリJM109/pKPDH1が挙
げられる。
【００１３】本発明の組換えプラスミドは、上記のよう
にして得られたＮＡＤ+ 依存性ギ酸デヒドロゲナーゼを
コードする遺伝子とＮＡＤＨ依存性アミノ酸デヒドロゲ
ナーゼをコードする遺伝子とを、大腸菌を宿主とするこ
とが可能なプラスミド、例えばpUC19(宝酒造社製）、pB
luescript KS(+)(ストラタジーン社製）等に、tac プロ
モーターの下流に同一転写方向で直列になるように連結
することにより得ることができる。
にして得られたＮＡＤ+ 依存性ギ酸デヒドロゲナーゼを
コードする遺伝子とＮＡＤＨ依存性アミノ酸デヒドロゲ
ナーゼをコードする遺伝子とを、大腸菌を宿主とするこ
とが可能なプラスミド、例えばpUC19(宝酒造社製）、pB
luescript KS(+)(ストラタジーン社製）等に、tac プロ
モーターの下流に同一転写方向で直列になるように連結
することにより得ることができる。
【００１４】連結する方法としては、例えばモレキュラ
ー・クローニング第二版（コールドスプリングハーバー
出版社、1989年）に記載されているように、これらの酵
素をコードする遺伝子断片、プラスミド及びtac プロモ
ーターを制限酵素で消化し、次いでＤＮＡリガーゼを用
いて結合させればよい。ここで用いられるtac プロモー
ターとしては、市販のもの（例えば、ファルマシア社
製）を用いればよく、制限酵素としては、HindIII 、Ps
t I 、Sal I 等が挙げられる。また、ＤＮＡリガーゼと
しては、T4ファージ感染大腸菌由来T4ＤＮＡリガーゼが
好適に用いられる。
ー・クローニング第二版（コールドスプリングハーバー
出版社、1989年）に記載されているように、これらの酵
素をコードする遺伝子断片、プラスミド及びtac プロモ
ーターを制限酵素で消化し、次いでＤＮＡリガーゼを用
いて結合させればよい。ここで用いられるtac プロモー
ターとしては、市販のもの（例えば、ファルマシア社
製）を用いればよく、制限酵素としては、HindIII 、Ps
t I 、Sal I 等が挙げられる。また、ＤＮＡリガーゼと
しては、T4ファージ感染大腸菌由来T4ＤＮＡリガーゼが
好適に用いられる。
【００１５】このようにして作製された組換えプラスミ
ドの具体例としては、プラスミドpUC19 にマイコバクテ
リウム・バッカエ（Mycobacterium vaccae）由来のギ酸
デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子とサーモアクチノ
ミセス・インターミディアス（Thermoactinomyces inte
rmedius ）由来のロイシンデヒドロゲナーゼをコードす
る遺伝子を含む組換えプラスミドpFDH/LeuDH、プラスミ
ドpUC19 にマイコバクテリウム・バッカエ（Mycobacter
ium vaccae）由来のギ酸デヒドロゲナーゼをコードする
遺伝子とバチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus
stearothermophilus ）由来のアラニンデヒドロゲナー
ゼをコードする遺伝子を含む組換えプラスミドpFDH/Ala
DH、プラスミドpUC19 にマイコバクテリウム・バッカエ
（Mycobacterium vaccae）由来のギ酸デヒドロゲナーゼ
をコードする遺伝子とサーモアクチノミセス・インター
ミディアス（Thermoactinomyces intermedius ）由来の
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子
を含む組換えプラスミドpFDH/PheDHが挙げられる。
ドの具体例としては、プラスミドpUC19 にマイコバクテ
リウム・バッカエ（Mycobacterium vaccae）由来のギ酸
デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子とサーモアクチノ
ミセス・インターミディアス（Thermoactinomyces inte
rmedius ）由来のロイシンデヒドロゲナーゼをコードす
る遺伝子を含む組換えプラスミドpFDH/LeuDH、プラスミ
ドpUC19 にマイコバクテリウム・バッカエ（Mycobacter
ium vaccae）由来のギ酸デヒドロゲナーゼをコードする
遺伝子とバチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus
stearothermophilus ）由来のアラニンデヒドロゲナー
ゼをコードする遺伝子を含む組換えプラスミドpFDH/Ala
DH、プラスミドpUC19 にマイコバクテリウム・バッカエ
（Mycobacterium vaccae）由来のギ酸デヒドロゲナーゼ
をコードする遺伝子とサーモアクチノミセス・インター
ミディアス（Thermoactinomyces intermedius ）由来の
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子
を含む組換えプラスミドpFDH/PheDHが挙げられる。
【００１６】このようにして得られた組換えプラスミド
を用いて大腸菌を形質転換する方法としては、例えばジ
ャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー〔J. Mo
l. Biol., 53巻, 159-162頁(1970)〕に記載の方法に
従って、０℃付近の温度で塩化カルシウム処理した大腸
菌に組換えプラスミドを接触、導入する方法が挙げられ
る。このときに用いられる大腸菌としては、JM109 株、
DH5a株等が挙げられる。
を用いて大腸菌を形質転換する方法としては、例えばジ
ャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー〔J. Mo
l. Biol., 53巻, 159-162頁(1970)〕に記載の方法に
従って、０℃付近の温度で塩化カルシウム処理した大腸
菌に組換えプラスミドを接触、導入する方法が挙げられ
る。このときに用いられる大腸菌としては、JM109 株、
DH5a株等が挙げられる。
【００１７】このようにして形質転換された大腸菌か
ら、本発明の組換えプラスミドを保有する形質転換体を
選択する方法としては、例えばモレキュラー・クローニ
ング第二版（コールドスプリングハーバー出版社、1989
年）に記載の方法に従って、プラスミドを抽出した後、
各種制限酵素による切断パターンを調べることにより選
択することができる。
ら、本発明の組換えプラスミドを保有する形質転換体を
選択する方法としては、例えばモレキュラー・クローニ
ング第二版（コールドスプリングハーバー出版社、1989
年）に記載の方法に従って、プラスミドを抽出した後、
各種制限酵素による切断パターンを調べることにより選
択することができる。
【００１８】このようにして本発明の組換えプラスミド
によって形質転換された大腸菌の具体例として、組換え
プラスミドpFDH/LeuDHを保有するエシェリチア・コリJM
109(pFDH/LeuDH)（ＦＥＲＭ Ｐ−１５３５０）、組換
えプラスミドpFDH/AlaDHを保有するエシェリチア・コリ
JM109 (pFDH/AlaDH)（ＦＥＲＭ Ｐ−１５３５１）、組
換えプラスミドpFDH/PheDHを保有するエシェリチア・コ
リJM109 (pFDH/PheDH)（ＦＥＲＭ Ｐ−１５３５４）が
挙げられる。これらの大腸菌は平成７年１２月１８日付
けで、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されて
いる。
によって形質転換された大腸菌の具体例として、組換え
プラスミドpFDH/LeuDHを保有するエシェリチア・コリJM
109(pFDH/LeuDH)（ＦＥＲＭ Ｐ−１５３５０）、組換
えプラスミドpFDH/AlaDHを保有するエシェリチア・コリ
JM109 (pFDH/AlaDH)（ＦＥＲＭ Ｐ−１５３５１）、組
換えプラスミドpFDH/PheDHを保有するエシェリチア・コ
リJM109 (pFDH/PheDH)（ＦＥＲＭ Ｐ−１５３５４）が
挙げられる。これらの大腸菌は平成７年１２月１８日付
けで、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されて
いる。
【００１９】このようにして形質転換された大腸菌を培
養するための栄養培地としては、一般の大腸菌の培養に
使用される培地を用いることができ、例えば、炭素源と
しては、グルコース、グリセロール、フルクトース、シ
ュークロース、マルトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の
炭水化物、エタノール等のアルコール類が挙げられ、窒
素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸ア
ンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢
酸アンモニウム等の各種無機あるいは有機アンモニウム
塩類、尿素等の無機含窒素化合物、グルタミン酸等のア
ミノ酸類、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン
加水分解物、コーンスチープリカー等の含窒素天然栄養
源等を用いることができる。また、無機非金属又は金属
塩として、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸
アンモニウム、硫酸第一鉄、塩化マグネシウム、硫酸マ
グネシウム、塩化マンガン、硫酸マンガン等を用いるこ
とができる。
養するための栄養培地としては、一般の大腸菌の培養に
使用される培地を用いることができ、例えば、炭素源と
しては、グルコース、グリセロール、フルクトース、シ
ュークロース、マルトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の
炭水化物、エタノール等のアルコール類が挙げられ、窒
素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸ア
ンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢
酸アンモニウム等の各種無機あるいは有機アンモニウム
塩類、尿素等の無機含窒素化合物、グルタミン酸等のア
ミノ酸類、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン
加水分解物、コーンスチープリカー等の含窒素天然栄養
源等を用いることができる。また、無機非金属又は金属
塩として、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸
アンモニウム、硫酸第一鉄、塩化マグネシウム、硫酸マ
グネシウム、塩化マンガン、硫酸マンガン等を用いるこ
とができる。
【００２０】さらに、ビオチン、チアミン等のビタミン
類を必要に応じて添加してもよく、プラスミドの安定保
持のためにアンピシリン等の抗性物質を少量添加するこ
とが好ましい。また、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラ
クトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を添加することにより、
宿種大腸菌内のラクトースリプレッサー制御下にある目
的遺伝子産物の発現を誘導することができる。
類を必要に応じて添加してもよく、プラスミドの安定保
持のためにアンピシリン等の抗性物質を少量添加するこ
とが好ましい。また、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラ
クトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を添加することにより、
宿種大腸菌内のラクトースリプレッサー制御下にある目
的遺伝子産物の発現を誘導することができる。
【００２１】本発明のアミノ酸又はその誘導体の製造方
法としては、上記のようにして形質転換された大腸菌
を、上記のような栄養培地で培養し、大腸菌内にギ酸デ
ヒドロゲナーゼ及びアミノ酸デヒドロゲナーゼを生産さ
せた培養物の存在下に、α−ケト酸とギ酸アンモニウム
とを反応させるが、このときに培養物そのもののほか
に、培養物から菌体を回収し、超音波処理、リゾチーム
処理、ガラスビーズ等により菌体を破砕して得られた破
砕液であってもよい。
法としては、上記のようにして形質転換された大腸菌
を、上記のような栄養培地で培養し、大腸菌内にギ酸デ
ヒドロゲナーゼ及びアミノ酸デヒドロゲナーゼを生産さ
せた培養物の存在下に、α−ケト酸とギ酸アンモニウム
とを反応させるが、このときに培養物そのもののほか
に、培養物から菌体を回収し、超音波処理、リゾチーム
処理、ガラスビーズ等により菌体を破砕して得られた破
砕液であってもよい。
【００２２】このときの反応液中のα−ケト酸の濃度と
しては、０．５〜５．０重量％が好ましく、特に１．０
〜２．０重量％が好ましい。また、ギ酸アンモニウムの
濃度としては、１．０〜５．０重量％が好ましく、特に
２．５〜３．５重量％が好ましい。また、培養物の添加
量としては、アミノ酸デヒドロゲナーゼ及びギ酸デヒド
ロゲナーゼの酵素量がそれぞれ１ユニット／ミリリット
ル以上になるように添加することが好ましい。
しては、０．５〜５．０重量％が好ましく、特に１．０
〜２．０重量％が好ましい。また、ギ酸アンモニウムの
濃度としては、１．０〜５．０重量％が好ましく、特に
２．５〜３．５重量％が好ましい。また、培養物の添加
量としては、アミノ酸デヒドロゲナーゼ及びギ酸デヒド
ロゲナーゼの酵素量がそれぞれ１ユニット／ミリリット
ル以上になるように添加することが好ましい。
【００２３】反応条件としては、ギ酸デヒドロゲナーゼ
反応の最適条件と、アミノ酸デヒドロゲナーゼ反応の最
適条件を考慮して選択すればよい。例えば、Ｌ−ロイシ
ンを製造する反応においては、ｐＨとしては５．０〜
９．０であることが好ましく、特に７．０〜８．０であ
ることが好ましく、通常はこの範囲のｐＨの緩衝液が用
いられる。また、反応温度としては、２０〜６０℃で行
うことが好ましく、特に２５〜４５℃で行うことが好ま
しい。また、反応時間としては２５℃で反応を行う場
合、６〜２４時間が好ましく、特に８〜１６時間が好ま
しい。
反応の最適条件と、アミノ酸デヒドロゲナーゼ反応の最
適条件を考慮して選択すればよい。例えば、Ｌ−ロイシ
ンを製造する反応においては、ｐＨとしては５．０〜
９．０であることが好ましく、特に７．０〜８．０であ
ることが好ましく、通常はこの範囲のｐＨの緩衝液が用
いられる。また、反応温度としては、２０〜６０℃で行
うことが好ましく、特に２５〜４５℃で行うことが好ま
しい。また、反応時間としては２５℃で反応を行う場
合、６〜２４時間が好ましく、特に８〜１６時間が好ま
しい。
【００２４】このようにして得られた反応物からアミノ
酸又はその誘導体を回収する方法としては、熱処理、遠
心分離等により核酸、蛋白等を除去した後、活性炭処
理、イオン交換樹脂等の公知の方法により回収すること
ができる。
酸又はその誘導体を回収する方法としては、熱処理、遠
心分離等により核酸、蛋白等を除去した後、活性炭処
理、イオン交換樹脂等の公知の方法により回収すること
ができる。
【００２５】
【実施例】次に、本発明を実施例によって具体的に説明
する。なお、本発明において、制限酵素は全て宝酒造社
製のものを用いた。 参考例１ （ａ）マイコバクテリウム・バッカエの全染色体ＤＮＡ
の抽出 栄養培地（組成：酵母エキス３０ｇ、肉エキス５ｇ、グ
ルコース５ｇ、グリセロール１５ｇを蒸留水に溶解して
１リットルとした。ｐＨ７．０）１００ミリリットルを
５００ミリリットル容三角フラスコに分注し、１２１℃
で２０分間加圧滅菌した後、マイコバクテリウム・バッ
カエＮ１０株を１白金耳植菌して３０℃で２４時間振と
う攪はん培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して
菌体を収集し、得られた菌体を、１０ｍｇ／ミリリット
ルのリゾチームを含有する緩衝液（組成：１０ｍＭのＮ
ａＣｌ、２０ｍＭのトリス塩酸、１ｍＭのＥＤＴＡ・２
Ｎａ、ｐＨ８．０）２０ミリリットルに懸濁した。これ
にプロテイナーゼＫを最終濃度が１００ｍｇ／ミリリッ
トルとなるように添加し、３７℃で１時間インキュベー
トした後、ドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５
％（Ｗ／Ｖ）となるように添加し、５０℃で６時間イン
キュベートして溶菌させて溶菌液を得た。この溶菌液に
等量のフェノール／クロロホルム（１：１、Ｖ／Ｖ）混
和液を添加し、室温で１０分間緩やかに振とうした後、
全量を滅菌済み遠心管に移し、１０〜１２℃で２０分
間、５０００×ｇの遠心分離を行って上清画分を得た。
得られた上清画分を分取し、３Ｍの酢酸ナトリウムを最
終濃度が０．３Ｍとなるように添加した後、これに２倍
量のエタノールを穏やかに添加し、溶液の水層とエタノ
ール層の間に存在するＤＮＡをガラス棒で巻取りってＤ
ＮＡを得た。得られたＤＮＡを７０％（Ｖ／Ｖ）エタノ
ールで洗浄した後、風乾した。このＤＮＡに１ｍＭのＥ
ＤＴＡ・２Ｎａを含む１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）を５ミリリットル添加して４℃で一晩静置し
た後、以下の実験に供した。
する。なお、本発明において、制限酵素は全て宝酒造社
製のものを用いた。 参考例１ （ａ）マイコバクテリウム・バッカエの全染色体ＤＮＡ
の抽出 栄養培地（組成：酵母エキス３０ｇ、肉エキス５ｇ、グ
ルコース５ｇ、グリセロール１５ｇを蒸留水に溶解して
１リットルとした。ｐＨ７．０）１００ミリリットルを
５００ミリリットル容三角フラスコに分注し、１２１℃
で２０分間加圧滅菌した後、マイコバクテリウム・バッ
カエＮ１０株を１白金耳植菌して３０℃で２４時間振と
う攪はん培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して
菌体を収集し、得られた菌体を、１０ｍｇ／ミリリット
ルのリゾチームを含有する緩衝液（組成：１０ｍＭのＮ
ａＣｌ、２０ｍＭのトリス塩酸、１ｍＭのＥＤＴＡ・２
Ｎａ、ｐＨ８．０）２０ミリリットルに懸濁した。これ
にプロテイナーゼＫを最終濃度が１００ｍｇ／ミリリッ
トルとなるように添加し、３７℃で１時間インキュベー
トした後、ドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５
％（Ｗ／Ｖ）となるように添加し、５０℃で６時間イン
キュベートして溶菌させて溶菌液を得た。この溶菌液に
等量のフェノール／クロロホルム（１：１、Ｖ／Ｖ）混
和液を添加し、室温で１０分間緩やかに振とうした後、
全量を滅菌済み遠心管に移し、１０〜１２℃で２０分
間、５０００×ｇの遠心分離を行って上清画分を得た。
得られた上清画分を分取し、３Ｍの酢酸ナトリウムを最
終濃度が０．３Ｍとなるように添加した後、これに２倍
量のエタノールを穏やかに添加し、溶液の水層とエタノ
ール層の間に存在するＤＮＡをガラス棒で巻取りってＤ
ＮＡを得た。得られたＤＮＡを７０％（Ｖ／Ｖ）エタノ
ールで洗浄した後、風乾した。このＤＮＡに１ｍＭのＥ
ＤＴＡ・２Ｎａを含む１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）を５ミリリットル添加して４℃で一晩静置し
た後、以下の実験に供した。
【００２６】（ｂ）ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする
構造遺伝子の一部ＤＮＡ断片の増幅 バイオケミカル アンド バイオフィジカル リサーチ
コミュニケーション〔Biochemical and Biophysical
Research Communication） Vol.192, No.2，976-981 (1
993)〕に記載のシュードモナス（Pseudomonas sp. ）１
０１株由来のギ酸デヒドロゲナーゼを構成するアミノ酸
配列を始め、各種菌株由来のギ酸デヒドロゲナーゼを構
成するアミノ酸配列から、相同かつ種を超えて保存され
ている領域に基づき、配列番号３及び配列番号４に示す
２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、ＤＮ
Ａ／ＲＮＡシンセサイザー〔３９４型、アプライド・バ
イオシステムズ（Applied Biosystems）社製、米国〕を
用いて合成した。
構造遺伝子の一部ＤＮＡ断片の増幅 バイオケミカル アンド バイオフィジカル リサーチ
コミュニケーション〔Biochemical and Biophysical
Research Communication） Vol.192, No.2，976-981 (1
993)〕に記載のシュードモナス（Pseudomonas sp. ）１
０１株由来のギ酸デヒドロゲナーゼを構成するアミノ酸
配列を始め、各種菌株由来のギ酸デヒドロゲナーゼを構
成するアミノ酸配列から、相同かつ種を超えて保存され
ている領域に基づき、配列番号３及び配列番号４に示す
２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、ＤＮ
Ａ／ＲＮＡシンセサイザー〔３９４型、アプライド・バ
イオシステムズ（Applied Biosystems）社製、米国〕を
用いて合成した。
【００２７】このプライマーを用い、上記（ａ）で調製
したマイコバクテリウム・バッカエＮ１０株の染色体Ｄ
ＮＡを鋳型にしてポリメラーゼ・チェーン・リアクショ
ン（Polymerase Chain Reaction : ＰＣＲ）法によりギ
酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の一部ＤＮＡ断
片の増幅を行った。ＰＣＲの条件としては、５００ミリ
リットル容エッペンドルフ・チューブに、染色体ＤＮＡ
１０ｎｇ、オリゴ・ヌクレオチド・プライマー各１ｍ
ｇ、２０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ
のＭｇＣｌ2 、２５ｍＭのＫＣｌ、０．０５％（Ｗ／
Ｖ）のツイーン２０、１００ｍｇ／ミリリットルの牛胎
児血清アルブミン、各々５０ｍＭのdATP、dGTP、dTTP及
びdCTP、２．５ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
（宝酒造社製）を総量で１００ミリリットル添加し、サ
ーマル・サイクラ〔パーキン・エルマー（Perkin-Elme
r）社製〕を用いて、ＤＮＡ変性９５℃で１分、プライ
マーのアニーリング６５℃で２分、プライマーの伸長反
応７２℃で２分を１サイクルとして、３０サイクルの増
幅を行い、３８６塩基対のギ酸デヒドロゲナーゼをコー
ドする遺伝子の一部ＤＮＡ断片を得た。
したマイコバクテリウム・バッカエＮ１０株の染色体Ｄ
ＮＡを鋳型にしてポリメラーゼ・チェーン・リアクショ
ン（Polymerase Chain Reaction : ＰＣＲ）法によりギ
酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の一部ＤＮＡ断
片の増幅を行った。ＰＣＲの条件としては、５００ミリ
リットル容エッペンドルフ・チューブに、染色体ＤＮＡ
１０ｎｇ、オリゴ・ヌクレオチド・プライマー各１ｍ
ｇ、２０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ
のＭｇＣｌ2 、２５ｍＭのＫＣｌ、０．０５％（Ｗ／
Ｖ）のツイーン２０、１００ｍｇ／ミリリットルの牛胎
児血清アルブミン、各々５０ｍＭのdATP、dGTP、dTTP及
びdCTP、２．５ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
（宝酒造社製）を総量で１００ミリリットル添加し、サ
ーマル・サイクラ〔パーキン・エルマー（Perkin-Elme
r）社製〕を用いて、ＤＮＡ変性９５℃で１分、プライ
マーのアニーリング６５℃で２分、プライマーの伸長反
応７２℃で２分を１サイクルとして、３０サイクルの増
幅を行い、３８６塩基対のギ酸デヒドロゲナーゼをコー
ドする遺伝子の一部ＤＮＡ断片を得た。
【００２８】（ｃ）ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする
遺伝子を含むＤＮＡ断片の単離 上記（ｂ）で得られたギ酸デヒドロゲナーゼをコードす
る構造遺伝子の一部ＤＮＡ断片の塩基配列（配列番号
２）を決定した後、この一部ＤＮＡ断片をプローブとし
て、上記（ａ）で得られたマイコバクテリウム・バッカ
エＮ１０株の染色体ＤＮＡを制限酵素Hind III及びPst
I で処理したものに対してサザンハイブリダイゼーショ
ンを行い、ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を
含むＤＮＡ断片を得た（約２〜３Kbp ）。得られたＤＮ
Ａ断片をプラスミドpUC119（宝酒造社製）に挿入し、得
られたプラスミドを用いて大腸菌JM109 株を形質転換し
て、ライブラリーを作製した後、配列番号４で示される
プローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションを行
い、上記ライブラリーから、マイコバクテリウム・バッ
カエＮ１０株由来のギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含有
するクローン株エシェリチア・コリJM109 (pFDH)（ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１５３５２）を取得した。
遺伝子を含むＤＮＡ断片の単離 上記（ｂ）で得られたギ酸デヒドロゲナーゼをコードす
る構造遺伝子の一部ＤＮＡ断片の塩基配列（配列番号
２）を決定した後、この一部ＤＮＡ断片をプローブとし
て、上記（ａ）で得られたマイコバクテリウム・バッカ
エＮ１０株の染色体ＤＮＡを制限酵素Hind III及びPst
I で処理したものに対してサザンハイブリダイゼーショ
ンを行い、ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を
含むＤＮＡ断片を得た（約２〜３Kbp ）。得られたＤＮ
Ａ断片をプラスミドpUC119（宝酒造社製）に挿入し、得
られたプラスミドを用いて大腸菌JM109 株を形質転換し
て、ライブラリーを作製した後、配列番号４で示される
プローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションを行
い、上記ライブラリーから、マイコバクテリウム・バッ
カエＮ１０株由来のギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含有
するクローン株エシェリチア・コリJM109 (pFDH)（ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１５３５２）を取得した。
【００２９】（ｄ）クローン断片の塩基配列の決定 上記（ｃ）で取得したエシェリチア・コリJM109 (pFDH)
よりプラスミドpFDHを回収し、常法に従いクローン断片
の塩基配列を決定した（配列番号１）。さらに求められ
た塩基配列からアミノ酸配列を推定した。この結果、マ
イコバクテリウム・バッカエＮ１０株由来のギ酸デヒド
ロゲナーゼ遺伝子は約１２００塩基からなり、４００個
のアミノ酸がコードされていた。
よりプラスミドpFDHを回収し、常法に従いクローン断片
の塩基配列を決定した（配列番号１）。さらに求められ
た塩基配列からアミノ酸配列を推定した。この結果、マ
イコバクテリウム・バッカエＮ１０株由来のギ酸デヒド
ロゲナーゼ遺伝子は約１２００塩基からなり、４００個
のアミノ酸がコードされていた。
【００３０】実施例１ （ａ）組換えプラスミドpFDH/LeuDHの作製 参考例１で得られたギ酸デヒドロゲナーゼをコードする
遺伝子の塩基配列（配列番号１）に基づき、5'末端側の
端に制限酵素BamH Iの認識配列タッグを、3'末端側の端
に制限酵素Sph I の認識配列タッグを付与したオリゴ・
ヌクレオチド・プライマー（配列番号５と６）を設計
し、pFDHを鋳型にしてＰＣＲ法によりマイコバクテリウ
ム・バッカエＮ１０株由来のシャイン・ダルガーノ配列
（SD配列）に続くギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺
伝子を含むＤＮＡ断片の増幅を行った。
遺伝子の塩基配列（配列番号１）に基づき、5'末端側の
端に制限酵素BamH Iの認識配列タッグを、3'末端側の端
に制限酵素Sph I の認識配列タッグを付与したオリゴ・
ヌクレオチド・プライマー（配列番号５と６）を設計
し、pFDHを鋳型にしてＰＣＲ法によりマイコバクテリウ
ム・バッカエＮ１０株由来のシャイン・ダルガーノ配列
（SD配列）に続くギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺
伝子を含むＤＮＡ断片の増幅を行った。
【００３１】また、ロイシンデヒドロゲナーゼをコード
する遺伝子を含むＤＮＡ断片としては、ヨ−ロピアンジ
ャーナル・オブ・バイオケミストリー〔(European Jour
nalof Biochemistry) vol.222, 305-312,（1994) 〕に
記載のロイシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の
分離法に基づき、サーモアクチノミセス・インターミデ
ィアスから分離した遺伝子断片が挿入されたプラスミド
ベクタ−pULDH2を用い、5'末端側の端に制限酵素Sph I
の認識配列タッグを、3'末端側の端に制限酵素EcoR Iの
認識配列タッグを付与したオリゴ・ヌクレオチド・プラ
イマー（配列番号７と８）を設計し、pULDH2を鋳型に
し、ＰＣＲ法によサーモアクチノミセス・インターミデ
ィアス由来のシャイン・ダルガーノ配列（SD配列）に続
くロイシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含む
ＤＮＡ断片の増幅を行った。なお、pULDH2は、エシェリ
チア コリJM109/pUlDH2をＴＥ−シュークロース緩衝液
（２００ｍｇ／ミリリットルのシュークロースと２０ｍ
ＭのＥＤＴＡを含む０．０５Ｍのトリス緩衝液、ｐＨ
８．０）８０ミリリットルに懸濁し、さらに５ｍｇ／ミ
リリットルのリゾチームを含むＴＥ−シュークロース緩
衝液８ミリリットル、５ＭのＮａＣｌ２８ミリリット
ル、４０ｍｇ／ミリリットルのＳＤＳ溶液を加えて３７
℃で２時間反応させた後、遠心分離して調製した。
する遺伝子を含むＤＮＡ断片としては、ヨ−ロピアンジ
ャーナル・オブ・バイオケミストリー〔(European Jour
nalof Biochemistry) vol.222, 305-312,（1994) 〕に
記載のロイシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の
分離法に基づき、サーモアクチノミセス・インターミデ
ィアスから分離した遺伝子断片が挿入されたプラスミド
ベクタ−pULDH2を用い、5'末端側の端に制限酵素Sph I
の認識配列タッグを、3'末端側の端に制限酵素EcoR Iの
認識配列タッグを付与したオリゴ・ヌクレオチド・プラ
イマー（配列番号７と８）を設計し、pULDH2を鋳型に
し、ＰＣＲ法によサーモアクチノミセス・インターミデ
ィアス由来のシャイン・ダルガーノ配列（SD配列）に続
くロイシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含む
ＤＮＡ断片の増幅を行った。なお、pULDH2は、エシェリ
チア コリJM109/pUlDH2をＴＥ−シュークロース緩衝液
（２００ｍｇ／ミリリットルのシュークロースと２０ｍ
ＭのＥＤＴＡを含む０．０５Ｍのトリス緩衝液、ｐＨ
８．０）８０ミリリットルに懸濁し、さらに５ｍｇ／ミ
リリットルのリゾチームを含むＴＥ−シュークロース緩
衝液８ミリリットル、５ＭのＮａＣｌ２８ミリリット
ル、４０ｍｇ／ミリリットルのＳＤＳ溶液を加えて３７
℃で２時間反応させた後、遠心分離して調製した。
【００３２】次に、制限酵素Hind III、EcoR I処理を行
ったプラスミドベクターpUC19(宝造社製）、制限酵素Hi
nd III、BamH I処理を行ったtac プロモーター（ファル
マシア社製）に、上記の方法で得られたギ酸デヒドロゲ
ナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片及びロイシ
ンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断
片をそれぞれ制限酵素BamH I、Sph I 及び制限酵素Sph
I 、EcoR Iで処理したものを混合し、これに６．６ｍＭ
のＭｇＣｌ2 、１０ｍＭのＤＴＴ及び６６μＭのＡＴＰ
を含むトリス緩衝液（ｐＨ７．６）を２０マイクロリッ
トル加え、さらにＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）３
５０ユニットを加えてを１８℃で１６時間反応させてＤ
ＮＡ鎖の連結反応を行い、組換えプラスミドpFDH/LeuDH
を作製した。この組換えプラスミドpFDH/LeuDHの開裂地
図を図１に示す。
ったプラスミドベクターpUC19(宝造社製）、制限酵素Hi
nd III、BamH I処理を行ったtac プロモーター（ファル
マシア社製）に、上記の方法で得られたギ酸デヒドロゲ
ナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片及びロイシ
ンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断
片をそれぞれ制限酵素BamH I、Sph I 及び制限酵素Sph
I 、EcoR Iで処理したものを混合し、これに６．６ｍＭ
のＭｇＣｌ2 、１０ｍＭのＤＴＴ及び６６μＭのＡＴＰ
を含むトリス緩衝液（ｐＨ７．６）を２０マイクロリッ
トル加え、さらにＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）３
５０ユニットを加えてを１８℃で１６時間反応させてＤ
ＮＡ鎖の連結反応を行い、組換えプラスミドpFDH/LeuDH
を作製した。この組換えプラスミドpFDH/LeuDHの開裂地
図を図１に示す。
【００３３】（ｂ）組換え大腸菌JM109(pFDH/LeuDH) の
作製 上記（ａ）で得たプラスミドpFDH/LeuDHを用いて大腸菌
JM109 株の形質転換を行った。すなわち、ジャーナル・
オブ・モレキュラバイオロジー〔J. Mol. Biol., 53巻,
159-162 頁(1970)〕に記載の方法に従って、０℃付近
の温度で塩化カルシウム処理した大腸菌JM109 に、上記
（ａ）の方法で得られたプラスミドpFDH/LeuDHを加えて
形質転換を行なった後、アンピシリン５０μｇ／ミリリ
ットルを含むLB培地〔組成：バクトトリプトン １０
ｇ、酵母エキス ５ｇ、ＮａＣｌ １０ｇを蒸留水に溶
解して１リットルとする（ｐＨ７．２）〕で培養して、
形質転換株を選択した。
作製 上記（ａ）で得たプラスミドpFDH/LeuDHを用いて大腸菌
JM109 株の形質転換を行った。すなわち、ジャーナル・
オブ・モレキュラバイオロジー〔J. Mol. Biol., 53巻,
159-162 頁(1970)〕に記載の方法に従って、０℃付近
の温度で塩化カルシウム処理した大腸菌JM109 に、上記
（ａ）の方法で得られたプラスミドpFDH/LeuDHを加えて
形質転換を行なった後、アンピシリン５０μｇ／ミリリ
ットルを含むLB培地〔組成：バクトトリプトン １０
ｇ、酵母エキス ５ｇ、ＮａＣｌ １０ｇを蒸留水に溶
解して１リットルとする（ｐＨ７．２）〕で培養して、
形質転換株を選択した。
【００３４】得られた形質転換株から、上記の方法に従
ってプラスミドを抽出した後、各種制限酵素を用いて処
理し、アガロースゲル電気泳動により制限酵素処理組換
えプラスミドを電気泳動した。電気泳動後、切断パター
ンを比較して、プラスミドpFDH/LeuDHで形質転換された
大腸菌を選択し、これをエシェリチア・コリJM109(pFDH
/LeuDH) と命名した（ＦＥＲＭ Ｐ−１５３５０）。
ってプラスミドを抽出した後、各種制限酵素を用いて処
理し、アガロースゲル電気泳動により制限酵素処理組換
えプラスミドを電気泳動した。電気泳動後、切断パター
ンを比較して、プラスミドpFDH/LeuDHで形質転換された
大腸菌を選択し、これをエシェリチア・コリJM109(pFDH
/LeuDH) と命名した（ＦＥＲＭ Ｐ−１５３５０）。
【００３５】実施例２ 5'末端側の端に制限酵素Sph I の認識配列タッグを、3'
末端側の端に制限酵素EcoR Iの認識配列タッグを付与し
たオリゴ・ヌクレオチド・プライマー（配列番号９と１
０）を設計し、実施例１と同様にしてエシェリチア コ
リC600-pICR3（ＦＥＲＭ Ｐ−７４４７）から調製した
pICR3 を鋳型にしてアラニンデヒドロゲナーゼをコード
する遺伝子を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅し
た。次に、実施例１で得られた組換えプラスミドpFDH/L
euDHに制限酵素Sph I 、EcoR I処理を施してロイシンデ
ヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を
除いた組換えプラスミドに、上記のアラニンデヒドロゲ
ナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡを制限酵素Sph
I 、EcoR Iで処理したものを混合し、実施例１と同様に
してＤＮＡ鎖の連結反応を行い、組換えプラスミドpFDH
/AlaDHを作製した。この組換えプラスミドpFDH/AlaDHの
開裂地図を図２に示す。この組換えプラスミドpFDH/Ala
DHを実施例１と同様にして大腸菌JM109 に導入し、エシ
ェリチア・コリJM109(pFDH/AlaDH) （ＦＥＲＭ Ｐ−１
５３５１）を作製した。
末端側の端に制限酵素EcoR Iの認識配列タッグを付与し
たオリゴ・ヌクレオチド・プライマー（配列番号９と１
０）を設計し、実施例１と同様にしてエシェリチア コ
リC600-pICR3（ＦＥＲＭ Ｐ−７４４７）から調製した
pICR3 を鋳型にしてアラニンデヒドロゲナーゼをコード
する遺伝子を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅し
た。次に、実施例１で得られた組換えプラスミドpFDH/L
euDHに制限酵素Sph I 、EcoR I処理を施してロイシンデ
ヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を
除いた組換えプラスミドに、上記のアラニンデヒドロゲ
ナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡを制限酵素Sph
I 、EcoR Iで処理したものを混合し、実施例１と同様に
してＤＮＡ鎖の連結反応を行い、組換えプラスミドpFDH
/AlaDHを作製した。この組換えプラスミドpFDH/AlaDHの
開裂地図を図２に示す。この組換えプラスミドpFDH/Ala
DHを実施例１と同様にして大腸菌JM109 に導入し、エシ
ェリチア・コリJM109(pFDH/AlaDH) （ＦＥＲＭ Ｐ−１
５３５１）を作製した。
【００３６】実施例３ アラニンデヒドゲナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片をフェニルアラニンデヒドロゲナーゼをコードす
る遺伝子を含むＤＮＡ断片に代える以外は実施例２と同
様にして組換えプラスミドpFDH/PheDH及びこれにより形
質転換されたエシェリチア・コリJM109(pFDH/PheDH)
（ＦＥＲＭ Ｐ−１５３５４）を作製した。なお、フェ
ニルアラニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含
むＤＮＡ断片としては、ジャーナル・オブ・バイオケミ
ストリー〔(Journal of Biochemistry）vol.109, 371-3
76, （1991) 〕に記載のフェニルアラニンデヒドロゲナ
ーゼをコードする遺伝子の分離法に基づき、サーモアク
チノミセス・インターミディアスから分離した遺伝子断
片が挿入されたプラスミドベクターpKPDH1を鋳型とし
て、5'末端側の端に制限酵素Sph I の認識配列タッグ
を、3'末端側の端に制限酵素EcoR Iの認識配列タッグを
付与したオリゴ・ヌクレオチド・プライマー（配列番号
１１と１２）を用いてＰＣＲ法により増幅したフェニル
アラニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片を用いた。
Ａ断片をフェニルアラニンデヒドロゲナーゼをコードす
る遺伝子を含むＤＮＡ断片に代える以外は実施例２と同
様にして組換えプラスミドpFDH/PheDH及びこれにより形
質転換されたエシェリチア・コリJM109(pFDH/PheDH)
（ＦＥＲＭ Ｐ−１５３５４）を作製した。なお、フェ
ニルアラニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含
むＤＮＡ断片としては、ジャーナル・オブ・バイオケミ
ストリー〔(Journal of Biochemistry）vol.109, 371-3
76, （1991) 〕に記載のフェニルアラニンデヒドロゲナ
ーゼをコードする遺伝子の分離法に基づき、サーモアク
チノミセス・インターミディアスから分離した遺伝子断
片が挿入されたプラスミドベクターpKPDH1を鋳型とし
て、5'末端側の端に制限酵素Sph I の認識配列タッグ
を、3'末端側の端に制限酵素EcoR Iの認識配列タッグを
付与したオリゴ・ヌクレオチド・プライマー（配列番号
１１と１２）を用いてＰＣＲ法により増幅したフェニル
アラニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片を用いた。
【００３７】実施例４ 実施例１で作製したエシェリチア・コリJM109(pFDH/Leu
DH) を５０μｇ／ミリリットルを含むLB培地１０ミリリ
ットルに植菌し、３７℃で一晩種培養し、そのうちの１
００マイクロリットルを５０ｍｇ／ミリリットルのアン
ピシリンを含むLB培地１０ミリリットルに植菌し、３７
℃で６６０ｎｍの吸光度が０．３になるまで振とう培養
した後、ＩＰＴＧを１ｍＭとなるように添加して遺伝子
発現の誘導をかけ、さらに３７℃で１２時間振とう培養
して培養液を得た。この培養液を遠心分離して菌体を回
収した後、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗
浄し、同緩衝液に再懸濁した後、超音波により菌体を破
砕して菌体破砕液を得た。この菌体破砕液のギ酸デヒド
ロゲナーゼ、ロイシンデヒドロゲナーゼ各酵素活性を測
定したところ、可溶化蛋白１ｍｇあたり、それぞれ１．
３０ユニット、１１．２ユニットの活性を示し、酵素蛋
白発現量は総蛋白あたりそれぞれ４〜８％と良好な発現
を示していた。
DH) を５０μｇ／ミリリットルを含むLB培地１０ミリリ
ットルに植菌し、３７℃で一晩種培養し、そのうちの１
００マイクロリットルを５０ｍｇ／ミリリットルのアン
ピシリンを含むLB培地１０ミリリットルに植菌し、３７
℃で６６０ｎｍの吸光度が０．３になるまで振とう培養
した後、ＩＰＴＧを１ｍＭとなるように添加して遺伝子
発現の誘導をかけ、さらに３７℃で１２時間振とう培養
して培養液を得た。この培養液を遠心分離して菌体を回
収した後、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗
浄し、同緩衝液に再懸濁した後、超音波により菌体を破
砕して菌体破砕液を得た。この菌体破砕液のギ酸デヒド
ロゲナーゼ、ロイシンデヒドロゲナーゼ各酵素活性を測
定したところ、可溶化蛋白１ｍｇあたり、それぞれ１．
３０ユニット、１１．２ユニットの活性を示し、酵素蛋
白発現量は総蛋白あたりそれぞれ４〜８％と良好な発現
を示していた。
【００３８】実施例５ 実施例４と同様の方法で培養して得られたエシェリチア
・コリJM109(pFDH/LeuDH) の菌体破砕液を用いて、ギ酸
デヒドロゲナーゼとロイシンデヒドロゲナーゼの共役反
応によるロイシンの生成反応を以下のようにして行っ
た。すなわち、１０ｍＭのα−ケトカプロン酸及び５０
ｍＭのギ酸アンモニウムを含む５００ｍＭのアンモニア
緩衝液（ｐＨ７．５）１００ミリリットルにエシェリチ
ア・コリJM109(pFDH/LeuDH) の菌体破砕液をギ酸デヒド
ロゲナーゼ １ユニット／ミリリットル、ロイシンデヒ
ドロゲナーゼ ８．６ユニット／ミリリットルとなるよ
うに加えて、２５℃で８時間、攪拌しながら反応させて
Ｌ−ロイシンを生成させた。
・コリJM109(pFDH/LeuDH) の菌体破砕液を用いて、ギ酸
デヒドロゲナーゼとロイシンデヒドロゲナーゼの共役反
応によるロイシンの生成反応を以下のようにして行っ
た。すなわち、１０ｍＭのα−ケトカプロン酸及び５０
ｍＭのギ酸アンモニウムを含む５００ｍＭのアンモニア
緩衝液（ｐＨ７．５）１００ミリリットルにエシェリチ
ア・コリJM109(pFDH/LeuDH) の菌体破砕液をギ酸デヒド
ロゲナーゼ １ユニット／ミリリットル、ロイシンデヒ
ドロゲナーゼ ８．６ユニット／ミリリットルとなるよ
うに加えて、２５℃で８時間、攪拌しながら反応させて
Ｌ−ロイシンを生成させた。
【００３９】この間に生成したＬ−ロイシンをアミノ酸
自動分析装置（アプライド・バイオシステムズ社製）及
び高速液体クロマトグラフィー（ウォーターズ社製）を
用いて定性及び定量した。その結果を図４に示す。図４
は、本発明のギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子
とロイシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子とを含
有するプラスミドで形質転換された大腸菌の培養物を用
いてＬ−ロイシンを製造したときの結果を示す図であ
り、縦軸にＬ−ロイシンの生成量を、横軸に反応時間を
示している。図４から明らかなように、本発明のギ酸デ
ヒドロゲナーゼをコードする遺伝子とロイシンデヒドロ
ゲナーゼをコードする遺伝子とを含有するプラスミドで
形質転換された大腸菌の培養物を用いてギ酸デヒドロゲ
ナーゼとロイシンデヒドロゲナーゼの共役反応を行うこ
とにより、α−ケトイソカプロン酸からＬ−ロイシンを
効率よく製造することができた。
自動分析装置（アプライド・バイオシステムズ社製）及
び高速液体クロマトグラフィー（ウォーターズ社製）を
用いて定性及び定量した。その結果を図４に示す。図４
は、本発明のギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子
とロイシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子とを含
有するプラスミドで形質転換された大腸菌の培養物を用
いてＬ−ロイシンを製造したときの結果を示す図であ
り、縦軸にＬ−ロイシンの生成量を、横軸に反応時間を
示している。図４から明らかなように、本発明のギ酸デ
ヒドロゲナーゼをコードする遺伝子とロイシンデヒドロ
ゲナーゼをコードする遺伝子とを含有するプラスミドで
形質転換された大腸菌の培養物を用いてギ酸デヒドロゲ
ナーゼとロイシンデヒドロゲナーゼの共役反応を行うこ
とにより、α−ケトイソカプロン酸からＬ−ロイシンを
効率よく製造することができた。
【００４０】実施例６ 実施例２で作製したエシェリチア・コリJM109(pFDH/Ala
DH) を５０μｇ／ミリリットルを含むLB培地１０ミリリ
ットルに植菌し、３７℃で一晩種培養し、そのうちの１
００マイクロリットルを５０μｇ／ミリリットルのアン
ピシリンを含むLB培地１０ミリリットルに植菌し、３７
℃で６６０ｎｍの吸光度が０．３になるまで振とう培養
した後、ＩＰＴＧを１ｍＭとなるように添加して遺伝子
発現の誘導をかけ、さらに３７℃で１２時間振とう培養
して培養液を得た。この培養液を遠心分離して菌体を回
収した後、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗
浄した。さらに同緩衝液に再懸濁した後、超音波により
菌体を破砕して菌体破砕液を得た。この菌体破砕液のギ
酸デヒドロゲナーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼ各酵素
活性を測定したところ、可溶化蛋白１ｍｇあたり、それ
ぞれ１．２５ユニット、８．２ユニットの活性を示し
た。
DH) を５０μｇ／ミリリットルを含むLB培地１０ミリリ
ットルに植菌し、３７℃で一晩種培養し、そのうちの１
００マイクロリットルを５０μｇ／ミリリットルのアン
ピシリンを含むLB培地１０ミリリットルに植菌し、３７
℃で６６０ｎｍの吸光度が０．３になるまで振とう培養
した後、ＩＰＴＧを１ｍＭとなるように添加して遺伝子
発現の誘導をかけ、さらに３７℃で１２時間振とう培養
して培養液を得た。この培養液を遠心分離して菌体を回
収した後、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗
浄した。さらに同緩衝液に再懸濁した後、超音波により
菌体を破砕して菌体破砕液を得た。この菌体破砕液のギ
酸デヒドロゲナーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼ各酵素
活性を測定したところ、可溶化蛋白１ｍｇあたり、それ
ぞれ１．２５ユニット、８．２ユニットの活性を示し
た。
【００４１】実施例７ 実施例６と同様の方法で培養して得られたエシェリチア
・コリJM109(pFDH/AlaDH) の菌体破砕液を用いて、ギ酸
デヒドロゲナーゼとアラニンデヒドロゲナーゼの共役反
応によるアラニンの生成反応を以下のようにして行っ
た。すなわち、１０ｍＭのピルビン酸及び５０ｍＭのギ
酸アンモニウムを含む５００ｍＭのアンモニア緩衝液
（ｐＨ７．５）１００ミリリットルにエシェリチア・コ
リJM109(pFDH/AlaDH) の菌体破砕液をギ酸デヒドロゲナ
ーゼ １ユニット／ミリリットル、アラニンデヒドロゲ
ナーゼ ６．６ユニット／ミリリットルとなるように加
えて、２５℃で８時間、攪拌しながら反応させてＬ−ア
ラニンを生成させた。
・コリJM109(pFDH/AlaDH) の菌体破砕液を用いて、ギ酸
デヒドロゲナーゼとアラニンデヒドロゲナーゼの共役反
応によるアラニンの生成反応を以下のようにして行っ
た。すなわち、１０ｍＭのピルビン酸及び５０ｍＭのギ
酸アンモニウムを含む５００ｍＭのアンモニア緩衝液
（ｐＨ７．５）１００ミリリットルにエシェリチア・コ
リJM109(pFDH/AlaDH) の菌体破砕液をギ酸デヒドロゲナ
ーゼ １ユニット／ミリリットル、アラニンデヒドロゲ
ナーゼ ６．６ユニット／ミリリットルとなるように加
えて、２５℃で８時間、攪拌しながら反応させてＬ−ア
ラニンを生成させた。
【００４２】この間に生成したＬ−アラニンをアミノ酸
自動分析装置（アプライド・バイオシステムズ社製）及
び高速液体クロマトグラフィー（ウォーターズ社製）を
用いて定性及び定量した。その結果を図５に示す。図５
は、本発明のギ酸デヒドロゲナーゼとアラニンデヒドロ
ゲナーゼの遺伝子を含有するプラスミドで形質転換され
た大腸菌の培養物を用いてＬ−アラニンを製造したとき
の結果を示す図であり、縦軸にＬ−アラニンの生成量
を、横軸に反応時間を示している。図５からわかるよう
に、本発明のギ酸デヒドロゲナーゼとアラニンデヒドロ
ゲナーゼの遺伝子を含有するプラスミドで形質転換され
た大腸菌の培養物を用いてギ酸デヒドロゲナーゼとアラ
ニンデヒドロゲナーゼの共役反応を行うことにより、ピ
ルビン酸からＬ−アラニンを効率よく製造することがで
きる。
自動分析装置（アプライド・バイオシステムズ社製）及
び高速液体クロマトグラフィー（ウォーターズ社製）を
用いて定性及び定量した。その結果を図５に示す。図５
は、本発明のギ酸デヒドロゲナーゼとアラニンデヒドロ
ゲナーゼの遺伝子を含有するプラスミドで形質転換され
た大腸菌の培養物を用いてＬ−アラニンを製造したとき
の結果を示す図であり、縦軸にＬ−アラニンの生成量
を、横軸に反応時間を示している。図５からわかるよう
に、本発明のギ酸デヒドロゲナーゼとアラニンデヒドロ
ゲナーゼの遺伝子を含有するプラスミドで形質転換され
た大腸菌の培養物を用いてギ酸デヒドロゲナーゼとアラ
ニンデヒドロゲナーゼの共役反応を行うことにより、ピ
ルビン酸からＬ−アラニンを効率よく製造することがで
きる。
【００４３】実施例８ 実施例３で作製したエシェリチア・コリJM109(pFDH/Phe
DH) を５０μｇ／ミリリットルを含むLB培地１０ミリリ
ットルに植菌し、３７℃で一晩種培養し、そのうちの１
００マイクロリットルを５０μｇ／ミリリットルのアン
ピシリンを含むLB培地１０ミリリットルに植菌し、３７
℃で６６０ｎｍの吸光度が０．３になるまで振とう培養
した後、ＩＰＴＧを１ｍＭとなるように添加して遺伝子
発現の誘導をかけ、さらに３７℃で１２時間振とう培養
して培養液を得た。この培養液を遠心分離して菌体を回
収した後、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗
浄した。さらに同緩衝液に再懸濁した後、超音波により
菌体を破砕して菌体破砕液を得た。この菌体破砕液のギ
酸デヒドロゲナーゼ、フェニルアラニンデヒドロゲナー
ゼ各酵素活性を測定したところ、可溶化蛋白１ｍｇあた
り、それぞれ１．２０ユニット、７．８ユニットの活性
を示した。
DH) を５０μｇ／ミリリットルを含むLB培地１０ミリリ
ットルに植菌し、３７℃で一晩種培養し、そのうちの１
００マイクロリットルを５０μｇ／ミリリットルのアン
ピシリンを含むLB培地１０ミリリットルに植菌し、３７
℃で６６０ｎｍの吸光度が０．３になるまで振とう培養
した後、ＩＰＴＧを１ｍＭとなるように添加して遺伝子
発現の誘導をかけ、さらに３７℃で１２時間振とう培養
して培養液を得た。この培養液を遠心分離して菌体を回
収した後、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗
浄した。さらに同緩衝液に再懸濁した後、超音波により
菌体を破砕して菌体破砕液を得た。この菌体破砕液のギ
酸デヒドロゲナーゼ、フェニルアラニンデヒドロゲナー
ゼ各酵素活性を測定したところ、可溶化蛋白１ｍｇあた
り、それぞれ１．２０ユニット、７．８ユニットの活性
を示した。
【００４４】実施例９ 実施例８と同様の方法で培養して得られたエシェリチア
・コリJM109(pFDH/PheDH) の菌体破砕液を用いて、ギ酸
デヒドロゲナーゼとフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ
の共役反応によるフェニルアラニンの生成反応を以下の
ようにして行った。すなわち、１０ｍＭのフェニルピル
ビン酸及び５０ｍＭのギ酸アンモニウムを含む５００ｍ
Ｍのアンモニア緩衝液（ｐＨ７．５）１００ミリリット
ルにエシェリチア・コリJM109(pFDH/PheDH) の菌体破砕
液をギ酸デヒドロゲナーゼ １ユニット／ミリリット
ル、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ ６．５ユニッ
ト／ミリリットルとなるように加えて、２５℃で８時
間、攪拌しながら反応させてＬ−フェニルアラニンを生
成させた。
・コリJM109(pFDH/PheDH) の菌体破砕液を用いて、ギ酸
デヒドロゲナーゼとフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ
の共役反応によるフェニルアラニンの生成反応を以下の
ようにして行った。すなわち、１０ｍＭのフェニルピル
ビン酸及び５０ｍＭのギ酸アンモニウムを含む５００ｍ
Ｍのアンモニア緩衝液（ｐＨ７．５）１００ミリリット
ルにエシェリチア・コリJM109(pFDH/PheDH) の菌体破砕
液をギ酸デヒドロゲナーゼ １ユニット／ミリリット
ル、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ ６．５ユニッ
ト／ミリリットルとなるように加えて、２５℃で８時
間、攪拌しながら反応させてＬ−フェニルアラニンを生
成させた。
【００４５】この間に生成したＬ−フェニルアラニンを
アミノ酸自動分析装置（アプライド・バイオシステムズ
社製）及び高速液体クロマトグラフィー（ウォーターズ
社製）を用いて定性及び定量した。その結果を図６に示
す。図６は、本発明のギ酸デヒドロゲナーゼとフェニル
アラニンデヒドロゲナーゼの遺伝子を含有するプラスミ
ドで形質転換された大腸菌の培養物を用いてＬ−フェニ
ルアラニンを製造したときの結果を示す図であり、縦軸
にＬ−フェニルアラニンの生成量を、横軸に反応時間を
示している。図６からわかるように、本発明のギ酸デヒ
ドロゲナーゼとフェニルアラニンデヒドロゲナーゼの遺
伝子を含有するプラスミドで形質転換された大腸菌の培
養物を用いてギ酸デヒドロゲナーゼとフェニルアラニン
デヒドロゲナーゼの共役反応を行うことにより、フェニ
ルピルビン酸からＬ−フェニルアラニンを効率よく製造
することができる。
アミノ酸自動分析装置（アプライド・バイオシステムズ
社製）及び高速液体クロマトグラフィー（ウォーターズ
社製）を用いて定性及び定量した。その結果を図６に示
す。図６は、本発明のギ酸デヒドロゲナーゼとフェニル
アラニンデヒドロゲナーゼの遺伝子を含有するプラスミ
ドで形質転換された大腸菌の培養物を用いてＬ−フェニ
ルアラニンを製造したときの結果を示す図であり、縦軸
にＬ−フェニルアラニンの生成量を、横軸に反応時間を
示している。図６からわかるように、本発明のギ酸デヒ
ドロゲナーゼとフェニルアラニンデヒドロゲナーゼの遺
伝子を含有するプラスミドで形質転換された大腸菌の培
養物を用いてギ酸デヒドロゲナーゼとフェニルアラニン
デヒドロゲナーゼの共役反応を行うことにより、フェニ
ルピルビン酸からＬ−フェニルアラニンを効率よく製造
することができる。
【００４６】実施例１０ 実施例４と同様の方法で培養して得られたエシェリチア
・コリJM109(pFDH/LeuDH) の菌体破砕液を用いて、ギ酸
デヒドロゲナーゼとロイシンデヒドロゲナーゼの共役反
応による表１に示す各種アミノ酸及びその誘導体の生成
反応を以下のようにして行った。すなわち、１０ｍＭの
各種α−ケト酸及び５０ｍＭのギ酸アンモニウムを含む
５００ｍＭのアンモニア緩衝液（ｐＨ７．５）１００ミ
リリットルにエシェリチア・コリJM109(pFDH/LeuDH) の
菌体破砕液をギ酸デヒドロゲナーゼ １ユニット／ミリ
リットル、ロイシンデヒドロゲナーゼ ８．６ユニット
／ミリリットルとなるように加えて、２５℃で１２時
間、攪拌しながら反応させて表１に示すアミノ酸及びそ
の誘導体を生成させた。
・コリJM109(pFDH/LeuDH) の菌体破砕液を用いて、ギ酸
デヒドロゲナーゼとロイシンデヒドロゲナーゼの共役反
応による表１に示す各種アミノ酸及びその誘導体の生成
反応を以下のようにして行った。すなわち、１０ｍＭの
各種α−ケト酸及び５０ｍＭのギ酸アンモニウムを含む
５００ｍＭのアンモニア緩衝液（ｐＨ７．５）１００ミ
リリットルにエシェリチア・コリJM109(pFDH/LeuDH) の
菌体破砕液をギ酸デヒドロゲナーゼ １ユニット／ミリ
リットル、ロイシンデヒドロゲナーゼ ８．６ユニット
／ミリリットルとなるように加えて、２５℃で１２時
間、攪拌しながら反応させて表１に示すアミノ酸及びそ
の誘導体を生成させた。
【００４７】この間に生成したアミノ酸及びその誘導体
をアミノ酸自動分析装置（アプライド・バイオシステム
ズ社製）及び高速液体クロマトグラフィー（ウォーター
ズ社製）を用いて定性及び定量した。その結果を表１に
示す。
をアミノ酸自動分析装置（アプライド・バイオシステム
ズ社製）及び高速液体クロマトグラフィー（ウォーター
ズ社製）を用いて定性及び定量した。その結果を表１に
示す。
【００４８】
【表１】
【００４９】表１から明らかなように、本発明のギ酸デ
ヒドロゲナーゼをコードする遺伝子とロイシンデヒドロ
ゲナーゼをコードする遺伝子とを含有するプラスミドに
よって形質転換された大腸菌の培養物を用いてギ酸デヒ
ドロゲナーゼとロイシンデヒドロゲナーゼの共役反応を
行うことにより、各種α−ケト酸から各種アミノ酸及び
その誘導体を効率よく製造することができた。
ヒドロゲナーゼをコードする遺伝子とロイシンデヒドロ
ゲナーゼをコードする遺伝子とを含有するプラスミドに
よって形質転換された大腸菌の培養物を用いてギ酸デヒ
ドロゲナーゼとロイシンデヒドロゲナーゼの共役反応を
行うことにより、各種α−ケト酸から各種アミノ酸及び
その誘導体を効率よく製造することができた。
【００５０】
【発明の効果】本発明の組換えプラスミド、それにより
形質転換された大腸菌及びその培養物は、アミノ酸及び
その誘導体を容易に製造するために用いることができ
る。また、本発明の方法によれば、アミノ酸及びその誘
導体を容易に効率よく製造することができる。
形質転換された大腸菌及びその培養物は、アミノ酸及び
その誘導体を容易に製造するために用いることができ
る。また、本発明の方法によれば、アミノ酸及びその誘
導体を容易に効率よく製造することができる。
【図１】本発明の組換えプラスミドpFDH/LeuDHの開裂地
図を示す図である。
図を示す図である。
【図２】本発明の組換えプラスミドpFDH/AlaDHの開裂地
図を示す図である。
図を示す図である。
【図３】本発明の組換えプラスミドpFDH/PheDHの開裂地
図を示す図である。
図を示す図である。
【図４】本発明の組換えプラスミドpFDH/LeuDHで形質転
換された大腸菌の培養物を用いてＬ−ロイシンを製造し
たときの、Ｌ−ロイシンの生成量の経時変化を示す図で
ある。
換された大腸菌の培養物を用いてＬ−ロイシンを製造し
たときの、Ｌ−ロイシンの生成量の経時変化を示す図で
ある。
【図５】本発明の組換えプラスミドpFDH/AlaDHで形質転
換された大腸菌の培養物を用いてＬ−アラニンを製造し
たときの、Ｌ−アラニンの生成量の経時変化を示す図で
ある。
換された大腸菌の培養物を用いてＬ−アラニンを製造し
たときの、Ｌ−アラニンの生成量の経時変化を示す図で
ある。
【図６】本発明の組換えプラスミドpFDH/PheDHで形質転
換された大腸菌の培養物を用いてＬ−フェニルアラニン
を製造したときの、Ｌ−フェニルアラニンの生成量の経
時変化を示す図である。
換された大腸菌の培養物を用いてＬ−フェニルアラニン
を製造したときの、Ｌ−フェニルアラニンの生成量の経
時変化を示す図である。
配列番号：１ 配列の長さ：１２０３ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：cDNA 起源 微生物名：マイコバクテリウム・バッカエ 株名：Ｎ１０ 配列の特長 特徴を表す記号：ＣＤＳ 特徴を決定した方法：Ｐ 配列 ATG GCA AAG GTC CTG TGC GTT CTT TAC GAT GAT CCG GTC GAC GGC TAC 48 Met ala lys val leu cys val leu tyr asp asp pro val asp gly tyr CCG AAG ACC TAT GCC CGC GAC GAT CTT CCG AAG ATC GAC CAC TAT CCG 96 pro lys thr tyr ala arg asp asp leu pro lys ile asp his lys ala GGC GGC CAG ATC TTG CCG ACG CCG AAG GCC ATC GAC TTC ACG CCC GGG 144 ile asp phe thr pro gly gln leu leu gly ser val ser gly glu leu CAG TTG CTC GGC TCC GTC TCC GGC GAG CTC GGC CTG CGC GAA TAT CTC 192 tyr pro gly gly gln ile leu pro thr pro gly leu arg glu tyr leu GAA TCC AAC GGC CAC ACC CTG GTC GTG ACC TCC GAC AAG GAC GGC CCC 240 glu ser asn gly his thr leu val val thr ser asp lys asp gly pro GAC TCG GTG TTC GAG CGC GAG CTG GTC GAT GCG GAT GTC GTC ATC TCC 288 asp ser val phe glu arg glu leu val asp ala asp val val ile ser CAG CCC TTC TGG CCG GCC TAT CTG ACG CCC GAG CGC ATC GCC AAG GCC 336 gln pro phe trp pro ala tyr leu thr pro glu arg ile ala lys ala AAG AAC CTG AAG CTC GCG CTC ACC GCC GGC ATC GGT TCC GAC CAC GTC 384 lys asn leu lys leu ala leu thr ala gly ile gly ser asp his val GAT CTT CAG TCG GCT ATC GAC CGC AAC GTC ACC GTG GCG GAA GTC ACC 432 asp leu gln ser ala ile asp arg asn val thr val ala glu val thr TAC TGC AAC TCG ATC AGC GTC GCC GAG CAT GTG GTG ATG ATG ATC CTG 480 tyr cys asn ser ile ser ser leu val arg asn tyr leu pro ser his TCG CTG GTG CGC AAC TAT CTG CCC TCG CAC GAA TGG GCG CGG AAG GGC 528 glu trp ala arg lys gly gly trp val ala glu his val val met met GGC TGG AAC ATC GCC GAC TGC GTC TCC CAC GCC TAC GAC CTC GAG GCG 576 ile leu asn ile ala asp cys val ser his ala tyr asp leu glu ala ATG CAT GTC GGC ACC GTG GCC GCC GGC CGC ATC GGT CTC GCG GTG CTG 624 met his val gly thr val ala ala gly arg ile gly leu ala val leu CGC CGT CTG GCG CCG TTC GAC GTG CAC CTG CAC TAC ACC GAC CGT CAC 672 arg arg leu ala pro phe asp val his leu his tyr thr asp arg his CGC CTG CCG GAA TCG GTC GAG AAG GAG CTC AAC CTC ACC TGG CAC GCG 720 arg leu pro glu ser val glu lys glu leu asn leu thr trp his ala ACC CGC GAG GAC ATG TAT CCG GTT TGC GAC GTG GTG ACG CTG AAC TGC 768 thr arg glu asp met tyr pro val cys asp val val thr leu asn cys CCG CTG CAC CCC GAA ACC GAG CAC ATG ATC AAT GAC GAG ACG CTG AAG 816 pro leu his pro glu thr glu his met ile asn asp glu thr leu lys CTG TTC AAG CGT GGC GCC TAC ATC GTC AAC ACC GCC CGC GGC AAG CTG 864 leu phe lys arg gly ala tyr ile val asn thr ala arg gly lys leu TGC GAC CGC GAT GCC GTG GCA CGT GCG CTC GAA TCC GGC CGG CTG GCC 912 cys asp arg asp ala val ala arg ala leu glu ser gly arg leu ala GGC TAT GCC GGC GAC GTG TGG TTC CCG CAG CCG GCG CCG AAG GAC CAC 960 gly tyr ala gly asp val trp phe pro gln pro ala pro lys asp his CCC TGG CGG ACG ATG CCC TAT AAC GGC ATG ACC CCG CAC ATC TCC GGC 1008 pro trp arg thr met pro tyr asn gly met thr pro his ile ser gly ACC ACG CTG ACC GCG CAG GCG CGT TAT GCG GCG GGC ACC CGC GAG ATC 1056 thr thr leu thr ala gln ala arg tyr ala ala gly thr arg glu ile CTG GAG TGC TTC TTC GAG GGC CGT CCG ATC CGC GAC GAA TAC CTC ATC 1104 leu glu cys phe phe glu gly arg pro ile arg asp glu tyr leu ile GTG CAG GGC GGC GCT CTT GCC GGC ACC GGC GCG CAT TCC TAC TCG AAG 1152 val gln gly gly ala leu ala gly thr gly ala his ser tyr ser lys GGC AAT GCC ACC GGC GGT TCG GAA GAG GCC GCC AAG TTC AAG AAG GCG 1200 gly asn ala thr gly gly ser glu glu ala ala lys phe lys lys ala GTC TGA 1206 val ＊ 配列番号：２ 配列の長さ：３８６ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：cDNA 起源 微生物名：マイコバクテリウム・バッカエ 株名：Ｎ１０ 配列の特長 特徴を表す記号：ＣＤＳ 特徴を決定した方法：Ｐ 配列GTGACCTCCG ACAAGGACGG CCCCGACTCG GTGTTCGAGC GCGAGCTGGT CGATGCGGAT 60 GTCGTCATCT CCCAGCCCTT CTGGCCGGCC TATCTGACGC CCGAGCGCAT CGCCAAGGCC 120 AAGAACCTGA AGCTCGCGCT CACCGCCGGC ATCGGTTCCG ACCACGTCGA TCTTCAGTCG 180 GCTATCGACC GCAACGTCAC CGTGGCGGAA GTCACCTACT GCAACTCGAT CAGCGTCGCC 240 GAGCATGTGG TGATGATGAT CCTGTCGCTG GTGCGCAACT ATCTGCCCTC GCACGAATGG 300 GCGCGGAAGG GCGGCTGGAA CATCGCCGAC TGCGTCTCCC ACGCCTACGA CCTCGAGGCG 360 ATGCATGTCG GCACCGTGGC CGCCGG ３
８６ 配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GTG(or C)ACG(or C)TCG(or C)G AC(or T)AAGGAG(or C)GG 20 配列番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：合成DNA 配列 CCG(or C)GCG(or C)G(or C)CG(or C)A CG(or C)GTG(or C)CCG(or C)AC 20 配列番号：５ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：合成DNA 配列 GGATCCGGAG AGGAGATGCC CGCATG 26 配列番号：６ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：合成DNA 配列 GCATGCAGCG GAGAAGGCTC AGACCG 26 配列番号：７ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：合成DNA 配列 GCATGCGGAG GAAATGTAAT GGAATTGTTC AAATATATG 39 配列番号：８ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：合成DNA 配列 GAATTCGTTT TATATTGCCG AAGCACC 27 配列番号：９ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：合成DNA 配列 GCATGCGGAG GAAATGTAAT GAAGATC 27 配列番号：１０ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：合成DNA 配列 GAATTCATGA TTTCATCCGT GCAAC 25 配列番号：１１ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＡＴＧＣＧＧＡＧ ＧＡＡＧＣＧＡＡＧＡ ＴＧＣＧＣＧ
２６ 配列番号：１２ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：合成DNA 配列 ＧＡＡＴＴＣＴＴＴＣ ＡＴＣＡＡＴＧＡＴＴ ＴＴＴＡＣＣ
２６
８６ 配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GTG(or C)ACG(or C)TCG(or C)G AC(or T)AAGGAG(or C)GG 20 配列番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：合成DNA 配列 CCG(or C)GCG(or C)G(or C)CG(or C)A CG(or C)GTG(or C)CCG(or C)AC 20 配列番号：５ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：合成DNA 配列 GGATCCGGAG AGGAGATGCC CGCATG 26 配列番号：６ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：合成DNA 配列 GCATGCAGCG GAGAAGGCTC AGACCG 26 配列番号：７ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：合成DNA 配列 GCATGCGGAG GAAATGTAAT GGAATTGTTC AAATATATG 39 配列番号：８ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：合成DNA 配列 GAATTCGTTT TATATTGCCG AAGCACC 27 配列番号：９ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：合成DNA 配列 GCATGCGGAG GAAATGTAAT GAAGATC 27 配列番号：１０ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：合成DNA 配列 GAATTCATGA TTTCATCCGT GCAAC 25 配列番号：１１ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＡＴＧＣＧＧＡＧ ＧＡＡＧＣＧＡＡＧＡ ＴＧＣＧＣＧ
２６ 配列番号：１２ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：合成DNA 配列 ＧＡＡＴＴＣＴＴＴＣ ＡＴＣＡＡＴＧＡＴＴ ＴＴＴＡＣＣ
２６
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｂ Ａ 13/08 13/08 Ｄ 13/12 13/12 Ａ 13/22 13/22 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (4)
- 【請求項１】 ＮＡＤ+ 依存性ギ酸デヒドロゲナーゼを
コードする遺伝子と、ＮＡＤＨ依存性アミノ酸デヒドロ
ゲナーゼをコードする遺伝子とを含有してなる組換えプ
ラスミド。 - 【請求項２】 請求項１記載の組換えプラスミドで形質
転換された大腸菌。 - 【請求項３】 請求項２記載の大腸菌を培養して得た培
養物。 - 【請求項４】 請求項３記載の培養物の存在下に、α−
ケト酸とギ酸アンモニウムとを反応させることを特徴と
するアミノ酸又はその誘導体の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8217060A JPH1023896A (ja) | 1996-05-07 | 1996-08-19 | 組換えプラスミド、それにより形質転換された大腸菌、その培養物及びそれを用いたアミノ酸又はその誘導体の製造方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8-112303 | 1996-05-07 | ||
| JP11230396 | 1996-05-07 | ||
| JP8217060A JPH1023896A (ja) | 1996-05-07 | 1996-08-19 | 組換えプラスミド、それにより形質転換された大腸菌、その培養物及びそれを用いたアミノ酸又はその誘導体の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1023896A true JPH1023896A (ja) | 1998-01-27 |
Family
ID=26451504
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8217060A Pending JPH1023896A (ja) | 1996-05-07 | 1996-08-19 | 組換えプラスミド、それにより形質転換された大腸菌、その培養物及びそれを用いたアミノ酸又はその誘導体の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
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-
1996
- 1996-08-19 JP JP8217060A patent/JPH1023896A/ja active Pending
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