WO2006132145A1 - Ｌ－アミノ酸の製造方法 - Google Patents

Ｌ－アミノ酸の製造方法 Download PDF

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WO2006132145A1
WO2006132145A1 PCT/JP2006/311081 JP2006311081W WO2006132145A1 WO 2006132145 A1 WO2006132145 A1 WO 2006132145A1 JP 2006311081 W JP2006311081 W JP 2006311081W WO 2006132145 A1 WO2006132145 A1 WO 2006132145A1
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amino acid
enzyme
dehydrogenase
acid
derived
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PCT/JP2006/311081
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Motoko Hayashi
Hiroaki Yamamoto
Norihiro Kimoto
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Daicel Chemical Industries, Ltd.
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    • C12P41/001—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by metabolizing one of the enantiomers
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    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/002—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by oxidation/reduction reactions

Definitions

  • the present invention relates to an L amino acid using a mixture of enantiomers of amino acids as a raw material, an enzyme that converts D-amino acid to keto acid, and a transformant that expresses an enzyme that converts keto acid to L amino acid. It relates to a method of manufacturing.
  • keto acid used as a raw material is generally expensive, and is used as an industrial raw material. There is a problem that it is inappropriate.
  • L-amino acids depending on the amino acid structure, it may be cheaper to use racemic amino acids rather than keto acids as raw materials.
  • the theoretical yield of L-amino acid does not exceed 50% in the process of simply optically resolving racemates as raw materials. A force that requires separate racemization to improve the yield. By optical resolution alone, unnecessary D-form becomes waste, and it is difficult to bring the theoretical yield close to 100%.
  • yeast cells or D-amino acid oxidase and catalase are used to convert D-form into keto acid, and then L-amino acid dehydrogenase and glucose dehydrogenase are used to convert keto acid to L Enzymatic synthesis method to convert to body (Biomolecular Engineering, 17,
  • D amino acid is converted into an acid by the action of D amino acid acid enzyme to produce imine as an intermediate, and then a catalytic hydrogen using a hydride reducing agent or using a metal catalyst Synthetic method (Chem. Com m "246 (2002) that combines the enzymatic method and the chemical method characterized in that the L form is obtained by repeating the process of regenerating racemic amino acid by reducing imine by isomerization (racemization) )) o
  • International Publication WO2005-090590 pamphlet includes D-amino acid oxidase, L-amino acid dehydrogenase, co-substrate NADH-regenerating enzyme and, optionally, a recombinant microorganism having an increased concentration or activity of catalase, and I made use of it-Made amino acids
  • a method of making is disclosed. Examples include one or two enzymes of the D-amino acid oxidase enzyme derived from Alsulopactor 'protoformier or Trigonopsis' barrier bilis, the leucine dehydrogenase derived from Bacillus cereus, and the co-substrate NADH regenerating enzyme.
  • Non-Patent Document 1 Method Enzymol., 3, 554, (1957)
  • Non-Patent Document 2 Agric. Biol. Chem., 51, 729 (1087)
  • Non-Patent Document 3 Biotechnol. Bioeng., 14, 1288 (1994)
  • Non-Patent Document 4 Biomolecular Engineering, 17, 167 (2001)
  • Non-Patent Document 5 Chem. Comm., 246 (2002)
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 10-23896
  • Patent Document 2 International Publication WO2005—090590 Pamphlet
  • the object of the present invention is to allow the reaction of converting D amino acid to keto acid and the reaction of converting keto acid to L amino acid in one pot (within the same system), and the L-amino acid can be obtained at a high accumulated concentration. It is an object of the present invention to provide a transformant that can be converted into a non-acid, and a method for producing an L amino acid that can efficiently produce an L amino acid from an inexpensive raw material using the transformant.
  • another object of the present invention is to provide a transformant capable of converting to L amino acid with higher efficiency by utilizing an enzyme activity that supplements the main reaction, and an L ⁇ using the transformant.
  • the object is to provide a method for producing an amino acid.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for producing L-amino acid having excellent productivity capable of obtaining L-amino acid in high yield even when a high substrate concentration is used, and a transformant used in the method. It is to provide. Means for solving the problem [0010] As a result of intensive studies to achieve the above-mentioned object, the present inventors use a transformant that expresses both an enzyme that converts D form into keto acid and an enzyme that converts keto acid into L amino acid. As a result, it was found that two kinds of reactions can be carried out in one pot (in the same system), and L amino acid can be accumulated at a high concentration using an inexpensive raw material, and the present invention has been completed.
  • a method for producing an L amino acid that enzymatically generates L amino acid from an enantiomeric mixture of amino acids, the base sequence encoding an enzyme that converts D amino acid into keto acid, and keto acid as L amino acid A transformant formed by introducing one or a plurality of recombinant vectors incorporated into an expression vector having the same or different base sequence encoding the enzyme to be converted into the same host or a processed product thereof into amino acid enantiomers.
  • a method for producing an L-amino acid comprising a step of contacting with a body mixture is provided (hereinafter sometimes referred to as “Method 1 for producing L-amino acid of the present invention” or “Method 1”).
  • the transformant comprises a base sequence encoding an enzyme that converts D amino acid to keto acid, a base sequence encoding an enzyme that converts keto acid to L amino acid, It may be a transformant formed by introducing one or a plurality of recombinant vectors in which the base sequence encoding the coenzyme regenerating enzyme is incorporated into the same or different expression vector into the same host.
  • the transformant also includes a base sequence encoding an enzyme that converts D-amino acid to keto acid, a base sequence encoding an enzyme that converts keto acid to L amino acid, and a base sequence encoding a hydrogen peroxide-degrading enzyme. It may be a transformant formed by introducing one or a plurality of recombinant vectors in which sequences are incorporated into the same or different expression vectors into the same host.
  • the enzyme that converts D-amino acid to keto acid may be D-amino acid oxidase and Z or D amino acid dehydrogenase! /.
  • D amino acid oxidase include Candida boidinii, Trigon opsis variabilis, and Schizosaccharomyces pombe.
  • the D-amino acid dehydrogenase may be a D-amino acid dehydrase derived from Escherichia coli, and the enzyme that converts keto acid to L-amino acid is L-amino acid. It may be a dehydrogenase and a Z or L amino acid aminotransferase!
  • Said L amino acid Dehydrogenases include Thermoactinomyces in Termedius ferro-alanine dehydrogenase, Geobacillus stearothermophilus alanine dehydrogenase, Bacillus thermostat-Yuratas (Bacillus). alanine dehydrogenase from thermocatenulatus, alanine dehydrogenase from Bacillus sphearicus, alanine dehydrogenase from Shewanella sp. (Shewane 11a species), derived from Geobac illus stearothermophilus Leucine dehydrogenase and leucine dehydrogenase from Bacillus sphaericus are included.
  • the coenzyme regenerating enzyme in the present invention may be formate dehydrogenase.
  • the formate dehydrogenase includes formic dehydrase derived from Mycobacterium vaccae.
  • the peroxyhydrogenase may be catalase.
  • the catalase may be a catalase derived from Escherichia coli.
  • an enzyme that converts D amino acid to keto acid is a D amino acid oxidase
  • an enzyme that converts keto acid to L amino acid is an L amino acid dehydrogenase.
  • a method in which the coenzyme regenerating enzyme is formate dehydrogenase and the hydrogen peroxide degrading enzyme is catalase. More preferably, the D amino acid oxidase is derived from Canada Voidi, and the L amino acid dehydrogenase is used.
  • the enzyme is Thermoactinomyces intermedius-derived ferro-alanine dehydrogenase
  • the formate dehydrogenase is derived from Mykonoctrum pacae
  • the catalase is derived from Escherichia coli.
  • L amino acid in the present invention L-norparin and the like are preferably used.
  • the present invention also provides a base sequence encoding an enzyme that converts D-amino acid to keto acid, a base sequence encoding an enzyme that converts keto acid to L amino acid, and a base encoding a coenzyme regenerating enzyme.
  • a transformant formed by introducing, into the same host, one or more recombinant vectors in which a sequence and a base sequence encoding a hydrogen peroxide-degrading enzyme are incorporated in the same or different expression vector. .
  • the enzyme that converts D-amino acid to keto acid is a D amino acid acid enzyme
  • the enzyme that converts keto acid to L amino acid is L
  • examples include amino acid dehydrogenase, coenzyme regenerating enzyme is formate dehydrogenase, and hydrogen peroxide-degrading enzyme is catalase. More preferably, D-amino acid oxidase is Candida boise.
  • -L-amino acid dehydrogenase is a thermoactinomyces intermedius-derived ferulalanin dehydrogenase, formate dehydrogenase is derived from Mycobacterium paccae, and catalase is derived from Escherichia coli A conversion body is mentioned.
  • the present invention provides a base sequence encoding an enzyme that converts D amino acid to keto acid, a base sequence encoding an enzyme that converts keto acid to L amino acid, and a base encoding a coenzyme regenerating enzyme.
  • a recombinant vector in which a sequence and a base sequence encoding a hydrogen peroxide degrading enzyme are incorporated into the same expression vector.
  • the enzyme that converts D-amino acid to keto acid is D-amino acid acid enzyme
  • the enzyme that converts keto acid to L-amino acid is L.
  • Body-derived, L-amino acid dehydrogenase is Thermoactinomyces ⁇ Intermedius-derived ferro-alanine dehydrogenase, formate dehydrogenase is derived from Mycobacterium puckae, and catalase is Escherichia Examples include recombinant vectors derived from E. coli.
  • the present invention is also a method for producing an L amino acid that enzymatically produces L amino acid from an enantiomeric mixture of amino acids, the enzyme for oxidizing at least D amino acid to keto acid, and peracid Using a transformant that co-expresses hydrogenolytic enzyme or its treated product, mainly an oxidation step that oxidizes D-amino acid, an enzyme that produces L amino acid from keto acid, and a coenzyme regenerating enzyme as needed.
  • Method 2 of L-amino acid production of the present invention a method for producing an L-amino acid characterized by having two or more different reaction steps in the reduction step mainly for synthesizing keto acid strength L-amino acid using an expressed transformant or a processed product thereof (Hereinafter, it may be referred to as “Method 2 of L-amino acid production of the present invention” or “Method 2”).
  • the transformant of the present invention may be used.
  • the method 2 of the present invention is a method in which the acidification step and the reduction step are performed under different reaction conditions. Also good.
  • the oxidation step is performed under the aeration condition of the oxygen-containing gas, and the reduction step is not aerated with the oxygen-containing gas! This can be done under aerated conditions.
  • the amount of oxygen-containing gas in the oxidation step is 1% by volume or more per minute with respect to the reaction solution
  • the amount of oxygen-containing gas in the reduction step is The method is less than 10% by volume per minute with respect to the reaction solution, preferably, the oxygen-containing gas flow rate in the oxidation step is 2% by volume or more per minute with respect to the reaction solution, and the oxygen-containing gas in the reduction step In which the aeration rate of the oxygen-containing gas in the oxidation step is 5% by volume or more per minute with respect to the reaction solution.
  • An oxygen-containing gas aeration capacity in the reduction process is a method in which the reaction liquid is less than 5 volume% per minute.
  • the oxygen-containing gas flow rate in the oxygenation step is 1% by volume or more per minute with respect to the reaction solution, and the oxygen-containing gas is substantially vented in the reduction step. No matter how.
  • the pH of the reaction solution in the acidification step is adjusted to 7.0 to 9.5, and the pH of the reaction solution in the reduction step is 6.0 to 8.5.
  • the pH of the reaction solution in the acidification step may be adjusted to 7.5 to 9.0, and the reaction solution in the reduction step may be adjusted to a value lower than the pH in the acidification step.
  • a method of adjusting the pH to 6.5 to 8.0 may be used.
  • the transformant of the present invention or a processed product thereof may be additionally added to the reaction solution before or after the transition to the reduction step. Good.
  • the pH of the reaction for converting D-amino acid into keto acid can be adjusted using formic acid or a salt thereof.
  • reaction solution containing 0.2 equivalent or more of formate ion and Z or ammonium ion relative to the raw material amino acid enantiomer mixture may be used.
  • the "enzyme” in the specification of the present application is genetically engineered by means such as deletion, substitution, Z or addition of a part of the amino acids constituting the enzyme as long as it has the target enzyme activity. It may be a mutated mutant. Further, the “method of the present invention” is used to collectively refer to the above-described method 1 and method 2 of the present invention. The invention's effect
  • a reaction for converting D amino acid using the enzyme activity to keto acid and a reaction for converting keto acid to L amino acid are performed. Since it can be carried out in one pot (in the same system), L-amino acids can be accumulated efficiently and at a high concentration. For this reason, L-amino acids can be produced with a theoretical yield of 100% with a small number of steps by using an inexpensive enantiomeric mixture of amino acids as a raw material.
  • FIG. 1 is a restriction enzyme map of plasmid pSE420U used in Production Example 1.
  • FIG. 2 is a restriction enzyme map of plasmid pSUCBDO 1 used in Production Example 1.
  • FIG. 3 is a restriction map of plasmid pUCTVDOT used in Production Example 2.
  • FIG. 4 is a restriction enzyme map of plasmid pSUTVDOl used in Production Example 2.
  • FIG. 5 is a restriction enzyme map of plasmid pUCECDDl used in Production Example 3.
  • FIG. 6 is a restriction map of plasmid pETECDDl used in Production Example 3.
  • FIG. 7 is a restriction map of plasmid pSU-MF26 used in Production Example 4.
  • FIG. 8 is a restriction map of plasmid pSF-GSA2 used in Production Example 5.
  • FIG. 9 is a restriction map of plasmid pSF-BTAl used in Production Example 6.
  • FIG. 10 is a restriction map of plasmid pSFBPADl used in Production Example 7.
  • FIG. 11 is a restriction map of plasmid pSF-SADl used in Production Example 8.
  • FIG. 12 is a restriction map of plasmid pEGSLED2 used in Production Example 9.
  • FIG. 13 is a restriction map of plasmid pFGSLEDl used in Production Example 9.
  • FIG. 14 is a restriction map of plasmid pSFBPLDl used in Production Example 10.
  • FIG. 15 is a restriction map of plasmid pSU-TIP2 used in Production Example 11.
  • FIG. 16 is a restriction map of plasmid pSF-TIP2 used in Production Example 11.
  • FIG. 17 is a restriction map of plasmid pSE-ECB1 used in Production Example 12.
  • FIG. 18 is a restriction map of plasmid pSE-BSBl used in Production Example 13.
  • FIG. 19 is a restriction enzyme map of the plasmid pSFTPCOl constructed in Example 1.
  • FIG. 20 is a restriction map of plasmid pSFGACOl constructed in Example 2.
  • the L-amino acid production method 1 of the present invention is a method for enzymatically producing L-amino acid from an enantiomeric mixture of amino acids, comprising a base sequence encoding an enzyme that converts D amino acid into keto acid, and A transformant formed by introducing one or a plurality of recombinant vectors incorporated in an expression vector having the same or different base sequence encoding an enzyme that converts keto acid into an L amino acid into the same host, or a processed product thereof Comprising contacting with a mixture of amino acid enantiomers.
  • the L-amino acid production method 1 of the present invention comprises a culturing step of inducing expression of the transformant having the above-described structure to obtain a culture having the target converting enzyme, and an enzyme using the culture. And a reaction step of converting D amino acids contained in the amino acid enantiomeric mixture into L amino acids by a chemical reaction!
  • a base sequence encoding an enzyme that converts D amino acid to keto acid and a base sequence encoding an enzyme that converts keto acid to L amino acid are incorporated into the same or different expression vector.
  • it is a step of obtaining a culture having the target converting enzyme by introducing a plurality of recombinant vectors into the same host and inducing expression of the formed transformant.
  • the enzyme that converts D amino acid to keto acid used in the present invention is not particularly limited as long as it is an enzyme that acts on D amino acid to produce the corresponding keto acid, and includes, for example, D amino acid acid enzyme, And D amino acid dehydrogenase.
  • D amino acid oxidase examples include D amino acid oxidase, amino acid sequence ability in which a part of the amino acid constituting the enzyme is deleted, substituted, and Z or added, and the D-amino acid described above A polypeptide capable of expressing an acid enzyme can be used.
  • the D-amino acid oxidase is EC 1.4.3.1, EC 1.4.3.3, EC 1.4.3.7, EC 1.4.3.15,
  • D-amino acid oxidase may be derived from any organism, for example, Candida, Trigonopsis, Schizosaccharomyces, Arthrobacter Enzymes derived from microorganisms such as genus, Corynebacterium, Pseudomonas, Rhodotorula; Enzymes derived from the liver of mammals such as humans, mice, pigs, and rabbits (Biochemistry, 26, 3612 (1987)) can be used.
  • Specific examples of the enzyme derived from the microorganism include, for example, Arthrobacter (Arthrobacter Origin (European Patent Publication No. 1375649), Candida boidinii (Yeast, 16, 1217 (2000)), Corynebacterium glutamicum (J. Biotechnol. 104) , 5 (2003), derived from Pseudomonas putida (Environ. Microbiol. 4, 799 (2002)), derived from Rhodotorula gracilis (J. BacterioL, 58, 115 (1997), Trigonopsis) Derived from Trigonopsis variabilis (Japanese Patent Publication No. 7-108225), Fusarium solani (J. Biochem., 108, 1063 (1990)), Derived from Schizosaccharomyces pombe Enzymes are included.
  • Arthrobacter Arthrobacter Origin (European Patent Publication No. 1375649)
  • Candida boidinii Yeast, 16, 1217 (2000)
  • D-amino acid oxidase derived from the genus Candida such as Candida boidinii DSM 70026 strain
  • Trigonopsis variabilis Trigonopsis such as CBS 4095 strain
  • a genus-derived D-amino acid oxidase or the like is preferably used.
  • Examples of the D-amino acid dehydrogenase include D-amino acid dehydrogenase, amino acid sequence having a part of the amino acid constituting the enzyme deleted, substituted, and Z or added.
  • a polypeptide capable of expressing the D-amino acid dehydrogenase can be used.
  • the D-amino acid dehydrogenase is classified into EC 1.4.99.1, etc., and 2,6-dichloroindophenol (DCIP) or the like is used as an electron acceptor, and D-amino acid is deaminated in an acidic manner. It has an enzymatic activity to produce the corresponding keto acid.
  • DCIP 2,6-dichloroindophenol
  • the D amino acid dehydrogenase may be derived from any organism, for example, Escherichia
  • Enzymes derived from microorganisms such as the genus (Escherichia), the genus Pseudomonas, the genus Salmonella, and the genus Flavobacterium
  • D amino acid dehydrogenases derived from the genus Escherichia such as Escherichia coli K-12 strain are preferably used.
  • the enzyme activity for converting D-amino acids into keto acids in the present invention can be measured using the following method.
  • the enzyme activity of D amino acid oxidase was determined using a reaction solution containing lOOmM potassium phosphate buffer (pH 8.0), 10 mM D amino acid, 0.5 mM 4-aminoantipyrine, 2 mM phenol, and 5 U / mL peroxidase.
  • the amount of enzyme that catalyzes the formation of 0.5 / z mol of quinonimine per minute is measured as 1U.
  • D amino acids enzymatic activity of dehydrogenase, LOOmM Tris - HCl buffer (.
  • the enzyme for converting keto acid used in the present invention to L amino acid is not particularly limited as long as it is an enzyme that acts on keto acid to produce the corresponding L amino acid.
  • L amino acid dehydrogenase and a polypeptide having an L-amino acid aminotransferase.
  • the L amino acid dehydrogenase is, for example, oc- in the presence of NAD (P) H and ammonia. It has an enzymatic activity to reductively aminate keto acid to produce the corresponding L amino acid! /.
  • L amino acid dehydrogenase examples include alanine dehydrogenase (EC 1.4.1.1), glutamate dehydrogenase (EC 1.4.1.2, EC 1.4.1.3, EC 1.4.1.4), L amino acid dehydrogenase.
  • the L amino acid dehydrogenase may be derived from any organism, for example, an enzyme derived from a microorganism; an enzyme derived from a mammal such as human 'mouse' pig'usushi and the like.
  • Examples of the alanine dehydrogenase include, for example, derived from Geobacillus stearothermophilus (Biochemistry, 29, 1009 (1990), Notinoles' Samochacate-Yuratus ( Derived from Bacillus thermocatenulatus (Biochimie, 71, 55 9 (1989), derived from Shewanella sp (Appl. Environ. Microbiol, 6 5, 4014 (1999)), derived from Bacillus sphaericus IFO 3525) ( Biochemi stry, 29, 1009 (1990); Accession No. M33298) and the like.
  • Examples of the glutamate dehydrogenase include, for example, derived from rabbit liver (J. Biochem. Mol. Biol, 36, 545 (2003), Derived from Bacillus subtilis (J. BacterioL, 180, 6298 (1998), derived from Sulfolobus solfataricus (Biochemistry, 203, 81 (1992), derived from Saccharomyces cerevisiae) Examples include biological glutamate dehydrogenases such as Biochemistry, 217, 469 (1993).
  • L amino acid dehydrogenase examples include biologically derived L amino acid dehydrogenases such as obligat e anaerobes.
  • Examples of the serine dehydrogenase include microorganism-derived enzymes such as those derived from Agrobacterium tumefaciens (Accession No. AB032242).
  • Examples of the palin dehydrogenase include Cytoferga sp. Examples include biologically derived palin dehydrogenase derived from Cytophaga sp (Accession No. AF339150).
  • Examples of the leucine dehydrogenase include, for example, derived from Geobacillus stearothermophilus (Biochemistry, 27, 9056 (1988), Bacillus sphaericus leucine. Examples include biological enzymes such as dehydrogenase.
  • Examples of the glycine dehydrogenase include biological glycine dehydrogenases derived from Escheri chia coli (Eur. J. Biochem. 216, 539 (1993), etc.) Is mentioned.
  • Examples of the lysine dehydrogenase are derived from organisms such as, for example, derived from veobacillus stearothermophilus (Appl. Environ. Microbiol. 70, 937 (2004)). Examples include enzymes.
  • the ferulalanin dehydrogenase (EC 1.4.1.20) is, for example, derived from Thermoactinomyces intermedius (J. Biochem., 10 9, 371 (1991)), Brevi Bacterial spices (Brevibacterium sp) (JP-A-63-1157986), Sporosarcina urea (JP-A-61-239887), Bacillus sphaericus (specialty) No.
  • JP-A 63-15 7986 derived from Bacillus' Padius (Bacillus & (1013) (JP-A 63-157986), Rhodococcus sp) (JP-A 61-146183) , Nocardia sp (Nocardia sp) (Arch. Microbiol, 153, 12 (1989)), Halomona & Pacifica (Halomona & 1 ⁇ &) origin (JP 2002-65270), etc. Examples include dehydrogenase
  • microorganism-derived L amino acid dehydrogenases such as the genus Geobacillus, the genus Bacillus, the genus Shewane 11a, and the genus Thermoactinomyces are preferred.
  • preferable L-amino acid dehydrogenases include Thermoactinomyces intermedius-derived Hua-norealanine dehydrogenase, Diobacillus stearother mophilus alanine dehydrogenase, Bacillus dehydrogenase.
  • Mocate-Yuratas (Bacillus therm ocatenulatus), alanine dehydrogenase from Bacillus' Bacillus sphearicus, alanine dehydrogenase from Shewanella species, alanine dehydrogenase from Shewanella species, leucine dehydration from Geobacillus stearothermophilus And a leucine dehydrogenase derived from Bacillus sphaericus.
  • L-amino acid aminotransferase has an enzymatic activity to transfer an amino group from an amino group donor such as L-glutamic acid or L-aspartic acid to (X-keto acid to produce the corresponding L amino acid.
  • L-amino acid aminotransferases include, for example, Ranan aminotransferase (EC 2.6.1.2), cysteine aminotransferase (EC 2.6.1.3), glycine aminotransferase (EC).
  • the L amino acid aminotransferase may be derived from any organism, for example, an enzyme derived from a microorganism; an enzyme derived from a mammal such as a human 'rat' mouse or the like.
  • L amino acid aminotransferase include, for example, Oryza 'sativa-derived alanine aminotransferase (Plant Mol. Biol. 39, 149 (1999)); mammals such as rats. Derived cysteine aminotransferase (Physiol. Chem. Phys., 10, 483 (1978)); glycine aminotransferase derived from mammals such as human and rat (J. Biol. Chem., 242, 3614 (1967)); Tyrosine aminotransferase derived from mammals such as rats (Anal. Biochem., 95, 188 (1979)); Leucine aminotransferase derived from mammals such as rats (Biochim. Biophys.
  • branched chain amino acid aminotransferase examples include, for example, those derived from Escherichia coli (J. Biochem., 97, 993 (1985), derived from Bacillus subtilis 0. BacterioL, 179, 496 (1997)) and other branched-chain amino acid aminotransferases Can be mentioned.
  • the aromatic amino acid aminotransferases for example, Eshierihia 'coli (Esc herichia coli) origin (Biochem. Biophys. Res.
  • branched chain amino acid aminotransferases are particularly preferred, in particular, branched chain amino acid aminotransferase derived from the genus Escherichia such as Escherichia coli K-12 strain; ⁇ A microorganism-derived amino acid aminotransferase such as a branched chain amino acid aminotransferase derived from Bacillus such as Bacillus subtilis is preferably used.
  • the enzyme activity for converting a keto acid into an L amino acid in the present invention can be measured by the following method. That is, L amino acid dehydrogenase activity was determined by reacting a reaction solution containing 200 mM potassium glycine monochloride monopotassium monohydroxide buffer ( ⁇ .5), 10 mM L amino acid, 2.5 mM NAD + at 30 ° C. In 1 minute: The amount of enzyme that produces mol NADH can be measured as 1U.
  • L-amino acid aminotransferase activity is 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 50 mM ammonium chloride, 10 mM ⁇ -ketoisocaproate, 40 mM L amino acid (amino group donor), 0.05 mM pyrido.
  • a reaction solution containing xanthanol 5, monophosphate, 0.2 mM NADPH, 5 U / mL Proteus species glutamate dehydrogenase (Toyobo Co., Ltd.) at 30 ° C.
  • the amount of enzyme that reduces 1 ⁇ mol of NADPH per minute can be measured as 1 U.
  • the enzyme activity is not inhibited!
  • the base sequence encoding the other enzyme is the same as the expression vector incorporating the base sequence encoding the target converting enzyme. Alternatively, they may be incorporated into different expression vectors.
  • the other enzyme include an enzyme that decomposes a substance that inhibits the progress of the main reaction (for example, a hydrogen peroxide-degrading enzyme), an enzyme that regenerates a substrate consumed in the main reaction (for example, a coenzyme-regenerating enzyme, etc.) Etc. can be used.
  • the peracid-hydrolyzing enzyme is by-produced in a reaction using D-amino acid acid-enzyme, and efficiently reacts by the action of decomposing and removing hydrogen peroxide that inhibits the progress of the main reaction. Can be advanced.
  • the hydrogen peroxide-degrading enzyme comprises, for example, catalase and an amino acid sequence in which a part of the amino acids constituting the catalase is deleted, substituted, and / or added, and can express peracid-hydrogenolysis activity Polypeptide (catalase-like enzyme) etc. can be used.
  • the catalase known ones derived from microorganisms and the like can be used, and examples thereof include catalase derived from Escherichia coli.
  • catalase derived from Escherichia coli include katE (J. Biol. Chem., 254, 11664-11668 (1979)) and katG (J. Biol. Chem., 254, 4245-4252). (1979)).
  • the decomposition activity (catalase activity) of peroxyhydrogen is, for example, a method of reacting a reaction solution composed of 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) and 0.035% hydrogen peroxide at 30 ° C.
  • the amount of enzyme that decomposes 1 ⁇ mol of hydrogen peroxide per minute can be measured as 1 U.
  • the coenzyme regenerating enzyme may cause the main reaction to proceed smoothly by the action of regenerating the coenzyme NAD (P) H that is consumed as the reaction proceeds using the L amino acid dehydrogenase. it can.
  • a transformant having the effect of regenerating the coenzyme NAD (P) H for example, one or more recombinant vectors incorporating a base sequence corresponding to the target converting enzyme are used as the coenzyme NAD.
  • (P) A transformant formed by introduction into a host that retains the activity of regenerating H, a base sequence that encodes an enzyme that converts Z or D amino acid to keto acid, and L amino acid dehydrogenase
  • a transformant formed by introducing one or a plurality of recombinant vectors into which the base sequence and the base sequence encoding the coenzyme regenerating enzyme are incorporated into the same or different expression vectors can be used.
  • a wide variety of microorganisms can be used as the host having the action of regenerating NAD (P) H.
  • a coenzyme can be obtained by a glycolytic system possessed by the microorganism, a C1-compound assimilation pathway of methylotroph, or the like. Played.
  • coenzyme regenerating enzyme examples include, for example, a coenzyme regenerating enzyme, an amino acid sequence having a part of the amino acid constituting the coenzyme regenerating enzyme deleted, substituted, and Z or added.
  • a polypeptide capable of expressing coenzyme regenerating enzyme activity can be used.
  • Examples of the coenzyme regenerating enzyme include formate dehydrogenase, glucose dehydrogenase, Examples include alcohol dehydrogenase, amino acid dehydrogenase, and organic acid dehydrogenase (malate dehydrogenase).
  • the coenzyme regenerating enzyme may be derived from any organism, but preferably a formate dehydrogenase derived from the genus Mycobacterium; a glucose dehydration derived from the genus Bacillus or the genus Thermoplasma. Elementary enzymes are used.
  • Specific coenzyme regenerating enzymes include, for example, NADH regenerating enzyme, formate dehydrogenase derived from Mycobacterium vaccae, etc .; NAD (P) H regenerating enzyme, Bacillus subtilis Glucose dehydrogenase derived from Thermoplasma acidphilum, Bacillus meg aterium, Bacillus cereus, etc. can be used.
  • the coenzyme regenerating enzyme activity can be measured by the following method.
  • formate dehydrogenase activity is 1 / z per minute by reacting a reaction solution containing lOOmM potassium phosphate buffer (pH 7.0), lOOmM sodium formate, and 2.5 mM NAD + at 30 ° C.
  • the amount of enzyme catalyzing the formation of mol NADH can be measured as 1U.
  • the base sequence encoding the enzyme may be a base sequence encoding a polypeptide that expresses the target enzyme activity.
  • a part or all of the base sequence is disclosed in DDBJ.
  • a known nucleotide sequence, an amino acid sequence identified from the purified enzyme, and a nucleotide sequence determined to correspond to the amino acid sequence are included.
  • These base sequences can be prepared by using a known method such as a method using an amplification means such as PCR or a method of chemically synthesizing.
  • a plasmid vector or a phage vector can be used as an expression vector.
  • the expression vector can be appropriately selected according to the type of host and the type and number of genes to be incorporated. These expression vectors may be used alone or in combination. Specific examples of the expression vector corresponding to the host include those described below.
  • an expression vector in which a base sequence encoding an enzyme that converts D amino acid to keto acid and a base sequence encoding an enzyme that converts keto acid to L amino acid are the same or different.
  • a base sequence encoding an enzyme that converts D amino acid to keto acid A recombinant vector in which a nucleotide sequence encoding an enzyme that converts tomic acid to an L amino acid is incorporated into the same expression vector is preferably used.
  • a base sequence corresponding to another enzyme may be further incorporated into an expression vector that is the same as or different from the expression vector into which the base sequence has been incorporated.
  • Representative examples of the thread-replaceable vector in the present invention include, for example, a base sequence corresponding to an enzyme that converts D amino acid to keto acid, and a base that corresponds to an enzyme that converts keto acid to L amino acid. 2 gene expression recombinant vector integrated in the same expression vector; D Base sequence corresponding to enzyme converting amino acid to keto acid and base sequence corresponding to enzyme converting keto acid to L amino acid And a multi-gene expression recombinant vector in which the nucleotide sequence corresponding to any other enzyme is incorporated in the same expression vector; D Gene expression in which a nucleotide sequence corresponding to an enzyme that converts amino acids into keto acids is incorporated A combination of a recombinant vector and a single gene expression recombinant vector in which the nucleotide sequence corresponding to the enzyme that converts keto acid to L-amino acid is different from the former; D A base sequence corresponding to an enzyme that converts an amino acid to keto acid, a base sequence corresponding to
  • a single recombinant vector that expresses a plurality of genes because a transformant can be obtained without problems such as incompatibility and is excellent in workability and handling.
  • a thread-replaceable vector for example, a base sequence encoding an enzyme that converts D amino acid to keto acid and a base sequence encoding an enzyme that converts keto acid to L amino acid are incorporated into the same expression vector.
  • Recombinant vector D—enzyme that converts amino acids into keto acids
  • a “recombinant vector using peroxyhydrogenase, preferably catalase, or a combination thereof is preferably used as“ any other enzyme ”.
  • Specific examples of such a recombinant vector and a combination thereof include, for example, a base sequence corresponding to an enzyme that converts D amino acid to keto acid, a base sequence corresponding to L amino acid dehydrogenase, and a hydrogen peroxide decomposing enzyme.
  • the coenzyme regenerating enzyme is referred to as “any other enzyme” to facilitate the main reaction.
  • a recombinant vector using or a combination thereof is preferably used. Specific examples of such recombinant vectors and combinations thereof include, for example, a base sequence corresponding to an enzyme that converts D amino acid to keto acid, a base sequence corresponding to L amino acid dehydrogenase, and a coenzyme regenerating enzyme.
  • a three-gene expression recombinant vector in which the nucleotide sequence corresponding to is incorporated into the same expression vector; a nucleotide sequence corresponding to an enzyme that converts D amino acid to keto acid; a nucleotide sequence corresponding to an L amino acid dehydrogenase; Of the base sequences corresponding to the coenzyme regenerating enzyme, at least two or more types of base sequences are combined into the same expression vector.
  • the base sequence introduced into the host by the recombinant vector is incorporated into the host chromosome, even if the recombinant vector force is directly transcribed and translated to express the enzyme activity. It may be expressed in different forms.
  • the recombinant vector is constructed by a method in which a base sequence corresponding to the target converting enzyme is incorporated into an expression vector so that it can be expressed.
  • a method for incorporating the base sequence corresponding to the target converting enzyme so that it can be expressed a method (expression control unit) such as a promoter, terminator, etc. that is involved in expression control is usually incorporated in the vicinity of the target base sequence. Used.
  • a method of linking an expression control unit such as a promoter and a terminator to each gene, or a ratatosoperon Such a method of expressing as an operon containing a plurality of cistrons can be appropriately selected and used according to the type of host organism.
  • the preferred configuration of such a recombinant vector is, for example, a configuration in which a promoter is arranged upstream of the 5 bases of the target nucleotide sequence, and more preferably, a terminator is arranged downstream in addition to the promoter.
  • examples include the configuration.
  • vectors, promoters, and terminators that can be used according to the type of host organism, see “Microbiology Basic Course 8 Genetic Engineering” on Kyoritsu Shuppan, especially for yeast. Adv. Biochem. Eng. 43, 75- 102 (1990), Yeast 8, 423-488 (1992), and the like.
  • a system that expresses a large amount of heterologous protein in the host using animals such as insects such as moths (Nature 315, 592-594 (1985)) and plants such as rapeseed, corn, and potato has been developed. And can be used suitably. Construction of a recombinant vector according to the type of host should be performed according to techniques commonly used in the fields of molecular biology, biotechnology, and genetic engineering. (Eg Sambrook et al., Molecular ⁇ ⁇ Cloning, Cold Spring Harbor Labo ratories G
  • Specific examples of the configuration of the recombinant vector include, for example, a C-Candida bodi-derived D-amino acid oxidase on a three-gene expression vector pSE420U modified from pSE420D (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-189170).
  • Plasmid pSFTPCO 1 inserted in the order of gene, mycobacterial pakae formate dehydrogenase, thermoactinomyces intermedius ferulalanin dehydrogenase gene D-from Candida boidii Examples include plasmids pSFGAC01, pSFTPC02, and pSFTPC03 into which an amino acid oxidase gene, mycobacterial 'pakkae-derived formate dehydrogenase, and Gyobacillus stearothermophilus-derived alanine dehydrogenase gene are inserted in various orders.
  • a gene encoding the D-amino acid oxidase gene derived from Candida boidi and the recombinant vector pSCCBDO 1 co-expressed with the catalase gene derived from Escherichia coli, and the formate dehydrogenase derived from Mycobacterium puckae.
  • Thermoactinomyces' intermedius-derived recombinant vector pSF-TIP2 co-expressing the gene encoding the fetal luranin dehydrogenase gene, C-davidoid's B-derived D-amino acid oxidase gene, Escherichia coli PSFCPCOl, which co-expresses four genes: the catalase gene derived from Thermoactinomyces intermedius, the ferulalanin dehydrogenase gene derived from Mycobacterium puckae, and the formate dehydrogenase gene.
  • the host into which the recombinant vector is introduced is not particularly limited as long as it can introduce one or a plurality of recombinant vectors containing a base sequence corresponding to the enzyme and can express the target enzyme. It can be appropriately selected from a wide range of organisms such as microorganisms, plants and animals.
  • a microorganism that can be used as a host a microorganism for which an expression vector system that can be used as a host has been developed can be used.
  • Escherichia genus Bacillus ( Bacillus genus, Pseudomonas genus, Serratia genus, Brevibacterium genus, Corynebacterium genus, Streptococcus genus, Lactobacillus genus, etc.
  • Bacteria Host vector systems such as Rhodococcus and Streptomyces have been developed.
  • Actinomycetes Saccharomyces, Kluyverom yces
  • Schizosaccharomyces Zygos accharomyces
  • Yarrowia birds Trichosporon, Rhodosporidium, Rhodosporidium, Pichiaand Candida, Candida Development of a host vector system such as the following: yeasts; genus Neurospora; genus Aspergillus, genus Cephalosporium, and the like.
  • an expression vector and an expression control unit used according to the type of host.
  • the host is of the genus Escherichia, such as Escherichia coli, pBR, pUC plasmid vector; lac (j8-galatatosidase), trp (tryptophan operon), tac, trc (lac, trp fusion), promoter derived from ⁇ phage PL, PR, etc .; terminator force 3 ⁇ 4rpA-derived, phage-derived, rrnB riboso-manole RNA-derived terminator.
  • the vector PSE420D Japanese Patent Laid-Open No.
  • plasmid vectors such as pUBllO-based plasmids and pC194-based plasmids can be used and can be integrated into the chromosome.
  • apr alkaline protease
  • npr neutral protease
  • amy Q; -amylase
  • Pseudomonas putida Pseudomonas cepacia
  • a broad host range vector (including genes necessary for autonomous replication derived from RSF1010, etc.) based on the plasmid TOL plasmid involved in the degradation of toluene compounds, such as PKT240, can be used as a promoter, terminator
  • a lipase gene JP-A-5-284973 can be used.
  • plasmid vectors such as pAJ43 (Gene 39, 281 (198 5)) can be used.
  • pAJ43 Gene 39, 281 (198 5)
  • Yes as a promoter and terminator Can use the promoter and terminator used in Escherichia coli as they are.
  • the host is a genus Corynebacterium, for example, Corynebacterium glutamicum, pCSll (JP 57-183799 A), pCBlOKMol. Gen. Genet Plasmid vectors such as 196, 175 (1984) are available.
  • pGKl Appl. Environ. Microbiol. 50, 94 (1985)
  • pGKl can be used as plasmid vectors.
  • Rhodococcus When the host belongs to the genus Rhodococcus, a plasmid vector isolated from Rhodococcus rhodochrous can be used (J. Gen. Micr obiol. 138, 1003 (1992)).
  • a plasmid can be constructed according to the method described in Hopwood et al. Genetic Manipulation or Streptomyces: A Laooratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories (1985). .
  • pIJ486 Mol. Gen. Genet. 203, 4 68-478 (1986)
  • pKC1064 Gene 103, 97-99 (1991)
  • pUWL-KS Gene 165,149 -150 (1995)
  • a similar plasmid can be used in Streptomyces virginiae (Actinomycetol. 11, 46-53 (199).
  • Saccharomyces for example, Saccharomyces cerevisiae, YRp, YEp, YCp, and Yip plasmids are available, and there are multiple copies in the chromosome. Integration vectors that utilize homologous recombination with ribosomal DNA (such as EP 537456) are extremely useful because they can introduce genes in multiple copies and retain genes stably.
  • ADH alcohol removal Hydrogenase
  • GAPDH Denriceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
  • PHO acid phosphatase
  • GAL j8 galactosidase
  • PGK phosphoglycerate kinase
  • ENO enolase
  • the host is a genus Kluyveromyces, such as Kluyveromyces lactis, a 2 ⁇ m plasmid derived from Saccharomyces cerevisiae, a pKDl plasmid (J. Bacteriol. 145, 382). -390 (1981), pGKll-derived plasmids involved in killer activity, autonomously propagated genes in the genus Kluyveromyces KARS plasmids, vector plasmids that can be integrated into chromosomes by homologous recombination with ribosomal DNA (EP) 537456 etc.)
  • promoters and terminators derived from ADH, PGK, etc. can be used.
  • ARS genes involved in autonomous replication
  • ADH promoter derived from Schizosaccharomyces bomb can be used (EMBO J. 6, 729 (1987)).
  • pAUR224 is commercially available from Takara Shuzo and can be used easily.
  • plasmid vector derived from pSB3 Nucleic Acids Res. 13, 4267 (1985)
  • pSB3 Nucleic Acids Res. 13, 4267 (1985)
  • PH05 promoter from Saccharomyces cerevisiae
  • GAP-Zr glycosyl-Zr
  • a host vector system has been developed in Pichia 'Angusta (former name: Hansenula polymorpha).
  • genes involved in autonomous replication derived from Pichia Angusta (HARS1, HARS2) can be used, but because they are relatively unstable, multicopy integration into the chromosome is effective (Yeast 7, 431-443 (1991)).
  • AOX alcohol oxidase
  • FDH formate dehydrogenase promoters induced by methanol are available.
  • host vector systems using genes (PARS1, PARS2) involved in Pichia's autonomous replication have been developed for Pichia pastoris (Mol. Cell. Bio 1.5, 3376 (1985)). )), Strong promoters such as high concentration culture and methanol-inducible AOX are available (Nucleic Acids Res. 15, 3859 (1987)).
  • Candida maltosa ARS was derived from Candida maltosa (Agri. Biol. Chem. 51, 1587 (1987), and a vector using this was developed.
  • a strong promoter for the chromosome integration type vector JP-A-8-173170.
  • organisms such as plants and animals can also be used as the host.
  • Vectors, promoters and the like that can be used corresponding to the host have been developed.
  • insects such as moths (Nature 315, 592-594 (1985) and plants such as rapeseed, corn, and potato have been developed, and systems for expressing large amounts of heterologous proteins in the host have been developed. It can be suitably used.
  • a transformant introduced into the host is formed.
  • the transformant of the present invention is formed by introducing the recombinant vector exemplified above into the same host.
  • a base sequence encoding an enzyme that converts D amino acid to keto acid is identical to a base sequence that encodes an enzyme that converts keto acid to L amino acid.
  • D Base sequence encoding an enzyme that converts amino acid to keto acid, base sequence encoding an enzyme that converts keto acid to L amino acid, base sequence encoding coenzyme regenerating enzyme and Z or peroxidation Incorporate into one or more recombinant vectors in which the base sequence encoding hydrolase is integrated into the same expression vector, and into two or more different expression vectors in the previous 3 or 4 base sequences
  • One transformant such as a plurality of the recombinant vector formed by introducing into the same host was like.
  • a transformant into which a single recombinant vector has been introduced is preferably used in that problems such as incompatibility between vectors are unlikely to occur.
  • the enzyme that converts D-amino acid to keto acid in the above configuration is a D amino acid oxidase
  • the enzyme that converts keto acid to L amino acid is L-amino acid dehydrogenase
  • a transformant in which the coenzyme regenerating enzyme is formate dehydrogenase and the hydrogen peroxide degrading enzyme is catalase more preferably, the D-amino acid enzyme is derived from Candida boise
  • L amino acid dehydrogenase Examples include a transformant in which the enzyme is Thermoactinomyces intermedius-derived fluoralanine dehydrogenase, the formate dehydrogenase is derived from Mykonocterium paccae, and the catalase is derived from Escherichia coli.
  • preferable transformants of the present invention include a trait that co-expresses at least an enzyme that oxidizes D amino acid to keto acid, a hydrogen peroxide-degrading enzyme, and an enzyme that converts keto acid to L amino acid.
  • a conversion body is mentioned.
  • the preferable transformant may be a mode in which a coenzyme regenerating enzyme is co-expressed as necessary. In this case, the activity of the coenzyme regenerating enzyme causes the keto acid The reductive amination reaction can proceed efficiently and L amino acids can be obtained in high yield.
  • an enzyme that converts D-amino acid to keto acid and an enzyme that converts keto acid to L amino acid can be expressed together by culturing the transformant having the above-mentioned constitution alone. For this reason, since the reaction for converting D amino acid to keto acid and the reaction for converting keto acid to L amino acid (main reaction) can proceed in one pot (in the same system), the number of production steps can be reduced. In addition, in the present invention, since a forced expression system using a vector is used, the main reaction can be efficiently advanced by the enzyme accumulated at a high concentration. Therefore, there is an advantage that L-amino acid can be produced with a theoretical yield of 100% using an inexpensive enantiomeric mixture of amino acids as a raw material.
  • a liquid medium or a solid medium containing at least useful components such as proteins, lipids, carbohydrates, vitamins and minerals necessary for the growth of the host can be used.
  • a liquid medium is preferably used in that the culture can be directly used for an enzymatic reaction.
  • the culture medium may contain various additives.
  • the culture process produces an enzyme that converts D-amino acid to keto acid, an enzyme that converts keto acid to L amino acid, and, if necessary, a culture in which other enzymes are accumulated at a high concentration.
  • reaction step a reaction in which D amino acid contained in the enantiomeric mixture of amino acids is converted to L amino acid by enzymatic reaction using the culture obtained in the culturing step or a processed product thereof.
  • the reaction process uses an enantiomeric mixture of amino acids as a raw material to allow an enzymatic reaction to convert D amino acid to keto acid and an enzymatic reaction to convert the produced keto acid to L amino acid in the same system. This is a process for producing a high concentration accumulation of L amino acids.
  • the reaction solution in the reaction step contains at least the culture obtained in the culturing step or a processed product thereof and a mixture of enantiomers of amino acids as raw materials.
  • the culture obtained in the culturing step is composed of at least a transformant in which expression is induced and a medium.
  • the culture is a transformation obtained by removing the medium from the culture as a processed product of the culture in that a reaction solution suitable for the enzymatic reaction can be easily prepared.
  • the body is preferably used.
  • culture Use treated products that have been subjected to appropriate treatments such as crushing, concentration, dilution, filtration, centrifugation, extraction, immobilization, etc., to the extent that the target enzyme activity induced in the nutrients can be maintained. Can do.
  • the treated product of the culture is prepared by crushing using a bacterium-fixed microbial cell whose membrane permeability has been enhanced by a surfactant or an organic solvent, a homogenizer, ultrasonic waves, or the like.
  • Cell-free extracts can be used.
  • amino acids constituting the enantiomeric mixture include, for example, the following formula (1):
  • R represents a hydrocarbon group which may have a substituent
  • hydrocarbon group in R examples include linear or branched hydrocarbon groups such as methyl, ethyl, propyl, probenyl, butyl, isobutyl and butenyl; alicyclic groups such as cyclopentane and cyclohexane Hydrocarbon groups; aromatic hydrocarbon groups such as phenyl.
  • substituent include a halogen atom, an amino group, a nitro group, an alkyl group, and an alkoxy group.
  • amino acids used in the present invention include, for example, norpaline, normouth isine, homophenenolanine, o-nitrophenalanine, m-nitrophenalanine, p-trophe- Examples include lulanin, 2-aminobutyric acid, and ⁇ -naphthylalanin. Among them, a mixture of enantiomers of norpaline is preferably used.
  • the amount of the enantiomeric mixture of amino acids used can be appropriately selected according to the type and amount of the enzyme expressed from the transformant. Preferably, it is about 1 to 30% by weight, more preferably about 2 to 20% by weight.
  • the reaction solution may contain other components in addition to the culture product or processed product thereof, and the enantiomeric mixture of amino acids.
  • a reaction solvent, a substrate corresponding to the enzyme activity, a coenzyme, an antifoaming agent, and the like can be used.
  • the reaction solvent water; an appropriate organic solvent such as hydrocarbon, ester, alcohol, etc., a liquid modifier such as a pH adjuster or a buffer solution, and the like are used. These reaction solvents may be used alone or in combination of two or more.
  • the substrate and coenzyme corresponding to the enzyme activity are appropriately selected and used depending on the enzyme expressed by the transformant.
  • NAD (P) H is used for transformants expressing amino acid dehydrogenase, and coenzyme regenerating enzymes such as formate dehydrogenase and glucose dehydrogenase are used.
  • NAD (P) + can be used as a transformant to be expressed.
  • the coenzyme (NAD (P) H, NAD (P) +) is, for example, about 0.001 to 100 mM, preferably about 0.01 to: LOmM, more preferably about 0.1 to about LmM with respect to the total amount of the reaction solution. Can be added at a concentration of
  • the transformant expresses both an amino acid dehydrogenase and a coenzyme regenerating enzyme, it is necessary to coexist a substrate corresponding to the coenzyme regenerating enzyme activity in the system.
  • Specific examples of the combination of the coenzyme regenerating enzyme and its substrate include formate dehydrogenase and formic acid or salts thereof, glucose dehydrogenase and glucose, alcohol dehydrogenase and ethanol or 2-propanol, malate dehydrogenase. And malic acid or a salt thereof, glycerol dehydrogenase and glycerol are added to the reaction system.
  • the substrate can be added, for example, in an amount of 0.1 to 20 equivalents, preferably about 1 to 5 equivalents, relative to the D amino acid contained in the enantiomeric mixture used as a raw material.
  • amino group donor When the transformant expresses an L amino acid aminotransferase, an amino group donor is added.
  • amino group donors include various amino acids such as glutamic acid and aspartic acid, and salts thereof.
  • the amino group donor can be added, for example, in an amount of 0.1 to LOO equivalent, preferably about 1 to 20 equivalents, relative to the D-amino acid contained in the raw enantiomeric mixture.
  • the transformant expresses L-amino acid dehydrogenase
  • the It is preferable to have an amino group donor such as hydrogen.
  • the form of adding ammonium ions to the reaction solution is not particularly limited. For example, it may be added as an ammonium buffer. It also serves as the donation of formic acid as a substrate for formate dehydrogenase, a coenzyme regenerating enzyme. Ammonium formate or formic acid and ammonia can be added separately.
  • the amount of ammonia added is, for example, 0.1 to 20 equivalents, preferably 0.2 to 10 equivalents, more preferably about 0.5 to 4 equivalents, relative to the D amino acid present in the system at the start of the reaction. It is.
  • Antifoaming agents are effective in improving liquid properties, such as Adeka Pull Mick L 61, Ade Force Pull Mock L 71, Adeka Pull Mock 25R 1, Adeka Pull Mock 25R-2, Ade force nor LG-294, caralin, silicon, etc. can be used.
  • the addition amount of the antifoaming agent, the reaction solution f columns example I theta with respect to the total amount. 001 to 0.5 weight 0/0, preferably I or 0.005 to 0.1 wt 0/0, more preferably 0. It is about 01 to 0.05% by weight.
  • various buffer solutions and compounds having a buffering ability can be added.
  • an L amino acid dehydrating enzyme is used as an enzyme that converts keto acid to L amino acid
  • ammonia buffer, ammonium formate, and the like are preferably used. These can be added at a concentration of, for example, about 10 mM to 3 M, preferably about 50 mM to 1.5 M with respect to the total amount of the medium.
  • the enzyme reaction is performed in the presence of oxygen.
  • a transformant expressing D amino acid oxidase can react, for example, with pure oxygen or air with increased oxygen partial pressure, air or the like being vented into the reaction solution.
  • the air flow rate is, for example, about 0.01 to: LOwm, preferably about 0.05 to 2 wm.
  • the aeration method may be different from the method in which oxygen or the like is brought into contact with the reaction solution by means of stirring, shaking or the like, or the method by pressurization. Control these conditions according to the amount of dissolved oxygen.
  • the reaction in the reaction step is performed by mixing a culture or a processed product thereof and other components with an enantiomeric mixture of amino acids as a raw material.
  • the raw materials and the like may be added to the reaction solvent or the like all at once, or may be added sequentially, continuously or intermittently.
  • the reaction is carried out by standing or stirring.
  • the reaction conditions are appropriately selected within a range that does not inhibit the progress of the enzyme reaction!
  • the pH of the reaction solution is selected so as to maintain the target enzyme activity, and is usually about pH 5 to ll, preferably about pH 6 to 10, more preferably about pH 7 to 9.
  • the pH during the reaction and at the end of the reaction can be controlled within an appropriate range, or may be left to change as the reaction proceeds.
  • the reaction temperature can be appropriately selected within the range in which the target enzyme activity can be maintained, for example, 5 to 70 ° C, preferably 10 to 55 ° C, more preferably about 20 to 40 ° C.
  • the reaction step is preferably performed by a transformant collected from the culture obtained in the culture step, a mixture of enantiomers of amino acids, and a reaction solution in which a substrate corresponding to the enzyme and other appropriate additives are mixed. Is agitated under aeration conditions.
  • the enzyme expressed in the culturing step is allowed to act on the enantiomeric mixture of amino acids to thereby convert the D amino acid into keto acid, and the enzyme converting keto acid power into amino acid. Reaction proceeds in one pot (within the same system) and L amino acid is generated
  • the completion of the reaction can be confirmed when the D-amino acid concentration in the reaction solution decreases and the L-amino acid accumulates at a high concentration. That is, the end point of the reaction in the present invention is L amino acid accumulation concentration in the culture system, for example, 90% e.e or more, preferably 95% e.e or more, more preferably 99% e.e or more.
  • “% e. E” refers to the value represented by the following formula.
  • a reaction solution in which L amino acid is accumulated at a high concentration is generated.
  • a reaction solution containing L amino acid at a high concentration may be subjected to treatment such as sterilization and protein removal using an appropriate separation means after solubilizing L amino acid accumulated in the reaction solution to a degree higher than its solubility.
  • the L-amino acid can be recovered by purifying the obtained treatment solution as necessary.
  • the soluble amino acid treatment of L-amino acid is performed, for example, when the target L-amino acid is accumulated in a culture solution in a liquid culture in excess of its solubility. It can be applied by means of acidification, basification or dilution. Acidification is within the system By adding an acid such as hydrochloric acid or sulfuric acid, the basification is carried out by adding a base such as sodium hydroxide or lithium hydroxide.
  • the treatment solution after the solubilization treatment may be acidic, basic, or neutral.
  • the separation means for example, conventional means such as filtration and centrifugation can be used.
  • the treatment solution after the sterilization and protein removal treatment is an L amino acid solution from which inorganic salts have been removed by depositing unnecessary inorganic salts by adding additives and applying separation means such as filtration. It can be.
  • Such an additive is not particularly limited as long as it can reduce the solubility of unnecessary inorganic salts while maintaining the solubility of L-amino acid, but is preferably a water-soluble solution such as methanol, ethanol, 2-propanol, acetone, and acetonitrile.
  • Organic solvents can be used.
  • These additives may be removed from the system by an operation such as distillation, or the subsequent purification may be performed while remaining.
  • Purification may be performed by, for example, concentration, isoelectric precipitation, crystallization treatment by cooling or addition of an additive having an action of lowering the solubility of the target product, ion exchange resin treatment, membrane separation, extraction with an organic solvent.
  • various types of chromatography such as ion exchange chromatography, adsorption with an adsorbent, flocculant, dehydration or aggregation with a dehydrating agent, and known purification means such as distillation, and a combination thereof are performed.
  • the purification means can be appropriately selected depending on the type of amino acid.
  • L-norpaline is separated and purified as an amino acid
  • the following method can be used. That is, by adding sulfuric acid to the reaction solution containing L-norparin and acidifying it, the L-norparin accumulated in the lysis reaction solution is dissolved and then sterilized by centrifugation. Methanol is added to the obtained L-norparin-containing solution to precipitate unnecessary inorganic salts, which are removed by filtration.
  • a purified norvaline can be obtained by adding a base such as ammonia or sodium hydroxide to the collected filtrate to neutralize it, and further adding acetone for crystallization treatment.
  • the enzymatic reaction for converting D amino acid to keto acid and the enzymatic reaction for converting the produced keto acid to L amino acid are allowed to proceed in one pot (within the same system). Therefore, the enzymatic reaction that produces keto acid from D-amino acid and the enzyme reaction that produces L-amino acid from keto acid can be performed as one transformant culture process, and L-amino acid can be obtained in a high amount of accumulation. Can do. For this reason, L amino acids can be produced in a theoretical yield of 100% even when an inexpensive amino acid mixture in which a D form and an L form such as a racemate are mixed is used as a raw material.
  • L-amino acid production method 2 of the present invention is a L-amino acid production method in which L-amino acid is enzymatically generated from a mixture of enantiomers of amino acids, and at least D amino acid is oxidized to keto acid.
  • a transformant that co-expresses an enzyme and a hydrogen peroxide-degrading enzyme or its processed product an oxidation process that mainly oxidizes D amino acid, an enzyme that produces L amino acid from keto acid, and coenzyme regeneration as needed
  • a transformant co-expressing an enzyme or a processed product thereof it is characterized by having two or more different reaction steps, which are mainly reduction steps for synthesizing ketoacid L-amino acids.
  • the "acidification step” means that the step mainly includes an oxidation reaction that oxidizes D amino acid to keto acid, and other reactions may proceed in addition to the oxidation reaction. Good. Examples of other reactions in the acidification step include a reaction that promotes an oxidation reaction (a reaction by the action of a hydrogen peroxide decomposing enzyme, etc.), a reduction reaction that will be described later, and the like.
  • the "reduction step” means a step including a reduction reaction in which L amino acid is synthesized mainly by reductive amination of keto acid, and other reactions proceed in addition to the reduction reaction. You may do it.
  • Examples of other reactions in the reduction step include a reaction that promotes a reduction reaction (such as a reaction by the action of a coenzyme regenerating enzyme) and the above-described oxidation reaction.
  • Transformant that co-expresses an enzyme that produces L amino acid from keto acid and, if necessary, coenzyme regenerating enzyme” in the reduction process refers to a transformant that expresses an enzyme that produces L amino acid from keto acid. And a transformant that co-expresses an enzyme that generates L amino acid from keto acid and a coenzyme regenerating enzyme.
  • the L-amino acid production method 2 of the present invention only needs to have at least two different reaction steps consisting of the oxidation step and the reduction step. May be included.
  • the oxidation reaction using an enzyme that oxidizes D amino acid to keto acid is carried out when the substrate concentration in the reaction solution is high, and the yield of the reaction product (keto acid) [
  • the ratio of L amino acid to the mixture of raw amino acid enantiomers (DL amino acid) tends to be low.
  • the yield should be about 70%. Therefore, there was a problem that it could not withstand industrial production.
  • the reason for the low yield is that the keto acid produced by the action of D-amino acid oxidase is decarboxylated by contact with hydrogen peroxide produced as a by-product in the reaction, and the resulting aldehyde is further enzymatically oxidized.
  • the main reaction was hindered as a result of decomposition through a series of reactions that undergo air oxidation to produce organic acids.
  • the present inventors have significantly improved the yield of L-amino acid when using a transformant in which D-amino acid oxidase and hydrogen peroxide-degrading enzyme (particularly catalase) are co-expressed. I found something that could be done.
  • catalase was added separately to the reaction solution containing a transformant expressing D amino acid oxidase, the effect was hardly exhibited. This is because the ⁇ -keto acid produced in the cell is rapidly degraded in the cell by the peroxy hydrogen peroxide produced as a by-product, and the ⁇ -keto leaked out of the cell. This suggests that the acid is not gradually decomposed by peroxyhydrogen leaked out of the cell.
  • D amino acid oxidase and hydrogen peroxide-degrading enzyme should be the same. It shows special value by being expressed in cells.
  • Equation (1) one molecule of oxygen is required to oxidize one molecule of D amino acid, and one molecule of hydrogen peroxide is produced as a by-product at the same time.
  • reaction formula (2) proceeds.
  • 1Z2 molecules of oxygen are generated from one molecule of hydrogen peroxide decomposed by the action of hydrogen peroxide-degrading enzyme and supplied to the reaction system. The amount of oxygen introduced from outside the system can be halved.
  • the peroxidase activity of catalase would promote the degradation of the intermediate product keto acid.
  • a significant improvement in the yield of L-amino acid was obtained.
  • the method 2 of the present invention is extremely high in suppressing the decomposition of keto acid by decomposition of peroxyhydrogen, which has almost no problem (acceleration of decomposition of keto acid) due to the combined use of catalase, which is almost no problem. Since the effect can be exhibited, it is extremely advantageous for high yield.
  • Method 2 of the present invention has the above-described configuration, keto acid can be obtained in high yield using mild reaction conditions.
  • the same enzymes, recombinant vectors, transformants, culture conditions and the like as used in Method 2 of the present invention can be used.
  • the reaction conditions described in the method 1 can be used.
  • the oxidation step is mainly composed of an oxidation reaction of D amino acid that requires oxygen
  • the reduction step is mainly composed of a reductive amination reaction of keto acid that does not require oxygen.
  • reductive coenzyme regenerating enzyme for example, formic acid which is a substrate for formate dehydrogenase
  • the reductive amination reaction of keto acid in the reduction step is preferably a reaction without oxygen.
  • the reductive amination reaction of a-keto acid is promoted by carrying out the reduction step and the acid-soaking step performed in one pot (in the same system) under different reaction conditions.
  • reaction conditions set differently for the acid process and the reduction process include oxygen aeration conditions, stirring conditions, PH, addition of catalysts (including enzymes), transformants, etc. .
  • the oxidation step is carried out under an oxygen-containing gas ventilation condition, and the reduction step is not conducted with an oxygen-containing gas, or the oxygen-containing gas is oxidized.
  • the method include a method in which the air is passed at a lower air flow rate than in the process. According to this method, in the reduction step, the reduced coenzyme is wastefully oxidized, or the oxidized coenzyme is re-reduced by the action of the coenzyme regenerating enzyme, so that the enzyme substrate is wasted.
  • problems such as inhibition of the progress of the reductive amination reaction can be avoided, and in particular, the production efficiency of L-amino acid from keto acid can be further improved.
  • the oxygen-containing gas may be a gas containing at least oxygen, for example, oxygen, and a mixed gas of oxygen and other gases such as air.
  • gases include inert gases such as carbon dioxide and nitrogen.
  • Air or the like is preferably used as the oxygen-containing gas.
  • the oxygen content in the oxygen-containing gas is, for example, 0.1 volume% or more (0.1 to: LOO volume%), preferably 1 volume% or more, more preferably 5 volume% or more.
  • Specific oxygen-containing gas ventilation conditions include, for example, the oxygen-containing gas ventilation rate in the oxidation step is 1% by volume or more per minute with respect to the reaction solution, and the oxygen-containing gas ventilation in the reduction step.
  • the volume is less than 10% by volume per minute, preferably in the oxidation step
  • the flow rate of oxygen-containing gas in the reaction solution is 2% by volume or more per minute, and the flow rate of oxygen-containing gas in the reduction process is less than 2% by volume per minute, more preferably.
  • the flow rate of oxygen-containing gas in the oxidation step is 5% by volume or more per minute with respect to the reaction solution, and the flow rate of oxygen-containing gas in the reduction step is less than 5% by volume with respect to the reaction solution.
  • the oxygen-containing gas flow rate in the acidification step is 1% by volume or more per minute with respect to the reaction solution, and the oxygen-containing gas is not substantially bubbled in the reduction step. According to such aeration conditions, the effect of further improving the yield of L amino acid can be obtained.
  • a method of adjusting the reaction solution in the acidification step and the reaction solution in the reduction step to different pHs for example, a reaction solution in the oxidation step
  • a method of adjusting the pH of the reaction solution in the reduction step to a lower value than the pH of the solution for example, the pH of the reaction solution in the acidification step is adjusted to 7.0 to 9.5, and the pH of the reaction solution in the reduction step is 6.0 to 8.5.
  • Conditions for adjusting to a value lower than the pH in the process preferably the pH of the reaction liquid in the acid process is adjusted to 7.5 to 9.0, and the pH of the reaction liquid in the reduction process is adjusted to 6.5 to 8.0. There may be mentioned conditions for adjusting to a value lower than the pH in the acidification step.
  • the pH adjustment in the acidification step and the reduction step is not particularly limited as long as the progress of the main reaction is not inhibited, and an appropriate amount of a known acid or base can be used depending on the type.
  • a known acid or base can be used depending on the type.
  • formic acid or a salt thereof for example, ammonium formate
  • acid This is preferable in that it efficiently replenishes formic acid that is wasted in the dredging process.
  • a reaction solution containing 0.2 equivalent or more of formate ion and Z or ammonium ion with respect to the raw material amino acid enantiomer mixture.
  • a compound capable of generating formate ion in the reaction system can be added.
  • formic acid formate such as ammonium formate and sodium formate can be used.
  • ammonium ion a compound capable of generating ammonium ion in the reaction system can be added. Examples of such a compound include ammonia; ammonium chloride, ammonium formate, ammonium acetate.
  • -Ammum salt such as um It is possible to be.
  • formate ion acts as a pH adjuster, and keto acid can be obtained in high yield.
  • formate ions serve as a source of substrate for formate dehydrogenase and coenzymes are used.
  • the reductive amination reaction of keto acid is promoted and L amino acid can be obtained in high yield. For this reason, the residual amount of keto acid in the reaction solution after completion of the reaction can be further reduced.
  • the above method is more effective when it involves a reaction using D amino acid oxidase.
  • the above method in the reaction of converting keto acid to L amino acid, it acts as an ammonium ion force 3 ⁇ 4H regulator, and at the same time, the ammonium ion serves as an amino group supply source.
  • the L-amino acid can be efficiently produced by promoting the conversion reaction. Furthermore, the above method can achieve a higher effect when L amino acid dehydrogenase is used.
  • the present inventors converted ammonium formate, which does not inherently affect the reaction (especially oxidation reaction) for converting D amino acid into keto acid, into a mixture of starting amino acid enantiomers (D, L It was found that the addition of 0.2 equivalents or more to (mino acid) promotes the formation of keto acid. That is, the method of the present invention has the above-mentioned effect by using a reaction solution containing both 0.2 equivalents or more of formate ions and 0.2 equivalents or more of ammonium ions with respect to the raw material amino acid enantiomer mixture. Can be improved.
  • both the formate ion and the ammonium ion act as pH adjusters, and the former is formic acid.
  • coenzyme is efficiently regenerated, and the latter further increases the efficiency of the reaction to convert ketoacid power L-amino acids by using ammo ions as a source of amino groups. Can be up.
  • the transformant of the present invention or a treated product thereof is added to the reaction solution before or after the oxidation process power is also transferred to the reduction process. It is preferable to add them. According to this method, the enzyme consumed in the acidification process is compensated. In addition, since the reductive amination reaction in the reduction step is performed smoothly, the intermediate keto acid is prevented from remaining after completion of the reaction, and the L amino acid can be obtained in a high yield.
  • an enzymatic reaction that converts D-amino acid oxidase co-expressed with hydrogen peroxide-degrading enzyme into keto acid, and the generated keto acid is converted into L-amino acid. Since the enzymatic reaction is carried out in one pot (within the same system), the acidity of the D amino acid can be carried out under mild conditions, and the strength of the keto acid can be prevented from being degraded. Is accumulated at a high V and concentration, and L amino acid can be efficiently obtained in a high yield in the subsequent reduction step.
  • LB medium a medium composed of 1% noctotryptone, 0.5% notato yeast extract, 1% sodium chloride sodium salt, pH 7.2 was used.
  • the “LB medium containing ampicillin” uses a medium in which ampicillin is added at a concentration of 50 g ZmL to the LB medium having the above structure.
  • “Nva” indicates “norpaline substrate concentration (% by weight)”
  • “Nva residual ratio [%]” indicates “norpaline molar concentration in the reaction solution.
  • Escherichia coli HB101 strain was transformed with the plasmid prepared in Production Example or Example, and the obtained transformant was cultured at 30 ° C overnight in liquid LB medium containing ampicillin (50 ⁇ g / ml). ImM IPTG was added to induce gene expression, and further cultured at 30 ° C for 4 hours. After the obtained gonococcus, 50 mM solution containing 0.02% 2-mercaptoethanol The supernatant (cell-free extract) was recovered by suspending in potassium phosphate buffer (pH 8.0), crushing with a closed ultrasonic crusher UCD-200TM (Cosmo Bio), and centrifuging. Using the obtained cell-free extract, enzyme activity was measured by the following methods. (Measurement of D-alanic acid enzyme activity)
  • L-amino acid dehydrogenase activity was measured by advancing. 1 U was defined as the amount of enzyme that catalyzes the production of 1 ⁇ mol NADH per minute.
  • L-amino acid L-alanine was used to measure L-alanine dehydrogenase activity, L-alanine was used to measure L-mouth isine dehydrogenase activity, and leucine was used to measure L-phenylalanine dehydrogenase activity. Each of the two lanalanins was used.
  • PSE420D JP 2000-189170 was digested with Nde I, subjected to blunting with Klenow fragment, and self-ligated to construct a vector PSE420-N in which the Nde I restriction enzyme site was crushed.
  • pSE420-N CTAG 260-263 was replaced with AGCT by site-specific mutation, and pSE420S was constructed in which the Sac I site was incorporated at the same site.
  • the plasmid pSE420U (FIG. 1) was constructed by double digesting pSE420S with Cla I and Nco I, annealing synthetic DNA (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2) at the same site, and ligating them.
  • Candida boidinii DSM 70026 strain was prepared as YEPD medium
  • a bacterial cell was prepared. According to the method described in Meth. Cell Biol, 29, 39 (1975), chromosomal DNA was isolated and purified from the bacterial cells.
  • Candida 'Bodyin TK 62 (Candida boidinii T described in Yeast, 16, 1217 (2000) Sense primer CbDAO-Al (SEQ ID NO: 3) and anti-sense primer CbDAO-T1 (SEQ ID NO: 4) for cloning based on the D-amino acid oxidase gene base sequence (Accession No. AB042032) derived from K62) strain ) was synthesized.
  • SEQ ID NO: 3 CACCATATGGGTGATCAAATTGTTGTTCTTGGTTC
  • the obtained DNA fragment was double-digested with restriction enzymes Nde I and AH II, treated with phenol-chloroform, then subjected to agarose gel electrophoresis, and the target band was excised. Sepha glas Band Prep Kit The target DNA fragment was recovered by purification with (Falmacia). Plasmid PSE420U was double-digested with restriction enzymes Nde I and All II, and the target DNA fragment was ligated using T4 DNA ligase (Takara Bio). Escherichia coli JM109 strain was transformed with the obtained plasmid.
  • the transformed strain was grown on an LB medium plate containing ampicillin, and a single direct PCR was performed using the sense primer CbDAO-A1 and the antisense primer CbDAO-T1 to confirm the size of the inserted fragment.
  • Colonies thought to have lkb DNA fragments inserted were cultured in LB medium containing ampicillin and purified using FlexiPrep Kit (manufactured by Pharmacia) to obtain plasmid pSUCBDOl (FIG. 2).
  • the ORF start position is 1st position, 77G ⁇ T (Cys27 ⁇ Phe), 83C ⁇ A ( Ala28 ⁇ Asp), 198A ⁇ C, 243C ⁇ A (His81 ⁇ Gln), 501A ⁇ G, and 525A ⁇ G, including 6 amino acid substitutions were observed.
  • the D-amino acid oxidase gene derived from the Candida boidinii DSM 70026 strain was incorporated into the plasmid pSUCBDOl.
  • the D-alaninate activity by the plasmid pSUCBDOl was measured.
  • the specific activity was 4.68 UZmg-protein.
  • the D-amino acid oxidase gene derived from Trigonopsis variabilis CBS 4095 strain described in JP 2001-506868 (Accession No. Z50019) contains an intron inside the ORF. Therefore, the second exon part was closed first.
  • Sense primer TvDAO-e2Al SEQ ID NO: 5
  • antisense primer TvDAO-T2 SEQ ID NO: 6
  • Plasmid vector pUC119 was double digested with restriction enzymes Hind III and Hinc II, and a DNA fragment containing the second exon was ligated using T4 DNA ligase (Takara Bio) to form a plasmid. Transformed.
  • the transformant was cultured in an LB medium containing ampicillin, and the plasmid was purified using FlexiPrep Kit (manufactured by Pharmacia) to obtain plasmid pUCTVDOT (FIG. 3).
  • the nucleotide sequence of the inserted DNA was analyzed using the primer walking method under the conditions described in Production Example 1, and the trigonopsis described in JP 2001-506868 (Accession No. Z50019) was published.
  • the primer walking method under the conditions described in Production Example 1, and the trigonopsis described in JP 2001-506868 (Accession No. Z50019) was published.
  • the primer ORF As the first position.
  • the second exon portion of the D-amino acid oxidase gene derived from the strain Trigonopsis variabilis CBS 4095 was incorporated into the plasmid pUCTVDOT.
  • TvDAO-e5 SEQ ID NO: 7
  • TvDAO-e3 TvDAO-e3. It was synthesized as (SEQ ID NO: 8).
  • SEQ ID NO: 7 CAGCCATGGCTAAAATCGTTGTTATTGGTG
  • SEQ ID NO: 8 CCGGCACCAATAACAACGATTTTAGCCATGGCTG
  • TvDAO-e3 and TvDAO-e5 were each 1.25 ⁇ mol, 0.1 mM EDTA, 10 mM Tris monohydrochloride buffer solution (pH 8.0), and 50 ⁇ L reaction solution was denatured at 94 ° C for 1 minute. After annealing at 61 ° C for 1 minute, digestion with the restriction enzyme Nco I, phenol-chloroform treatment, agarose gel electrophoresis, excision of the target band, Sephaglas Band Prep Kit (manufactured by Pharmacia) To obtain a DNA fragment containing the second exon. Double digest pUCTVDOT with restriction enzymes NgoM IV and Hind III, and perform agarose gel electrophoresis. The band portion to be cut out was cut out and purified by Sephaglas Band Prep Kit (manufactured by Falmasia) to obtain a DNA fragment containing the first exon.
  • the plasmid pSUTVDOl (FIG. 4) was constructed in which the D-amino acid enzyme enzyme gene derived from Trigonopsis variabilis CBS 4095 strain was incorporated.
  • Escherichia coli JM 109 strain was cultured in LB medium to prepare bacterial cells. According to the method described in Nucleic Acids Res., 8, 4321 (1980), the chromosomal DNA was separated from the bacterial cells and purified.
  • D-amino acid dehydrogenase gene (Accession No. L02948) derived from Escherichia coli K-12 strain described in J. BacterioL, 176, 1500 (1994).
  • SEQ ID NO: 9 TGGCCATGGCTCGTGTTGTAATTCTGGGAAGTGGTGTG
  • SEQ ID NO: 10 CAGTCTAGATTAAGAATGTGCACCATGTAAATGGCCC
  • Chromosomal DNA purified from the aforementioned Escherichia coli K-12 strain is used as a cage, and PCR is performed under the same conditions as in Production Example 1 using primers EcDadA-Al and EcDadA-Tl. went.
  • PCR is performed under the same conditions as in Production Example 1 using primers EcDadA-Al and EcDadA-Tl. went.
  • a highly specific band of about 1.3 kbp was detected. This band was excised and purified by GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (manufactured by Falmasia) to recover the target DNA fragment.
  • the plasmid vector PUC118 was digested with the restriction enzyme Hinc II, and the target DNA fragment was ligated using T4 DNA ligase (Takara Bio). Escherichia coli JM109 strain with the obtained plasmid
  • the plasmid pUCECDDl (FIG. 5) was obtained by purification in the same manner as in Production Example 1.
  • the purified plasmid pUCECDDl was analyzed using the primer walking method under the conditions described in Production Example 1, and as a result, the nucleotide sequence of the inserted DNA was analyzed.
  • J. BacterioL, 176, 1500 (1994) -12 (Escherichia coli K-12) strain-derived D-amino acid dehydrogenase gene nucleotide sequence accesion No. L02948) completely matched.
  • the D-amino acid dehydrogenase gene derived from Escherichia coli K-12 was incorporated into the plasmid pUCECDDl!
  • the obtained pUCECDDl was double-digested with restriction enzymes Nco I and EcoR I, and subjected to agarose gel electrophoresis.
  • the target band was excised and purified by Sephaglas Band Prep Kit (manufactured by Pharmacia). A DNA fragment was obtained.
  • Plasmid vector pET-21d is double digested with restriction enzymes Nco I and EcoR I, and the target DNA fragment is ligated using T4 DNA ligase (manufactured by Takara Bio Inc.). The resulting plasmid is transformed into Escherichia coli ( Escherichia coli) BL21 (DB3) pLysS strain was transformed. Plasmid pETEC in which D-amino acid dehydrogenase gene derived from Escherichia coli K-12 strain was incorporated by purifying the plasmid by transformation using the same procedure as in Production Example 1. DDI ( Figure 6) was obtained.
  • Escherichia coli 'BL21 (DB3) pLysS strain transformed with the purified plasmid pETECDD 1 was cultured overnight at 28 ° C in LB medium containing ampicillin and chloramphee-coal (25 ⁇ g / mL). 0. ImM IPTG was added to induce gene expression, and further cultured at 30 ° C for 4 hours. After harvesting the obtained cells were suspended in 0.02% 2-mercaptoethanol to 50 mM potassium phosphate buffer containing (P H8. 0), closed sonicator UCD- 2 00TM (Cosmo The supernatant (cell-free extract) was recovered by crushing with Bio) and centrifuging. Using the obtained cell-free extract, the D-alaninate activity was measured according to the enzyme activity measurement method, and the specific activity was 49.2 mUZmg-protein.
  • the obtained DNA fragment was ligated with plasmids PSE420U (Production Example 1) and T4 ligase (manufactured by Takara Bio) digested with the same restriction enzymes Nco I and Xba I to obtain a plasmid.
  • Escherichia coli JM109 was transformed with the obtained plasmid, and the plasmid was purified from the transformed strain selected by culturing in LB medium containing ampicillin, and thus, formate dehydrogenase derived from Mycobacterium vaccae (Mycobacterium vaccae).
  • PSU-MF26 Fig. 7 incorporating the mutant gene was obtained.
  • the leucine dehydrogenase expression plasmid pICD301 derived from Giobacillus' stearothermophilus IFO 12250 strain described in Biochemistry, 29, 1009 (1990) is used as a cocoon type, and the sense primer BstAlaDH-Al and the antisense primer BstAlaDH- PCR was performed using T1 according to the method described in Preparation Example 1. As a result of analyzing a part of the PCR reaction solution by agarose gel electrophoresis, a specific band of about 1. lkbp was detected.
  • This band was excised, purified with G FX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (manufactured by Falmasia), double digested with restriction enzymes EcoR I and Hind III, treated with phenol-chloroform, and then agarose gel.
  • the target band was excised by electrophoresis and purified with Sephaglas Band Prep Kit (manufactured by Pharmacia) to obtain the target DNA fragment.
  • the pSU-MF26 obtained in Production Example 4 was double-digested with restriction enzymes EcoR I and Hind III, and the target DNA fragment was ligated using T4 DNA ligase (Takara Bio). Escherichia coli JM109 strain was transformed with the obtained plasmid and purified by the same method as in Production Example 1 to obtain plasmid pSF-GSA2 (FIG. 8).
  • the nucleotide sequence of the inserted DNA was analyzed under the conditions described in Production Example 1 using the primer walking method, and the Gyobacillus stearothermo described in Biochemistry, 29, 1009 (1990).
  • 20 base substitutions, 3 base deletions, and 3 base insertions were observed.
  • 16 amino acid substitution, 1 amino acid deletion, and 1 amino acid insertion occurred.
  • the obtained base sequence is shown in SEQ ID NO: 13.
  • the plasmid pSF-GSA2 was transformed into the L-alanine dehydrogenase gene derived from the strain of Geobacillus stearothermophilus IFO 12550 and the formate dehydrogenase derived from Mycobacterium vaccae. It was confirmed that the mutant gene of the enzyme was integrated.
  • Sense primer for cloning BthAlaDH-Al (sequence) from the base sequence of alanine dehydrogenase gene derived from Bacillus thermocatenulatus DSM 730 strain described in Biochimie, 71, 559 (1989) No. 14) and antisense primer BthAlaDH-Tl (SEQ ID NO: 15) were synthesized.
  • SEQ ID NO: 14 GAGGAATTCTATTCATGATTATTGGTGTGCCAAAGGAA
  • SEQ ID NO: 15 CAGAAGCTTCTAGATTAATTAGCAGCCAACGTTTTCC
  • Plasmid pKUAD103 is a cocoon type, and sense primer BthAlaDH-A1 and antisense PCR was performed according to the method described in Production Example 1 using Imah BthAlaDH-Tl.
  • a highly specific band of about 1.2 kbp was detected. This band was excised, purified with GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (manufactured by Pharmacia), double digested with restriction enzymes EcoR I and Hind III, treated with phenol-chloroform, and subjected to agarose gel electrophoresis.
  • Sephaglas Band Prep Kit manufactured by Falmasia
  • the pSE-MF26 obtained in Production Example 4 was double-digested with restriction enzymes EcoR I and Hind III, and the target DNA fragment was ligated using T4 DNA ligase (Takara Bio). Escherichia coli JM109 was transformed with the obtained plasmid, and purified by the same method as in Production Example 1 to obtain plasmid pSF-BTA1 (FIG. 9).
  • the purified plasmid pSF-BTAl was analyzed.
  • the Bacillus thermo cate-uratus DSM 730 Biochimie, 71, 559 (1989)
  • the nucleotide sequence of the L-alanine dehydrogenase gene from Bacillus thermocatenulatus DSM 730 was completely identical.
  • the plasmid pSF-BTAl was mutated with the L-alanine dehydrogenase gene from Bacillus thermocatenulatus DSM 730 and the formate dehydrogenase from Mycobacteria paecae (Mycobacteri awake vaccae). It was confirmed that it was integrated with a body gene.
  • a cell-free extract was prepared using plasmid pSF-BTA1 according to the above enzyme activity measurement method, except that the cells were cultured overnight at 25 ° C, and L-alanic acid activity and formate activity were measured. The specific activities were 3.38 U / mg-protein and 1.24 UZmg-protein, respectively.
  • Notils' sphaericus IFO 3525 (Bacillus sphaericus IFO 3525) strain was cultivated in LB medium to prepare bacterial cells. Using Genome tip 100 (Qiagen) Separation and purification.
  • Chromosomal DNA purified from the Bacillus sphaericus IFO 3525 strain was used as a saddle, and PCR was performed under the same conditions as in Production Example 1 using primers BspAlaDH-A1 and BspAlaDH-T1.
  • a highly specific band of about 1. lkbp was detected.
  • This band was cut out and purified with GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (manufactured by Falmasia), then double digested with restriction enzymes EcoR I and Hind III, treated with phenol-chloroform, and subjected to agarose gel electrophoresis.
  • the target band portion was cut out and purified by Sephaglas Band Prep Kit (manufactured by Fanolemacia) to obtain the target DNA fragment.
  • PSU-MF26 obtained in Production Example 4 was double-digested with restriction enzymes EcoR I and Hind III, and ligated using T4 DNA ligase (Takara Bio). Escherichia coli JM109 was transformed with the obtained plasmid, and purified by the same method as in Production Example 1 to obtain plasmid pSFBPADl (FIG. 10).
  • the purified plasmid pSFBPADl was analyzed for the nucleotide sequence of the inserted DNA under the conditions described in Production Example 1 using the primer walking method, and the batinoles' sphaericus IFO 3525 (Bacillus as described in Biochemistry, 29, 1009 (1990). Compared with the base sequence of sphaericus IFO 3525) (Accession No.
  • the base position of ORF is 1st, 99GT ⁇ TG, 119G ⁇ C, 150G ⁇ T, 537G ⁇ C, 888T ⁇ C, 6 bases 6 base deletion, 96G, 103G, 104C, 169G, 297C, 505C, insertion of 186CA ⁇ CAA, 302CT ⁇ CGT, and 499CA ⁇ CAA.
  • the base sequence is shown in SEQ ID NO: 18.
  • the plasmid pSFBPADl incorporates the L-alanine dehydrogenase gene from the strain of N. sphaericus IFO 3525 (Bacillus sphaericus IFO 3 525) and the mutant gene of formate dehydrogenase from Mycob acterium vaccae. It was confirmed that
  • a cell-free extract was prepared using plasmid pSFB PAD1 according to the above enzyme activity measurement method except that the cells were cultured overnight at 25 ° C, and L-alanic acid activity and formate activity were measured. The specific activities were 8.44 UZmg protein and 0.83 UZmg protein, respectively.
  • PCR was performed according to the method described in Preparation Example 1 using plasmid pSheAlaDH2 as a saddle and using sense primer SheAlaDH-A2 and antisense primer SheAlaDH-T2.
  • a highly specific band of about 1. lkb p was detected. This band was excised, purified with GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (manufactured by Falumasia), double digested with restriction enzymes EcoR I and Hind III, treated with phenol-chloroform, and subjected to agarose gel electrophoresis.
  • Sephaglas Band Prep Kit manufactured by Falmasia
  • PSE-MF26 obtained in Production Example 4 was double digested with restriction enzymes EcoR I and Hind III, and the target DNA fragment was ligated using T4 DNA ligase (Takara Bio). Large with the resulting plasmid Enterococcus JM109 strain was transformed and purified by the same method as in Production Example 1 to obtain plasmid pS F-SAD1 (FIG. 11).
  • the plasmid pSF-SAD1 incorporates the L-alanine dehydrogenase gene from Shiwanella sp. AclO strain and the mutant gene of Mycobacterium vaccae formate dehydrogenase from Mycobacterium vaccae. I confirmed that I was talking.
  • a cell-free extract was prepared using plasmid pSF-SAD1 according to the above enzyme activity measurement method except that it was cultured overnight at 25 ° C, and L-alaninic acid activity and formate activity were observed. When measured, the specific activities were 3.50 U / mg protein and 1.02 U / mg protein.
  • SEQ ID NO: 22 CTGAAGCTTCTAGATTATATTGCCGAAGCACCTGCC
  • This band was excised, purified with GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (manufactured by Falmasia), double digested with restriction enzymes Xba I and Not I, treated with phenol-chloroform, and subjected to agarose gel electrophoresis.
  • the band part to be cut out was cut out and purified with Sephaglas Band Prep Kit (manufactured by Falmasia) to obtain the target DNA fragment.
  • a part of the remaining PCR reaction solution was double-digested with restriction enzymes Not I and Hind III, and purified by the same method as described above to prepare a DNA fragment.
  • PSE420D Japanese Patent Laid-Open No. 2000-189170
  • restriction enzymes Xba I and Hind III restriction enzymes Xba I and Hind III
  • Escherichia coli JM109 was transformed with the obtained plasmid and purified in the same manner as in Production Example 1 to obtain plasmid pEGSLED2 (FIG. 12).
  • the primer walking method was used to analyze the nucleotide sequence of the inserted DNA under the conditions described in Production Example 1, and compared with the registered sequence (M22977) described in Biochemistry, 27, 9056 (1988). The insertion of an untranslated sequence of 186 bp was observed at the 3'-end of the registered sequence. The base sequence is shown in SEQ ID NO: 23.
  • the plasmid pEGSLED2 was incorporated with the L-mouth isine dehydrogenase gene derived from the strain of Geobacillus stearohtermophilus IFO 12550 (Geobacillus stearohtermophilus IFO 12550).
  • GstLeuDH-Sall (SEQ ID NO: 24), a sense primer for cloning, based on the middle part and 3'-end sequence of L-leucine dehydrogenase gene derived from Giobacillus' steer mouth thermophilus IF0 12550 (Geobacillus stearohtermophilus IFO 12550)
  • Antisense primer GstLeuDH-TAA1 (SEQ ID NO: 25) was synthesized.
  • SEQ ID NO: 24 GCGGTCGACCCGAACGAC
  • SEQ ID NO: 25 CTGAAGCTTCTAGATTAACGTGCACGACGGCGGCTTAA
  • PCR was performed according to the method described in Production Example 1 using the plasmid PLGSLED2 as a cage and using the sense primer GstLeuDH-Sail and the antisense primer GstLeuDH-TAA1.
  • a highly specific band of about 0.7 kbp was detected.
  • This band was cut out and GFX PCR DNA and Gel Ba After purification with the nd Purification Kit (manufactured by Falmasia), double-extending with restriction enzymes Sal I and Hind III, phenol-chloroform treatment, agarose gel electrophoresis, cutting out the target band, Sephaglas Band Prep Kit
  • the target DNA fragment was obtained by purification with (Falmacia).
  • the plasmid pLGSLED2 was double-digested with restriction enzymes Xba I and Sal I and purified by the same method as described above to prepare a DNA fragment.
  • PSU-MF26 obtained in Production Example 4 was double-digested with restriction enzymes Xba I and Hind III, and the above two DNA fragments were ligated using T4 DNA ligase (manufactured by Takara Bio Inc.). Escherichia coli JM109 was transformed with the obtained plasmid and purified in the same manner as in Production Example 1 to obtain plasmid pFGSLEDl (FIG. 13).
  • the purified plasmid pFGSLEDl was analyzed for the base sequence of the inserted DNA under the conditions described in Production Example 1 using the primer walking method. As a result, the plasmid pFGSLEDl was found to have a DNA sequence consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 23. Incorporation of the L-mouth isine dehydrogenase gene from the strain of Thermotherophilus IFO 12 550 (Geobacillus stearohtermophilus IFO 12550) and the mutant gene of formate dehydrogenase from Mycobacterium vaccae It was confirmed.
  • a cell-free extract was prepared using plasmid pFGS LED1 according to the above enzyme activity measurement method, except that it was cultured overnight at 24 ° C, and L-leucine acid activity and formate activity were measured. When measured, the specific activities were 4.03 U / mg protein and 0.63 U / mg protein.
  • Sense primer BspLeuDH-Al (SEQ ID NO: 26) based on the base sequence (Accession No. AB103119) of the L-mouth isine dehydrogenase gene derived from Bacillus spha ericus described in the DDBJ / EMBL / GenBank database And an antisense primer BspLeuDH-Tl (SEQ ID NO: 27) were synthesized.
  • the pSU-MF26 obtained in Production Example 4 was double-digested with a restriction enzyme, and the target DNA fragment was ligated using T4 DNA ligase (Takara Bio). Escherichia coli JM109 was transformed with the obtained plasmid and purified in the same manner as in Production Example 1 to obtain plasmid pSFBPLDl (FIG. 14).
  • the nucleotide sequence of the inserted DNA was analyzed using the primer walking method under the conditions described in Production Example 1. As a result, it was found that L from Bacillus sphaericus described in the DDBJ / EMBL / GenBank database. It completely matched the nucleotide sequence (Accession No. AB103119) of the mouthful isine dehydrogenase gene. Thus, it was confirmed that the L-leucine dehydrogenase gene derived from the Bacillus sphaericus IFO 3525 strain was incorporated into the plasmid pSFBPLDl.
  • a cell-free extract was prepared using plasmid pSFB PLD 1 according to the above enzyme activity measurement method, except that the cells were cultured overnight at 24 ° C. L-leucine acid activity and formate activity The specific activities were 5.76 UZmg protein and 0.54 UZmg protein, respectively.
  • Thermoactinomyces intermedius IFC 14230 (Thermoactinomyces interm edius IFO 14230) strain in M-64 medium (1% peptone, 0.25% yeast extract, 0.2% meat extract, 0.2% glycerol, 2% sodium chloride, 0.2% potassium dihydrogen phosphate, 0.2% potassium dihydrogen phosphate, 0.01% magnesium sulfate heptahydrate, trace amount of piotin (20mgZl00mL in 1L of medium) 2 and cultured at 55 ° C. using pH 7.2) to prepare bacterial cells Chromosomal DNA was purified from the bacterial cells according to the method described in Methods Enzymo L, 152, 116 (1987).
  • Sense primer TIP-A TGI SEQ ID NO: 28
  • antisense primer TIP-TAA1 SEQ ID NO: 29
  • the band was excised, precipitated with phenol and chloroform, and ethanol precipitated to recover the DNA fragment, then double digested with restriction enzymes EcoRI and HindIII, treated with phenol-chloroform, and subjected to agarose gel electrophoresis.
  • the desired band portion was cut out and purified by Sephaglas Band Prep Kit (manufactured by Falmasia) to obtain the desired DNA fragment.
  • PSE420U prepared in Production Example 1 was double digested with restriction enzymes EcoR I and Hind III, and the target DNA fragment was ligated using T4 DNA ligase (Takara Bio). Escherichia coli JM109 was transformed with the obtained plasmid, and purified by the same method as in Production Example 1 to obtain plasmid pSU-TIP2 (FIG. 15). [0202] The purified plasmid pSU-TIP2 was analyzed for the nucleotide sequence of the inserted DNA under the conditions described in Production Example 1 using the primer walking method, and described in J. Biochem., 109, 371 (1991).
  • the ORF start position was As the first position, a base substitution including two amino acid substitutions of 431AG ⁇ GC (Lysl44 ⁇ Ser) and 846T ⁇ G (Cys282 ⁇ Trp) was observed.
  • Plasmid pSE-MF26 obtained in Production Example 4 was double digested with restriction enzymes Nco I and EcoR I, treated with phenol-chloroform, and then subjected to agarose gel electrophoresis, and the target band was excised. Purification by Prep Kit (manufactured by Falmasia) gave the target DNA fragment. Plasmid pSU-TIP2 was double-digested with restriction enzymes Nco I and EcoR I, and the target DNA fragment was ligated using T4 DNA ligase (Takara Bio).
  • Escherichia coli JM109 strain was transformed with the obtained plasmid and purified in the same manner as in Production Example 1 to obtain L-ferulalanin dehydrogenation from Thermoactinomyces intermedius IFO 14230 (Thermoactinomyces intermedius IF O 14230) strain.
  • Plasmid pS F-TIP2 (FIG. 16) incorporating the enzyme and the formate dehydrogenase gene derived from Mycobacterium vaccae was obtained.
  • a cell-free extract was prepared using plasmid pSF-TIP2 according to the above-described method for measuring enzyme activity except that the cells were cultured overnight at 24 ° C, and L-phenylalanic acid activity and formic acid activity were determined. The specific activity was measured to be 9.56 UZmg protein and 0.76 U / mg protein, respectively.
  • PSE420D Japanese Patent Laid-Open No. 2000-189170
  • restriction enzymes Nco I and Xba I restriction enzymes Nco I and Xba I
  • the target DNA fragment was ligated using T 4 DNA ligase (Takara Bio).
  • Escherichia coli JM109 was transformed with the obtained plasmid and purified by the same method as in Production Example 1 to obtain plasmid pSE-ECBl (FIG. 17).
  • the purified plasmid pSFBPAD1 was analyzed for the nucleotide sequence of the inserted DNA using the primer walking method under the conditions described in Production Example 1, and as a result, J. Biochem., 97, 993 (1988)
  • the nucleotide sequence (Accession No. X02413) of the branched-chain amino acid aminotransferase gene derived from Escherichia coli K-12 was completely identical. Thus, it was confirmed that the branched-chain amino acid aminotransferase gene derived from Escherichia coli K-12 was incorporated into the plasmid pSE-ECB1.
  • a cell-free extract was prepared using plasmid pSE-ECB 1 according to the above enzyme activity measurement method, except that it was cultured overnight at 24 ° C. When the transferase activity was measured, the specific activity was 1.44 U / mg protein.
  • Plasmid pSE-BSBl containing a branched-chain amino acid aminotransferase gene A Bacillus subtilis DB 104 strain was cultured in LB medium to prepare cells. According to the method described in Nucleic Acids Res., 8, 4321 (1980) Chromosomal DNA was isolated and purified.
  • SEQ ID NO: 32 TGATCATGACTAAACAAACAATTCGCGTTGA
  • SEQ ID NO: 33 GCTTCTAGATTATTTACTTTCAGTCAGCGCTGCGA
  • the chromosomal DNA derived from the Bacillus subtilis DB 104 strain was used as a cage, and PCR was performed according to the method described in Production Example 1 using the sense primer BsBCA-Al and the antisense primer BsBCA-Tl.
  • PCR was performed according to the method described in Production Example 1 using the sense primer BsBCA-Al and the antisense primer BsBCA-Tl.
  • This band was cut out, purified with GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (manufactured by Falmasia), double digested with restriction enzymes BspH I and Xba I, treated with phenol-chloroform, and subjected to agarose gel electrophoresis.
  • the target band was excised and purified by Sephaglas Band Prep Kit (manufactured by Fanolemacia) to obtain the target DNA fragment.
  • PSE420D Japanese Patent Laid-Open No. 2000-189170
  • restriction enzymes Nco I and Xba I and ligated with the target DNA fragment using T 4 DNA ligase (Takara Bio).
  • Escherichia coli JM1 09 strain was transformed.
  • Escherichia coli JM109 was transformed with the obtained plasmid and purified in the same manner as in Production Example 1 to obtain plasmid pSE-BSBl (FIG. 18).
  • the nucleotide sequence of the inserted DNA was analyzed using the primer walking method under the conditions described in Production Example 1, and Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) described in J. BacterioL, 179, 496 (1997).
  • Bacillus subtilis Bacillus subtilis
  • the ORF start position is number 1 and includes one amino acid substitution of 177A ⁇ G and 178A ⁇ G (Thr60 ⁇ Ala) 2 Two base substitutions were observed.
  • the branched-chain amino acid aminotransferase gene derived from plasmid pSE-BSB1 and Bacillus subtilis was incorporated.
  • E. coli strain HB101 was transformed with the plasmid pSUCBDOl obtained in Production Example 1, and the resulting transformant was transformed into 2 XYT medium (2% pacttryptone, 1% bacto yeast extract, 1% sodium chloride sodium, PH 7.2. ) At 33 ° C overnight.
  • the medium was supplemented with 0. ImM IPTG to induce the expression of the D amino acid oxidase gene, and the cells were collected to obtain Escherichia coli expressing D-amino acid oxidase.
  • Production Example 14 the same procedure as in Production Example 14 was carried out except that pSUTVDO 1 obtained in Production Example 2 was used instead of pSUCBDOl obtained in Production Example 1 as a plasmid, and D-amino acid oxidase was used. E. coli to be expressed was prepared. Using the obtained Escherichia coli, the reaction was carried out in the same manner as in Production Example 14, and optical purity analysis and quantification of norpaline contained in the reaction solution were performed. The results are shown in Table 1.
  • E. coli BL21 (DE3) pLysS strain was transformed with the plasmid pETECDDl obtained in Production Example 3, and the resulting transformant was transformed into 2 XYT medium (2% noctotryptone, 1% notato yeast extract, 1% sodium chloride, pH 7 2) was used to culture overnight at 33 ° C. After 0. ImM IPT G was added to the medium to induce the expression of the D amino acid dehydrogenase gene, the cells were collected to obtain Escherichia coli expressing the D amino acid dehydrogenase.
  • Plasmid pSF-GSA2 obtained in Production Example 5 was used to transform E. coli HB101, and the resulting transformant was transformed into 2 XYT medium (Production Example 14 And cultured at 33 ° C overnight. After adding 0.1 ImM IPTG to the medium to induce the expression of the L-alanine dehydrogenase gene, the cells were collected to obtain Escherichia coli co-expressing L-alanine dehydrogenase and formate dehydrogenase.
  • Production Example 17 the same procedure as in Production Example 17 was used, except that pSF-BTAl obtained in Production Example 6 was used instead of pSF-GSA2 obtained in Production Example 5 as a plasmid. E. coli co-expressing dehydrogenase and formate dehydrogenase was prepared. Using the obtained Escherichia coli, the reaction was performed in the same manner as in Production Example 17, and optical purity analysis and quantification of norpaline contained in the reaction solution were performed. The results are shown in Table 2.
  • Production Example 17 the same procedure as in Production Example 17 was used, except that pSFBPAD 1 obtained in Production Example 7 was used instead of pSF-GSA2 obtained in Production Example 5 as a plasmid. Escherichia coli co-expressing elementary enzyme and formate dehydrogenase was prepared. The resulting E. coli The reaction was performed in the same manner as in Production Example 17, and optical purity analysis and quantification of norpaline contained in the reaction solution were performed. The results are shown in Table 2.
  • Production Example 17 the same procedure as in Production Example 17 was performed, except that pSF-SADl obtained in Production Example 8 was used instead of pSF-GSA2 obtained in Production Example 5 as a plasmid. And E. coli co-expressing formate dehydrogenase were prepared. Using the obtained Escherichia coli, the reaction was performed in the same manner as in Production Example 17, and optical purity analysis and quantification of norpaline contained in the reaction solution were performed. The results are shown in Table 2.
  • Production Example 17 the same procedure as in Production Example 17 was performed, except that pFGSLEDl obtained in Production Example 9 was used instead of pSF-GSA2 obtained in Production Example 5 as a plasmid.L leucine dehydrogenase and formate E. coli co-expressing dehydrogenase was prepared. Using the obtained Escherichia coli, the reaction was performed in the same manner as in Production Example 17, and optical purity analysis and quantification of norpaline contained in the reaction solution were performed. The results are shown in Table 2.
  • Production Example 17 p-SFBPLD 1 obtained in Production Example 10 was used instead of pSF-GSA2 obtained in Production Example 5 as a plasmid, and the same procedure as in Production Example 17 was performed, except that L-leucine dehydrogenation was performed. E. coli co-expressing enzyme and formate dehydrogenase was prepared. Using the obtained Escherichia coli, the reaction was performed in the same manner as in Production Example 17, and optical purity analysis and quantification of norpaline contained in the reaction solution were performed. The results are shown in Table 2.
  • Production Example 17 the same procedure as in Production Example 17 was used, except that PSF-TIP2 obtained in Production Example 11 was used instead of pSF-GSA2 obtained in Production Example 5 as a plasmid. Escherichia coli co-expressing elementary enzyme and formate dehydrogenase was prepared. Using the obtained Escherichia coli, the reaction was performed in the same manner as in Production Example 17, and optical purity analysis and quantification of norpaline contained in the reaction solution were performed. The results are shown in Table 2.
  • Production of L-oxopentanoic acid L-norparin (using L-amino acid aminotransferase)
  • Production Example 17 the same procedure as in Production Example 17 was performed, except that pSE-ECBl obtained in Production Example 12 was used instead of pSF-GSA2 obtained in Production Example 5 as a plasmid. E. coli expressing the aminotransferase was prepared.
  • E. coli expressing the branched chain amino acid aminotransferase prepared in Production Example 24 was used in the following reaction.
  • the reaction was carried out in the same manner as in Production Example 24 except that L-aspartic acid was used in place of sodium L-glutamate as the amino group donor, and the optical properties of norpaline contained in the reaction solution were used. Purity analysis and quantification were performed. The results are shown in Table 3.
  • Production Example 17 the same procedure as in Production Example 17 was carried out except that pSE-BSBl obtained in Production Example 13 was used instead of pSF-GSA2 obtained in Production Example 5 as a plasmid. E. coli expressing a transferase was prepared. Using the obtained Escherichia coli, the reaction was carried out in the same manner as in Production Example 24, and optical purity analysis and quantification of norpaline contained in the reaction solution were performed. The results are shown in Table 3.
  • E. coli expressing the branched chain amino acid aminotransferase prepared in Production Example 26 was used in the following reaction.
  • the reaction was carried out in the same manner as in Production Example 26 except that L-aspartic acid was used in place of sodium L-glutamate as the amino group donor, and the optical properties of norpaline contained in the reaction solution were used. Purity analysis and quantification were performed. The results are shown in the table Shown in 3.
  • the Escherichia coli HB101 strain was transformed with the plasmid pSUCBDOl obtained in Production Example 1, and the obtained transformant was cultured at 33 ° C. overnight using 50 ml of 2 XYT medium (as in Production Example 14). After 0. ImM IPTG was added to the medium to induce gene expression, the cells were collected to obtain Escherichia coli expressing D amino acid oxidase.
  • the Escherichia coli HB101 strain was transformed with the plasmid PSF-TIP2 obtained in Production Example 11, and the obtained transformant was cultured at 33 ° C. overnight using 50 ml of 2 XYT medium (as in Production Example 14). After 0. ImM IPTG was added to the medium to induce gene expression, the cells were collected to obtain Escherichia coli that co-expressed L-furalanine dehydrogenase and formate dehydrogenase. Add 5g each of the above two cultures to the reaction mixture containing 4wt% DL norparin, 0.20M sodium formate, 0.75M ammonia buffer (pH8.0), and total weight 10g The mixture was shaken under aeration conditions and reacted at 30 ° C.
  • the reaction solution was the same as Production Example 28, except that a reaction solution containing 10% by weight DL norparin, 0.51M sodium formate, and 0.75M ammonia buffer (pH 8.0) was used.
  • the reaction was carried out by the method. Samples of 0.1 lg were collected from the reaction solution 20 hours after the start of the reaction and 45 hours later, and optical purity analysis and quantification of norpaline contained in the reaction solution were performed based on norpaline analysis condition 1 described later. . These results are shown in Table 4.
  • the Escherichia coli HB101 strain was transformed with the plasmid pSUCBDOl obtained in Production Example 1, and the obtained transformant was cultured at 33 ° C. overnight using 50 ml of 2 XYT medium (as in Production Example 14). After 0. ImM IPTG was added to the medium to induce gene expression, the cells were collected to obtain Escherichia coli expressing D amino acid oxidase.
  • the Escherichia coli HB101 strain was transformed with the plasmid pSF-GSA2 obtained in Production Example 5, and the resulting transformant was cultured overnight at 33 ° C using 50 ml of 2 XYT medium (as in Production Example 14). After 0. ImM IPTG was added to the culture medium to induce gene expression, the cells were collected to obtain Escherichia coli co-expressing L-alanin dehydrogenase and formate dehydrogenase.
  • the reaction solution was the same as Production Example 30 except that a reaction solution containing 10% by weight DL norparin, 0.51M sodium formate, and 0.75M ammonia buffer (pH 8.0) was used.
  • the reaction was carried out by the method. Samples of 0.1 lg were collected from the reaction solution 20 hours after the start of the reaction and 45 hours later, and optical purity analysis and quantification of norpaline contained in the reaction solution were performed based on norpaline analysis condition 1 described later. . These results are shown in Table 4.
  • Plasmid PSE420U obtained in Production Example 1 was double-digested with Spel, and synthetic DNA (SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36) was annealed at the same site, followed by ligation to construct plasmid pSE420Q.
  • SEQ ID NO: 35 CTAGTAGAGGTACCTATATATGCATGTGCACGC
  • SEQ ID NO: 36 TTAAGCGTGCACATGCATATATAGGTACCTCTA
  • SEQ ID NO: 37 gacggtacctatacATGTCTCAACATAACGAAAAGAACCCACA
  • SEQ ID NO: 38 tcgaagcttaagaTTATGCAGGAATTTTGTCAATCTTAGGAATGC
  • the obtained DNA fragment was double digested with restriction enzymes Kpnl and Hindlll and ligated with pSE420 Q obtained in Production Example 32, which was double digested with the same restriction enzymes, to construct pSQECKEl.
  • the catalase EckatE derived from Escherichia coli contained in the plasmid pSQECKEl has higher catalase activity and stability than the catalase EckatG derived from Escherichia coli contained in the plasmid pSQECKGl obtained in Production Example 34. Since the above characteristics are consistent with the object of the present invention, the plasmid pSQECKEl expressing EckatE was used in the subsequent experiments.
  • SEQ ID NO: 40 gacggtaccatatcATGAGTACTTCAGACGATATCCATAACAC
  • SEQ ID NO: 41 gacaagcttaagaTTAAAGCAGATCAAAACGGTCGAGG
  • Chromosomal DNA generated from the Escherichia coli Kl 2 (Escherichia coli K12) strain is PCR was performed in the same manner as described in Production Example 1 using the sense primer EckatG-Al (SEQ ID NO: 40) and the antisense primer EckatG-T1 (SEQ ID NO: 41).
  • a DNA fragment consisting of the base sequence was amplified.
  • the obtained DNA fragment was double digested with restriction enzymes Kpnl and Hindlll and ligated with pSE420 Q obtained in Production Example 32, which was double digested with the same restriction enzymes, to construct pSQECKGl.
  • Thermo-actinomyces intermedius I FO 14230 (Thermoactinomyces intermedius IFO 14230) strain described in J. Biochem., 109, 371 (1991)
  • Sense primer TIP-A TG4 (SEQ ID NO: 43)
  • antisense primer TIP-TAA4 (SEQ ID NO: 44) were synthesized based on the base sequence (Accession No. D00631) of the luranin dehydrase enzyme gene.
  • SEQ ID NO: 44 gtcaggtacctcTTAACGACGTGCACTATTACGG
  • PCR was carried out in the same manner as described in Production Example 1 using the phenylalanine dehydrogenase expression plasmid PSU-TIP2 obtained in Production Example 11 as a cage and using sense primer TIP-ATG4 and antisense primer TIP-TAA4. The DNA fragment was amplified.
  • the obtained DNA fragment was double digested with restriction enzymes Kbal and Kpnl, and double digested with the same restriction enzymes and ligated with pSQECKEl obtained in Production Example 33, and Thermoactinomyces intermedius IFO 1 4230 (Thermoactinomyces A plasmid PSQTIP4 was obtained in which L-ferulanin dehydrogenase derived from intermedius IFO 14230) and a catalase gene katE derived from Escherichia coli K12 were incorporated.
  • An antisense primer CbDAO-T2 (SEQ ID NO: 34) of the D-amino acid oxidase gene derived from Candida 'Body-DSM 70026 strain was synthesized.
  • a plasmid pSUCBDOl obtained in Production Example 11 was used as a cage, and the production was performed using the sense primer CbDAO-Al (SEQ ID NO: 3) and the antisense primer CbDAO-T1 (SEQ ID NO: 4) used in Production Example 11.
  • PCR was performed according to the method described in 11. As a result of analyzing a part of the PCR reaction solution by agarose gel electrophoresis, a specific band of about 1. lkbp was detected.
  • This band was excised, purified with GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (manufactured by Falmasia), double digested with restriction enzymes Nde I and Pac I, treated with phenol-chloroform, and subjected to agarose gel electrophoresis.
  • the target band was excised and purified with Sepha glas Band Prep Kit (Falmacia) to obtain the target DNA fragment.
  • the plasmid PSF-TIP2 obtained in Production Example 11 is double-digested with restriction enzymes Nde I and Pac I, treated with phosphatase, then with phenol-chloroform, and then used with T4 DNA ligase (manufactured by Takara Bio). DNA fragments were ligated. Escherichia coli JM109 was transformed with the obtained plasmid and purified in the same manner as in Production Example 1 to obtain plasmid pSFTPCOl (Fig. 19).
  • D-amino acid oxidase derived from Candida boidii obtained by PCR in Production Example 1 The DNA fragment containing the gene and the plasmid pSF-GSA2 obtained in Production Example 5 were double digested with restriction enzymes Nde I and Pac I, respectively, treated with phosphatase and then with phenol-chloroform. Ligation was performed using DNA ligase (manufactured by Takara Bio Inc.), and Escherichia coli JM109 strain was transformed.
  • the transformant into which the target DNA fragment is inserted is cultured in a liquid LB medium containing ampicillin, and the plasmid is purified using the FlexiPrep Kit (manufactured by Falmasia), and the D-amino acid oxidase derived from Candida boise- A three-gene-containing plasmid pSFGACOl (FIG. 20) was obtained which co-expressed the genes for Gyabacillus 'stear mouth thermophilus-derived alanine dehydrogenase and Mycobacterium' pacca-derived formate dehydrogenase.
  • the purified plasmid pSFGACOl the base sequence of the inserted DNA was confirmed by the primer walking method.
  • a cell-free extract was prepared using plasmid pSFG AC01 according to the above enzyme activity measurement method, except that the cells were cultured overnight at 26 ° C, and each enzyme activity was measured.
  • D-alanin oxidation activity was 2.42U / mg-protein
  • L-alaninic acid activity was 2.63UZmg-protein
  • formate oxidation activity was 0.79UZmg-protein.
  • Escherichia coli HB101 was transformed with the 3 gene-containing plasmid pSFTPCOl constructed in Example 1, and the obtained transformant was cultured overnight at 33 ° C using 50 ml of 2 XYT medium (as in Production Example 14). After 0. ImM IPTG was added to the medium to induce gene expression, the cells were collected to obtain E. coli expressing 3 genes.
  • Example 4 is the same as Example 3 except that a reaction solution containing 10% by weight DL-norparin, 0.51M sodium formate, and 0.43M ammonia buffer (pH 8.0) was used as the reaction solution. The reaction was carried out in the same manner. After 20 hours and 45 hours after the start of the reaction, 0.1 lg of each sample was taken from the reaction solution, and optical purity analysis and quantification of norpaline contained in the reaction solution were conducted based on norparin analysis condition 1 described later. These results are shown in Table 5.
  • Example 3 except that a reaction solution containing 12% by weight DL-norparin, 0.61M sodium formate, and 0.51M ammonia buffer (pH 8.0) was used as the reaction solution, Example 3 and Example 3 were used. The reaction was carried out in the same manner. After 20 hours and 45 hours after the start of the reaction, 0.1 lg of each sample was taken from the reaction solution, and optical purity analysis and quantification of norpaline contained in the reaction solution were conducted based on norparin analysis condition 1 described later. These results are shown in Table 5.
  • Example 3 the reaction was carried out in the same manner as in Example 3 except that the 3 gene-containing plasmid pSFGACOl constructed in Example 2 was used instead of pSFTPCOl as the 3 gene-containing plasmid. After 20 hours and 45 hours after the start of the reaction, 0.1 lg of reaction solution was sampled, and optical purity analysis and quantification of norpaline contained in the reaction solution were conducted based on norparin analysis condition 1 described later. These results are shown in Table 5.
  • Example 6 is the same as Example 6 except that a reaction solution containing 10 wt% DL-norparin, 0.51M sodium formate, and 0.21M ammonia buffer (pH 8.0) was used as the reaction solution. The reaction was carried out in the same manner. After 20 hours and 45 hours after the start of the reaction, 0.1 lg of each sample was taken from the reaction solution, and optical purity analysis and quantification of norpaline contained in the reaction solution were conducted based on norparin analysis condition 1 described later. These results are shown in Table 5.
  • Example 6 the reaction solution was 12 wt% DL-norparin, 0.61 M sodium formate. The reaction was carried out in the same manner as in Example 6 except that a reaction solution containing lithium and 0.26M ammonia buffer (pH 8.0) was used. After 20 hours and 45 hours after the start of the reaction, 0.1 lg of each sample was taken from the reaction solution, and optical purity analysis and quantification of norpaline contained in the reaction solution were conducted based on norparin analysis condition 1 described later. These results are shown in Table 5.
  • Escherichia coli HB101 strain was transformed with the three-gene expression plasmid pSFTPCOl constructed in Example 1, and the obtained transformant was cultured at 33 ° C. overnight using 400 ml of 2 XYT medium (as in Production Example 14). After 0. ImM IPTG was added to the medium to induce gene expression, the cells were collected to obtain E. coli expressing 3 genes.
  • a part of the reaction solution obtained in Example 9 was purified by the following method.
  • Example 11 A part of the reaction solution obtained in Example 9 was purified by the following method.
  • the three-gene expression plasmid pSFTPOl obtained in Example 1 was double-digested with restriction enzymes Ndel and Xbal to prepare a DNA fragment containing D-alanine oxidase and formate dehydrogenase genes.
  • the two-gene expression plasmid pSQTIP4 obtained in Production Example 35 was double-digested with the same restriction enzyme and the DNA fragment containing the D-alanic acid enzyme and formate dehydrogenase gene was ligated to give Candida (Bandida- D-alanine oxidase from boidinii), formate dehydrogenase from Mycobacterium vaccae, Thermoferinomyces intermedius IFO 14230, L-ferulanine dehydrogenase from Escherichia coli K12 A plasmid pSFCPCO 1 was obtained which co-expressed 4 genes consisting of the catalase gene katE derived from the strain (Escherichia coli Kl 2).
  • a cell-free extract was prepared according to the method described in “Measurement of enzyme activity” above, and the activity was measured according to the method according to each enzyme. As a result, D-alanine was obtained. Acid enzyme activity is 2. 40 UZmg-protein, formate dehydrase enzyme activity is 0.663 UZmg-protein, L-phenylalanine dehydrogenase activity is 5. 30 UZmg protein, catalase activity is 399 UZmg protein It was confirmed that these enzymes were also expressed with sufficient activity.
  • E. coli HB101 strain was transformed with the 3 gene-containing plasmid pSFTPCO 1 constructed in Example 12, and the obtained transformant was used overnight at 33 ° C using 2 X YT medium (as in Production Example 14). Cultured. After 0. ImM IPTG was added to the medium to induce gene expression, the cells were collected to obtain E. coli expressing 3 genes.
  • Example 13 the reaction was carried out in the same manner as in Example 13 except that the 4-gene-containing plasmid pSFCPCOl obtained in Example 12 was used instead of the 3-gene-containing plasmid pSFTPCO 1, and the optical purity of norpaline was determined. As a result of analysis and quantification, the optical purity of L-norparin was 100% ee, and the yield was 76.6%.
  • Escherichia coli HB101 was transformed with the 4-gene-containing plasmid pSFCPCOl obtained in Example 12, and the obtained transformant was cultured overnight at 33 ° C using 2 XYT medium (similar to Production Example 14). . After 0. ImM IPTG was added to the medium to induce gene expression, the cells were collected to obtain E. coli expressing 4 genes.
  • Bacteria prepared from 132 g of culture broth were mixed with 8 wt% DL norparin, 0.6 equivalents of ammonium formate, 0.02% adenolol (antifoaming agent; manufactured by Asahi Denki Kogyo Co., Ltd.) ), And 400 ml of the reaction solution adjusted to pH 8.0 with sulfuric acid is placed in a 1-liter mini jar.
  • the air flow rate is 0.5 vvm
  • the stirring speed is 500 rpm
  • 30 ° C A time response was made.
  • Example 15 A method of adjusting pH in the acidification step with formic acid and adding ammonium formate to the reduction step In Example 15, except for using formic acid instead of sulfuric acid when adjusting the pH of the reaction solution in the oxidation step
  • the acid-oxidation step and the reduction step were performed.
  • the optical purity of L-norparin was 100% ee, and the yield was 92.8%.
  • a ketovaleric acid was not detected.
  • Example 17 Adjust the pH of the acid process with formic acid, and add ammonium formate to the reduction process! /,Method
  • Example 15 the same method as in Example 15 except that when adjusting the pH of the reaction solution in the oxidation step, formic acid was used instead of sulfuric acid and ammonium formate was not added in the reduction step. As a result, the optical purity of L-norparin was 100% ee, and the yield was 93.3%.
  • Escherichia coli HB101 was transformed with the 4-gene-containing plasmid pSFCPCOl obtained in Example 12, and the obtained transformant was cultured overnight at 33 ° C using 2 XYT medium (similar to Production Example 14). . After 0. ImM IPTG was added to the medium to induce gene expression, the cells were collected to obtain E. coli expressing 4 genes.
  • the time required to complete the acidification process for each condition was 28 hours or more, 28 hours, 24 hours, and 28 hours, respectively.
  • Table 6 shows the results of optical purity analysis of norpaline contained in the reaction solution based on norparin analysis condition 1 described later. From these results, in the acidification step, if the formic acid ammonium was not added at the start of the reaction, the optical purity remained at 49.3% ee even if the reaction was performed for more than 28 hours, The optical purity was 99% ee or higher when ammonium formate was added in an amount equal to or more than 0.2 equivalent to DL norpaline, but the reaction progressed very slowly. When the amount of ammonium formate added was 0.2 equivalent or more, the optical purity of L-norparin was strong enough to show no significant difference.
  • Example 18 (Your plan: Additional Example 13, Previous Reference Example 3)
  • Escherichia coli HB101 was transformed with the 4-gene-containing plasmid pSFCPCOl obtained in Example 12, and the obtained transformant was cultured overnight at 33 ° C using 2 XYT medium (similar to Production Example 14). . After 0. ImM IPTG was added to the medium to induce gene expression, the cells were collected to obtain E. coli expressing 4 genes.
  • Bacteria prepared from 132 g of culture broth were mixed with 8 wt% DL norparin, 0.6 equivalents of ammonium formate, 0.02% adenolol (antifoaming agent; manufactured by Asahi Denki Kogyo Co., Ltd.) ), And 400 ml of the reaction solution adjusted to pH 8.0 with sulfuric acid is placed in a 1-liter mini jar.
  • the air flow rate is 0.5 vvm
  • the stirring speed is 500 rpm
  • 30 ° C A time response was made.
  • the aeration of the oxygen-containing gas is stopped, the stirring speed is 300 rpm, and the temperature is 30.
  • formic acid was used to adjust the ⁇ of the reaction solution to 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, and the reaction was performed for 62 hours. . Collect 0.1 lg from the reaction mixture after the reaction is complete.
  • the optical purity of norparin contained in the reaction solution was analyzed and quantified based on the analysis condition 1 of norpaline to be analyzed. As a result, the optical purity of L-norparin was 100% ee and the yield was 86.6%.
  • the supernatant obtained by adding 0.1M hydrochloric acid to 0. lg of norpaline-containing reaction solution, suspending, and centrifuging was diluted with a 50% aqueous solution of acetonitrile containing 0.4% triethylamine. Mix 100 L of this diluted solution with 0.2% 2, 3, 4, 6-tetra-O-acetyl- ⁇ -D-glucopyranosyl isothiocyanate (GITC) at 40 ° C for 90 minutes. Reacted.
  • the obtained reaction solution was analyzed by high performance liquid chromatography under the following conditions.
  • GITC-modified L-norparin was detected at a retention time of 8.8 minutes, and GITC-conjugated D-norpaline was detected at 11.8 minutes.
  • L-norparin has a retention time of 2.5 minutes and D-norparin has a retention time of 3.3. Detected in minutes.
  • the supernatant obtained by adding 0.1 M hydrochloric acid to the reaction sample sample (0.1 lg) at the time of preparation of the reaction solution, suspending, and centrifuging was analyzed under the following conditions.
  • the method for producing an L amino acid of the present invention is useful as a method for efficiently producing an L amino acid in the same system using an enzymatic reaction. According to this method, an L amino acid having a high optical yield can be obtained from an inexpensive amino acid enantiomeric mixture.
  • the method for expressing hydrogen peroxide hydrolyzing enzyme in the same host is an intermediate production method using mild reaction conditions. Since the decomposition of keto acid in the product can be avoided, the productivity of L-amino acid can be improved.

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Abstract

　本発明のＬ－アミノ酸の製造方法は、アミノ酸の鏡像異性体混合物からＬ－アミノ酸を酵素的に生成するＬ－アミノ酸の製造方法であって、Ｄ－アミノ酸をケト酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、ケト酸をＬ－アミノ酸に変換する酵素をコードする塩基配列とが同一又は異なる発現ベクターに組み込まれた一又は複数の組換えベクターを同一宿主に導入して形成される形質転換体又はその処理物を、アミノ酸鏡像異性体混合物と接触させる工程を含むことを特徴とする。本発明のＬ－アミノ酸の製造方法によれば、Ｄ－アミノ酸をケト酸に変換する反応とケト酸をＬ－アミノ酸に変換する反応を一工程で行うことができ、且つ高い蓄積濃度でＬ－アミノ酸に変換可能な形質転換体、及び前記形質転換体を用いて安価な原料から効率よくＬ－アミノ酸を生成することができる。

Description

明 細 書
L一アミノ酸の製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、アミノ酸の鏡像異性体混合物を原料とし、 D—アミノ酸をケト酸に変換す る酵素と、ケト酸を L アミノ酸に変換する酵素を発現する形質転換体を用いて L アミノ酸を製造する方法に関する。
背景技術
[0002] 近年、医薬品、農薬、食品、飼料、香料などの分野で光学活性体を合成する重要 性が増大している。これは、対掌体間で生理活性が異なる場合があるためであり、純 粋な光学活性体を 、かにして入手するかは産業上重要な課題になって 、る。中でも 、 L アミノ酸、特に天然型のものは入手容易なキラルシントンとして積極的に誘導体 合成が研究されてきた。更に、非天然型の構造を有するものについても利用展開が 行われ、純粋な光学活性体を入手する重要性は益々高まっている。
[0003] 従来、非天然型の L アミノ酸の合成法として次のような方法が知られていた。
(1)ァシルイ匕したラセミ体を原料とし、 L -アミノアシラーゼにより L アミノ酸を生成す る方法（Method EnzymoL, 3, 554, (1957))
(2)ヒダントインを L ヒダントイナーゼによって開環した後にし 力ルバモイラーゼな どによって力ルバモイル基を脱離させ、 L アミノ酸を生成する方法 (Agric. Biol. Che m.， 51, 729 (1087))
(3)アミド化したラセミ体を原料とし、アミダーゼにより L アミノ酸を生成する方法 (Me thod EnzymoL, 3, 554, (1957))
(4)ラセミ体を原料とし、 D体を選択的に分解して L アミノ酸を残存させる方法 (Biot echnol. Bioeng., 14, 1288 (1994))
(5)ケト酸の還元的ァミノ化により L アミノ酸を合成する方法 (特開平 10— 23896 号公報）
[0004] しかし、上記いずれの方法も工業的に実施するには満足できるものではなぐ例え ば、前記方法 (5)は、原料に用いられるケト酸が一般的に高価であり工業用原料とし て不適当であるという問題がある。 L アミノ酸を製造する際に、アミノ酸の構造によつ ては、原料としてケト酸ではなくラセミアミノ酸を用いた方が安価となる場合がある。一 方、ラセミ体を原料として単に光学分割する製法では、 L アミノ酸の理論収率は 50 %を越えることはない。収率向上にはラセミ化が別途必要となる力 光学分割のみで は不要な D体が廃棄物となり、理論収率を 100%に近づけることは困難である。
[0005] 不要な D体をリサイクルして収率を向上させる方法として、 D体を立体反転させるェ 程を設けたり、酵素活性を利用して不要な D体をケト酸に変換する工程とケト酸をアミ ノ化して L—アミノ酸に変換する工程とを組み合わせる方法が試みられている。例え ば、ラセミ体を原料とし、全量を L アミノ酸とする方法として次のような例が報告され ている。
(6)ラセミアミノ酸を原料とし、酵母細胞又は D アミノ酸酸化酵素とカタラーゼの作 用により D体をケト酸に変換し、次いで L アミノ酸脱水素酵素とグルコース脱水素酵 素の作用によりケト酸を L体に変換する酵素的合成法（Biomolecular Engineering, 17,
167 (2001)) o
(7)ラセミアミノ酸を原料とし、 D アミノ酸酸ィ匕酵素の作用により D体を酸ィ匕して中間 体としてイミンを生成させ、次 、でヒドリド還元剤の利用又は金属触媒を用いた接触 水素化によりイミンを還元してラセミアミノ酸を再生させる（ラセミ化）工程を繰り返して L体を得ることを特徴とする酵素的手法と化学的手法を併用した合成法 (Chem. Com m" 246 (2002)) o
[0006] しかし、前記（6)の方法は、微生物等を利用して各工程に用いる少なくとも 2種の酵 素を多量発現させ、回収、精製するか、又は酵素の市販品を別途購入するなどして 精製酵素を準備する必要があるため経済的に不利であり、複数の酵素を添加するた め反応液の調製方法が煩雑となるなどの問題があった。また、前記（7)の方法では、 還元反応に有害な金属触媒が利用されること、加圧条件が必要であること、生成物 の蓄積濃度が低いことなどの問題があった。
[0007] また、国際公開 WO2005— 090590号パンフレットには、 D アミノ酸酸化酵素、 L アミノ酸脱水素酵素、補基質 NADH再生酵素および場合によりカタラーゼの濃度 または活性が高められて ヽる組換え微生物、及びそれを利用したし -アミノ酸類を製 造する方法が開示されている。実施例には、ァルスロパクター 'プロトフオルミエ由来 又はトリゴノプシス'バリアビリス由来の D アミノ酸酸ィ匕酵素、バチルス'セレウス由来 のロイシン脱水素酵素、及び補基質 NADH再生酵素のうち 1又は 2種類の酵素を発 現する 2つの組換えベクターが導入された形質転換体を用いる方法により、 Lーメチ ォニン又は L ロイシンを製造した例が記載されている。しかし、この方法では、基質 濃度が 25mM程度と極めて低いことから、工業ィ匕は困難であるという問題があった。 また、カタラーゼを併用した実施例はなぐカタラーゼを併用する効果が具体的に示 されていなかった。
[0008] 非特許文献 1： Method Enzymol., 3, 554, (1957)
非特許文献 2 :Agric. Biol. Chem., 51, 729 (1087)
非特許文献 3 : Biotechnol. Bioeng., 14, 1288 (1994)
非特許文献 4: Biomolecular Engineering, 17, 167 (2001)
非特許文献 5 : Chem. Comm., 246 (2002)
特許文献 1：特開平 10— 23896号公報
特許文献 2 :国際公開 WO2005— 090590号パンフレット
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0009] 本発明の目的は、 D アミノ酸をケト酸に変換する反応とケト酸を L アミノ酸に変 換する反応をワンポット（同一系内）で行うことができ、し力も高い蓄積濃度で L アミ ノ酸に変換可能な形質転換体、及び前記形質転換体を用いて安価な原料から効率 よく L アミノ酸を生成しうる L アミノ酸の製造方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、上記の特性に加えて、主反応を補う酵素活性を利用してよ り高い効率で L アミノ酸に変換可能な形質転換体、及び前記形質転換体を用いた L -アミノ酸の製造方法を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、高い基質濃度を用いた場合にも高収率で L アミノ酸 を得ることができる生産性に優れた L アミノ酸の製造方法、及び該方法に用いる形 質転換体を提供することにある。 課題を解決するための手段 [0010] 本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討した結果、 D体をケト酸に変換 する酵素と、ケト酸を L アミノ酸に変換する酵素を共に発現する形質転換体を利用 することにより、 2種の反応をワンポット（同一系内）で行うことができ、且つ安価な原料 を用いて L アミノ酸を高濃度で蓄積できることを見出し、本発明を完成した。
[0011] すなわち、アミノ酸の鏡像異性体混合物から L アミノ酸を酵素的に生成する L アミノ酸の製造方法であって、 D アミノ酸をケト酸に変換する酵素をコードする塩基 配列と、ケト酸を L アミノ酸に変換する酵素をコードする塩基配列とが同一又は異 なる発現ベクターに組み込まれた一又は複数の組換えベクターを同一宿主に導入し て形成される形質転換体又はその処理物を、アミノ酸鏡像異性体混合物と接触させ る工程を含むことを特徴とする L—アミノ酸の製造方法を提供する（以下、「本発明の L アミノ酸の製造方法 1」又は「方法 1」と称する場合がある)。
[0012] 本発明の方法 1において、前記形質転換体は、 D アミノ酸をケト酸に変換する酵 素をコードする塩基配列と、ケト酸を L アミノ酸に変換する酵素をコードする塩基配 列と、補酵素再生酵素をコードする塩基配列とを、同一又は異なる発現ベクターに組 み込んだ一又は複数の組換えベクターを、同一宿主に導入して形成される形質転換 体であってもよい。前記形質転換体は、また、 D—アミノ酸をケト酸に変換する酵素を コードする塩基配列と、ケト酸を L アミノ酸に変換する酵素をコードする塩基配列と 、過酸化水素分解酵素をコードする塩基配列とを、同一又は異なる発現ベクターに 組み込んだ一又は複数の組換えベクターを、同一宿主に導入して形成される形質転 換体であってもよい。
[0013] 本発明において、 D—アミノ酸をケト酸に変換する酵素は、 D—アミノ酸酸化酵素及 び Z又は D アミノ酸脱水素酵素であってもよ!/、。前記 D アミノ酸酸化酵素には、 例えばキャンディダ 'ボイディ- (Candida boidinii)、トリゴノプシス'バリアビリス（Trigon opsis variabilis)、及びシゾサッカロ^セス'ポンへ (Schizosaccharomyces pombeノ り 選択される少なくとも一つの微生物由来の D アミノ酸酸化酵素が含まれる。前記 D —アミノ酸脱水素酵素は、ェシエリヒア'コリ (Escherichia coli)由来の D アミノ酸脱水 素酵素であってもよい。前記ケト酸を L アミノ酸に変換する酵素は、 L アミノ酸脱 水素酵素及び Z又は L アミノ酸アミノ基転移酵素であってもよ!/、。前記 L アミノ酸 脱水素酵素には、サーモアクチノマイセス'インターメディウス（Thermoactinomyces in termedius)由来フエ-ルァラニン脱水素酵素、ジォバチルス 'ステアロサーモフィラス (Geobacillus stearothermophilus)由来ァラニン脱水素酵素、バチルス'サーモカテ- ユラタス（Bacillus thermocatenulatus)由来ァラニン脱水素酵素、ノ チルス'スフエリカ ス（Bacillus sphearicus)由来ァラニン脱水素酵素、シェワネラ'スピーシーズ（Shewane 11a species)由来ァラニン脱水素酵素、ジォバチルス 'ステアロサーモフィラス（Geobac illus stearothermophilus)由来ロイシン脱水素酵素、及びバチルス 'スフエリカス（Bacil lus sphaericus)由来ロイシン脱水素酵素が含まれる。
[0014] 本発明における補酵素再生酵素は、ギ酸脱水素酵素であってもよい。前記ギ酸脱 水素酵素には、マイコバクテリゥム 'パッカェ（Mycobacterium vaccae)由来ギ酸脱水 素酵素が含まれる。前記過酸ィ匕水素分解酵素はカタラーゼであってもよい。前記カタ ラーゼには、ェシエリヒア'コリ (Escherichia coli)由来のカタラーゼであってもよい。
[0015] 本発明の方法 1の好ましい態様として、例えば、 D アミノ酸をケト酸に変換する酵 素が D アミノ酸酸化酵素であり、ケト酸を L アミノ酸に変換する酵素が L アミノ酸 脱水素酵素であり、補酵素再生酵素がギ酸脱水素酵素であり、過酸化水素分解酵 素がカタラーゼである方法が挙げられ、より好ましくは、 D アミノ酸酸化酵素がキヤ ンデイダ ·ボイディ-由来であり、 L アミノ酸脱水素酵素がサーモアクチノマイセス · インターメディウス由来フエ-ルァラニン脱水素酵素であり、ギ酸脱水素酵素がマイコ ノ クテリゥム ·パッカェ由来であり、カタラーゼがェシエリヒア 'コリ由来である方法が挙 げられる。
[0016] 本発明における L アミノ酸としては、 L ノルパリン等が好ましく用いられる。
[0017] また、本発明は、 D—アミノ酸をケト酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、ケト 酸を L アミノ酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、補酵素再生酵素をコード する塩基配列と、過酸化水素分解酵素をコードする塩基配列とが同一又は異なる発 現ベクターに組み込まれた一又は複数の組換えベクターを、同一宿主に導入して形 成される形質転換体を提供する。
[0018] 本発明の形質転換体の好ましい態様として、例えば、 D—アミノ酸をケト酸に変換 する酵素が D アミノ酸酸ィ匕酵素であり、ケト酸を L アミノ酸に変換する酵素が L アミノ酸脱水素酵素であり、補酵素再生酵素がギ酸脱水素酵素であり、過酸化水素 分解酵素がカタラーゼである形質転換体が挙げられ、より好ましくは、 D—アミノ酸酸 化酵素がキャンディダ ·ボイディ-由来であり、 L アミノ酸脱水素酵素がサーモアク チノマイセス ·インターメディウス由来フエ-ルァラニン脱水素酵素であり、ギ酸脱水 素酵素がマイコバクテリゥム ·パッカェ由来であり、カタラーゼがェシエリヒア 'コリ由来 である形質転換体が挙げられる。
[0019] さらに、本発明は、 D アミノ酸をケト酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、ケ ト酸を L アミノ酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、補酵素再生酵素をコード する塩基配列と、過酸化水素分解酵素をコードする塩基配列とが同一の発現べクタ 一に組込まれた組換えベクターを提供する。
[0020] 本発明の組換えベクターの好ましい態様として、例えば、 D—アミノ酸をケト酸に変 換する酵素が D—アミノ酸酸ィ匕酵素であり、ケト酸を L—アミノ酸に変換する酵素が L アミノ酸脱水素酵素であり、補酵素再生酵素がギ酸脱水素酵素であり、過酸化水 素分解酵素がカタラーゼである組換えベクターが挙げられ、より好ましくは、 D—アミ ノ酸酸化酵素がキャンディダ ·ボイディ-由来であり、 L アミノ酸脱水素酵素がサー モアクチノマイセス ·インターメディウス由来フエ-ルァラニン脱水素酵素であり、ギ酸 脱水素酵素がマイコバクテリゥム ·パッカェ由来であり、カタラーゼがェシエリヒア ·コリ 由来である組換えベクターが挙げられる。
[0021] 本発明は、また、アミノ酸の鏡像異性体混合物から L アミノ酸を酵素的に生成す る L アミノ酸の製造方法であって、少なくとも D アミノ酸をケト酸に酸化する酵素及 び過酸ィ匕水素分解酵素を共発現する形質転換体又はその処理物を用い、主に D— アミノ酸を酸化する酸化工程と、ケト酸から L アミノ酸を生成する酵素及び必要に応 じて補酵素再生酵素を共発現する形質転換体又はその処理物を用い、主にケト酸 力 L—アミノ酸を合成する還元工程の、異なる 2つ以上の反応工程を併せ持つこと を特徴とする L—アミノ酸の製造方法を提供する（以下、「本発明の L—アミノ酸の製 造方法 2」又は「方法 2」と称する場合がある）。本発明の方法 2において、上記本発 明の形質転換体を用いてもょ 、。
[0022] 本発明の方法 2は、酸ィ匕工程と還元工程とを異なる反応条件下で行う方法であって もよい。本発明の方法 2は、例えば、酸化工程を酸素含有気体の通気条件下で行い 、還元工程を酸素含有気体を通気しな!、か又は酸素含有気体を酸化工程時より低 V、通気量で通気する条件下で行うことができる。
[0023] 本発明の方法 2には、例えば、酸ィ匕工程における酸素含有気体の通気量が、反応 液に対して毎分 1容量％以上であり、還元工程における酸素含有気体の通気量が、 反応液に対して毎分 10容量％未満である方法、好ましくは、酸化工程における酸素 含有気体の通気量が、反応液に対して毎分 2容量％以上であり、還元工程における 酸素含有気体の通気量が、反応液に対して毎分 2容量％未満である方法、より好ま しくは、酸化工程における酸素含有気体の通気量が、反応液に対して毎分 5容量％ 以上であり、還元工程における酸素含有気体の通気量力 反応液に対して毎分 5容 量％未満である方法が挙げられる。また、本発明の方法 2は、酸ィ匕工程における酸 素含有気体の通気量が、反応液に対して毎分 1容量％以上であり、還元工程におい て酸素含有気体を実質的に通気しな 、方法であってもよ 、。
[0024] 本発明の方法 2は、酸ィ匕工程における反応液の pHを 7. 0〜9. 5に調整し、還元ェ 程における反応液の pHを 6. 0〜8. 5であって酸ィ匕工程における pHより低い値に調 整する方法であってもよぐ特に、酸ィ匕工程における反応液の pHを 7. 5〜9. 0に調 整し、還元工程における反応液の pHを 6. 5〜8. 0に調整する方法であってもよい。
[0025] さらに、本発明の方法 2は、酸ィ匕工程カゝら還元工程へ移行前又は移行後に、上記 本発明の形質転換体又はその処理物を反応液に付加的に添加してもよい。
[0026] 本発明の方法 1及び方法 2は、 D—アミノ酸をケト酸に変換する反応の pH調整をギ 酸又はその塩を用いて行うこともできる。
[0027] また、本発明の方法 1及び方法 2は、原料アミノ酸鏡像異性体混合物に対して 0. 2 当量以上のギ酸イオン及び Z又はアンモ-ゥムイオンを含む反応液を用いてもよい
[0028] なお、本願明細書における「酵素」は、目的の酵素活性を有すれば、該酵素を構成 するアミノ酸の一部を欠失、置換、及び Z又は付加等の手段で遺伝子工学的に変異 させた変異体であってもよい。また、「本発明の方法」は、上記本発明の方法 1及び方 法 2を総称する意味に用いる。 発明の効果
[0029] 本発明によれば、特定の酵素を発現する一の形質転換体を用いて、酵素活性を利 用した D アミノ酸をケト酸に変換する反応とケト酸を L アミノ酸に変換する反応を ワンポット（同一系内）で行うことができるため、 L—アミノ酸を効率よく且つ高い濃度 で蓄積することができる。このため、安価なアミノ酸の鏡像異性体混合物を原料に用 いて、少ない工程で L アミノ酸を理論収率 100%で製造することができる。
特に、 D アミノ酸をケト酸に酸化する酸化工程を含む場合には、過酸化水素分解 酵素を同一宿主内で発現させるため、穏和な反応条件を用いてケト酸の分解を回避 でき、優れた生産性で L -アミノ酸を得ることができる。
図面の簡単な説明
[0030] [図 1]製造例 1で用いたプラスミド pSE420Uの制限酵素地図である。
[図 2]製造例 1で用 、たプラスミド pSUCBDO 1の制限酵素地図である。
[図 3]製造例 2で用いたプラスミド pUCTVDOTの制限酵素地図である。
[図 4]製造例 2で用いたプラスミド pSUTVDOlの制限酵素地図である。
[図 5]製造例 3で用いたプラスミド pUCECDDlの制限酵素地図である。
[図 6]製造例 3で用いたプラスミド pETECDDlの制限酵素地図である。
[図 7]製造例 4で用いたプラスミド pSU-MF26の制限酵素地図である。
[図 8]製造例 5で用いたプラスミド pSF-GSA2の制限酵素地図である。
[図 9]製造例 6で用いたプラスミド pSF-BTAlの制限酵素地図である。
[図 10]製造例 7で用いたプラスミド pSFBPADlの制限酵素地図である。
[図 11]製造例 8で用いたプラスミド pSF-SADlの制限酵素地図である。
[図 12]製造例 9で用いたプラスミド pEGSLED2の制限酵素地図である。
[図 13]製造例 9で用いたプラスミド pFGSLEDlの制限酵素地図である。
[図 14]製造例 10で用いたプラスミド pSFBPLDlの制限酵素地図である。
[図 15]製造例 11で用いたプラスミド pSU-TIP2の制限酵素地図である。
[図 16]製造例 11で用いたプラスミド pSF-TIP2の制限酵素地図である。
[図 17]製造例 12で用 、たプラスミド pSE- ECB1の制限酵素地図である。
[図 18]製造例 13で用いたプラスミド pSE-BSBlの制限酵素地図である。 [図 19]実施例 1で構築プラスミド pSFTPCOlの制限酵素地図である。
[図 20]実施例 2で構築プラスミド pSFGACOlの制限酵素地図である。
発明を実施するための最良の形態
[0031] 本発明の L アミノ酸の製造方法 1は、アミノ酸の鏡像異性体混合物から Lーァミノ 酸を酵素的に生成する方法であって、 D アミノ酸をケト酸に変換する酵素をコード する塩基配列と、ケト酸を L アミノ酸に変換する酵素をコードする塩基配列とが同一 又は異なる発現ベクターに組み込まれた一又は複数の組換えベクターを同一宿主 に導入して形成される形質転換体又はその処理物を、アミノ酸鏡像異性体混合物と 接触させる工程を含むことを特徴としている。すなわち、アミノ酸の鏡像異性体混合 物を原料とし、一の形質転換体より発現させた酵素を利用して、 D アミノ酸からケト 酸に変換する反応と、ケト酸を L アミノ酸に変換する反応（以下、両反応をまとめて「 主反応」と称する場合がある）とをワンポット（同一系内）で行うことにより、理論収率 10 0%で L アミノ酸を生成する方法である。
[0032] 本発明の L アミノ酸の製造方法 1は、上記構成の形質転換体に対して発現を誘 導し、目的の変換酵素を有する培養物を得る培養工程と、該培養物を用いた酵素的 反応によりアミノ酸鏡像異性体混合物に含まれる D アミノ酸を L アミノ酸に変換す る反応工程とで構成されて!、る。
[0033] 培養工程は、 D アミノ酸をケト酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、ケト酸 を L アミノ酸に変換する酵素をコードする塩基配列とを同一又は異なる発現べクタ 一に組み込んだ一又は複数の組換えベクターを同一宿主に導入し、形成された形 質転換体に対して発現を誘導することにより目的の変換酵素を有する培養物を得る 工程である。
[0034] 本発明に用いる D アミノ酸をケト酸に変換する酵素としては、 D アミノ酸に作用 して対応するケト酸を生成する酵素であれば特に限定されず、例えば、 D アミノ酸 酸ィ匕酵素、及び D アミノ酸脱水素酵素などが挙げられる。
[0035] D アミノ酸酸化酵素としては、例えば、 D アミノ酸酸化酵素、前記酵素を構成す るアミノ酸の一部が欠失、置換、及び Z又は付加されたアミノ酸配列力もなり、且つ前 記 D—アミノ酸酸ィ匕酵素を発現しうるポリペプチド等を利用できる。 [0036] 前記 D—アミノ酸酸化酵素は、 EC 1.4.3.1、 EC 1.4.3.3、 EC 1.4.3.7、 EC 1.4.3.15、
EC 1.4.3.19等に分類され、酸素を電子受容体とし、水の存在下で D—アミノ酸を酸 化的に脱ァミノ化して対応するケト酸と過酸化水素を生成する酵素活性を有している 。また、酸素を電子受容体としてアミノ酸を酸化してイミンを形成するが過酸化水素を 生成しない D—アミノ酸酸ィ匕酵素も見出されており、本発明の D—アミノ酸酸ィ匕酵素 にはこれらの酵素も含まれる。
[0037] D—アミノ酸酸化酵素は、いかなる生物由来であってもよぐ例えば、キャンディダ（ Candida)属、トリゴノプシス (Trigonopsis)属、シゾサッカロミセス (Schizosaccharomyce s)属、ァノレスロノくクタ一 (Arthrobacter)属、コリネノ クテリゥム (Corynebacterium)属、 シユードモナス (Pseudomonas)属、ロドトルラ（Rhodotorula)属などの微生物に由来す る酵素；ヒト ·マウス ·ブタ ·ラビットなどの哺乳類の肝臓に由来する酵素（Biochemistry, 26, 3612 (1987))などが利用できる。
[0038] 前記微生物に由来する酵素の具体例には、例えば、ァルスロパクター ·プロトフオル メ (Arthrobacter
Figure imgf000011_0001
由来（欧州特許出願公開第1375649号明細書）、キ ヤンデイダ'ボイディ- (Candida boidinii)由来（Yeast, 16, 1217 (2000))、コリネバタテリ ゥム 'グノレタミカム (Corynebacterium glutamicum)由来（J. Biotechnol. 104, 5 (2003》、 シユードモナス'プチダ (Pseudomonas putida)由来（Environ. Microbiol. 4, 799 (2002) )、ロドトルラ，グラシリス (Rhodotorula gracilis)由来（J. BacterioL, 58, 115 (1997》、トリ ゴノプシス'バリアビリス (Trigonopsis variabilis)由来（特公平 7— 108225号公報）、フ ザリウム'ソラ -(Fusarium solani)由来（J. Biochem., 108, 1063 (1990))、シゾサッカロ ミセス 'ボンべ（Schizosaccharomyces pombe)由来の酵素などが含まれる。
[0039] なかでも、キャンディダ 'ボイディ- (Candida boidinii)DSM 70026株などのキャンディ ダ（Candida)属由来の D—アミノ酸酸化酵素、トリゴノプシス'バリアビリス (Trigonopsis variabilis) CBS 4095株などのトリゴノプシス（Trigonopsis)属由来の D—アミノ酸酸化 酵素などが好ましく用いられる。
[0040] D—アミノ酸脱水素酵素としては、例えば、 D—アミノ酸脱水素酵素、前記酵素を構 成するアミノ酸の一部が欠失、置換、及び Z又は付加されたアミノ酸配列力 なり、且 つ前記 D—アミノ酸脱水素酵素を発現しうるポリペプチド等を利用できる。 [0041] 前記 D—アミノ酸脱水素酵素は、 EC 1.4.99.1等に分類され、 2, 6 ジクロ口インド フエノール (DCIP)等を電子受容体とし、 D—アミノ酸を酸ィ匕的に脱ァミノ化して対応 するケト酸を生成する酵素活性を有して ヽる。
[0042] D アミノ酸脱水素酵素は、いかなる生物由来であってもよぐ例えば、ェシエリヒア
(Escherichia)属、シユードモナス (Pseudomonas)属、サノレモネラ (Salmonella)属、 フラボバタテリゥム（Flavobacterium)属等の微生物に由来する酵素などが挙げられる
[0043] 前記微生物に由来する酵素の具体例としては、エシ リヒア 'コリ (Escherichia coli)
由来 (J. BacterioL , 176, 1500 (1994》、シユードモナス'エルギノサ (Pseudomonas aeru ginosa)由来 (Curr. Microbiol. 41 , 290 (2000))、サルモネラ'チフイミラム (Salmonella ty phimurium)由来 (Nature, 413, 852 (2001》、フラボバタテリゥム 'エスピー（Flavobacteri um sp)由来（J. Gen. Microbiol. 133, 745-754 (1987))等の微生物由来酵素等が挙 げられる。
[0044] なかでも、ェシエリヒア 'コリ (Escherichia coli) K- 12株等のェシエリヒア（Escherichia) 属由来の D アミノ酸脱水素酵素が好ましく用いられる。
[0045] 本発明における D—アミノ酸をケト酸に変換する酵素活性は、次の方法を用いて測 定することができる。すなわち、 D アミノ酸酸化酵素の酵素活性は、 lOOmM リン 酸カリウム緩衝液（pH8. 0)、 10mM D アミノ酸、 0. 5mM 4 ァミノアンチピリン 、 2mM フエノール、 5U/mL 過酸化酵素を含む反応液を 30°Cで反応させる方法 を用いて、 1分間に 0. 5 /z molのキノンィミン生成を触媒する酵素量を 1Uとして測定 される。 D アミノ酸脱水素酵素の酵素活性は、 lOOmM トリス—塩酸緩衝液 (PH8 . 0)、 10mM D アミノ酸、 0. ImM 2, 6 ジクロロインドフエノールナトリウム塩（ DCIP)を含む反応液を 30°Cで反応させる方法を用いて、 1分間に 1 μ molの DCIP を減少させる酵素量を 1Uとして測定される。
[0046] 本発明に用いるケト酸を L アミノ酸に変換する酵素としては、ケト酸に作用して対 応する L アミノ酸を生成する酵素であれば特に限定されず、例えば、 L アミノ酸脱 水素酵素、及び L—アミノ酸アミノ基転移酵素を有するポリペプチド等が挙げられる。
[0047] 前記 L アミノ酸脱水素酵素は、例えば、 NAD (P) Hとアンモニアの存在下、 oc— ケト酸を還元的にァミノ化して対応する L アミノ酸を生成する酵素活性を有して!/、る 。このような L アミノ酸脱水素酵素には、例えば、ァラニン脱水素酵素（EC 1.4.1.1) 、グルタミン酸脱水素酵素（EC 1.4.1.2、 EC 1.4.1.3、 EC 1.4.1.4)、 L アミノ酸脱水 素酵素（EC 1.4.1.5)、セリン脱水素酵素（EC 1.4.1.7)、パリン脱水素酵素（EC 1.4.1. 8)、ロイシン脱水素酵素（EC 1.4.1.9)、グリシン脱水素酵素（EC 1.4.1.10)、リジン脱 水素酵素（EC 1.4.1.15)、トリプトファン脱水素酵素（EC 1.4.1.19)、フ 二ルァラニン 脱水素酵素（EC 1.4.1.20)などが含まれる。
[0048] L アミノ酸脱水素酵素は、いかなる生物由来であってもよぐ例えば、微生物に由 来する酵素；ヒト 'マウス'ブタ'ゥシなどの哺乳類に由来する酵素などが利用できる。
[0049] 前記ァラニン脱水素酵素（EC 1.4.1.1)としては、例えば、ジォバチルス'ステア口サ 一モフィラス (Geobacillus stearothermophilus)由来 (Biochemistry, 29, 1009 (1990》、 ノ チノレス 'サ一モカテ-ユラタス（Bacillus thermocatenulatus)由来 (Biochimie, 71, 55 9 (1989》、シエワネラ.スピーシーズ (Shewanella sp)由来 (Appl. Environ. Microbiol, 6 5, 4014 (1999))、バチルス 'スフエリカス (Bacillus sphaericus IFO 3525)由来（Biochemi stry, 29, 1009 (1990) ; Accession No. M33298)等の生物由来ァラニン脱水素酵素等 が挙げられる。
[0050] 前記グルタミン酸脱水素酵素（EC 1.4.1.2、 EC 1.4.1.3、 EC 1.4.1.4)としては、例え ば、ゥシ肝臓由来 (J. Biochem. Mol. Biol, 36, 545 (2003)、バチルス 'サブチリス（Bac illus subtilis)由来 (J. BacterioL, 180, 6298 (1998》、スルホロバス'ソルフアタリカス（Su lfolobus solfataricus)由来 (Biochemistry, 203, 81 (1992》、サッカロマイセス 'セレビジ ェ（Saccharomyces cerevisiae)由来 (Biochemistry, 217, 469 (1993》等の生物由来グ ルタミン酸脱水素酵素が挙げられる。
[0051] 前記 L アミノ酸脱水素酵素（EC 1.4.1.5)としては、例えば、絶対嫌気性菌（obligat e anaerobes)などの生物由来 L アミノ酸脱水素酵素が挙げられる。
[0052] 前記セリン脱水素酵素（EC 1.4.1.7)としては、例えば、ァグロバタテリゥム'チュメフ アセンス (Agrobacterium tumefaciens)由来 (Accession No. AB032242)等の微生物由 来酵素などが挙げられる。
[0053] 前記パリン脱水素酵素（EC 1.4.1.8)としては、例えば、サイトファーガ 'スピーシー ズ (Cytophaga sp)由来 (Accession No. AF339150)等の生物由来パリン脱水素酵素な どが挙げられる。
[0054] 前記ロイシン脱水素酵素（EC 1.4.1.9)としては、例えば、ジォバチルス.ステア口サ 一モフィラス (Geobacillus stearothermophilus)由来 (Biochemistry, 27, 9056 (1988》、 バチルス.スフエリカス（Bacillus sphaericus)由来ロイシン脱水素酵素等の生物由来 酵素などが挙げられる。
[0055] 前記グリシン脱水素酵素（EC 1.4.1.10)としては、例えば、ェシエリヒア'コリ（Escheri chia coli)由来 (Eur. J. Biochem. 216, 539 (1993》等の生物由来グリシン脱水素酵素 などが挙げられる。
[0056] 前記リジン脱水素酵素（EC 1.4.1.15)としては、例えば、ジォバチルス'ステア口サ ~~モフィフス (veobacillus stearothermophilus)由来 (Appl. Environ. Microbiol. 70, 937 (2004))等の生物由来酵素などが挙げられる。
[0057] 前記フエ-ルァラニン脱水素酵素（EC 1.4.1.20)としては、例えば、サーモアクチノ マイセス'インタ ~~ アイウス (Thermoactinomyces intermedius)由来 (J. Biochem., 10 9, 371 (1991))、ブレビバクテリウム'スピーシーズ（Brevibacterium sp)由来（特開昭 6 3— 157986号公報）、スポロサルシナ'ゥレア（Sporosarcina urea)由来（特開昭 61— 239887号公報）、バチルス 'スフェリカス（Bacillus sphaericus)由来（特開昭 63— 15 7986号公報）、バチルス'パディウス（Bacillus &(1013)由来（特開昭63— 157986号 公報）、ロドコッカス.スピーシーズ（Rhodococcus sp)由来（特開昭 61— 146183号公 報）、ノカルディア'スピーシーズ（Nocardia sp)由来 (Arch. Microbiol, 153, 12 (1989) )、ハロモナ'パシフィカ（Halomona & 1^&)由来（特開2002— 65270号公報）等の 生物由来フエ二ルァラニン脱水素酵素などが挙げられる。
[0058] なかでも、ジォバチルス (Geobacillus)属、バチルス (Bacillus)属、シエワネラ（Shewane 11a)属、サーモアクチノマイセス (Thermoactinomyces)属等の微生物由来 L アミノ酸 脱水素酵素が好ましい。好ましい L アミノ酸脱水素酵素の具体例としては、サーモ ァクチノマイセス 'インターメディウス（Thermoactinomyces intermedius)由来フエ-ノレ ァラニン脱水素酵素、ジォバチルス'ステア口サーモフィラス（Geobacillus stearother mophilus)由来ァラニン脱水素酵素、バチルス 'サ一モカテ-ユラタス（Bacillus therm ocatenulatus)由来ァラニン脱水素酵素、バチルス 'スフエリカス（Bacillus sphearicus) 由来ァラニン脱水素酵素、シェワネラ'スピーシーズ（Shewanella species)由来ァラ- ン脱水素酵素、ジォバチルス'ステア口サーモフィラス（Geobacillus stearothermophil us)由来ロイシン脱水素酵素、及びバチルス.スフエリカス（Bacillus sphaericus)由来 ロイシン脱水素酵素等が挙げられる。
[0059] L—アミノ酸アミノ基転移酵素は、 L—グルタミン酸や Lーァスパラギン酸などのアミノ 基供与体からアミノ基を (Xーケト酸に転移させて対応する L アミノ酸を生成する酵 素活性を有している。このような L—アミノ酸アミノ基転移酵素には、例えば、了ラニン アミノ基転移酵素（EC 2.6.1.2)、システィンアミノ基転移酵素（EC 2.6.1.3)、グリシン アミノ基転移酵素（EC 2.6.1.4)、チロシンアミノ基転移酵素（EC 2.6.1.5)、ロイシンァ ミノ基転移酵素（EC 2.6.1.6)、トリブトファンアミノ基転移酵素（EC 2.6.1.27)、ヒスチジ ンァミノ基転移酵素（EC 2.6.1.38)、分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素（EC 2.6.1.42)、 芳香族 L アミノ酸アミノ基転移酵素 (EC 2.6.1.57)などが含まれる。
[0060] L アミノ酸アミノ基転移酵素は、いかなる生物由来であってもよぐ例えば、微生物 に由来する酵素；ヒト 'ラット'マウスなどの哺乳類に由来する酵素などが利用できる。
[0061] L アミノ酸アミノ基転移酵素の代表的な例としては、例えば、オリザ'サティバ（Ory za sativa)由来ァラニンアミノ基転移酵素 (Plant Mol. Biol. 39, 149 (1999)) ;ラット等の 哺乳類由来システィンアミノ基転移酵素 (Physiol. Chem. Phys., 10, 483 (1978))；ヒト やラット等の哺乳類由来グリシンアミノ基転移酵素 (J. Biol. Chem., 242, 3614 (1967)) ；ラットなどの哺乳類由来チロシンアミノ基転移酵素 (Anal. Biochem., 95, 188 (1979)) ；ラットなどの哺乳類由来ロイシンアミノ基転移酵素 (Biochim. Biophys. Acta, 445, 62 2 (1976)) ;ストレプトマイセス 'グリシウス (Streptomyces griseus)由来トリプトファンァミノ 基転移酵素 0. Biol. Chem., 250, 7819 (1975)) ;シユードモナス'テストステロ- (Pseud omonas testosteroni)由来ヒスチジンアミノ基転移酵素 (Biochem. J., 147, 327 (1975》 などが挙げられる。
[0062] また、分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素としては、例えば、ェシエリヒア'コリ (Escheric hia coli)由来 (J. Biochem., 97, 993 (1985》、バチノレス'サブチリス（Bacillus subtilis)由 来 0. BacterioL, 179, 496 (1997))等の生物由来分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素が 挙げられる。芳香族アミノ酸アミノ基転移酵素としては、例えば、ェシエリヒア'コリ (Esc herichia coli)由来 (Biochem. Biophys. Res. Commun., 133, 134 (1985》、パラコッカス •デニトリフイカンズ (paracoccus denitrificans)由来（特開平 01— 153084号公報）等 の生物由来芳香族アミノ酸アミノ基転移酵素が例示できる。
[0063] なかでも、分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素が好ましぐ特に、エシ リヒア 'コリ (Esch erichia coli)K- 12株等のエシ リヒア（Escherichia)属由来分岐鎖アミノ酸アミノ基転移 酵素；バチルス ·サブチリス（Bacillus subtilis)等のバチルス属 (Bacillus)由来分岐鎖ァ ミノ酸ァミノ基転移酵素などの微生物由来アミノ酸アミノ基転移酵素が好ましく用いら れる。
[0064] 本発明におけるケト酸を L アミノ酸に変換する酵素活性は、次の方法により測定 することができる。すなわち、 L アミノ酸脱水素酵素活性は、 200mM グリシン一 塩化カリウム一水酸化カリウム緩衝液 (ρΗΙΟ. 5)、 10mM L アミノ酸、 2. 5mM NAD +を含む反応液を 30°Cで反応させる方法により、 1分間に： molの NADH を生成する酵素量を 1Uとして測定できる。 L アミノ酸アミノ基転移酵素活性は、 10 OmM トリス—塩酸緩衝液（pH8. 0)、 50mM 塩化アンモ-ゥム、 10mM α ケ トイソカプロン酸ナトリウム、 40mM L アミノ酸（ァミノ基供与体）、 0. 05mM ピリド キサーノレ一 5，一リン酸、 0. 2mM NADPH、 5U/mLプロテウス'スピーシーズ (Pr oteus species)由来グルタミン酸脱水素酵素 (東洋紡社製)を含む反応液を 30°Cで反 応させる方法により、 1分間に 1 μ molの NADPHを減少させる酵素量を 1Uとして測 定できる。
[0065] 本発明にお 、ては、上記酵素活性を阻害しな!、範囲で、他の酵素をコードする塩 基配列が、 目的の変換酵素をコードする塩基配列を組み込んだ発現ベクターと同一 又は異なる発現ベクターに組み込まれていてもよい。前記他の酵素としては、例えば 、主反応の進行を阻害する物質を分解する酵素 (例えば過酸化水素分解酵素等)、 主反応で消費される基質を再生する酵素 (例えば補酵素再生酵素等)等を用いるこ とがでさる。
[0066] 前記過酸ィ匕水素分解酵素は、 D アミノ酸酸ィ匕酵素を利用した反応で副生され、 主反応の進行を阻害する過酸化水素を分解、除去する作用により、効率よく反応を 進行させることができる。前記過酸化水素分解酵素としては、例えばカタラーゼ及び 該カタラーゼを構成するアミノ酸の一部が欠失、置換、及び/又は付加されたァミノ 酸配列からなり、過酸ィ匕水素分解活性を発現しうるポリペプチド (カタラーゼ様酵素） 等を利用できる。前記カタラーゼとしては、微生物等に由来する公知のものを利用で き、例えば、ェシエリヒア'コリ (Escherichia coli)由来のカタラーゼ等が挙げられる。ェ シエリヒア'コリ (Escherichia coli)由来のカタラーゼの具体例として、 katE (J. Biol. Che m.， 254, 11664-11668 (1979))及び katG (J. Biol. Chem., 254, 4245-4252 (1979))な どが好適に挙げられる。
[0067] 過酸ィ匕水素の分解活性 (カタラーゼ活性）は、例えば、 50mM リン酸カリウム緩衝 液 (pH7. 0)、 0. 035%過酸化水素からなる反応液を 30°Cで反応させる方法により 、 1分間に 1 μ molの過酸ィ匕水素を分解する酵素量を 1Uとして測定できる。
[0068] 前記補酵素再生酵素は、 L アミノ酸脱水素酵素を利用した反応の進行に伴って 消費される補酵素 NAD (P) Hを再生する作用により、主反応を円滑に進行させるこ とができる。本発明において、補酵素 NAD (P) Hを再生する作用を有する形質転換 体としては、例えば、目的の変換酵素に対応する塩基配列を組み込んだ一又は複 数の組換えベクターを、補酵素 NAD (P) Hを再生する活性を保持する宿主に導入し て形成される形質転換体、及び Z又は D アミノ酸をケト酸に変換する酵素をコード する塩基配列と、 L アミノ酸脱水素酵素をコードする塩基配列と、補酵素再生酵素 をコードする塩基配列とを、同一又は異なる発現ベクターに組み込んだ一又は複数 の組換えベクターを、同一宿主に導入して形成される形質転換体を用いることができ る。
[0069] 前記 NAD (P) H再生する作用を有する宿主としては、広範な微生物を用いること ができ、該微生物が持つ解糖系、メチロトローフの C1ィ匕合物資化経路等により補酵 素が再生される。
[0070] 前記補酵素再生酵素としては、例えば、補酵素再生酵素、該補酵素再生酵素を構 成するアミノ酸の一部が欠失、置換、及び Z又は付加されたアミノ酸配列力 なり、且 つ補酵素再生酵素活性を発現しうるポリペプチド等を利用できる。
[0071] 前記補酵素再生酵素としては、例えば、ギ酸脱水素酵素、グルコース脱水素酵素、 アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素 酵素)などが挙げられる。補酵素再生酵素は、いかなる生物由来であってもよいが、 好ましくは、マイコバクテリゥム（Mycobacterium)属由来のギ酸脱水素酵素；バチルス (Bacillus)属、サーモプラズマ (Thermoplasma)属由来のグルコース脱水素酵素等が 用いられる。具体的な補酵素再生酵素として、例えば、 NADH再生酵素にはマイコ ノ クテリゥム.パッカェ（Mycobacterium vaccae)由来などのギ酸脱水素酵素； NAD ( P) H再生用酵素にはバチルス 'サブチリス（Bacillus subtilis)由来、サーモプラズマ' ァシドフィラム（Thermoplasma acidphilum)由来、バチルス ·メガテリゥム（Bacillus meg aterium)由来、バチルス 'セレウス（Bacillus cereus)由来などのグルコース脱水素酵 素等が利用できる。
[0072] 前記補酵素再生酵素活性は、次の方法により測定することができる。例えば、ギ酸 脱水素酵素活性は、 lOOmM リン酸カリウム緩衝液 (pH7. 0)、 lOOmM ギ酸ナト リウム、 2. 5mM NAD+を含む反応液を 30°Cで反応させる方法により、 1分間に 1 /z molの NADH生成を触媒する酵素量を 1Uとして測定できる。
[0073] 本発明にお 、て、酵素をコードする塩基配列は、目的の酵素活性を発現するポリ ペプチドをコードする塩基配列であればよぐ例えば、一部又は全部が DDBJに公開 されている公知の塩基配列、精製した酵素からアミノ酸配列を特定し、当該アミノ酸 配列に対応するよう定めた塩基配列などが含まれる。これらの塩基配列は、 PCR等 の増幅手段を用いる方法、化学的に合成する方法等の公知の方法を利用して調製 することができる。
[0074] 発現ベクターとしては、プラスミドベクターやファージベクターを利用することができ る。発現ベクターは、宿主の種類、組み込む遺伝子の種類や数等に応じて適宜選択 することができる。これらの発現ベクターは、単独で又は複数を組み合わせて用いて もよ 、。宿主に対応する発現ベクターの具体例としては後述のものが例示される。
[0075] 本発明においては、組換えベクターとして、 D アミノ酸をケト酸に変換する酵素を コードする塩基配列と、ケト酸を L アミノ酸に変換する酵素をコードする塩基配列と が同一又は異なる発現ベクターに組み込まれた一又は複数の組換えベクターが用 いられる。なかでも、 D アミノ酸をケト酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、ケ ト酸を L アミノ酸に変換する酵素をコードする塩基配列とが同一の発現ベクターに 組み込まれた組換えベクターが好ましく用いられる。組換えベクターは、さらに、他の 酵素に対応する塩基配列を、上記塩基配列を組み込んだ発現ベクターと同一又は 異なる発現ベクターに組み込まれて 、てもよ 、。
[0076] 本発明における糸且換えベクターの代表的な例としては、例えば、 D アミノ酸をケト 酸に変換する酵素に対応する塩基配列と、ケト酸を L アミノ酸に変換する酵素に対 応する塩基配列とが同一の発現ベクターに組み込まれた 2遺伝子発現組換えべクタ 一； D アミノ酸をケト酸に変換する酵素に対応する塩基配列と、ケト酸を L アミノ酸 に変換する酵素に対応する塩基配列と、任意の他の酵素に対応する塩基配列とが 同一の発現ベクターに組み込まれた複数遺伝子発現組換えベクター； D アミノ酸を ケト酸に変換する酵素に対応する塩基配列が組み込まれた 1遺伝子発現組換えべク ターと、ケト酸を L アミノ酸に変換する酵素に対応する塩基配列が前者と異なる発 現ベクターに組み込まれた 1遺伝子発現組換えベクターの組み合わせ; D—アミノ酸 をケト酸に変換する酵素に対応する塩基配列と、ケト酸を L アミノ酸に変換する酵 素に対応する塩基配列と、任意の他の酵素に対応する塩基配列のうち少なくとも 2種 以上の塩基配列が同一の発現ベクターに組み込まれた複数遺伝子発現組換えべク ターと、 1種の塩基配列がこれとは異なる発現ベクターに組み込まれた 1遺伝子発現 組換えベクターの組み合わせ； D アミノ酸をケト酸に変換する酵素に対応する塩基 配列を発現ベクターに組み込んだ 1遺伝子発現組換えベクターと、ケト酸を Lーァミノ 酸に変換する酵素に対応する塩基配列を前者とは異なる発現ベクターに組み込ん だ 1遺伝子発現組換えベクターと、任意の他の酵素に対応する塩基配列を前 2者と は異なる発現ベクターに組み込んだ組換えベクターとの組み合わせ等が挙げられる
[0077] なかでも、不和合性等の問題なく形質転換体が得られ、作業性、取扱性に優れる ため、複数遺伝子を発現する一の組換えベクターを用いることが好ましい。このような 糸且換えベクターとしては、例えば、 D アミノ酸をケト酸に変換する酵素をコードする 塩基配列と、ケト酸を L アミノ酸に変換する酵素をコードする塩基配列とが同一の 発現ベクターに組み込まれた組換えベクター； D—アミノ酸をケト酸に変換する酵素 に対応する塩基配列と、ケト酸を L アミノ酸に変換する酵素に対応する塩基配列と 、任意の他の酵素に対応する塩基配列とが同一の発現ベクターに組み込まれた複 数遺伝子発現組換えベクター等が挙げられる。
[0078] D アミノ酸をケト酸に変換する酵素が D アミノ酸酸ィ匕酵素である場合には、副生 する過酸ィ匕水素によるケト酸の分解を抑制し、 D アミノ酸酸化反応に必要な酸素量 を低減させて、主反応を円滑に進行させるため、「任意の他の酵素」として、過酸ィ匕 水素分解酵素、好ましくはカタラーゼを用いた組換えベクター又はその組み合わせ が好ましく用いられる。このような組換えベクター及びその組み合わせの具体例として は、例えば D アミノ酸をケト酸に変換する酵素に対応する塩基配列と、 L アミノ酸 脱水素酵素に対応する塩基配列と、過酸化水素分解酵素に対応する塩基配列と、 補酵素再生酵素に対応する塩基配列とが同一の発現ベクターに組み込まれた 4遺 伝子発現組換えベクター； D アミノ酸をケト酸に変換する酵素に対応する塩基配列 と、 L アミノ酸脱水素酵素に対応する塩基配列と、過酸化水素分解酵素に対応す る塩基配列が同一の発現ベクターに組み込まれた 3遺伝子発現組換えベクター； D アミノ酸をケト酸に変換する酵素に対応する塩基配列と過酸化水素分解酵素に対 応する塩基配列が同一の発現ベクターに組み込まれた 2遺伝子発現組換えベクター 、及び L アミノ酸脱水素酵素に対応する塩基配列と補酵素再生酵素に対応する塩 基配列が前者とは異なる発現ベクターに組み込まれた 2遺伝子発現組換えベクター の組み合わせ等が挙げられる。
[0079] また、ケト酸を L—アミノ酸に変換する酵素が L—アミノ酸脱水素酵素である場合に は、主反応を円滑に進行させるため、「任意の他の酵素」として、補酵素再生酵素を 用いた組換えベクター又はその組み合わせが好ましく用いられる。このような組換え ベクター及びその組み合わせの具体例としては、例えば、 D アミノ酸をケト酸に変 換する酵素に対応する塩基配列と、 L アミノ酸脱水素酵素に対応する塩基配列と、 補酵素再生酵素に対応する塩基配列が同一の発現ベクターに組み込まれた 3遺伝 子発現組換えベクター; D アミノ酸をケト酸に変換する酵素に対応する塩基配列と 、 L アミノ酸脱水素酵素に対応する塩基配列と、補酵素再生酵素に対応する塩基 配列のうち少なくとも 2種以上の塩基配列が同一の発現ベクターに組み込まれた複 数遺伝子発現組換えベクターと、 1種の塩基配列がこれとは異なる発現ベクターに組 み込まれた 1遺伝子発現組換えベクターの組み合わせ; D—アミノ酸をケト酸に変換 する酵素に対応する塩基配列を発現ベクターに組み込んだ 1遺伝子発現組換えべ クタ一と、 L アミノ酸脱水素酵素に対応する塩基配列を前者とは異なる発現べクタ 一に組み込んだ 1遺伝子発現組換えベクターと、補酵素再生酵素に対応する塩基 配列を前 2者とは異なる発現ベクターに組み込んだ組換えベクターとの組み合わせ などが挙げられる。
[0080] 組換えベクターにより宿主内に導入された塩基配列は、組換えベクター力 直接転 写，翻訳されて酵素活性が発現されてもよぐ導入された塩基配列が宿主の染色体 上に組み込まれた形態で発現されていても良い。組換えベクターの構築は、発現べ クタ一に、目的の変換酵素に対応する塩基配列を発現可能に組み込む方法により 行われる。前記目的の変換酵素に対応する塩基配列を発現可能に組み込む方法と しては、通常、プロモーター、ターミネータ一等の発現制御に関わる領域 (発現制御 ユニット）を目的の塩基配列の近傍に組み込む方法が用いられる。例えば、複数の 遺伝子をコードする塩基配列を任意の順で同一の発現ベクター導入する場合には、 プロモーター、ターミネータ一などの発現制御ユニットをそれぞれの遺伝子に連結す る方法や、ラタトースォペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させ る方法等、宿主となる生物の種類に応じて適宜選択して利用できる。
[0081] このような組換えベクターの好ま 、構成としては、例えば目的の塩基配列の 5 則 上流にプロモーターを配置した構成、より好ましくは、前記プロモーターに加えて^ 側下流にターミネータ一を配置した構成等が挙げられる。宿主となる生物の種類に 応じて利用可能なベクター、プロモーター、ターミネータ一については、「微生物学基 礎講座 8遺伝子工学 '共立出版」、特に酵母に関しては、 Adv. Biochem. Eng. 43, 75 -102 (1990)、 Yeast 8, 423-488 (1992)、などに詳細に記述されている。また、蚕等の 昆虫（Nature 315, 592-594 (1985))等の動物や、菜種、トウモロコシ、ジャガイモなど の植物を宿主として、当該宿主中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発さ れており、好適に利用できる。宿主の種類に応じた組換えベクターの構築は、分子生 物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うこと ができる（例えば、 Sambrookら、モレキュラ^ ~ ·クロー-ング、 Cold Spring Harbor Labo ratories G
[0082] 組換えベクターの具体的な構成例としては、例えば、 pSE420D (特開 2000— 1891 70号公報）を改変した 3遺伝子発現ベクター pSE420U上にキャンディダ 'ボイディ- 由来の D—アミノ酸酸化酵素遺伝子、マイコバクテリゥム ·パッカェ由来ギ酸脱水素酵 素、サーモアクチノマイセス ·インターメディウス由来フエ-ルァラニン脱水素酵素遺 伝子の順で挿入したプラスミド pSFTPCO 1；キャンディダ ·ボイディ-由来の D -ァミノ 酸酸化酵素遺伝子、マイコバクテリゥム'パッカェ由来ギ酸脱水素酵素、ジォバチル ス.ステアロサーモフィラス由来ァラニン脱水素酵素遺伝子を様々な順番で挿入した プラスミド pSFGAC01、 pSFTPC02、 pSFTPC03などが挙げられる。更に、キャンディ ダ ·ボイディ-由来の D—アミノ酸酸化酵素遺伝子及び大腸菌由来のカタラーゼ遺 伝子を共発現させた組換えベクター pSCCBDO 1、マイコバクテリゥム ·パッカェ由来ギ 酸脱水素酵素をコードする遺伝子及びサーモアクチノマイセス'インターメディウス由 来フエ二ルァラニン脱水素酵素遺伝子をコードする遺伝子を共発現する組換えべク ター pSF-TIP2、キャンディダ 'ボイディ-由来の D—アミノ酸酸化酵素遺伝子、大腸 菌由来のカタラーゼ遺伝子、サーモアクチノマイセス ·インターメディウス由来フエ- ルァラニン脱水素酵素遺伝子、マイコバクテリゥム ·パッカェ由来ギ酸脱水素酵素遺 伝子の 4遺伝子を共発現する pSFCPCOl、等が挙げられる。
[0083] 組換えベクターを導入する宿主としては、上記酵素に対応する塩基配列を含む一 又は複数の組換えベクターを導入でき、 目的の酵素を発現可能な生物であれば特 に限定されず、微生物、植物、動物などの広範な生物から適宜選択して利用できる。
[0084] 宿主として利用可能な微生物としては、通常、宿主としたときに利用可能な発現べ クタ一系が開発されている微生物を用いることができ、例えば、ェシエリヒア (Escherich ia)属、バチルス (Bacillus)属、シユードモナス (Pseudomonas)属、セラチア (Serratia)属、 ブレビバタテリゥム (Brevibacterium)属、コリネバタテリィゥム (Corynebacterium)属、スト レプトコッカス (Streptococcus)属、ラクトバチルス (Lactobacillus)属など細菌；ロドコッカ ス (Rhodococcus)属、ストレプトマイセス (Streptomyces)属など宿主ベクター系の開発さ れて 、る放線菌；サッカロマイセス (Saccharomyces)属、クライべロマイセス (Kluyverom yces)属、シゾサッカロマイセス (Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス (Zygos accharomyces)属、ャロウィァ (Yarrowia)鳥、トリコスホロン (Trichosporon) 、ロドスポリ ジゥム (Rhodosporidium)属、ピキア (Pichia)属、キャンディダ (Candida)属などの宿主べ クタ一系の開発されて 、る酵母；ノイロスポラ (Neurospora)属；ァスペルギルス (Aspergi llus)属、セファロスポリウム (Cephalosporium)属などが挙げられる。
[0085] 本発明にお 、て、宿主の種類に応じて用いられる発現ベクターと発現制御ユニット
(プロモーターやターミネータ）との組み合わせの具体例を以下に示す。
[0086] 宿主がェシエリヒア (Escherichia)属、例えばェシエリヒア'コリ (Escherichia coli)等の の場合には、 pBR、 pUC系プラスミドベクター； lac( j8—ガラタトシダーゼ)、 trp (トリプト ファンオペロン)、 tac、 trc (lac, trpの融合)、 λファージ PL、 PRなどに由来するプロモ 一ター；ターミネータ一力 ¾rpA由来、ファージ由来、 rrnBリボソ一マノレ RNA由来のタ 一ミネ一ターからなる組み合わせが挙げられる。なかでも、市販の pSE420 (Invitrogen 製）のマルチクローユングサイトを一部改変したベクター PSE420D (特開 2000— 189 170号公報）、 3遺伝子の共発現が可能なベクター pSE420U、 4遺伝子の共発現が可 能なベクター PSE420Qが好適に利用できる。
[0087] 宿主がバチルス (Bacillus)属の場合には、 pUBl lO系プラスミド、 pC194系プラスミドな どのプラスミドベクターが利用可能であり、染色体にインテグレートすることもできる。 また、プロモーター、ターミネータ一として、 apr (アルカリプロテア一ゼ)、 npr (中性プロ テア一ゼ)、 amy( Q;—アミラーゼ)などが利用できる。
[0088] 宿主がシユードモナス (Pseudomona)属の場合には、シユードモナス ·プチダ (Pseudo monas putida八ンュ ~~トモナス ·セノヽンァ (Pseudomonas cepacia)などを 王とす へ クタ一系が開発されている。トルエンィ匕合物の分解に関与するプラスミド TOLプラスミ ドを基本にした広宿主域ベクター (RSF1010などに由来する自律的複製に必要な遺 伝子を含む) PKT240などが利用可能であり、プロモーター、ターミネータ一として、リ パーゼ遺伝子 (特開平 5 - 284973号公報)などが利用できる。
[0089] 宿主がブレビバタテリゥム (Brevibacterium)属、例えば、ブレビバタテリゥム ·ラタトフ アーメンタム (Brevibacterium lactofermentum)の場合には、 pAJ43(Gene 39, 281 (198 5》などのプラスミドベクターが利用可能である。プロモーター、ターミネータ一として は、大腸菌で使用されているプロモーター、ターミネータ一をそのまま利用できる。
[0090] 宿主がコリネバタテリゥム (Corynebacterium)属、例えば、コリネバタテリゥム.ダルタミ カム (Corynebacterium glutamicum)の場合には、 pCSl l(特開昭 57— 183799号公報 )、 pCBlOKMol. Gen. Genet. 196, 175 (1984》などのプラスミドベクターが利用可能で ある。
[0091] 宿主がストレプトコッカス (Streptococcus)属の場合には、 pHV1301(FEMS Microbiol.
Lett. 26, 239 (1985)、 pGKl (Appl. Environ. Microbiol. 50, 94 (1985》などがプラスミ ドベクターとして利用可能である。
[0092] 宿主がラクトバチルス (Lactobacillus)属の場合には、ストレプトコッカス (Streptococcu s)属用に開発された PAM |8 1 (J. Bacteriol. 137, 614 (1979》などが利用可能である。 プロモーターには、上記バチルス (Bacillus)属におけるプロモーターとして例示のもの を利用可能である。
[0093] 宿主がロドコッカス (Rhodococcus)属の場合には、ロドコッカス ·ロドクロウス (Rhodoco ecus rhodochrous)から単離されたプラスミドベクターが使用可能である（J. Gen. Micr obiol. 138, 1003 (1992》。
[0094] 宿主がストレプトマイセス (Streptomyces)属の場合には、 Hopwoodらの Genetic Mani pulation or Streptomyces: A Laooratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories (1 985)に記載の方法に従って、プラスミドを構築することができる。特に、ストレプトマイ セス 'リビダンス (Streptomyces lividans)においては、 pIJ486 (Mol. Gen. Genet. 203, 4 68-478 (1986》、 pKC1064(Gene 103, 97-99 (1991》、 pUWL-KS (Gene 165,149-150 (1995》が使用できる。また、ストレプトマイセス 'バージニア (Streptomyces virginiae) においても、同様のプラスミドを使用することができる（Actinomycetol. 11, 46-53 (199
[0095] 宿主がサッカロマイセス (Saccharomyces)属、例えばサッカロマイセス 'セレビジァェ（ Saccharomyces cerevisiae)の場合には、 YRp系、 YEp系、 YCp系、 Yip系プラスミドが利 用可能であり、染色体内に多コピー存在するリボソーム DNAとの相同組み換えを利 用したインテグレーションベクター（EP 537456など）は、多コピーで遺伝子を導入でき 、かつ安定に遺伝子を保持できるため極めて有用である。また、 ADH (アルコール脱 水素酵素)、 GAPDH (ダリセルアルデヒド 3—リン酸脱水素酵素)、 PHO (酸性フォス ファタ一ゼ)、 GAL( j8 ガラクトシダーゼ)、 PGK (ホスホグリセレートキナーゼ)、 ENO( エノラーゼ)などのプロモーター、ターミネータ一が利用可能である。
[0096] 宿主がクライべロマイセス (Kluyveromyces)属、例えばクライべロマイセス ·ラクテイス (Kluyveromyces lactis)の場合には、サッカロマイセス 'セレビジァェ由来 2 μ m系プラ スミド、 pKDl系プラスミド（J. Bacteriol. 145, 382-390 (1981》、キラー活性に関与する pGKll由来プラスミド、クライべロマイセス（Kluyveromyces)属における自律増殖遺伝 子 KARS系プラスミド、リボソーム DNAなどとの相同組み換えにより染色体中にインテ グレート可能なベクタープラスミド（EP 537456など）などが利用可能である。また、 AD H、 PGKなどに由来するプロモーター、ターミネータ一が利用可能である。
[0097] 宿主がシゾサッカロマイセス (Schizosaccharomyces)属の場合には、シゾサッカロマイ セス ·ボンべ由来の ARS (自律複製に関与する遺伝子)およびサッカロマイセス ·セレ ビジァェ由来の栄養要求性を相補する選択マーカーを含むプラスミドベクターが利 用可能である（Mol. Cell. Biol. 6, 80 (1986))。また、シゾサッカロマイセス'ボンべ由 来の ADHプロモーターなどが利用できる（EMBO J. 6, 729 (1987))。特に、 pAUR224 は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
[0098] 宿主がチゴサッカロマイセス属 (Zygosaccharomyces)の場合には、チゴサッカロマイ セス.口ゥキシ (Zygosaccharomyces rouxii)由来の pSB3 (Nucleic Acids Res. 13, 4267 ( 1985))などに由来するプラスミドベクターが利用可能であり、サッカロマイセス ·セレビ ジァェ由来 PH05プロモーターや、チゴサッカロマイセス 'ロウキシ由来 GAP- Zr (グリ セルアルデヒド— 3 リン酸脱水素酵素)のプロモーター（Agri. Biol. Chem. 54, 2521 (1990》などが利用可能である。
[0099] 宿主がピキア (Pichia)属の場合には、ピキア'アンガスタ（旧名：ノヽンゼヌラ 'ポリモル ファ (Hansenula polymorpha))において宿主ベクター系が開発されている。ベクターと しては、ピキア ·アンガスタ由来自律複製に関与する遺伝子 (HARS1、 HARS2)も利用 可能であるが、比較的不安定であるため、染色体への多コピーインテグレーションが 有効である（Yeast 7, 431-443 (1991))。また、メタノールなどで誘導される AOX (アル コールォキシダーゼ）、 FDH (ギ酸脱水素酵素)のプロモーターなどが利用可能である 。また、ピキア'パストリス (Pichia pastoris)などにピキア由来自律複製に関与する遺伝 子（PARS1、 PARS2)などを利用した宿主ベクター系が開発されており（Mol. Cell. Bio 1. 5, 3376 (1985))、高濃度培養とメタノールで誘導可能な AOXなど強いプロモーター が利用できる（Nucleic Acids Res. 15, 3859 (1987》。
[0100] 宿主がキャンディダ (Candida)属の場合には、キャンディダ'マルトーサ (Candida mal tosa)、キャンディダ'アルビカンス (Candida albicans),キャンディダ 'トロピカリス (Candi da tropicalis)、キャンディダ'ゥチルス (Candida utilis)などにおいて宿主ベクター系が 開発されて 、る。キャンディダ ·マルトーサにお ヽてはキャンディダ ·マルトーサ由来 A RSがクローユングされ (Agri. Biol. Chem. 51, 1587 (1987》、これを利用したベクター が開発されている。また、キャンディダ 'ゥチルスにおいては、染色体インテグレートタ イブのベクターは強力なプロモーターが開発されている（特開平 8— 173170号公報
) o
[0101] 宿主がァスペルギルス (Aspergillus)属の場合には、ァスペルギルス '二ガー（Asperg illus niger)、ァスペルギルス'オリジー（Aspergillus oryzae)などがカビの中で最もよく 研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体 外プロテアーゼゃアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Trends in Biote chnology 7, 283-287 (1989))。
[0102] 宿主がトリコデルマ (Trichoderma)属の場合には、トリコデルマ'リーゼィ (Trichoderm a reesei)を利用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ遺伝子由来プロ モーターなどが利用できる（Biotechnology 7, 596-603 (1989))。
[0103] 宿主としては、上記の微生物以外に、植物、動物等の生物を利用することもできる。
当該宿主に対応して利用可能なベクター、プロモーター等が開発されている。例え ば、蚕等の昆虫（Nature 315, 592-594 (1985》や、菜種、トウモロコシ、ジャガイモなど の植物を宿主として、当該宿主中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発さ れており、好適に利用できる。
[0104] 組換えベクターを宿主へ導入する方法としては、宿主の種類等に応じて公知乃至 慣用の手段及び方法を利用できる。
[0105] 上記方法により、 目的の酵素を発現可能な一又は複数の組換えベクター力 同一 宿主に導入された形質転換体が形成される。
[0106] 本発明の形質転換体は、上記に例示の組換えベクターを同一宿主に導入して形 成される。本発明の形質転換体の代表的な例としては、例えば、 D アミノ酸をケト酸 に変換する酵素をコードする塩基配列と、ケト酸を L アミノ酸に変換する酵素をコー ドする塩基配列とが同一の発現ベクターに組み込まれた一の組換えベクターを含む 形質転換体、及び前記両塩基配列が異なる発現ベクターに組み込まれた複数の組 換えベクターを同一の宿主に導入して形成される一の形質転換体; D アミノ酸をケ ト酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、ケト酸を L アミノ酸に変換する酵素を コードする塩基配列と、補酵素再生酵素をコードする塩基配列及び Z又は過酸化水 素分解酵素をコードする塩基配列とが同一の発現ベクターに組み込まれた一又は複 数の組換えベクター、及び前 3又は 4塩基配列が 2以上の異なる発現ベクターに組込 まれた複数の組換えベクターを同一の宿主に導入して形成される一の形質転換体 等が挙げられる。なかでも、複数ベクター間の不和合性等の問題が生じにくい点で、 一の組換えベクターが導入された形質転換体が好ましく用いられる。
[0107] 好ましい形質転換体としては、上記構成における D—アミノ酸をケト酸に変換する 酵素が D アミノ酸酸化酵素であり、ケト酸を L アミノ酸に変換する酵素が Lーァミノ 酸脱水素酵素であり、補酵素再生酵素がギ酸脱水素酵素であり、過酸化水素分解 酵素がカタラーゼである形質転換体、より好ましくは、 D—アミノ酸酸ィ匕酵素がキャン デイダ ·ボイディ-由来であり、 L アミノ酸脱水素酵素がサーモアクチノマイセス ·ィ ンターメディウス由来フ 二ルァラニン脱水素酵素であり、ギ酸脱水素酵素がマイコ ノ クテリゥム ·パッカェ由来であり、カタラーゼがェシエリヒア 'コリ由来である形質転換 体が挙げられる。
[0108] 本発明の好ましい形質転換体の具体例としては、少なくとも D アミノ酸をケト酸に 酸化する酵素と、過酸化水素分解酵素と、ケト酸を L アミノ酸に変換する酵素とを 共発現する形質転換体が挙げられる。この形質転換体によれば、 D アミノ酸の酸 化反応で副生される過酸ィ匕水素によるケト酸の分解を抑制して、ケト酸の収率をより 向上できる。前記好ましい形質転換体は、必要に応じてさらに補酵素再生酵素を共 発現する態様であってもよい。この場合には、補酵素再生酵素の活性によりケト酸の 還元的ァミノ化反応を効率よく進行させて、 L アミノ酸を高い収率で得ることができ る。
[0109] 本発明では、上記構成の形質転換体を単独で培養することにより、 D—アミノ酸を ケト酸に変換する酵素と、ケト酸を L アミノ酸に変換する酵素を共に発現することが できる。このため、 D アミノ酸をケト酸に変換する反応と、ケト酸を L アミノ酸に変 換する反応 (主反応)をワンポット（同一系内）で進行させることができるため製造工程 を少なくできる。また、本発明では、ベクターによる強制発現系を利用するため、高濃 度に蓄積された酵素により主反応を効率よく進行させることができる。このため、安価 なアミノ酸の鏡像異性体混合物を原料として L—アミノ酸を理論収率 100%で製造す ることができるという利点がある。
[0110] 形質転換体の培養に用いる培地としては、宿主の生育に必要なタンパク質、脂質、 糖質、ビタミン、ミネラルなどの有用成分を少なくとも含む液体培地又は固体培地を 用いることができる。なかでも、培養物をそのまま酵素的反応に利用することができる 点で、液体培地が好ましく用いられる。培地は、各種添加物等を含んでいても良い。
[0111] 培養工程により、 D—アミノ酸をケト酸に変換する酵素、ケト酸を L アミノ酸に変換 する酵素、及び必要に応じて他の酵素が高濃度に蓄積された培養物が生成される。
[0112] 反応工程においては、培養工程で得た培養物又はその処理物を用い、酵素的反 応により、アミノ酸の鏡像異性体混合物に含まれる D アミノ酸を L アミノ酸に変換 する反応が進行する。すなわち、反応工程は、アミノ酸の鏡像異性体混合物を原料と して、 D アミノ酸をケト酸に変換する酵素反応と、生成したケト酸を L アミノ酸に変 換する酵素反応を同一系内で進行させて、 L アミノ酸の高濃度蓄積物を生成する 工程である。
[0113] 反応工程における反応液は、培養工程で得た培養物又はその処理物と、原料とし てのアミノ酸の鏡像異性体混合物とを少なくとも含んで ヽる。
[0114] 培養工程で得た培養物は、少なくとも発現誘導された形質転換体と培地とで構成さ れている。前記培養物は、そのまま反応工程に用いることも可能である力 酵素反応 に適した反応液が調製しやすい点で、培養物の処理物として、培養物から培地を除 去して得られる形質転換体が好ましく利用される。なお、培養物の処理物として、培 養物に発現誘導された目的の酵素活性を保持しうる範囲で、培養物に、破砕、濃縮 、希釈、濾過、遠心分離、抽出、固定化等の適宜な処理を施した処理物を用いること ができる。培養物の処理物としては、具体的には、界面活性剤や有機溶媒により膜 透過性が高められた菌ゃ固定ィ匕菌体、ホモジナイザーや超音波等用いて破砕処理 を施して調製される無細胞抽出液等を利用できる。
[0115] 原料に用いるアミノ酸の鏡像異性体混合物とは、 D アミノ酸と L アミノ酸の混合 物であり、 D体と L体の比率力 例えば D体： L体 = 10 : 90〜90 : 10、好ましくは 25 : 75-75： 25、より好ましくは 50： 50 (ラセミ体)である混合物が含まれる。
[0116] 鏡像異性体混合物を構成するアミノ酸としては、例えば、下記式（1)
[化 1]
R -CH- C09H
I (1 )
NH2
(式中、 Rは置換基を有していても良い炭化水素基を示す）
で表される化合物が挙げられる。 Rにおける炭化水素基としては、メチル、ェチル、プ 口ピル、プロべニル、ブチル、イソブチル、ブテニルなどの等の直鎖または分岐鎖状 炭化水素基；シクロペンタン、シクロへキサン等の脂環式炭化水素基；フエニル等の 芳香族系炭化水素基等が挙げられる。炭化水素基が有して 、てもよ 、置換基として は、例えば、ハロゲン原子、アミノ基、ニトロ基、アルキル基、アルコキシ基などが挙げ られる。
[0117] 本発明に用いられるアミノ酸の代表的な例としては、例えば、ノルパリン、ノル口イシ ン、ホモフエニノレアラニン、 o 二トロフエニノレアラニン、 m—二トロフエニノレアラニン、 p -トロフエ-ルァラニン、 2—ァミノ酪酸、 β—ナフチルァラニンなどが挙げられる。 なかでも、ノルパリンの鏡像異性体混合物が好ましく用いられる。
[0118] アミノ酸の鏡像異性体混合物の使用量は、形質転換体より発現される酵素の種類 や量に応じて適宜選択できる力 反応液全体に対して、例えば 0. 1〜50重量％、好 ましくは 1〜30重量％、より好ましくは 2〜20重量％程度である。 [0119] 反応液は、培養物又はその処理物、及びアミノ酸の鏡像異性体混合物以外に、他 の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、例えば、反応溶媒、酵素活性に対応 する基質や補酵素、消泡剤等を用いることができる。反応溶媒としては、水;炭化水 素、エステル、アルコール等の適宜な有機溶媒、 pH調整剤や緩衝液等の液性調整 剤等が用いられる。これらの反応溶媒は単独で又は 2種以上組み合わせて用いても よい。酵素活性に対応する基質及び補酵素は、形質転換体が発現する酵素に応じ て適宜選択して用いられる。
[0120] 反応液に添加する補酵素として、例えば、アミノ酸脱水素酵素を発現する形質転換 体には NAD (P) Hを、ギ酸脱水素酵素やグルコース脱水素酵素等の補酵素再生酵 素を発現する形質転換体には NAD (P) +を用いることができる。これらの補酵素を 反応液中に添加した場合には、各酵素を補強、安定化することにより主反応の進行 を促すことができる。前記補酵素 (NAD (P) H、 NAD (P) +)は、反応液全量に対し て例えば 0. 001〜100mM、好ましくは 0. 01〜： LOmM、より好ましくは 0. 1〜： LmM 程度の濃度で添加することができる。
[0121] 形質転換体がアミノ酸脱水素酵素と補酵素再生酵素とを共に発現する場合には、 系中に前記補酵素再生酵素活性に対応する基質を共存させる必要がある。前記補 酵素再生酵素とその基質の組み合わせの具体例としては、ギ酸脱水素酵素とギ酸又 はその塩、グルコース脱水素酵素とグルコース、アルコール脱水素酵素とエタノール 又は 2—プロパノール、リンゴ酸脱水素酵素とリンゴ酸又はその塩、グリセロール脱水 素酵素とグリセロールなどが反応系に添加される。前記基質は、原料として用いた鏡 像異性体混合物に含まれる D アミノ酸に対して、例えば 0. 1〜20当量、好ましくは 1〜5当量程度添加することができる。
[0122] また、形質転換体が L アミノ酸アミノ基転移酵素を発現する場合には、アミノ基供 与体が添加される。アミノ基供与体としては、例えば、グルタミン酸、ァスパラギン酸等 の各種アミノ酸、及びこれらの塩などが用いられる。アミノ基供与体は、原料の鏡像異 性体混合物に含まれる D—アミノ酸に対して、例えば 0. 1〜： LOO等量、好ましくは 1 〜20当量程度添加することができる。
[0123] 形質転換体が L アミノ酸脱水素酵素を発現する場合は、系中にアンモ-ゥムィォ ン等のアミノ基供与体を存在させることが好まし ヽ。アンモ-ゥムイオンを反応液に添 加する形態は特に限定されず、例えばアンモニゥムバッファ一として添加してもよぐ 補酵素再生酵素であるギ酸脱水素酵素の基質となるギ酸の供与を兼ねることができ るギ酸アンモ-ゥム又はギ酸とアンモニアとを別個に添カ卩してもょ 、。アンモ-ゥムィ オンの添加量は、反応開始時に系中に存在する D アミノ酸に対して、例えば 0. 1 〜20当量、好ましくは 0. 2〜10当量、より好ましくは 0. 5〜4当量程度である。
[0124] 消泡剤は、液性の改善に有効であり、例えば、アデカプル口ニック L 61、アデ力 プル口-ック L— 71、アデカプル口-ック 25R— 1、アデカプル口-ック 25R— 2、アデ 力ノール LG— 294、カラリン、シリコンなどが利用できる。消泡剤の添加量は、反応 液全量に対して f列え ί θ. 001〜0. 5重量0 /0、好ましく ίま 0. 005〜0. 1重量0 /0、より 好ましくは 0. 01〜0. 05重量％程度である。
[0125] また、反応液の ρΗの維持を目的として、各種緩衝液や緩衝能のある化合物を添カロ することもできる。特に、ケト酸を L アミノ酸に変換する酵素として L アミノ酸脱水 素酵素を用いた場合は、アンモニアバッファー、ギ酸アンモ-ゥム等が好適に用いら れる。これらは、培地全量に対して、例えば 10mM〜3M、好ましくは 50mM〜l. 5 M程度の濃度で添加することができる。
[0126] また、形質転換体が発現する酵素の種類によっては酸素存在下で酵素反応が行 われる。 D アミノ酸酸化酵素を発現する形質転換体は、例えば、純粋酸素や酸素 分圧を高めた空気、空気等を反応液中へ通気しながら反応することができる。この場 合、通気量は、例えば 0. 01〜： LOwm、好ましくは 0. 05〜2wm程度である。通気 方法は、撹拌、振盪等の手段により酸素等を反応液に接触させる方法、加圧による 方法の 、ずれであってもよ 、。これらの条件は溶存酸素量によってコントロールして ちょい。
[0127] 反応工程における反応は、培養物又はその処理物及び他の成分と、原料としての アミノ酸の鏡像異性体混合物を混合して行われる。原料等は、反応溶媒等に一括し て添加しても良ぐ逐次的、連続的または間欠的に添加してもよい。反応は、静置又 は撹拌下で行われる。
[0128] 反応条件は、酵素反応の進行を阻害しな!、範囲で適宜選択される。反応開始時の 反応液の pHは、目的の酵素活性を維持できる範囲力 選択され、通常は pH5〜l l 、好ましくは pH6〜10、より好ましくは pH7〜9程度である。また、反応中及び反応終 了時の pHは適当な範囲内でコントロールすることもできるし、反応の進行に伴って変 化するに任せてもよい。反応温度は、目的の酵素活性を維持できる範囲カゝら適宜選 択でき、例えば 5〜70°C、好ましくは 10〜55°C、より好ましくは 20〜40°C程度である
[0129] 反応工程の好ま 、態様としては、培養工程で得た培養物から回収した形質転換 体、アミノ酸の鏡像異性体混合物、及び酵素に対応する基質とその他適当な添加剤 を混合した反応液を、通気条件下で撹拌する方法が挙げられる。
[0130] 反応工程によれば、培養工程で発現させた酵素をアミノ酸の鏡像異性体混合物に 作用させることにより、 D アミノ酸がケト酸に変換する酵素反応とケト酸力 -ァミノ 酸に変換する酵素反応がワンポット（同一系内）で進行して L アミノ酸が生成される
[0131] 反応の終結は、反応液中の D アミノ酸濃度が低下し、 L アミノ酸が高濃度に蓄 積した時点で確認できる。すなわち、本発明における反応の終結時点は、培養系中 における L アミノ酸蓄積濃度力 例えば 90%e. e以上、好ましくは 95%e. e以上、 より好ましくは 99%e. e以上である。ここで、「％e. e」とは、以下の式で示される値の ことを言う。
e. e. (%) = { (L アミノ酸の濃度） - (D アミノ酸の濃度） } X 100/
{ (L アミノ酸の濃度） + (D アミノ酸の濃度） }
[0132] 上記反応により、 L アミノ酸が高濃度に蓄積された反応液が生成される。 L アミ ノ酸を高濃度に含む反応液は、例えば、反応液中に溶解度以上に蓄積した L アミ ノ酸を可溶化した後、適宜な分離手段を用いて除菌、除タンパク等の処理が施され、 得られた処理液を必要に応じて精製することにより、 L アミノ酸を回収することがで きる。
[0133] 前記 L—アミノ酸の可溶ィ匕処理は、例えば、液体培養を行った場合の培養液中に その溶解度以上に目的物の L アミノ酸が蓄積している場合に、例えば、培養系の 酸性化、塩基性化、もしくは希釈等の手段により施すことができる。酸性化は、系内 に塩酸、硫酸等の酸を添加することにより、塩基性化は、水酸化ナトリウム、水酸化力 リウム等の塩基を添加することにより行われる。可溶化処理後の処理液は、酸性、塩 基性、中性の何れであっても良い。前記分離手段としては、例えば、濾過、遠心分離 等の慣用の手段を用いることができる。
[0134] 前記除菌、除タンパク処理後の処理液は、添加剤を添加することにより不要な無機 塩を析出させ、ろ過等の分離手段を施すことにより、無機塩が除去された L アミノ酸 溶液とすることができる。このような添加剤としては、 L アミノ酸の溶解度を保持しつ つ不要な無機塩の溶解度を下げることができれば特に限定されないが、好ましくはメ タノール、エタノール、 2—プロパノール、アセトン、ァセトニトリルなどの水溶性有機 溶媒を用いることができる。これらの添加剤は蒸留等の操作によって系中から除去し てもよいし、残存したままで以降の精製を行ってもよい。
[0135] 精製は、例えば、濃縮、等電点沈殿、冷却や目的物の溶解度を低下させる作用を 有する添加物の添加などによる晶析処理、イオン交換榭脂処理、膜分離、有機溶媒 による抽出、イオン交換クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、吸着剤によ る吸着、凝集剤、脱水剤による脱水もしくは凝集、蒸留等の公知の精製手段及びこ れらの組み合わせて行われる。上記精製手段は、アミノ酸の種類に応じて適宜選択 することができる。
[0136] 反応液中から L アミノ酸を分離 '精製する好ましい方法としては、例えば、 L アミ ノ酸を含む反応液を濃縮後、等電点付近に pHを調整し、上記に例示の水溶性有機 溶媒を添加して晶析処理を施して、析出した精製 L アミノ酸を分離、回収する方法 が挙げられる。
[0137] アミノ酸として L ノルパリンを分離、精製する場合には、例えば、次の方法を利用 できる。すなわち、 L ノルパリンを含む反応液に硫酸を添加して酸性ィ匕することによ り溶反応液中に蓄積した L ノルパリンを可溶ィヒした後、遠心分離により除菌処理を 施す。得られた L ノルパリン含有溶液にメタノールを添加して不要な無機塩を析出 させ、ろ過により除去する。回収したろ液にアンモニア、水酸ィ匕ナトリウムなどの塩基 を添加して中和し、さらにアセトンを添加して晶析処理を施すことにより精製ノルバリ ンを得ることができる。 [0138] 本発明の方法 1によれば、 D アミノ酸をケト酸に変換する酵素的反応と、生成した ケト酸を L アミノ酸に変換する酵素的反応を、ワンポット（同一系内）で進行させるた め、 D アミノ酸からケト酸を生成する酵素反応とケト酸から L アミノ酸を生成する酵 素反応を一の形質転換体の培養工程として行うことができ、し力も L アミノ酸を高い 蓄積量で得ることができる。このため、ラセミ体などの D体と L体が混合した安価なアミ ノ酸混合物を原料とした場合にも、理論収率 100%で L アミノ酸を製造することが できる。
[0139] 本発明の L—アミノ酸の製造方法 2は、アミノ酸の鏡像異性体混合物から Lーァミノ 酸を酵素的に生成する L アミノ酸の製造方法であって、少なくとも D アミノ酸をケ ト酸に酸化する酵素及び過酸化水素分解酵素を共発現する形質転換体又はその処 理物を用い、主に D アミノ酸を酸化する酸化工程と、ケト酸から L アミノ酸を生成 する酵素及び必要に応じて補酵素再生酵素を共発現する形質転換体又はその処理 物を用い、主にケト酸力 L アミノ酸を合成する還元工程の、異なる 2つ以上の反 応工程を併せ持つことを特徴として 、る。
[0140] 前記「酸ィ匕工程」とは、主に D アミノ酸をケト酸へ酸化する酸化反応を含む工程で あることを意味しており、酸化反応以外に他の反応が進行していてもよい。前記酸ィ匕 工程における他の反応として、例えば酸化反応を促進する反応 (過酸化水素分解酵 素の作用による反応等）、後述する還元反応等が挙げられる。
[0141] 前記「還元工程」とは、主にケト酸の還元的ァミノ化により L アミノ酸を合成する還 元反応を含む工程であることを意味しており、還元反応以外に他の反応が進行して いてもよい。前記還元工程における他の反応として、例えば還元反応を促進する反 応 (補酵素再生酵素の作用による反応等)、上記酸化反応等が挙げられる。還元ェ 程における「ケト酸から L アミノ酸を生成する酵素及び必要に応じて補酵素再生酵 素を共発現する形質転換体」とは、ケト酸から L アミノ酸を生成する酵素を発現する 形質転換体、及びケト酸から L アミノ酸を生成する酵素と補酵素再生酵素を共発現 する形質転換体を含む意味である。
[0142] なお、本発明の L アミノ酸の製造方法 2は、上記酸化工程及び還元工程からなる 少なくとも 2つの異なる反応工程を有していればよぐさらに精製工程等の他の工程 を含んでいてもよい。
[0143] 本発明者らの検討によれば、 D アミノ酸をケト酸に酸化する酵素を用いる酸化反 応は、反応液中の基質濃度が高いと、反応生成物 (ケト酸)の収率 [原料アミノ酸鏡 像異性体混合物（DL アミノ酸）に対する L アミノ酸の割合]が低くなる傾向にあり 、例えば、基質濃度が 5重量％を超える反応条件では、前記収率が 70%程度にとど まることから、工業的生産に耐えられないという課題があった。収率が低くなる原因と して、 D アミノ酸酸化酵素の作用により生成されたケト酸は、同反応で副生される過 酸化水素と接触して脱炭酸され、生成したアルデヒドがさらに酵素的酸化もしくは空 気酸化を受けて有機酸を生成する一連の反応によって分解される結果、主反応の進 行が阻害されることが推察された。
[0144] 上記課題に対し、本発明者らは、 D アミノ酸酸化酵素と過酸化水素分解酵素 (特 にカタラーゼ)を共発現させた形質転換体を用いると、 L アミノ酸の収率が著しく向 上しうることを見いだした。一方、 D アミノ酸酸化酵素を発現する形質転換体を含む 反応液に、別途カタラーゼを添加した場合には、ほとんど効果を示さな力 た。このこ とは、菌体内で生成された α—ケト酸が、同時に副生された過酸ィ匕水素により菌体 内において速やかに分解されるのであって、菌体外へ漏出した α—ケト酸が同じく菌 体外に漏出した過酸ィ匕水素によって徐々に分解されるのではないことを示唆してい る。すなわち、 OC—ケト酸の分解抑制に高い効果を得るためには、反応混合液に過 酸化水素分解酵素を添加するより、むしろ D アミノ酸酸化酵素と過酸化水素分解 酵素（特にカタラーゼ）を同一の菌体内で発現することにより特別の価値があることを 示している。
[0145] また、 D アミノ酸酸ィ匕酵素の作用による D アミノ酸の酸ィ匕反応は、通常、酸素通 気が律速となるため、高通気、高撹拌条件が求められることが多い。これらの条件は 、工業的な規模の発酵槽においては設備上の負荷が大きくなつたり、溶菌ゃ反応液 の発泡を引き起こし、収率が低下しやすいという問題があった。本発明者らは、過酸 化水素分解酵素 (カタラーゼ等)を併用することにより、上記のような問題を解決しうる という副次的な効果が得られることを見出した。以下に詳述する。
[0146] D アミノ酸を酸化してケト酸を生成する酸化工程において、 D アミノ酸酸化酵素 を単独で利用した場合には、例えば下記反応式（1)が進行する。式（1)に示されるよ うに、 1分子の D アミノ酸を酸ィ匕するために酸素 1分子が必要であり、同時に 1分子 の過酸化水素が副生される。これに対し、 D アミノ酸酸化酵素と過酸化水素分解酵 素を併用した場合には、下記反応式（2)が進行する。式（2)に示されるように、過酸 化水素分解酵素の作用により分解された 1分子の過酸ィ匕水素から 1Z2分子の酸素 が生成されて反応系に供給されるため、全体として反応系外から導入する酸素の量 を半減することができる。このため、酸ィ匕工程における通気、攪拌をより緩和な条件で 行うことが可能になり、反応時間の短縮もできるという有利な効果を得ることができる。 (1) D—アミノ酸 + O + H O→ケト酸 +過酸化水素 +アンモニア （2) D-
2 2
アミノ酸 + 1/20 →ケト酸 +アンモニア
2
[0147] 過酸化水素分解酵素 (カタラーゼ等)の使用に際しては、例えばカタラーゼのもつ ペルォキシダーゼ活性により、中間生成物であるケト酸の分解が促進されることも予 想されたが、実際にカタラーゼを併用したところ、 L アミノ酸の収率の著しい向上効 果を得ることができた。このように、本発明の方法 2は、カタラーゼの併用により、ペル ォキシダーゼ活性に起因する弊害 (ケト酸の分解促進）はほとんど問題なぐ過酸ィ匕 水素の分解によるケト酸の分解抑制に極めて高い効果を発揮しうるため、高収率に 極めて有利である。
[0148] 本発明の方法 2は、上記構成を有するため、穏和な反応条件を用いて、ケト酸を高 収率で得ることができる。本発明の方法 2に用いる酵素、組換えベクター、形質転換 体、及び培養条件等は上記方法 1と同様のものを利用できる。また、本発明の方法 2 は、方法 1に記載の反応条件を用いることができる。
[0149] 本発明の方法 2においては、酸ィ匕工程と還元工程とを異なる反応条件下で行うこと が好ましい。前記酸化工程は、酸素を必要とする D アミノ酸の酸化反応で主に構 成され、還元工程は、酸素を必要としないケト酸の還元的ァミノ化反応で主に構成さ れるため、各工程に適した条件を設定することにより、 L アミノ酸の生成反応を促進 して収率を向上することができる。
[0150] 本発明者らは、更に検討した結果、酸ィ匕工程における D—アミノ酸の酸ィ匕反応を促 進する高通気条件では、還元工程におけるケト酸の還元反応に必要な基質ゃ補酵 素が酸化される結果、還元反応の進行を阻害してしまうことを見いだした。そして、そ の主な原因が、（1)本来、還元工程において還元的ァミノ化反応に有効に利用され るべき還元型補酵素 (NADH等)が、高通気条件下では酸化されて無駄に消費され やすぐさらに（2)還元型補酵素の酸ィヒ生成物 (NAD等）が、反応系内に存在する 補酵素再生酵素の活性により再生 (NADH等を生成)する反応が進行する結果、補 酵素再生酵素の基質 (例えばギ酸脱水素酵素の基質であるギ酸など）が無駄に消費 されやすい点にあるという知見を得た。このことは、還元工程におけるケト酸の還元的 アミノ化反応には、むしろ酸素がない方が好ましい反応であることを意味している。本 発明にお ヽては、ワンポット（同一系内）で行われる還元工程と酸ィ匕工程とを異なる 反応条件下で行うことにより、 aーケト酸の還元的ァミノ化反応を促進して、最終目的 物である L—アミノ酸の収率をさらに向上するという効果を得ることができる。酸ィ匕ェ 程と還元工程に対して異なって設定される反応条件としては、例えば、酸素の通気 条件、撹拌条件、 PH、触媒 (酵素を含む)や形質転換体等の追加等が挙げられる。
[0151] 本発明の方法 2の好ましい態様としては、酸ィ匕工程を酸素含有気体の通気条件下 で行 ヽ、還元工程を酸素含有気体を通気しな 、か又は酸素含有気体を酸ィヒ工程時 より低い通気量で通気する条件下で行う方法が挙げられる。この方法によれば、還元 工程において、還元型補酵素が無駄に酸化されたり、酸化された補酵素を補酵素再 生酵素の作用で再還元することにより、該酵素の基質が無駄に消費されることにより 、還元的ァミノ化反応の進行が阻害されるなどの問題を回避しうるため、特にケト酸か ら L—アミノ酸の生成効率をより向上することができる。
[0152] 前記酸素含有気体とは、少なくとも酸素を含む気体であればよぐ例えば、酸素、 及び空気等の酸素と他の気体との混合気体が含まれる。他の気体には、二酸化炭 素、窒素等の不活性ガス等が含まれる。酸素含有気体として空気等が好ましく用いら れる。酸素含有気体における酸素の含有量は、例えば 0. 1容量％以上 (0. 1〜： LOO 容量％)、好ましくは 1容量％以上、より好ましくは 5容量％以上である。
[0153] 具体的な酸素含有気体の通気条件としては、例えば、酸化工程における酸素含有 気体の通気量が、反応液に対して毎分 1容量％以上であり、還元工程における酸素 含有気体の通気量が、反応液に対して毎分 10容量％未満、好ましくは、酸化工程に おける酸素含有気体の通気量が、反応液に対して毎分 2容量％以上であり、還元ェ 程における酸素含有気体の通気量が、反応液に対して毎分 2容量％未満、より好ま しくは、酸化工程における酸素含有気体の通気量が、反応液に対して毎分 5容量％ 以上であり、還元工程における酸素含有気体の通気量力 反応液に対して毎分 5容 量％未満であり、特に酸ィ匕工程における酸素含有気体の通気量が、反応液に対して 毎分 1容量％以上であり、還元工程において酸素含有気体を実質的に通気しない 条件が挙げられる。このような通気条件によれば、 L アミノ酸の収率をより一層向上 する効果を得ることがでさる。
[0154] 本発明の方法 2の好ましい態様としては、上記方法の他に、酸ィ匕工程における反 応液と還元工程における反応液を異なる pHに調整する方法、例えば酸化工程にお ける反応液の pHより、還元工程における反応液の pHを低い値に調整する方法が挙 げられる。具体的な pHの条件としては、例えば酸ィ匕工程における反応液の pHを 7. 0〜9. 5に調整し、還元工程における反応液の pHを 6. 0〜8. 5であって酸化工程 における pHより低い値に調整する条件、好ましくは酸ィヒ工程における反応液の pH を 7. 5〜9. 0に調整し、還元工程における反応液の pHを 6. 5〜8. 0であって酸ィ匕 工程における pHより低い値に調整する条件が挙げられる。
[0155] 酸ィ匕工程及び還元工程の pH調整には、主反応の進行を阻害しない限り特に限定 されず、公知の酸又は塩基を、種類に応じて適当量用いられる。本発明の方法 1及 び方法 2において、 D アミノ酸をケト酸に変換する反応の pH調整をギ酸又はその 塩 (例えばギ酸アンモ-ゥム等)を用いた場合には、上述したように酸ィ匕工程で無駄 に消費されるギ酸を効率よく補充できる点で好ましい。
[0156] 本発明の方法は、原料アミノ酸鏡像異性体混合物に対して 0. 2当量以上のギ酸ィ オン及び Z又はアンモ-ゥムイオンを含む反応液を用いることが好まし 、。前記ギ酸 イオンとしては、反応系内でギ酸イオンを生成可能な化合物を添加することができ、 このような化合物として、例えばギ酸;ギ酸アンモ-ゥム、ギ酸ナトリウム等のギ酸塩等 を利用できる。前記アンモニゥムイオンとしては、反応系内でアンモニゥムイオンを生 成可能な化合物を添加することができ、このような化合物として、例えばアンモニア； 塩化アンモ-ゥム、ギ酸アンモ-ゥム、酢酸アンモ-ゥム等のアンモ-ゥム塩等を用 いることがでさる。
[0157] 上記方法によれば、 D アミノ酸からケト酸を生成する反応において、ギ酸イオンが pH調整剤として働き、ケト酸を収率よく得ることができる。特に、補酵素再生酵素とし てギ酸脱水素酵素を用いたケト酸を L—アミノ酸に変換する反応を含む場合には、ギ 酸イオンがギ酸脱水素酵素の基質の供給源となって補酵素を効率よく再生するため 、ケト酸の還元的ァミノ化反応が促進されて L アミノ酸を高収率で得ることができる。 このため、反応終了後の反応液中におけるケト酸の残存量をより低減することができ る。さらに、上記方法は、 D アミノ酸酸化酵素を用いる反応を含む場合により高い 効果が得られる。
[0158] また、上記方法によれば、ケト酸を L アミノ酸に変換する反応において、アンモ- アイオン力 ¾H調整剤として働くと同時に、アンモ-ゥムイオンがアミノ基供給源となり 、ケト酸の還元的ァミノ化反応を促進して、 L アミノ酸を効率よく生成することができ る。さらに、上記方法は、 L アミノ酸脱水素酵素を用いる場合により高い効果を得る ことができる。
[0159] 本発明者らは、 D アミノ酸をケト酸へ変換する反応 (特に酸化反応）には本来影 響しないと思われるギ酸アンモ-ゥムを、原料アミノ酸鏡像異性体混合物（D, L ァ ミノ酸）に対して 0. 2当量以上添加することによりケト酸の生成が促進されることを見 出した。すなわち、本発明の方法は、原料アミノ酸鏡像異性体混合物に対して 0. 2 当量以上のギ酸イオンと 0. 2当量以上のアンモ-ゥムイオンとを共に含む反応液に よれば、上述の効果をより向上することができる。特にギ酸酵素脱水素酵素を用いて ケト酸を L—アミノ酸に変換する反応を含む方法においては、ギ酸イオンとアンモ-ゥ ムイオンとが、共に pH調整剤として作用するのに加えて、前者がギ酸酵素脱水素酵 素の基質となって補酵素を効率よく再生し、後者がさらにアンモ-ゥムイオンがァミノ 基を供給源となることにより、ケト酸力 L—アミノ酸を変換する反応の効率を著しく向 上することができる。
[0160] 反応収率を向上させる目的で、本発明の方法 2において、酸ィ匕工程力も還元工程 へ移行前又は移行後に、上記本発明の形質転換体又はその処理物を反応液に付 加的に添加することが好ましい。この方法によれば、酸ィ匕工程で消費された酵素を補 い、還元工程における還元的ァミノ化反応をスムーズに行われるため、中間体である ケト酸が反応終了後に残存するのを防いで、 L アミノ酸を高い収率で得ることがで きる。
[0161] 本発明の方法 2によれば、過酸化水素分解酵素を共発現させた D アミノ酸酸ィ匕 酵素を用いたケト酸に変換する酵素的反応と、生成したケト酸を L アミノ酸に変換 する酵素的反応を、ワンポット（同一系内）で進行させるため、 D アミノ酸の酸ィ匕ェ 程を穏和な条件で行うことができ、し力も生成後のケト酸の分解を防 、でケト酸を高 V、濃度で蓄積し、続く還元工程にぉ 、て L アミノ酸を高 、収率で効率よく得ること ができる。特に、還元工程を酸ィ匕工程と異なる条件で進行させるにより、ケト酸力 L アミノ酸の変換反応が促進されて、反応終了後の反応液中に中間生成物であるケ ト酸が残存しにくぐ L アミノ酸の収率をより向上することができる。このため、ラセミ 体などの D体と L体が混合した安価なアミノ酸混合物を原料とした場合にも、理論収 率 100%で L アミノ酸を製造することができる。
実施例
[0162] 以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実 施例により限定されるものではない。なお、「LB培地」としては、 1% ノクトトリプトン、 0. 5% ノタト酵母エキス、 1% 塩ィ匕ナトリウム、 pH7. 2の構成の培地を用いた。ま た、「アンピシリンを含む LB培地」には、上記構成の LB培地にアンピシリンを 50 g ZmL濃度で添カ卩した培地が使用されている。表 1〜表 5中、「Nva」とは「ノルパリンの 基質濃度 (重量％)」を示し、「Nva残存率 [%]」とは、「反応液中のノルパリンのモル濃 度 Z反応液調製時のノルパリンのモル濃度 X 100」を示し、「Nva生成率 [%]」とは、「 反応液中のノルパリンのモル濃度 Z反応液調製時の 2—ォキソペンタン酸のモル濃 度 X 100」を示している。
[0163] 酵素活性の測定
製造例又は実施例で調製したプラスミドで大腸菌 HB101株を形質転換し、得られ た形質転換株をアンピシリン（50 μ g/ml)を含む液体 LB培地中、 30°Cで終夜培養 し、 0. ImM IPTGを添加して遺伝子の発現を誘導し、更に 30°Cで 4時間培養を行 つた。得られた菌体魏菌後、 0. 02% 2—メルカプトエタノールを含む 50mM リ ン酸カリウム緩衝液 (pH8. 0)に懸濁して、密閉式超音波破砕装置 UCD—200TM (コスモバイオ製)で破砕し、遠心分離することにより上清 (無細胞抽出液)を回収した 得られた無細胞抽出液を用いて、それぞれ下記の方法で酵素活性を測定した。 (D ァラニン酸ィ匕酵素活性の測定）
無細胞抽出液、 lOOmM リン酸カリウム緩衝液（pH8. 0)、 10mM D ァラニン 、 0. 5mM 4ーァミノアンチピリン、 2mM フエノール、 5UZmL過酸化酵素からな る反応液を 30°Cに保持して反応を進行させることにより、 D ァラニン酸ィ匕活性を測 定した。 1Uは、 1分間に 0. 5 /z molのキノンィミン生成を触媒する酵素量とした。
(D アミノ酸脱水素酵素活性の測定）
無細胞抽出液、 lOOmM トリスー塩酸緩衝液（pH8. 0)、 10mM D ァラニン、 0. ImM 2, 6 ジクロ口インドフエノールナトリウム塩（DCIP)からなる反応液を 30 °Cに保持して反応を進行させることにより、 D—ァラニン酸ィ匕活性を測定した。 1Uは 、 1分間に 1 μ molの DCIPの減少を触媒する酵素量とした。
(L アミノ酸脱水素酵素活性の測定）
無細胞抽出液、 200mM グリシン—塩ィ匕カリウム—水酸ィ匕カリウム緩衝液 (pHIO . 5)、 10mM L—アミノ酸、 2. 5mM NAD +力 なる反応液を 30°Cに保持して反 応を進行させることにより、 L アミノ酸脱水素酵素活性を測定した。 1Uは、 1分間に 1 μ molの NADH生成を触媒する酵素量とした。なお、 L—アミノ酸として、 Lーァラ ニン脱水素酵素活性の測定には Lーァラニンを、 L一口イシン脱水素酵素活性の測 定にはし ロイシンを、 L フエ二ルァラニン脱水素酵素活性の測定にはし フエ二 ルァラニンを、それぞれ用いた。
(ギ酸脱水素酵素活性の測定）
無細胞抽出液、 lOOmM リン酸カリウム緩衝液 (pH7. 0)、 lOOmM ギ酸ナトリウ ム、 2. 5mM NAD +力 なる反応液を 30°Cに保持して反応を進行させることにより 、ギ酸酸ィ匕活性を測定した。 1Uは、 1分間に 1 /z molの NADH生成を触媒する酵素 量とした。
(L アミノ酸アミノ基転移酵素活性の測定） 無細胞抽出液、 lOOmM トリス—塩酸緩衝液 (pH8. 0)、 50mM 塩化アンモ-ゥ ム、 10mM aーケトイソカプロン酸ナトリウム、 40mM L—グルタミン酸ナトリウム、 0. 05mM ピリドキサール— 5，—リン酸、 0. 2mM NADPH、 5UZmLプロテウス 'スピーシーズ (Proteus species)由来グルタミン酸脱水素酵素 (東洋紡製)からなる反 応液を 30°Cに保持して反応を進行させることにより、 L アミノ酸アミノ基転移酵素活 性を測定した。 1Uは、 1分間に: molの NADPHの減少を触媒する酵素量とした。
(カタラーゼ活性の測定）
無細胞抽出液、 50mM リン酸カリウム緩衝液 (pH7. 0)、 0. 035%過酸ィ匕水素か らなる反応液を 30°Cに保持して反応を進行させることにより、カタラーゼ活性を測定 した。 1Uは、 1分間に l /z molの過酸ィ匕水素を分解する酵素量とした。
[0164] 製造例 1
D アミノ酸酸化酵素遺伝子含有プラスミド pSUCBDO 1の構築
PSE420D (特開 2000— 189170号公報）を Nde Iで消化し、 Klenow fragmentにより 末端平滑化処理を行ない、セルフライゲーシヨンすることにより Nde I制限酵素サイト がつぶれたベクター PSE420-Nを構築した。 pSE420-Nの 260-263位 CTAGを部位特 異的変異により AGCTに置換し、同部位に Sac Iサイトが組み込まれた pSE420Sを構築 した。 pSE420Sを Cla I, Nco Iで 2重消化し、同部位に合成 DNA (配列番号： 1、配列 番号： 2)をァニール後、ライゲーシヨンすることによりプラスミド pSE420U (図 1)を構築 した。
ATATTTAATTAAGGAGGAATAATC
CTTTAATTTTTAATAATAAAGTTAAT
[0165] キャンディダ'ボイディ- DSM 70026 (Candida boidinii DSM 70026)株を YEPD培地
(2% バクトペプトン、 1% バクト酵母エキス、 2% ガラクトース、 pH6. 0)で培養し
、菌体を調製した。 Meth. Cell Biol, 29, 39 (1975)に記載の方法に従い、菌体から染 色体 DNAを分離、精製した。
[0166] Yeast, 16, 1217 (2000)に記載のキャンディダ'ボイディ- TK 62 (Candida boidinii T K 62)株由来の D—アミノ酸酸化酵素遺伝子の塩基配列（Accession No. AB042032) を元にクローユング用のセンスプライマー CbDAO-Al (配列番号： 3)、アンチセンス プライマー CbDAO- T1 (配列番号: 4)を合成した。
配列番号 3： CACCATATGGGTGATCAAATTGTTGTTCTTGGTTC
AACTAAAAG
[0167] 前記キャンディダ'ボイディ- DSM 70026 (Candida boidinii TK 62)株から精製した 染色体 DNA50ng、 3. 75U PfoUltra DNAポリメラーゼ、 PfoUltra用緩衝液、 0. 2m M dNTP、及びセンスプライマー CbDAO- A1とアンチセンスプライマー CbDAO- Tl 各 20pmolからなる 50 /z l反応液について、変性（95°C、 30秒）、ァニール（52°C、 3 0秒）、伸長（72°C、 70秒）を 30サイクル、 GeneAmp PCR System 2400 (パーキンェ ルマー製）を用いて PCRを行った。 PCR反応液の一部をァガロースゲル電気泳動に より解析した結果、特異的な約 1. lkbpのバンドが検出された。このバンドを切り出し 、 GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (フアルマシア製）で精製して DNA断 片を回収した。
[0168] 得られた DNA断片を制限酵素 Nde I、 AH IIで二重消化し、フエノールークロロホル ム処理後、ァガロースゲル電気泳動を行い、 目的とするバンド部分を切り出し、 Sepha glas Band Prep Kit (フアルマシア製）により精製して、 目的の DNA断片を回収した。 プラスミド PSE420Uを制限酵素 Nde I、 All IIで二重消化し、 T4 DNAリガーゼ（タカラバ ィォ製)を用いて目的の DNA断片を連結した。得られたプラスミドにより大腸菌 JM10 9株を形質転換した。形質転換株をアンピシリンを含む LB培地プレート上で生育させ 、センスプライマー CbDAO- A1とアンチセンスプライマー CbDAO- T1を用いてコ口- 一ダイレクト PCRを行い、挿入断片のサイズを確認した。 1. lkbの DNA断片が挿入 されていると考えられるコロニーをアンピシリンを含む LB培地で培養し、 FlexiPrep Kit (フアルマシア製)を用いて精製することによりプラスミド pSUCBDOl (図 2)を得た。
[0169] 精製したプラスミド pSUCBDOlにつ!/、て、 BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (パーキンエルマ一製）、及び ABI PRISMTM 310 (パーキンエル マー製)を用いてプライマーウォーキング法により挿入 DNAの塩基配列を解析した。 プラスミドに挿入されたキャンディダ'ボイディ- DSM 70026 (Candida boidinii DSM 7 0026)株由来の D アミノ酸酸化酵素の塩基配列を、 Yeast, 16, 1217 (2000)に記載 のキャンディダ 'ボイディ- TK 62 (Candida boidinii TK 62)株由来の D アミノ酸酸 化酵素遺伝子の塩基配列（Accession No. AB042032)と比較すると、 ORFの開始位 置を 1位として、 77G→T (Cys27→Phe)、 83C→A(Ala28→Asp)、 198A→C、 243C→A (His81→Gln)、 501A→G、 525A→Gという 3つのアミノ酸置換を含む 6つの塩基置換 が認められた。こうして、プラスミド pSUCBDOlに、キャンディダ'ボイディ- DSM 7002 6 (Candida boidinii DSM 70026)株由来の D アミノ酸酸化酵素遺伝子が組み込まれ ていることを確認した。
[0170] 上記酵素活性の測定方法に従い、プラスミド pSUCBDOlによる D—ァラニン酸ィ匕活 性を測定したところ、比活性は 4. 68UZmg—タンパク質であった。
[0171] 製造例 2
D アミノ酸酸化酵素遺伝子含有プラスミド pSUTVDO 1の構築
製造例 1に記載の方法と同様の方法を用いて、トリゴノプシス'バリアビリス CBS 409 5 (Trigonopsis variabilis CBS 4095)株を培養して菌体を調製し、菌体から染色体 D NAを分離、精製した。
特表 2001- 506868号公報（Accession No. Z50019)に記載のトリゴノプシス'バリアビ リス CBS 4095 (Trigonopsis variabilis CBS 4095)株由来の D-アミノ酸酸化酵素遺伝 子には、 ORFの内部にイントロンを含んでいるため、まず 2番目のェキソン部分のクロ 一ユングを行った。該遺伝子の第 2ェキソンの上流にあるイントロン部分の 5'_及び 3し 末端翻訳領域よりクローユング用のセンスプライマー TvDAO- e2Al (配列番号： 5)、 アンチセンスプライマー TvDAO- T2 (配列番号： 6)を合成した。
配列番号 5： GACGCCGGCGTTGCAGGTTTAACTAC
[0172] 前記トリゴノプシス'バリアビリス CBS 4095 (Trigonopsis variabilis CBS 4095)株から 精製した染色体 DNAを铸型とし、プライマー TvDAO- e2Alと TvDAO- T2を用いて製 造例 1と同様の条件で PCRを行った。 PCR反応液の一部をァガロースゲル電気泳 動により解析した結果、特異性の高い約 1. lkbpのバンドが検出された。このバンド を切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (フアルマシア製）で精製し て、第 2ェキソンを含む DNA断片を回収した。
得られた DNA断片を制限酵素 Hind IIIで消化し、ァガロースゲル電気泳動を行い、 目的とするバンド部分を切り出し、 Sephaglas Band Prep Kit (フアルマシア製）により精 製した。プラスミドベクター pUC119を制限酵素 Hind III、 Hinc IIで二重消化し、 T4 DN Aリガーゼ (タカラバイオ製)を用いて第 2ェキソンを含む DNA断片を連結してプラス ミドを形成し、大腸菌 JM109株を形質転換した。
形質転^ をアンピシリンを含む LB培地で培養し、 FlexiPrep Kit (フアルマシア製） を用 、てプラスミドを精製することによりプラスミド pUCTVDOT (図 3)を得た。
精製したプラスミド pUCTVDOTにつ 、て、プライマーウォーキング法を用いて製造 例 1に記載の条件で挿入 DNAの塩基配列を解析し、特表 2001-506868号公報 (Acc ession No. Z50019)に記載のトリゴノプシス'バリアビリス CBS 4095株由来の D-ァミノ 酸酸ィ匕酵素遺伝子の塩基配列と比較したところ、プライマー ORFの開始位置を 1位と して、 1002G→Aという 1つの塩基置換が認められた。こうして、プラスミド pUCTVDOT に、トリゴノプシス'バリアビリス CBS 4095(Trigonopsis variabilis CBS 4095)株由来の D -アミノ酸酸化酵素遺伝子の第 2ェキソン部分が組み込まれて ヽることを確認した
[0173] トリゴノプシス'バリアビリス CBS 4095(Trigonopsis variabilis CBS 4095)株染色体 DN A中に含まれる D—アミノ酸酸化酵素遺伝子中の第 1ェキソン部分を、 TvDAO-e5 (配 列番号： 7)と TvDAO- e3 (配列番号： 8)として合成した。
配列番号 7： CAGCCATGGCTAAAATCGTTGTTATTGGTG
配列番号 8： CCGGCACCAATAACAACGATTTTAGCCATGGCTG
[0174] TvDAO- e3と TvDAO- e5を各 1.25 μ mol、 0.1 mM EDTA、 10 mMトリス一塩酸緩衝 液 (pH 8.0)力らなる 50 μ L反応液を 94 °Cで 1分変性させ、次いで 61 °Cで 1分ァニー ルさせた後、制限酵素 Nco Iで消化し、フエノールークロロホルム処理後、ァガロース ゲル電気泳動を行い、 目的とするバンド部分を切り出し、 Sephaglas Band Prep Kit (フ アルマシア製）により精製して、第 2ェキソンを含む DNA断片を得た。 pUCTVDOTを 制限酵素 NgoM IV、 Hind IIIで二重消化し、ァガロースゲル電気泳動を行い、 目的と するバンド部分を切り出し、 Sephaglas Band Prep Kit (フアルマシア製）により精製して 、第 1ェキソンを含む DNA断片を得た。
製造例 1に記載の PSE420Uを制限酵素 Nco I、 Hind IIIで二重消化し、 T4 DNAリガ ーゼ (タカラバイオ製)を用いて第 1ェキソン及び第 2ェキソンを含む各 DNA断片を 連結して、トリゴノプシス'バリアビリス CBS 4095(Trigonopsis variabilis CBS 4095)株 由来の D アミノ酸酸ィ匕酵素遺伝子が組み込まれたプラスミド pSUTVDOl (図 4)を構 築した。
[0175] 上記酵素活性の測定方法に従い、プラスミド pSUTVDOlによる D ァラニン酸ィ匕活 性を測定したところ、比活性は 5. 26UZmg タンパク質であった。
[0176] 製造例 3
D アミノ酸脱水素酵素遺伝子含有プラスミド pETECDD 1の構築
ェシエリヒア'コリ JM 109 (Escherichia coli JM 109)株を LB培地で培養し、菌体を 調製した。 Nucleic Acids Res., 8, 4321 (1980)に記載の方法に従って、菌体から染色 体 DNAを分離、精製した。
J. BacterioL, 176, 1500 (1994)に記載のェシエリヒア'コリ K- 12 (Escherichia coli K -12)株由来の D-アミノ酸脱水素酵素遺伝子（Accession No. L02948)を元にクロー- ング用のセンスプライマー EcDadA-Al (配列番号： 9)、アンチセンスプライマー EcDa dA-Tl (配列番号： 10)を合成した。
配列番号 9： TGGCCATGGCTCGTGTTGTAATTCTGGGAAGTGGTGTG 配列番号 10： CAGTCTAGATTAAGAATGTGCACCATGTAAATGGCCC
[0177] 前記ェシエリヒア'コリ K-12 (Escherichia coli K-12)株から精製した染色体 DNAを 铸型とし、プライマー EcDadA-Alと EcDadA-Tlを用いて製造例 1と同様の条件で PC Rを行った。 PCR反応液の一部をァガロースゲル電気泳動により解析した結果、特 異性の高い約 1. 3kbpのバンドが検出された。このバンドを切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (フアルマシア製）で精製して目的の DNA断片を回収 した。
プラスミドベクター PUC118を制限酵素 Hinc IIで消化し、 T4 DNAリガーゼ（タカラバ ィォ製)を用いて目的の DNA断片を連結した。得られたプラスミドで大腸菌 JM109株 を形質転換し、製造例 1と同様の方法で精製することによりプラスミド pUCECDDl (図 5)を得た。
精製したプラスミド pUCECDDlにつ 、て、プライマーウォーキング法を用いて製造 例 1に記載の条件で挿入 DNAの塩基配列を解析した結果、 J. BacterioL, 176, 1500 (1994)に記載のェシエリヒア'コリ K- 12 (Escherichia coli K- 12)株由来の D-アミノ酸 脱水素酵素遺伝子の塩基配列（Accession No. L02948)と完全に一致していた。こう して、プラスミド pUCECDDlに、ェシエリヒア'コリ K— 12 (Escherichia coli K— 12)株由 来の D—アミノ酸脱水素酵素遺伝子が組み込まれて!/ヽることを確認した。
[0178] 得られた pUCECDDlを制限酵素 Nco I、 EcoR Iで二重消化し、ァガロースゲル電気 泳動を行い、 目的とするバンド部分を切り出し、 Sephaglas Band Prep Kit (フアルマシ ァ製）により精製して、 目的とする DNA断片を得た。
プラスミドベクター pET-21dを制限酵素 Nco I、 EcoR Iで二重消化し、 T4 DNAリガ一 ゼ (タカラバイオ製)を用いて目的の DNA断片を連結し、得られたプラスミドでェシェ リヒア 'コリ（Escherichia coli)BL21(DB3)pLysS株を形質転換した。製造例 1と同様の操 作を用いて形質転難よりプラスミドを精製し、ェシエリヒア'コリ K- 12 (Escherichia c oli K-12)株由来の D—アミノ酸脱水素酵素遺伝子が組み込まれたプラスミド pETEC DDI (図 6)を得た。
[0179] 精製したプラスミド pETECDD 1で形質転換されたェシエリヒア 'コリ BL21 (DB3)pLysS 株をアンピシリンとクロラムフエ-コール（25 μ g/mL)を含む LB培地中、 28°Cで終 夜培養し、 0. ImM IPTGを添加して遺伝子の発現を誘導し、更に 30°Cで 4時間 培養を行った。得られた菌体を集菌後、 0. 02% 2—メルカプトエタノールを含む 50 mM リン酸カリウム緩衝液 (PH8. 0)に懸濁して、密閉式超音波破砕装置 UCD— 2 00TM (コスモバイオ製)で破砕し、遠心分離することにより上清 (無細胞抽出液)を 回収した。得られた無細胞抽出液を用いて、上記酵素活性の測定方法に従い D—ァ ラニン酸ィ匕活性を測定したところ、その比活性は 49. 2mUZmg—タンパク質であつ た。
[0180] 製造例 4
ギ酸脱水素酵素変異体遺伝子含有プラスミド PSU-MF26の構築 マイコバクテリゥム ·パッカェ（Mycobacterium vaccae)由来のギ酸脱水素酵素遺伝 子の変異体遺伝子を含む発現プラスミド PSE-MF26 (特開 2003— 199595号公報） を制限酵素 Nco Iと Xba Iで二重消化し、フエノールークロロホルム処理後、ァガロース ゲル電気泳動を行い、 目的とするバンド部分を切り出し、 Sephaglas Band Prep Kit (フ アルマシア製）により精製した。得られた DNA断片と、同じ制限酵素 Nco Iと Xba Iで 消化したプラスミド PSE420U (製造例 1)と T4リガーゼ (タカラバイオ製)を用いて連結し てプラスミドを得た。得られたプラスミドで大腸菌 JM109株を形質転換し、アンピシリン を含む LB培地で培養して選別した形質転換株よりプラスミドを精製することにより、マ ィコバタテリゥム.パッカェ（Mycobacterium vaccae)由来のギ酸脱水素酵素の変異体 遺伝子を組み込んだ PSU-MF26 (図 7)を得た。
[0181] 製造例 5
2遺伝子含有プラスミド pSF-GSA2の構築 (Lーァラニン脱水素酵素とギ酸脱水素酵 素）
Biochemistry, 29, 1009 (1990)に記載のジォバチルス'ステア口サーモフィラス IFO 12550 (Geobacillus stearothermophilus IFO 12550)株由来の Lーァラニン脱水素酵 素遺伝子の塩基配列（Accession No. M33299)よりクロー-ング用のセンスプライマ 一 BstAlaDH-Al (配列番号： 11)とアンチセンスプライマー BstAlaDH- T1 (配列番号： 12)を合成した。
AACAATG
[0182] Biochemistry, 29, 1009 (1990)に記載のジォバチルス'ステアロサーモフィラス IFO 12250株由来のロイシン脱水素酵素発現プラスミド pICD301を铸型とし、センスプライ マー BstAlaDH-Alとアンチセンスプライマー BstAlaDH- T1を用いて製造例 1に記載 の方法に従つて PCRを行つた。 PCR反応液の一部をァガロースゲル電気泳動により 解析した結果、特異的な約 1. lkbpのバンドが検出された。このバンドを切り出し、 G FX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (フアルマシア製）で精製した後、制限酵 素 EcoR I、 Hind IIIで二重消化し、フエノールークロロホルム処理後、ァガロースゲル 電気泳動を行い、 目的とするバンド部分を切り出し、 Sephaglas Band Prep Kit (フアル マシア製）により精製して、 目的の DNA断片を得た。
[0183] 製造例 4で得た pSU- MF26を制限酵素 EcoR I、 Hind IIIで二重消化し、 T4 DNAリガ ーゼ (タカラバイオ製)を用いて目的の DNA断片を連結した。得られたプラスミドで大 腸菌 JM109株を形質転換し、製造例 1と同様の方法で精製することによりプラスミド pS F-GSA2 (図 8)を得た。
精製したプラスミド pSF- GSA2につ 、て、プライマーウォーキング法を用いて製造例 1に記載の条件で挿入 DNAの塩基配列を解析し、 Biochemistry, 29, 1009 (1990)に 記載のジォバチルス'ステアロサーモフィラス IFO 12550株の塩基配列と比較したと ころ、 20塩基の置換、 3塩基の欠失、 3塩基の挿入が認められた。これに伴い、 16アミ ノ酸の置換、 1アミノ酸の欠失、 1アミノ酸の挿入が起きていた。得られた塩基配列を配 列番号： 13に示す。こうして、プラスミド pSF- GSA2に、ジォバチルス'ステア口サーモ フィラス IFO 12550 (Geobacillus stearothermophilus IFO 12550)株由来の L ァラ- ン脱水素酵素遺伝子とマイコバクテリゥム 'パッカェ（Mycobacterium vaccae)由来ギ 酸脱水素酵素の変異体遺伝子とが組み込まれていることを確認した。
[0184] 上記酵素活性の測定方法に従い、プラスミド pSF-GSA2による L ァラニン酸ィ匕活 性とギ酸酸ィ匕活性を測定したところ、その比活性はそれぞれ 2. 40UZmg タンパ ク質、 0. 74UZmg タンパク質であった。
[0185] 製造例 6
2遺伝子含有プラスミド pSF-BTAlの構築 (Lーァラニン脱水素酵素とギ酸脱水素酵 素）
Biochimie, 71, 559 (1989)に記載のバチルス'サーモカテ-ユラタス DSM 730 (Bacil lus thermocatenulatus DSM 730)株由来のァラニン脱水素酵素遺伝子の塩基配列よ りクロー-ング用のセンスプライマー BthAlaDH-Al (配列番号： 14)とアンチセンスプ ライマー BthAlaDH-Tl (配列番号： 15)を合成した。
配列番号 14： GAGGAATTCTATTCATGATTATTGGTGTGCCAAAGGAA 配列番号 15： CAGAAGCTTCTAGATTAATTAGCAGCCAACGTTTTCC
[0186] プラスミド pKUAD103を铸型とし、センスプライマー BthAlaDH- A1とアンチセンスプラ イマ一 BthAlaDH- Tlを用いて製造例 1記載の方法に従って PCRを行った。 PCR反 応液の一部をァガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異性の高い約 1.2 kbp のバンドが検出された。このバンドを切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purifica tion Kit (フアルマシア製)で精製した後、制限酵素 EcoR I、 Hind IIIで二重消化し、フ エノールークロロホルム処理後、ァガロースゲル電気泳動を行い、 目的とするバンド 部分を切り出し、 Sephaglas Band Prep Kit (フアルマシア製）により精製して、 目的の D NA断片を得た。
[0187] 製造例 4で得た pSE-MF26を制限酵素 EcoR I、 Hind IIIで二重消化し、 T4 DNAリガ ーゼ (タカラバイオ製)を用いて目的の DNA断片を連結した。得られたプラスミドで大 腸菌 JM109株を形質転換し、製造例 1と同様の方法で精製することによりプラスミド pS F-BTA1 (図 9)を得た。
精製したプラスミド pSF-BTAlにつ!/、て、プライマーウォーキング法を用いて挿入 DN Aの塩基配列を解析した結果、 Biochimie, 71, 559 (1989)に記載のバチルス'サーモ カテ-ユラタス DSM 730 (Bacillus thermocatenulatus DSM 730)株由来の L—ァラ- ン脱水素酵素遺伝子の塩基配列と完全に一致した。こうして、プラスミド pSF-BTAlに 、バチルス'サーモカテ-ユラタス DSM 730 (Bacillus thermocatenulatus DSM 730) 株由来の L -ァラニン脱水素酵素遺伝子とマイコバクテリゥム .パッカェ（Mycobacteri 醒 vaccae)由来ギ酸脱水素酵素の変異体遺伝子とが組み込まれていることを確認し た。
[0188] 25°Cで終夜培養した点以外は、上記酵素活性の測定方法に従ってプラスミド pSF- BTA1を用いて無細胞抽出液を調製し、 L—ァラニン酸ィ匕活性とギ酸酸ィ匕活性を測 定したところ、その比活性はそれぞれ 3. 38U/mg—タンパク質、 1. 24UZmg—タ ンパク質であった。
[0189] 製造例 7
2遺伝子含有プラスミド pSFBPADlの構築 (Lーァラニン脱水素酵素とギ酸脱水素酵 素）
ノ チルス'スフエリカス IFO 3525 (Bacillus sphaericus IFO 3525)株を LB培地で培 養し、菌体を調製した。 Genome tip 100 (Qiagen製）を用いて菌体力 染色体 DNAを 分離、精製した。
Biochemistry, 29, 1009 (1990)に記載のバチルス.スフエリカス IFO 3525 (Bacillus s phaericus IFO 3525)株由来ァラニン脱水素酵素遺伝子の塩基配列（Accession No. M33298)を元にセンスプライマー BspAlaDH-Al (配列番号： 16)とアンチセンスプライ マー BspAlaDH- T1 (配列番号： 17)を合成した。
ACAACG
TGG
前記バチルス 'スフエリカス IFO 3525 (Bacillus sphaericus IFO 3525)株から精製し た染色体 DNAを铸型とし、プライマー BspAlaDH- A1と BspAlaDH- T1を用いて製造 例 1と同様の条件で PCRを行った。 PCR反応液の一部をァガロースゲル電気泳動に より解析した結果、特異性の高い約 1. lkbpのバンドが検出された。このバンドを切り 出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (フアルマシア製）で精製した後、 制限酵素 EcoR I、 Hind IIIで二重消化し、フエノールークロロホルム処理後、ァガロー スゲル電気泳動を行い、 目的とするバンド部分を切り出し、 Sephaglas Band Prep Kit ( ファノレマシア製）により精製して、 目的の DNA断片を得た。
製造例 4で得た pSU- MF26を制限酵素 EcoR I、 Hind IIIで二重消化し、 T4 DNAリガ ーゼ (タカラバイオ製)を用いて連結した。得られたプラスミドで大腸菌 JM109株を形 質転換し、製造例 1と同様の方法で精製することによりプラスミド pSFBPADl (図 10)を 得た。
精製したプラスミド pSFBPADlにつ 、て、プライマーウォーキング法を用いて製造例 1に記載の条件で挿入 DNAの塩基配列を解析し、 Biochemistry, 29, 1009 (1990)に 記載のバチノレス'スフエリカス IFO 3525 (Bacillus sphaericus IFO 3525)株の塩基配 列（Accession No. M33298)と比較すると、 ORFの開始位置を 1位として、 99GT→TG 、 119G→C、 150G→T、 537G→C、 888T→Cという 6塩基の置換、 96G、 103G、 104C、 169G、 297C、 505Cという 6塩基の欠失、 186CA→CAA、 302CT→CGT、 499CA→CA Aという 3塩基の挿入が認められた。その塩基配列を配列番号： 18に示す。こうして、 プラスミド pSFBPADlに、ノ チルス'スフエリカス IFO 3525 (Bacillus sphaericus IFO 3 525)株由来の L ァラニン脱水素酵素遺伝子とマイコバクテリゥム ·パッカェ (Mycob acterium vaccae)由来ギ酸脱水素酵素の変異体遺伝子とが組み込まれていることを 確認した。
[0191] 25°Cで終夜培養した点以外は、上記酵素活性の測定方法に従い、プラスミド pSFB PAD1を用いて無細胞抽出液を調製し、 L ァラニン酸ィ匕活性とギ酸酸ィ匕活性を測 定したところ、その比活性はそれぞれ 8. 44UZmg タンパク質、 0. 83UZmg タ ンパク質であった。
[0192] 製造例 8
2遺伝子含有プラスミド pSF-SADlの構築 (Lーァラニン脱水素酵素とギ酸脱水素酵 素）
Appl. Environ. MictobioL, 65, 4014 (1999)に記載のシエワネラ.スピーシーズ AclO (Shewanella sp. AclO)株由来の L ァラニン脱水素酵素遺伝子を有するプラスミド p SheAlaDH2の塩基配列（Accession No. AF070715)を元に、センスプライマー SheAla DH-A2 (配列番号： 19)とアンチセンスプライマー SheAlaDH- T2 (配列番号： 20)を合 成した。
プラスミド pSheAlaDH2を铸型とし、センスプライマー SheAlaDH- A2とアンチセンスプ ライマー SheAlaDH-T2を用いて製造例 1記載の方法に従って PCRを行った。 PCR反 応液の一部をァガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異性の高い約 1. lkb pのバンドが検出された。このバンドを切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purific ation Kit (フアルマシア製)で精製した後、制限酵素 EcoR I、 Hind IIIで二重消化し、 フエノールークロロホルム処理後、ァガロースゲル電気泳動を行い、 目的とするバンド 部分を切り出し、 Sephaglas Band Prep Kit (フアルマシア製）により精製して、 目的の D NA断片を得た。
製造例 4で得た pSE-MF26を制限酵素 EcoR I、 Hind IIIで二重消化し、 T4 DNAリガ ーゼ (タカラバイオ製)を用いて目的の DNA断片を連結した。得られたプラスミドで大 腸菌 JM109株を形質転換し、製造例 1と同様の方法で精製することによりプラスミド pS F- SAD1 (図 11)を得た。
[0193] 精製したプラスミド pSF-SADlにつ!/、て、プライマーウォーキング法を用いて挿入 DN Aの塩基配列を解析した結果、 Appl. Environ. MictobioL, 65, 4014 (1999)に記載の 塩基配列と完全に一致した。こうして、プラスミド pSF- SAD1に、シヱワネラ 'スピーシー ズ AclO (Shewanella sp. AclO)株由来の Lーァラニン脱水素酵素遺伝子とマイコバ クテリゥム 'パッカェ（Mycobacterium vaccae)由来ギ酸脱水素酵素の変異体遺伝子と が組み込まれて ヽることを確認した。
[0194] 25°Cで終夜培養した点以外は、上記酵素活性の測定方法に従い、プラスミド pSF- SAD1を用いて無細胞抽出液を調製し、 Lーァラニン酸ィ匕活性とギ酸酸ィ匕活性を測定 したところ、その比活性はそれぞれ 3. 50U/mg—タンパク質、 1. 02U/mg—タン ノ ク質であった。
[0195] 製造例 9
2遺伝子含有プラスミド pFGSLEDlの構築 (L—ロイシン脱水素酵素とギ酸脱水素酵 素） ジォバチルス 'ステアロサーモフィラス IFO 12550 (Geobacillus stearohtermophil us IFO 12550)株を LB培地で培養し、菌体を調製した。 Genome tip 100 (Qiagen製） を用いて菌体からの染色体 DNAを分離、精製した。
Biochemistry, 27, 9056 (1988)に記載のジォバチルス'ステア口サーモフィラス IFO 12550 (Geobacillus stearohtermophilus IFO 12550)株由来の L一口イシン脱水素酵 素遺伝子の塩基配列（Accession No. M22977)を元に、センスプライマー GSTLEUD H-A2 (配列番号： 21)とアンチセンスプライマー GSTLEUDH- T2 (配列番号： 22)を合 成した。
AACTTACGATTATGAGC
配列番号 22： CTGAAGCTTCTAGATTATATTGCCGAAGCACCTGCC
前記ジォバチルス'ステア口サーモフィラス IFO 12550 (Geobacillus stearohtermop hilus IFO 12550)株由来の染色体 DNAを铸型とし、センスプライマー GSTLEUDH-A2 とアンチセンスプライマー GSTLEUDH- T2を用いて製造例 1記載の方法に従って PC Rを行った。 PCR反応液の一部をァガロースゲル電気泳動により解析した結果、特 異性の高い約 1. 3kbpのバンドが検出された。このバンドを切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (フアルマシア製）で精製した後、制限酵素 Xba I、 Not Iで二重消化し、フエノールークロロホルム処理後、ァガロースゲル電気泳動を行い、 目的とするバンド部分を切り出し、 Sephaglas Band Prep Kit (フアルマシア製）により精 製して、 目的の DNA断片を得た。また、残りの PCR反応液の一部を制限酵素 Not I、 Hind IIIで二重消化し、上記と同様の方法で精製して DNA断片を調製した。
PSE420D (特開 2000— 189170号公報）を制限酵素 Xba Iと Hind IIIで二重消化し、 T4 DNAリガーゼ (タカラノィォ製)を用いて上記の 2種類の DNA断片を連結した。得 られたプラスミドで大腸菌 JM109株を形質転換し、製造例 1と同様の方法で精製する ことによりプラスミド pEGSLED2 (図 12)とした。
精製したプラスミドを用い、プライマーウォーキング法を用いて製造例 1に記載の条 件で挿入 DNAの塩基配列を解析し、 Biochemistry, 27, 9056 (1988)記載の登録配 列 (M22977)と比較したところ、同登録配列の 3'-末端に 186bpの非翻訳配列の挿入 が認められた。その塩基配列を配列番号： 23に示す。こうして、プラスミド pEGSLED2 に、ジォバチルス'ステア口サーモフィラス IF0 12550 (Geobacillus stearohtermophilu s IFO 12550)株由来の L一口イシン脱水素酵素遺伝子を組み込まれていることを確 piじ (し/こ。
ジォバチルス'ステア口サーモフィラス IF0 12550 (Geobacillus stearohtermophilus IFO 12550)株由来の L ロイシン脱水素酵素遺伝子の中間部分及び 3'-末配列を元 に、クローユング用のセンスプライマー GstLeuDH-Sall (配列番号： 24)とアンチセン スプライマー GstLeuDH- TAA1 (配列番号： 25)を合成した。
配列番号 24： GCGGTCGACCCGAACGAC
配列番号 25： CTGAAGCTTCTAGATTAACGTGCACGACGGCGGCTTAA
前記プラスミド PLGSLED2を铸型とし、センスプライマー GstLeuDH- Sailとアンチセン スプライマー GstLeuDH- TAA1を用いて製造例 1記載の方法に従って PCRを行った 。 PCR反応液の一部をァガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異性の高い 約 0. 7kbpのバンドが検出された。このバンドを切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Ba nd Purification Kit (フアルマシア製）で精製した後、制限酵素 Sal I、 Hind IIIで二重消 化し、フエノールークロロホルム処理後、ァガロースゲル電気泳動を行い、 目的とする バンド部分を切り出し、 Sephaglas Band Prep Kit (フアルマシア製）により精製して、 目 的の DNA断片を得た。また、前記プラスミド pLGSLED2を制限酵素 Xba Iと Sal Iで二 重消化し、前記と同様の方法で精製して DNA断片を調製した。
製造例 4で得た pSU- MF26を制限酵素 Xba Iと Hind IIIで二重消化し、 T4 DNAリガ ーゼ (タカラバイオ製)を用いて上記 2種の DNA断片を連結した。得られたプラスミド で大腸菌 JM109株を形質転換し、製造例 1と同様の方法で精製することによりプラスミ ド pFGSLEDl (図 13)を得た。
精製したプラスミド pFGSLEDlにつ 、て、プライマーウォーキング法を用いて製造例 1に記載の条件で挿入 DNAの塩基配列を解析したところ、プラスミド pFGSLEDlに、 配列番号： 23に示す塩基配列からなるジォバチルス 'ステアロサーモフィラス IFO 12 550 (Geobacillus stearohtermophilus IFO 12550)株由来の L一口イシン脱水素酵素 遺伝子とマイコバクテリゥム 'パッカェ（Mycobacterium vaccae)由来ギ酸脱水素酵素 の変異体遺伝子とが組み込まれていることを確認した。
[0197] 24°Cで終夜培養した点以外は、上記酵素活性の測定方法に従い、プラスミド pFGS LED1を用いて無細胞抽出液を調製し、 L—ロイシン酸ィ匕活性とギ酸酸ィ匕活性を測定 したところ、その比活性はそれぞれ 4. 03U/mg—タンパク質、 0. 63U/mg—タン ノ ク質であった。
[0198] 製造例 10
2遺伝子含有プラスミド pSFBPLDlの構築 (L一口イシン脱水素酵素とギ酸脱水素酵 素）
DDBJ/EMBL/GenBankデータベースに記載のバチルス 'スフエリカス（Bacillus spha ericus)由来の L一口イシン脱水素酵素遺伝子の塩基配列（Accession No. AB103119 )を元に、センスプライマー BspLeuDH-Al (配列番号： 26)とアンチセンスプライマー BspLeuDH-Tl (配列番号： 27)を合成した。
G TTTTTAAGAACTG
製造例 7で調製したバチルス 'スフエリカス（Bacillus sphaericus) IFO 3525株由来の 染色体 DNAを铸型とし、センスプライマー BspLeuDH-Alとアンチセンスプライマー Bs pLeuDH-Tlを用いて製造例 1記載の方法に従って PCRを行った。 PCR反応液の一 部をァガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異性の高い約 1. lkbpのバンド が検出された。このバンドを切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit ( フアルマシア製)で精製した後、制限酵素 EcoR I、 All IIで二重消化し、フエノール— クロ口ホルム処理後、ァガロースゲル電気泳動を行い、 目的とするバンド部分を切り 出し、 Sephaglas Band Prep Kit (フアルマシア製）により精製して、 目的の DNA断片を 得た。
製造例 4で得た pSU-MF26を制限酵素で二重消化し、 T4 DNAリガーゼ (タカラバイ ォ製)を用いて目的の DNA断片を連結した。得られたプラスミドで大腸菌 JM109株を 形質転換し、製造例 1と同様の方法で精製することによりプラスミド pSFBPLDl (図 14) を得た。
精製したプラスミドを用い、プライマーウォーキング法を用いて製造例 1に記載の条 件で挿入 DNAの塩基配列を解析したところ、 DDBJ/EMBL/GenBankデータベース に記載のバチルス 'スフエリカス（Bacillus sphaericus)由来の L一口イシン脱水素酵素 遺伝子の塩基配列（Accession No. AB103119)と完全に一致した。こうして、プラスミ ド pSFBPLDlに、ノ チルス'スフエリカス（Bacillus sphaericus) IFO 3525株由来の L— ロイシン脱水素酵素遺伝子が組み込まれていることを確認した。
[0199] 24°Cで終夜培養した点以外は、上記酵素活性の測定方法に従い、プラスミド pSFB PLD 1を用 ヽて無細胞抽出液を調製し、 L ロイシン酸ィ匕活性とギ酸酸ィ匕活性を測定 したところ、その比活性はそれぞれ 5. 76UZmg タンパク質、 0. 54UZmg タン ノ ク質であった。
[0200] 製造例 11
2遺伝子含有プラスミド pSF-TIP2の構築 (フエ二ルァラニン脱水素酵素とギ酸脱水 素酵素） サーモアクチノマイセス.インターメディウス IFC) 14230 (Thermoactinomyces interm edius IFO 14230)株を M— 64培地（1% ペプトン、 0. 25% 酵母エキス、 0. 2% 肉エキス、 0. 2% グリセロール、 0. 2% 塩ィ匕ナトリウム、 0. 2% リン酸水素二カリ ゥム、 0. 2% リン酸二水素カリウム、 0. 01% 硫酸マグネシウム七水和物、痕跡量 のピオチン（20mgZl00mLを培地 1Lにっき 2 、 pH7. 2)を用いて 55°Cで培 養し、菌体を調製した。 Methods EnzymoL, 152, 116 (1987)に記載の方法に従って 菌体から染色体 DNAを精製した。
J. Biochem., 109, 371 (1991)に記載のサーモアクチノマイセス'インターメディウス I FO 14230 (Thermoactinomyces intermedius IFO14230)株由来フエ-ルァラニン脱水 素酵素遺伝子の塩基配列（Accession No. D00631)を元に、センスプライマー TIP- A TGI (配列番号： 28)とアンチセンスプライマー TIP-TAA1 (配列番号： 29)を合成した
CCAA
前記サーモアクチノマイセス'インターメディウス IFO 14230(Thermoactinomyces int ermedius IFO 14230)株由来の染色体 DNAを铸型とし、センスプライマー TIP-ATG1 とアンチセンスプライマー TIP-TAA1を用 V、て製造例 1記載の方法と同様の方法によ り PCRを行った。 PCR反応液の一部をァガロースゲル電気泳動により解析した結果 、特異的な約 1. lkbpのバンドが検出された。このバンドを切り出し、フエノール一ク ロロホルム沈殿し、エタノール沈殿して DNA断片を回収した後、制限酵素 EcoR I、 Hi nd IIIで二重消化し、フエノールークロロホルム処理後、ァガロースゲル電気泳動を行 い、 目的とするバンド部分を切り出し、 Sephaglas Band Prep Kit (フアルマシア製）によ り精製して、 目的の DNA断片を得た。
製造例 1で調製した PSE420Uを制限酵素 EcoR I、 Hind IIIで二重消化し、 T4 DNAリ ガーゼ (タカラバイオ製)を用いて目的の DNA断片を連結した。得られたプラスミドで 大腸菌 JM109株を形質転換し、製造例 1と同様の方法で精製することによりプラスミド pSU- TIP2 (図 15)を得た。 [0202] 精製したプラスミド pSU- TIP2につ 、て、プライマーウォーキング法を用いて製造例 1 に記載の条件で挿入 DNAの塩基配列を解析し、 J. Biochem., 109, 371 (1991)に記 載のサーモアクチノマイセス.インターメディウス IF0 14230 (Thermoactinomyces inte rmedius IFO 14230)株由来の L フエ-ルァラニン脱水素酵素遺伝子の塩基配列（A ccession No. D00631)と比較したところ、 ORFの開始位置を 1位として、 431AG→GC (Lysl44→Ser)、 846T→G (Cys282→Trp)という 2つのアミノ酸置換を含む塩基置換が 認められた。こうして、プラスミド pSU- TIP2に、サーモアクチノマイセス'インターメディ ウス IFO 14230 (Thermoactinomyces intermedius IFO14230)株由来の L—フエ-ル ァラニン脱水素酵素遺伝子が組み込まれていることを確認した。
[0203] 製造例 4で得たプラスミド pSE-MF26を制限酵素 Nco I、 EcoR Iで二重消化し、フエノ 一ルークロロホルム処理後、ァガロースゲル電気泳動を行い、 目的とするバンド部分 を切り出し、 Sephaglas Band Prep Kit (フアルマシア製）により精製して、 目的の DNA 断片を得た。プラスミド pSU- TIP2を制限酵素 Nco I、 EcoR Iで二重消化し、 T4 DNAリ ガーゼ (タカラバイオ製)を用いて目的の DNA断片を連結した。得られたプラスミドで 大腸菌 JM109株を形質転換し、製造例 1と同様の方法で精製することにより、サーモ ァクチノマイセス 'インターメディウス IFO 14230 (Thermoactinomyces intermedius IF O 14230)株由来の L—フエ-ルァラニン脱水素酵素とマイコバクテリゥム'パッカェ（ Mycobacterium vaccae)由来のギ酸脱水素酵素遺伝子とが組み込まれたプラスミド pS F- TIP2 (図 16)を得た。
[0204] 24°Cで終夜培養した点以外は、上記酵素活性の測定方法に従い、プラスミド pSF- TIP2を用いて無細胞抽出液を調製し、 L—フエ二ルァラニン酸ィ匕活性とギ酸酸ィ匕活 性を測定したところ、その比活性はそれぞれ 9. 56UZmg タンパク質、 0. 76U/ mg タンパク質であった。
[0205] 製造例 12
分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素遺伝子含有プラスミド pSE-ECBlの構築 J. Biochem., 97, 993 (1985)に記載のェシエリヒア'コリ K- 12(Escherichia coli K- 12) 株由来の分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素遺伝子の塩基配列 (Accession No. X0241 3)を元に、センスプライマー EcBCA-Al (配列番号： 30)とアンチセンスプライマー Ec BCA-T1 (配列番号： 31)を合成した。
製造例 3で調製したェシエリヒア'コリ (Escherichia coli) JM 109株由来の染色体 DNA を铸型とし、センスプライマー EcBCA- A1とアンチセンスプライマー EcBCA- T1を用い て製造例 1と同様の条件で PCRを行った。 PCR反応液の一部をァガロースゲル電気 泳動により解析した結果、特異性の高いバンドが検出された。このバンドを切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (フアルマシア製）で精製した後、制限 酵素 BspH I、 Xba Iで二重消化し、フエノールークロロホルム処理後、ァガロースゲル 電気泳動を行い、 目的とするバンド部分を切り出し、 Sephaglas Band Prep Kit (フアル マシア製）により精製して目的の DNA断片を得た。
PSE420D (特開 2000— 189170号公報）を制限酵素 Nco Iと Xba Iで二重消化し、 T 4 DNAリガーゼ (タカラバイオ製)を用いて目的の DNA断片を連結した。得られたプ ラスミドで大腸菌 JM109株を形質転換し、製造例 1と同様の方法で精製することにより プラスミド pSE-ECBl (図 17)を得た。
精製したプラスミド pSFBPADlにつ 、て、プライマーウォーキング法を用いて製造例 1に記載の条件で挿入 DNAの塩基配列を解析したところ、 J. Biochem., 97, 993 (19 85)に記載のェシエリヒア'コリ K- 12(Escherichia coli K- 12)株由来の分岐鎖アミノ酸ァ ミノ基転移酵素遺伝子の塩基配列 (Accession No. X02413)と完全に一致した。こうし て、プラスミド pSE- ECB1に、ェシエリヒア'コリ K- 12(Escherichia coli K- 12)株由来の分 岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素遺伝子が組み込まれていることを確認した。
[0206] 24°Cで終夜培養した点以外は、上記酵素活性の測定方法に従い、プラスミド pSE- ECB 1を用 、て無細胞抽出液を調製し、上記酵素活性の測定方法に従!、アミノ基転 移活性をを測定したところ、その比活性は 1. 44U/mg—タンパク質であった。
[0207] 製造例 13
分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素遺伝子含有プラスミド pSE-BSBlの構築 バチルス 'サブチリス DB 104 (Bacillus subtilis DB 104)株を LB培地で培養し、菌 体を調製した。 Nucleic Acids Res., 8, 4321 (1980)に記載の方法に従って菌体からの 染色体 DNAを分離、精製した。
J. BacterioL, 179, 496 (1997)に記載のバチルス 'サブチリス（Bacillus subtilis)由来 の分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素の塩基配列 (Z49992)を元に、プライマー BsBCA- A1 (配列番号： 32)とアンチセンスプライマー BsBCA-Tl (配列番号： 33)を合成した。 配列番号 32： TGATCATGACTAAACAAACAATTCGCGTTGA
配列番号 33： GCTTCTAGATTATTTACTTTCAGTCAGCGCTGCGA
前記バチルス 'サブチリス DB 104 (Bacillus subtilis DB 104)株由来の染色体 DNA を铸型とし、センスプライマー BsBCA-Alとアンチセンスプライマー BsBCA-Tlを用い て製造例 1記載の方法に従って PCRを行った。 PCR反応液の一部をァガロースゲル 電気泳動により解析した結果、特異性の高いバンドが検出された。このバンドを切り 出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (フアルマシア製）で精製した後、 制限酵素 BspH I、 Xba Iで二重消化し、フエノールークロロホルム処理後、ァガロース ゲル電気泳動を行い、 目的とするバンド部分を切り出し、 Sephaglas Band Prep Kit (フ ァノレマシア製）により精製して、 目的の DNA断片を得た。
PSE420D (特開 2000— 189170号公報）を制限酵素 Nco Iと Xba Iで二重消化し、 T 4 DNAリガーゼ (タカラバイオ製)を用いて目的の DNA断片と連結した。、大腸菌 JM1 09株を形質転換した。得られたプラスミドで大腸菌 JM109株を形質転換し、製造例 1と 同様の方法で精製することによりプラスミド pSE-BSBl (図 18)とした。
精製したプラスミドを用い、プライマーウォーキング法を用いて製造例 1に記載の条 件で挿入 DNAの塩基配列を解析し、 J. BacterioL, 179, 496 (1997)に記載のバチル ス 'サブチリス (Bacillus subtilis)由来の分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素の塩基配列（ Z49992)と比較したところ、 ORFの開始位置を 1位として、 177A→G、 178A→G (Thr60 →Ala)という 1つのアミノ酸置換を含む 2つの塩基置換が認められた。こうして、プラス ミド pSE- BSB1〖こ、バチルス 'サブチリス（Bacillus subtilis)由来の分岐鎖アミノ酸ァミノ 基転移酵素遺伝子が組み込まれていることを確認した。
24°Cで終夜培養した点以外は、上記酵素活性の測定方法に従い、プラスミド pSE- BSB 1を用 、て無細胞抽出液を調製し、上記酵素活性の測定方法に従!、アミノ基転 移活性を測定したところ、その比活性は 0. 30UZmg—タンパク質であった。 [0209] 製造例 14
DL ノルパリンから 2—ォキソペンタン酸の製造
製造例 1で得たプラスミド pSUCBDOlで大腸菌 HB101株を形質転換し、得られた 形質転換体を 2 XYT培地（2% パクトトリプトン、 1% バクト酵母エキス、 1% 塩ィ匕 ナトリウム、 PH7. 2)を用いて 33°Cで終夜培養した。培地に 0. ImM IPTGを添カロ して D アミノ酸酸化酵素遺伝子の発現を誘導した後、菌体を集菌して、 D—ァミノ 酸酸化酵素を発現する大腸菌を得た。
基質の各終濃度が 1重量％ (85mM)、 4重量％ (341mM)、 10重量％ (850mM )となるように DL ノルパリン (ノルパリンの鏡像異性体混合物）を加えた 3つの反応 容器に、それぞれ 400mM リン酸カリウム緩衝液 (PH8. 0)と、培養液 10g分力、ら調 製した菌体とを加えて総重量 10gの反応液を調製し、振盪しながら 30°Cで終夜反応 を行った。反応液から 0. lgずつサンプルとして採取し、後述するノルパリンの分析条 件 1に基づき反応液中に含まれるノルパリンの光学純度分析と定量を行った。その結 果を表 1に示す。
[0210] 製造例 15
製造例 14において、プラスミドとして、製造例 1で得た pSUCBDOlの代わりに製造 例 2で得た pSUTVDO 1を用 ヽた点以外は製造例 14と同様の操作を行って D -ァミノ 酸酸化酵素を発現する大腸菌を調製した。得られた大腸菌を用いて、製造例 14と同 様の方法で反応を行!ヽ、反応液中に含まれるノルパリンの光学純度分析と定量を行 つた。その結果を表 1に示す。
[0211] 製造例 16
製造例 3で得たプラスミド pETECDDlで大腸菌 BL21(DE3)pLysS株を形質転換し、 得られた形質転換体を 2 XYT培地（2% ノクトトリプトン、 1% ノタト酵母エキス、 1 % 塩化ナトリウム、 pH7. 2)を用いて 33°Cで終夜培養した。培地に 0. ImM IPT Gを添加して D アミノ酸脱水素酵素遺伝子の発現を誘導した後、菌体を集菌して、 D アミノ酸脱水素酵素を発現する大腸菌を得た。
基質の各終濃度が 1重量％ (85mM)、 4重量％ (341mM)となるように DL ノル ノ リン (ノルパリンの鏡像異性体混合物）を加えた 2つの反応容器に、それぞれ 400m M リン酸カリウム緩衝液 (pH8. 0)と、培養液 10g分力も調製した菌体とを加えて総 重量 10gの反応液を調製し、振盪しながら 30°Cで終夜反応を行った。反応液から 0. lgずつサンプルとして採取し、後述するノルパリンの分析条件 1に基づき反応液中に 含まれるノルパリンの光学純度分析と定量を行った。その結果を表 1に示す。
[0212] 製造例 17
2 ォキソペンタン酸力 L ノルパリンの製造 (L アミノ酸脱水素酵素利用） 製造例 5で得たプラスミド pSF-GSA2で大腸菌 HB101株を形質転換し、得られた形 質転換体を 2 XYT培地 (製造例 14と同様)を用いて 33°Cで終夜培養した。培地に 0 . ImM IPTGを添加して Lーァラニン脱水素酵素遺伝子の発現を誘導した後、菌 体を集菌して、 Lーァラニン脱水素酵素とギ酸脱水素酵素を共発現する大腸菌を得 た。
2 ォキソペンタン酸ナトリウム塩を各終濃度 2重量％ (145mM)、 4重量％ (290m M)、 10重量0 /0 (724mM)、ギ酸ナトリウムを各終濃度 174mM、 348mM、 869mM となるように加えた 3つの反応容器に、それぞれ 400mM リン酸カリウム緩衝液 (PH 8. 0)と、培養液 10g分力も調製した菌体とを加えて総重量 10gの反応液を調製し、 振盪しながら 30°Cで終夜反応を行った。反応液から 0. lgずつサンプルとして採取し 、ノルバリンの分析条件 1に基づき反応液中に含まれるノルパリンの光学純度分析と 定量を行った。その結果を表 2に示す。
[0213] 製造例 18
製造例 17において、プラスミドとして、製造例 5で得た pSF-GSA2の代わりに製造例 6で得た pSF-BTAlを用 、た点以外は製造例 17と同様の操作を行って L -了ラニン 脱水素酵素とギ酸脱水素酵素を共発現する大腸菌を調製した。得られた大腸菌を 用いて、製造例 17と同様の方法で反応を行い、反応液中に含まれるノルパリンの光 学純度分析と定量を行った。その結果を表 2に示す。
[0214] 製造例 19
製造例 17において、プラスミドとして、製造例 5で得た pSF-GSA2の代わりに製造例 7で得た pSFBPAD 1を用 、た点以外は製造例 17と同様の操作を行って L -了ラニン 脱水素酵素とギ酸脱水素酵素を共発現する大腸菌を調製した。得られた大腸菌を 用いて、製造例 17と同様の方法で反応を行い、反応液中に含まれるノルパリンの光 学純度分析と定量を行った。その結果を表 2に示す。
[0215] 製造例 20
製造例 17において、プラスミドとして、製造例 5で得た pSF-GSA2の代わりに製造例 8で得た pSF-SADlを用いた点以外は製造例 17と同様の操作を行って L ァラニン 脱水素酵素とギ酸脱水素酵素を共発現する大腸菌を調製した。得られた大腸菌を 用いて、製造例 17と同様の方法で反応を行い、反応液中に含まれるノルパリンの光 学純度分析と定量を行った。その結果を表 2に示す。
[0216] 製造例 21
製造例 17において、プラスミドとして、製造例 5で得た pSF-GSA2の代わりに製造例 9で得た pFGSLEDlを用いた点以外は製造例 17と同様の操作を行って L ロイシン 脱水素酵素とギ酸脱水素酵素を共発現する大腸菌を調製した。得られた大腸菌を 用いて、製造例 17と同様の方法で反応を行い、反応液中に含まれるノルパリンの光 学純度分析と定量を行った。その結果を表 2に示す。
[0217] 製造例 22
製造例 17において、プラスミドとして、製造例 5で得た pSF-GSA2の代わりに製造例 10で得た pSFBPLD 1を用 、た点以外は製造例 17と同様の操作を行って L -ロイシン 脱水素酵素とギ酸脱水素酵素を共発現する大腸菌を調製した。得られた大腸菌を 用いて、製造例 17と同様の方法で反応を行い、反応液中に含まれるノルパリンの光 学純度分析と定量を行った。その結果を表 2に示す。
[0218] 製造例 23
製造例 17において、プラスミドとして、製造例 5で得た pSF-GSA2の代わりに製造例 11で得た PSF-TIP2を用 、た点以外は製造例 17と同様の操作を行って L -アミノ酸 脱水素酵素とギ酸脱水素酵素を共発現する大腸菌を調製した。得られた大腸菌を 用いて、製造例 17と同様の方法で反応を行い、反応液中に含まれるノルパリンの光 学純度分析と定量を行った。その結果を表 2に示す。
[0219] 製造例 24
2 ォキソペンタン酸力 L ノルパリンの製造 (L アミノ酸アミノ基転移酵素利用） 製造例 17において、プラスミドとして、製造例 5で得た pSF-GSA2の代わりに製造例 12で得た pSE-ECBlを用いた点以外は製造例 17と同様の操作を行って分岐鎖アミ ノ酸ァミノ基転移酵素を発現する大腸菌を調製した。
2—ォキソペンタン酸ナトリウム塩を各終濃度 2重量％ (145mM)、 4重量％ (290m M)アミノ基供与体としての L—グルタミン酸ナトリウムを各終濃度 290mM、 580mM となるように加えた 2つの反応容器に、それぞれ 400mM リン酸カリウム緩衝液 (PH 8. 0)をカ卩え、 5M水酸ィ匕ナトリウム水溶液で pH8. 0に調製した後、培養液 10g分か ら調製した菌体とを加えて総重量 10gの反応液を調製し、振盪しながら 30°Cで終夜 反応を行った。反応液から 0. lgずつサンプルとして採取し、後述するノルパリンの分 析条件 1に基づき反応液中に含まれるノルパリンの光学純度分析と定量を行った。そ の結果を表 3に示す。
[0220] 製造例 25
製造例 24で調製した分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素を発現する大腸菌を以下の 反応に用いた。製造例 24において、アミノ基供与体として、 L—グルタミン酸ナトリウ ムの代わりに L—ァスパラギン酸を用いた点以外は製造例 24と同様の方法で反応を 行い、反応液中に含まれるノルパリンの光学純度分析と定量を行った。その結果を表 3に示す。
[0221] 製造例 26
製造例 17において、プラスミドとして、製造例 5で得た pSF-GSA2の代わりに製造例 13で得た pSE-BSBlを用いた点以外は製造例 17と同様の操作を行って分岐鎖ァミノ 酸ァミノ基転移酵素を発現する大腸菌を調製した。得られた大腸菌を用いて、製造 例 24と同様の方法で反応を行 ヽ、反応液中に含まれるノルパリンの光学純度分析と 定量を行った。その結果を表 3に示す。
[0222] 製造例 27
製造例 26で調製した分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素を発現する大腸菌を以下の 反応に用いた。製造例 26において、アミノ基供与体として、 L—グルタミン酸ナトリウ ムの代わりに L—ァスパラギン酸を用いた点以外は製造例 26と同様の方法で反応を 行い、反応液中に含まれるノルパリンの光学純度分析と定量を行った。その結果を表 3に示す。
[0223] 製造例 28
混合菌体を用いた L ノルパリンの製造
製造例 1で得たプラスミド pSUCBDOlで大腸菌 HB101株を形質転換し、得られた 形質転換体を 2 XYT培地 (製造例 14と同様) 50mlを用いて 33°Cで終夜培養した。 培地に 0. ImM IPTGを添加して遺伝子の発現を誘導した後、菌体を集菌して、 D アミノ酸酸化酵素を発現する大腸菌を得た。
製造例 11で得たプラスミド PSF-TIP2で大腸菌 HB101株を形質転換し、得られた 形質転換体を 2 XYT培地 (製造例 14と同様) 50mlを用いて 33°Cで終夜培養した。 培地に 0. ImM IPTGを添加して遺伝子の発現を誘導した後、菌体を集菌して、 L フ 二ルァラニン脱水素酵素とギ酸脱水素酵素を共発現する大腸菌を得た。 上記 2種の培養液各 5g分力も調製した菌体を、 4重量％ DL ノルパリン、 0. 20 M ギ酸ナトリウム、 0. 75M アンモニア緩衝液 (pH8. 0)を含む反応液に加えて総 重量 10gとし、通気条件で振盪し、 30°Cで反応を行った。反応開始から 20時間後、 45時間後に反応液力 0. lgずつサンプルとして採取し、後述するノルパリンの分析 条件 1に基づき反応液中に含まれるノルパリンの光学純度分析と定量を行った。これ らの結果を表 4に示す。
[0224] 製造例 29
製造例 28において、反応液として、 10重量％ DL ノルパリン、 0. 51M ギ酸ナ トリウム、 0. 75M アンモニア緩衝液 (pH8. 0)を含む反応液を用いた点以外は、製 造例 28と同様の方法により反応を行った。反応開始から 20時間後、 45時間後に反 応液から 0. lgずつサンプルとして採取し、後述するノルパリンの分析条件 1に基づ き反応液中に含まれるノルパリンの光学純度分析と定量を行った。これらの結果を表 4に示す。
[0225] 製造例 30
混合菌体を用いた L ノルパリンの製造
製造例 1で得たプラスミド pSUCBDOlで大腸菌 HB101株を形質転換し、得られた 形質転換体を 2 XYT培地 (製造例 14と同様) 50mlを用いて 33°Cで終夜培養した。 培地に 0. ImM IPTGを添加して遺伝子の発現を誘導した後、菌体を集菌して、 D アミノ酸酸化酵素を発現する大腸菌を得た。
製造例 5で得たプラスミド pSF-GSA2で大腸菌 HB101株を形質転換し、得られた形 質転換体を 2 XYT培地 (製造例 14と同様) 50mlを用いて 33°Cで終夜培養した。培 地に 0. ImM IPTGを添加して遺伝子の発現を誘導した後、菌体を集菌して、 L ァラニン脱水素酵素とギ酸脱水素酵素を共発現する大腸菌を得た。
上記 2種の培養液各 5g分力も調製した菌体を、 4重量％ DL ノルパリン、 0. 20 M ギ酸ナトリウム、 0. 75M アンモニア緩衝液 (pH8. 0)を含む反応液に加えて総 重量 10gとし、通気条件で振盪し、 30°Cで反応を行った。反応開始から 20時間後、 45時間後に反応液力 0. lgずつサンプルとして採取し、後述するノルパリンの分析 条件 1に基づき反応液中に含まれるノルパリンの光学純度分析と定量を行った。これ らの結果を表 4に示す。
[0226] 製造例 31
製造例 30において、反応液として、 10重量％ DL ノルパリン、 0. 51M ギ酸ナ トリウム、 0. 75M アンモニア緩衝液 (pH8. 0)を含む反応液を用いた点以外は、製 造例 30と同様の方法により反応を行った。反応開始から 20時間後、 45時間後に反 応液から 0. lgずつサンプルとして採取し、後述するノルパリンの分析条件 1に基づ き反応液中に含まれるノルパリンの光学純度分析と定量を行った。これらの結果を表 4に示す。
[0227] 製造例 32
4遺伝子発現可能なベクター pSE420Qの構築
製造例 1で得たプラスミド PSE420Uを Spel,で 2重消化し、同部位に合成 DNA (配列 番号： 35、配列番号： 36)をァニール後、ライゲーシヨンすることによりプラスミド pSE42 0Qを構築した。
配列番号 35： CTAGTAGAGGTACCTATATATGCATGTGCACGC
配列番号 36： TTAAGCGTGCACATGCATATATAGGTACCTCTA
[0228] 製造例 33
大腸菌由来カタラーゼ遺伝子 katE含有プラスミド pSQECKElの構築 大腸菌 Kl 2 (Escherichia coli K12)株由来のカタラーゼ遺伝子 katEの塩基配列（Ac cession No. NC_000913 REGION: 1811891..1814152)を元にクロー-ング用のセンス プライマー EckatE-Al (配列番号： 37)、アンチセンスプライマー EckatE-Tl (配列番 号： 38)を合成した。
配列番号 37： gacggtacctatacATGTCTCAACATAACGAAAAGAACCCACA 配列番号 38： tcgaagcttaagaTTATGCAGGAATTTTGTCAATCTTAGGAATGC 前記大腸菌 Kl 2 (Escherichia coli K12)株から生成した染色体 DNAを铸型とし、前 記センスプライマー EckatE-Al (配列番号： 37)と、アンチセンスプライマー EckatE- T 1 (配列番号： 38)を用いて製造例 1記載の方法と同様の方法により PCRを行い、配 列番号 39の塩基配列力もなる DNA断片を増幅した。得られた DNA断片を制限酵 素 Kpnl, Hindlllで二重消化し、同制限酵素で二重消化した製造例 32で得た pSE420 Qとライゲーションして pSQECKElを構築した。
上記酵素活性の測定方法に従 、、プラスミド pSQECKElによるカタラーゼ活性を測 定したところ、比活性は 260UZmg -タンパク質であった。
なお、プラスミド pSQECKElが含む大腸菌由来カタラーゼ EckatEは、製造例 34で 得られるプラスミド pSQECKGlが含む大腸菌由来カタラーゼ EckatGと比較して、カタ ラーゼ活性及び安定性カ^ヽずれも高く、しカゝもペルォキシダーゼ活性は低 ヽことが 報告され、前記特性は本発明の目的にも合致するため、 EckatEを発現するプラスミド pSQECKElを以後の実験に用いた。
製造例 34
大腸菌由来カタラーゼ遺伝子 katG含有プラスミド pSQECKGlの構築
大腸菌 K12 (Escherichia coli K12)株由来のカタラーゼ遺伝子 katGの塩基配列（Acce ssion NC_000913 REGION: 4131858..4134038)を元にクロー-ング用のセンスプライ マー EckatG-Al (配列番号： 40)、アンチセンスプライマー EckatG- T1 (配列番号： 41 )を合成した。
配列番号 40： gacggtaccatatcATGAGTACTTCAGACGATATCCATAACAC 配列番号 41： gacaagcttaagaTTAAAGCAGATCAAAACGGTCGAGG
前記大腸菌 Kl 2 (Escherichia coli K12)株から生成した染色体 DNAを铸型とし、前 記センスプライマー EckatG- Al (配列番号： 40)と、アンチセンスプライマー EckatG- T 1 (配列番号: 41)を用いて製造例 1記載の方法と同様の方法により PCRを行い、配 列番号 42の塩基配列カゝらなる DNA断片を増幅した。得られた DNA断片を制限酵 素 Kpnl, Hindlllで二重消化し、同制限酵素で二重消化した製造例 32で得た pSE420 Qとライゲーションして pSQECKGlを構築した。
上記酵素活性の測定方法に従 、、プラスミド pSQECKGlによるカタラーゼ活性を測 定したところ、比活性は 108UZmg—タンパク質であった。
[0230] 製造例 35
2遺伝子含有プラスミド pSQTIP2の構築 (フエ-ルァラニン脱水素酵素とカタラーゼ） J. Biochem., 109, 371 (1991)に記載のサーモアクチノマイセス'インターメディウス I FO 14230 (Thermoactinomyces intermedius IFO14230)株由来フエ-ルァラニン脱水 素酵素遺伝子の塩基配列（Accession No. D00631)を元に、センスプライマー TIP- A TG4 (配列番号： 43)とアンチセンスプライマー TIP-TAA4 (配列番号： 44)を合成した
配列番号 44： gtcaggtacctcTTAACGACGTGCACTATTACGG
製造例 11で得たフエ二ルァラニン脱水素酵素発現プラスミド PSU-TIP2を铸型とし、 センスプライマー TIP-ATG4とアンチセンスプライマー TIP-TAA4を用いて製造例 1記 載の方法と同様の方法により PCRを行い、 DNA断片を増幅した。得られた DNA断 片を制限酵素 Kbal, Kpnlで二重消化し、同制限酵素で二重消化した製造例 33で得 た pSQECKElとライゲーシヨンして、サーモアクチノマイセス'インターメディウス IFO 1 4230 (Thermoactinomyces intermedius IFO 14230)株由来の L—フエ-ルァラニン脱 水素酵素と大腸菌 K12 (Escherichia coli K12)株由来のカタラーゼ遺伝子 katEとが組 み込まれたプラスミド PSQTIP4を得た。
[0231] 実施例 1
3遺伝子含有プラスミド pSFTPCOlの構築
キャンディダ 'ボイディ- DSM 70026株由来の D—アミノ酸酸化酵素遺伝子のアン チセンスプライマー CbDAO- T2 (配列番号： 34)を合成した。 製造例 11で得たプラスミド pSUCBDOlを铸型とし、製造例 11記載で用いたセンス プライマー CbDAO-Al (配列番号： 3)とアンチセンスプライマー CbDAO- T1 (配列番 号: 4)を用いて製造例 11記載の方法に従って PCRを行った。 PCR反応液の一部を ァガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異的な約 1. lkbpのバンドが検出さ れた。このバンドを切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (フアルマ シァ製)で精製した後、制限酵素 Nde Iと Pac Iで二重消化し、フエノールークロロホル ム処理後、ァガロースゲル電気泳動を行い、 目的とするバンド部分を切り出し、 Sepha glas Band Prep Kit (フアルマシア製）により精製して、 目的の DNA断片を得た。
製造例 11で得たプラスミド PSF-TIP2を制限酵素 Nde Iと Pac Iで二重消化し、フォス ファターゼ処理、次いでフエノールークロロホルム処理後、 T4 DNAリガーゼ（タカラバ ィォ製)を用いて目的の DNA断片を連結した。得られたプラスミドで大腸菌 JM109株 を形質転換し、製造例 1と同様の方法で精製してプラスミド pSFTPCOl (図 19)を得た 精製したプラスミドを用い、プライマーウォーキング法を用いて製造例 1に記載の条 件で挿入 DNAの塩基配列を解析し、キャンディダ 'ボイディ- (Candida boidinii)由 来の D—ァラニン酸化酵素、サーモアクチノマイセス'インターメディウス (Thermoactin omyces intermedius)由来の L—フエ-ルァラニン脱水素酵素、マイコバクテリゥム 'バ ッカェ（Mycobacterium vaccae)由来のギ酸脱水素酵素が組み込まれていることを確 した 0
[0232] 26°Cで終夜培養した点以外は、上記酵素活性の測定方法に従い、プラスミド pSFT PC01を用いて無細胞抽出液を調製し、各酵素活性を測定したところ、比活性はそれ ぞれ、 D—ァラニン酸化活性が 2. 93U/mg—タンパク質、 L—フエ-ルァラニン酸 化活性が 7. 03UZmg—タンパク質、ギ酸酸化活性が 0. 71UZmg—タンパク質で めつに。
[0233] 実施例 2
3遺伝子含有プラスミド pSFGACOlの構築
製造例 1における PCRで得たキャンディダ ·ボイディ-由来の D—アミノ酸酸化酵素 遺伝子を含む DNA断片と、製造例 5で得たプラスミド pSF-GSA2とをそれぞれ制限酵 素 Nde Iと Pac Iで二重消化し、フォスファターゼ処理、次いでフエノールークロロホル ム処理したものを、 T4 DNAリガーゼ (タカラバイオ製)を用いて連結し、大腸菌 JM109 株を形質転換した。 目的とする DNA断片が挿入した形質転 ·をアンピシリンを含 む液体 LB培地で培養し、 FlexiPrep Kit (フアルマシア製）を用いてプラスミドを精製し 、キャンディダ 'ボイディ-由来の D—アミノ酸酸化酵素、ジォバチルス'ステア口サー モフィラス由来ァラニン脱水素酵素、マイコバクテリゥム 'パッカェ由来ギ酸脱水素酵 素の遺伝子を共発現する 3遺伝子含有プラスミド pSFGACOl (図 20)を得た。精製し たプラスミド pSFGACOlを用い、プライマーウォーキング法を用いて挿入 DNAの塩基 配列を確認した。
[0234] 26°Cで終夜培養した点以外は、上記酵素活性の測定方法に従い、プラスミド pSFG AC01を用いて無細胞抽出液を調製し、各酵素活性を測定したところ、比活性はそ れぞれ、 D—ァラニン酸化活性が 2. 42U/mg—タンパク質、 L—ァラニン酸ィ匕活性 が 2. 63UZmg—タンパク質、ギ酸酸化活性が 0. 79UZmg—タンパク質であった
[0235] 実施例 3
3遺伝子含有プラスミド pSFTPCO 1を用 、1 L -ノルパリンの製造
実施例 1で構築した 3遺伝子含有プラスミド pSFTPCOlで大腸菌 HB101株を形質 転換し、得られた形質転換体を 2 XYT培地 (製造例 14と同様) 50mlを用いて 33°C で終夜培養した。培地に 0. ImM IPTGを添加して遺伝子の発現を誘導した後、菌 体を集菌して、 3遺伝子を発現する大腸菌を得た。
培養液 10g分力も調製した菌体を、 4重量％ DL—ノルパリン、 0. 20M ギ酸ナト リウム、 0. 17M アンモニア緩衝液 (pH8. 0)を含む反応液に加えて総重量 10gとし 、通気条件で振盪し、 30°Cで反応を行った。反応開始から 20時間後、 45時間後に 反応液から 0. lgずつサンプルとして採取し、後述するノルパリンの分析条件 1に基 づき反応液中に含まれるノルパリンの光学純度分析と定量を行った。これらの結果を 表 5に示す。
[0236] 実施例 4 実施例 3において、反応液として、 10重量％ DL—ノルパリン、 0. 51M ギ酸ナト リウム、 0. 43M アンモニア緩衝液 (pH8. 0)を含む反応液を用いた点以外は、実 施例 3と同様の方法により反応を行った。反応開始から 20時間後、 45時間後に反応 液から 0. lgずつサンプルとして採取し、後述するノルパリンの分析条件 1に基づき 反応液中に含まれるノルパリンの光学純度分析と定量を行った。これらの結果を表 5 に示す。
[0237] 実施例 5
実施例 3において、反応液として、 12重量％ DL—ノルパリン、 0. 61M ギ酸ナト リウム、 0. 51M アンモニア緩衝液 (pH8. 0)を含む反応液を用いた点以外は、実 施例 3と同様の方法により反応を行った。反応開始から 20時間後、 45時間後に反応 液から 0. lgずつサンプルとして採取し、後述するノルパリンの分析条件 1に基づき 反応液中に含まれるノルパリンの光学純度分析と定量を行った。これらの結果を表 5 に示す。
[0238] 実施例 6
実施例 3において、 3遺伝子含有プラスミドとして、 pSFTPCOlに代えて実施例 2で 構築した 3遺伝子含有プラスミド pSFGACOlを用いた点以外は実施例 3と同様の方 法により反応を行った。反応開始から 20時間後、 45時間後に反応液力も 0. lgずつ サンプルとして採取し、後述するノルパリンの分析条件 1に基づき反応液中に含まれ るノルパリンの光学純度分析と定量を行った。これらの結果を表 5に示す。
[0239] 実施例 7
実施例 6において、反応液として、 10重量％ DL—ノルパリン、 0. 51M ギ酸ナト リウム、 0. 21M アンモニア緩衝液 (pH8. 0)を含む反応液を用いた点以外は、実 施例 6と同様の方法により反応を行った。反応開始から 20時間後、 45時間後に反応 液から 0. lgずつサンプルとして採取し、後述するノルパリンの分析条件 1に基づき 反応液中に含まれるノルパリンの光学純度分析と定量を行った。これらの結果を表 5 に示す。
[0240] 実施例 8
実施例 6において、反応液として、 12重量％ DL—ノルパリン、 0. 61M ギ酸ナト リウム、 0. 26M アンモニア緩衝液 (pH8. 0)を含む反応液を用いた点以外は、実 施例 6と同様の方法により反応を行った。反応開始から 20時間後、 45時間後に反応 液から 0. lgずつサンプルとして採取し、後述するノルパリンの分析条件 1に基づき 反応液中に含まれるノルパリンの光学純度分析と定量を行った。これらの結果を表 5 に示す。
[0241] 実施例 9
3遺伝子含有プラスミド pSFTPCO 1を用 、1 L -ノルパリンの製造
実施例 1で構築した 3遺伝子発現プラスミド pSFTPCOlで大腸菌 HB101株を形質 転換し、得られた形質転換体を 2 X YT培地 (製造例 14と同様) 400mlを用いて 33 °Cで終夜培養した。培地に 0. ImM IPTGを添加して遺伝子の発現を誘導した後、 菌体を集菌して、 3遺伝子を発現する大腸菌を得た。
得られた大腸菌を、 12重量％(1. 02M) DL—ノルパリン、 2. 8% (0. 61M)ギ酸 ナトリウム、 1. 1% (0. 62M)アンモニア緩衝液 (pH8. 0)を含む反応液に加えて 40 0gとし、通気条件で撹拌下、 30°Cで 24時間反応させた。反応液から 0. lgサンプル として採取し、後述するノルパリンの分析条件 1に基づき反応液中に含まれるノルバリ ンの光学純度分析と定量を行ったところ、 L—ノルパリンの濃度は 9. 1重量％(0. 77 9M)、 D—ノルパリンは検出されず、光学純度は 100%であった。
[0242] 実施例 10
実施例 9で得た反応液の一部を以下の方法で精製した。
実施例 9で得た反応液 30. 5gに濃硫酸 1. 7gを添加して pH2. 5に調整し、 30°C で 17時間加熱撹拌した。得られた酸性懸濁液を遠心分離することによって除菌後、 上清にメタノール 50mlを添加し、生成した固体を濾過により除去して除タンパクを行 つた。得られたろ液にアンモニア水を添カ卩して pH6に調整し、さらにアセトン 60mlを 添加した。析出した固体をろ取、乾燥し、精製ノルパリンを含む白色固体を 2. 42g得 た。得られた固体について、マレイン酸を内部標準として 1H—NMRを測定したとこ ろ化学純度は 95%であり、後述するノルパリンの分析条件 2に基づく光学純度は 10 0% (L体)であった。
[0243] 実施例 11 実施例 9で得た反応液の一部を以下の方法で精製した。
実施例 9で得た反応液 9. lgに水 4. 5mlを添加し、 60°Cで 2. 5時間加熱撹拌した 。得られた懸濁液を遠心分離することによって除菌後、分画分子量 10000の限外濾 過膜（CentriCon YM10、ミリポア製）を用いて 2000 X g、 30°Cで遠心することにより 除タンパクを行った。次いで、ろ液を固体の析出が見られるまで減圧濃縮した。濃縮 液にギ酸を 0. lg添加して pH6. 2に調整し、更にアセトンを 14. 8mL添カロした。析 出した固体をろ取、乾燥し、精製ノルパリンを含む白色固体を 0. 433g得た。得られ た固体について、マレイン酸を内部標準として 1H— NMRを測定したところ化学純度 は 95%であり、後述するノルパリンの分析条件 2に基づく光学純度は 100% (L体)で めつに。
実施例 12
4遺伝子含有プラスミド pSFCPCOlの構築 (D アミノ酸酸化酵素、ギ酸脱水素酵素 、フエ-ルァラニン脱水素酵素、カタラーゼ)
実施例 1で得た 3遺伝子発現プラスミド pSFTPOlを制限酵素 Ndel, Xbalで二重消化 し、 D ァラニン酸化酵素及びギ酸脱水素酵素遺伝子を含む DNA断片を調製した。 製造例 35で得た 2遺伝子発現プラスミド pSQTIP4を同制限酵素で二重消化し、前記 D ァラニン酸ィ匕酵素及びギ酸脱水素酵素遺伝子を含む DNA断片をライゲーシヨン して、キャンディダ 'ボイディ- (Candida boidinii)由来の D ァラニン酸化酵素、マイ コバクテリゥム 'パッカェ（Mycobacterium vaccae)由来のギ酸脱水素酵素、サーモア クチノマイセス'インターメディウス IFO 14230 (Thermoactinomyces intermedius IFO 14230)株由来の L フエ-ルァラニン脱水素酵素、大腸菌 K12 (Escherichia coli Kl 2)株由来のカタラーゼ遺伝子 katEからなる 4遺伝子を共発現するプラスミド pSFCPCO 1を得た。
得られた 4遺伝子発現プラスミド pSFCPCOlを用いて、上記「酵素活性の測定」に記 載の方法に従って無細胞抽出液を調製し、上記各酵素に応じた方法に従って活性 を測定した結果、 D—ァラニン酸ィ匕酵素活性は 2. 40UZmg—タンパク質、ギ酸脱水 素酵素活性は 0. 63UZmg—タンパク質、、 L—フエ二ルァラニン脱水素酵素活性は 5. 30UZmg タンパク質、カタラーゼ活性は 399UZmg タンパク質であり、いず れの酵素も十分な活性で発現されていることが確認できた。
[0245] 実施例 13
3遺伝子含有プラスミド pSFTPCO 1を用 、1 L -ノルパリンの製造
実施例 12で構築した 3遺伝子含有プラスミド pSFTPCO 1で大腸菌 HB 101株を形 質転換し、得られた形質転換体を 2 X YT培地 (製造例 14と同様)を用いて 33°Cで終 夜培養した。培地に 0. ImM IPTGを添加して遺伝子の発現を誘導した後、菌体を 集菌して、 3遺伝子を発現する大腸菌を得た。
培養液 5g分力も調製した菌体を、 8重量％ DL ノルパリン、ノルパリンに対して 0 . 6当量のギ酸アンモ-ゥムを含む反応液 (pH8. 0)に加えて総重量 10gとし、通気 条件で振盪し、 30°Cで振盪下、 44時間反応させた。反応液から 0. lg採取し、後述 するノルパリンの分析条件 1に基づき反応液中に含まれるノルパリンの光学純度分析 と定量を行ったところ、 L ノルパリンの光学純度は 100%eeであり、収率は 65. 9% であった。
また、反応終了後の反応液に対して高速液体クロマトグラフィー分析を行ったところ 、 a ケト吉草酸は検出されなかった。
[0246] 実施例 14
4遺伝子含有プラスミド pSFCPCOlを用いた L ノルパリンの製造
実施例 13にお 、て、 3遺伝子含有プラスミド pSFTPCO 1に代えて実施例 12で得た 4遺伝子含有プラスミド pSFCPCOlを用いた点以外は実施例 13と同様の方法で反応 を行い、ノルパリンの光学純度分析と定量を行ったところ、 L ノルパリンの光学純度 は 100%eeであり、収率は 76. 6%であった。
また、実施例 13と同様の方法に従って、反応終了後に残存する ex—ケト吉草酸の 濃度を測定したところ、原料 DL ノルパリンに対して 21. 3モル％検出された。この 結果は、 D アミノ酸力 ケト酸を生成する酸ィ匕工程後の還元工程において、ケト酸 力 L アミノ酸を生成するケト酸の還元的ァミノ化反応が完全には進行せず、 oc ケト酸が蓄積されたままことを示して 、る。
[0247] 実施例 15
酸ィ匕工程と還元工程に異なる条件を用いる方法 実施例 12で得た 4遺伝子含有プラスミド pSFCPCOlで大腸菌 HB101株を形質転 換し、得られた形質転換体を 2 X YT培地 (製造例 14と同様)を用いて 33°Cで終夜培 養した。培地に 0. ImM IPTGを添加して遺伝子の発現を誘導した後、菌体を集菌 して、 4遺伝子を発現する大腸菌を得た。
培養液 132gから調製した菌体を、 8重量％DL ノルパリン、ノルパリンに対して 0. 6当量のギ酸アンモ-ゥム、 0. 02%アデ力ノール (消泡剤;旭電ィ匕工業社製）と混合 し、硫酸を用いて pH8. 0に調整した反応液 400mlを 1L用のミニジャーに入れ、酸 ィ匕工程として空気の通気量 0. 5vvm、撹拌速度 500rpm、 30°Cの条件で 43時間反 応を行った。酸ィ匕工程終了後の反応液力も 0. lg採取し、後述するノルパリンの分析 条件 1に基づき反応液中に含まれるノルパリンの光学純度分析と定量を行ったところ 、 L ノルパリンの光学純度は 98. 3%eeであり、収率は 64. 4%であった。
次いで、還元工程として、酸素含有気体の通気を停止し、撹拌速度 300rpm、原料 DL ノルパリン (培養液 132gから調製した菌体）に対して 0. 37当量のギ酸アンモ -ゥムを追加し、反応液の pH8. 0、 30°Cの条件で 62時間反応を行った。反応終了 後の反応液から 0. lg採取し、後述するノルパリンの分析条件 1に基づき反応液中に 含まれるノルノ《リンの光学純度分析と定量を行ったところ、 L—ノルパリンの光学純度 は 100%eeであり、収率は 86. 6%であった。
また、反応終了後の反応液に対して高速液体クロマトグラフィー分析を行ったところ 、 a ケト吉草酸はわずかに残存していた (原料 DL ノルパリン基準で 4重量％程 度)。
[0248] 実施例 16
酸ィ匕工程の pH調整をギ酸で行 、、還元工程にギ酸アンモニゥムを追加する方法 実施例 15において、酸化工程における反応液の pHを調整する際に、硫酸に代え てギ酸を用いた点以外は実施例 15と同様の方法により酸ィ匕工程及び還元工程を行 つたところ、 L ノルパリンの光学純度は 100%eeであり、収率は 92. 8%であった。 また、反応終了後の反応液に対して高速液体クロマトグラフィー分析を行ったところ 、、 a ケト吉草酸は検出されなかった。
[0249] 実施例 17 酸ィ匕工程の pH調整をギ酸で行 、、還元工程にギ酸アンモニゥムを追カ卩しな！/、方 法
実施例 15において、酸化工程における反応液の pHを調整する際に、硫酸に代え てギ酸を用い、還元工程においてギ酸アンモ-ゥムを追加しな力つた点以外は実施 例 15と同様の方法により酸ィ匕工程及び還元工程を行ったところ、 L ノルパリンの光 学純度は 100%eeであり、収率は 93. 3%であった。
また、実施例 13の方法に従い、反応終了後に残存する ex ケト吉草酸の濃度を測 定したが、 OC ケト吉草酸は検出されな力つた。
以上の結果から、酸ィ匕工程の pH調整に硫酸を用いた場合には、反応終了後に α ーケト酸が残存し、還元工程における還元的ァミノ化反応が十分に進行されなかった (実施例 15)。これに対し、酸ィ匕工程の pH調整にギ酸を用いた場合には還元工程が 完全に進行し、反応終了後に α—ケト酸の残存も見られな力つた (実施例 16, 17)。 この際、還元工程においてギ酸アンモ-ゥムを追加しても（実施例 16)、しなくても（ 実施例 17)収率に影響がな力つた。このことは、酸ィ匕工程においてギ酸が無駄に消 費された場合に、酸ィ匕工程の pH調整にギ酸を用いることにより、効率的にギ酸が補 充されて!/ヽることが示された。
参考例 1
実施例 12で得た 4遺伝子含有プラスミド pSFCPCOlで大腸菌 HB101株を形質転 換し、得られた形質転換体を 2 X YT培地 (製造例 14と同様)を用いて 33°Cで終夜培 養した。培地に 0. ImM IPTGを添加して遺伝子の発現を誘導した後、菌体を集菌 して、 4遺伝子を発現する大腸菌を得た。
培養液 132gから調製した菌体と、 8重量％DL ノルパリン、 0. 02%アデ力ノール (消泡剤;旭電化工業社製)、ギ酸アンモ-ゥムを原料 DL ノルパリンに対して 0 (無 添加）， 0. 2当量、 0. 4当量、 0. 6当量の各条件で混合し、ギ酸を用いて pH8. 0に 調整した反応液て pH8. 0に調整した反応液 400mlを 1L用のミニジャーに入れ、酸 化工程として空気の通気量 0. 5vvm、撹拌速度 500rpm、 30°Cの条件で酸ィ匕反応 を行った。各条件について酸ィ匕工程の終了に要した時間は、それぞれ 28時間以上 、 28時間、 24時間、 28時間であった。酸ィ匕工程終了後の反応液力も 0. lg採取し、 後述するノルパリンの分析条件 1に基づき反応液中に含まれるノルパリンの光学純度 分析を行った結果を表 6に示す。これらの結果より、酸ィ匕工程において、反応開始時 にギ酸アンモ-ゥムを添加しな力つた場合は、 28時間を超えて反応を行っても光学 純度が 49. 3%eeに留まり、ギ酸アンモ-ゥムを原料 DL ノルパリンに対して 0. 2当 量以上添加した場合の光学純度が 99%ee以上であるのに対して、極めて反応の進 行が遅い結果であった。なお、ギ酸アンモ-ゥムの添カ卩量が 0. 2当量以上では、 L ノルパリンの光学純度は十分に高ぐ差が見られな力つた。
[0251] 参考例 2
参考例 1において、 pH調整をギ酸アンモ-ゥムに代えてギ酸を用いて行い、且つ 反応液の pHを 7. 0、 7. 5、 8. 0、 8. 5の各値で調整した点以外は参考例 1と同様の 方法により酸ィ匕工程を行った。酸ィ匕工程終了後の反応液力 0. lg採取し、後述す るノルパリンの分析条件 1に基づき反応液中に含まれるノルパリンの光学純度分析を 行った結果を表 7に示す。
[0252] 実施例 18 (貴社案:追加実施例 13,前回の参考例 3)
実施例 12で得た 4遺伝子含有プラスミド pSFCPCOlで大腸菌 HB101株を形質転 換し、得られた形質転換体を 2 X YT培地 (製造例 14と同様)を用いて 33°Cで終夜培 養した。培地に 0. ImM IPTGを添加して遺伝子の発現を誘導した後、菌体を集菌 して、 4遺伝子を発現する大腸菌を得た。
培養液 132gから調製した菌体を、 8重量％DL ノルパリン、ノルパリンに対して 0. 6当量のギ酸アンモ-ゥム、 0. 02%アデ力ノール (消泡剤;旭電ィ匕工業社製）と混合 し、硫酸を用いて pH8. 0に調整した反応液 400mlを 1L用のミニジャーに入れ、酸 ィ匕工程として空気の通気量 0. 5vvm、撹拌速度 500rpm、 30°Cの条件で 43時間反 応を行った。酸ィ匕工程終了後の反応液力も 0. lg採取し、後述するノルパリンの分析 条件 1に基づき反応液中に含まれるノルパリンの光学純度分析と定量を行ったところ 、 L ノルパリンの光学純度は 98. 3%eeであり、収率は 64. 4%であった。
次いで、還元工程として、酸素含有気体の通気を停止し、撹拌速度 300rpm、温度 30。Cの条件下、ギ酸を用いて反応液の ρΗを 6. 5、 7. 0、 7. 5、 8. 0、 8. 5、 9. 0の 各値に調整し、 62時間反応を行った。反応終了後の反応液から 0. lg採取し、後述 するノルパリンの分析条件 1に基づき反応液中に含まれるノルパリンの光学純度分析 と定量を行ったところ、 L ノルパリンの光学純度は 100%eeであり、収率は 86. 6% であった。
また、反応終了後の反応液に対して高速液体クロマトグラフィー分析を行ったところ 、 a ケト吉草酸はわずかに残存していた (原料 DL ノルパリン基準で 4重量％程 度)。
[0253] (評価試験）
ノルパリンの分析条件 1
ノルパリン含有反応液サンプル 0. lgに 0. 1M 塩酸を加えて懸濁し、遠心分離し て得た上清を 0. 4% トリェチルァミンを含む 50% ァセトニトリル水溶液で希釈した 。この希釈液 100 Lを 0. 2% 2, 3, 4, 6—テトラ一 O ァセチルー β— D—グル コピラノシルイソチオシァネート（GITC) 100 μ Lと混合し、 40°Cで 90分反応させた。 得られた反応液を高速液体クロマトグラフィーにより以下の条件で分析した。
カラム：イナ一トシル ODS 3 ( φ 4. 6mm X 250mm) (ジーエノレサイエンス製） 温度： 25°C
検出： UV250nm
溶離液： 10mM リン酸カリウム緩衝液 (pH2. 5) /メタノール =45/55
流速： lmLZ分
以上の条件で GITC化した L ノルパリンは保持時間 8. 8分に、 GITC化した D— ノルパリンは 11. 8分に検出された。
[0254] ノルパリンの分析条件 2
ノルパリンを含む固体 5mgを水 lmLに溶解し、以下の条件で分析した。 カラム： CROWNPAK CR ( + ) ( 4mm X 150mm) (ダイセル化学工業 (株）製） 温度： 40°C
検出： UV 210nm
溶離液:過塩素酸水溶液 (pH2. 0)
流速： 0. 8mLZ分
以上の条件で L ノルパリンは保持時間 2. 5分に、 D—ノルパリンは保持時間 3. 3 分に検出された。
[0255] 2—ォキソペンタン酸の分析条件
反応液調製時の反応液サンプル 0. lgに、 0. 1M 塩酸を加えて懸濁し、遠心分 離して得た上清を以下の条件で分析した。
カラム： WakosU- II 5C18 Ηϋ ( 4. 6mm X 250mm) (和光純薬（株）製） 温度： 40°C
検出： UV230nm
溶離液: 0. 1容積0 /0トリフルォロ酢酸水溶液 Zァセトニトリル =95Z5
流速： lmLZ分
以上の条件で 2—ォキソペンタン酸は保持時間 8. 6分に検出された。
[0256] [表 1]
表 1
Figure imgf000079_0001
[0257] [表 2]
表 2
Figure imgf000080_0001
[表 3]
表 3
Figure imgf000080_0002
製 反応系 2 0時間後 4 5時間後 造 Nva ギ酸 Na 光学純度 Nva #率 光学純度 Nva残存率 ラスミド
例 [wt%] CM] [%] [%] [%] [%]
28 4 0. 20 100 73 一 ― pSUCBDOl/pSF - TIP2
29 10 0. 51 48 79 100 77
30 4 0. 20 100 44 ― ― pSUCBDOl/pSF - GSA2
31 10 0. 51 61 64 100 82 [0260] [表 5] 表 5
Figure imgf000081_0001
[0261] [表 6]
Figure imgf000081_0002
[0262] [表 7] 表 7
Figure imgf000081_0003
産業上の利用可能性
[0263] 本発明の L アミノ酸の製造方法は、酵素反応を利用して同一系内で効率よく L アミノ酸を生成する方法等として有用である。この方法によれば、安価なアミノ酸鏡像 異性体混合物から光学収率の高い L アミノ酸を得ることができる。特に、過酸化水 素分解酵素を同一宿主内で発現させる方法は、穏和な反応条件を用いて中間生成 物のケト酸の分解を回避しうるため、 L—アミノ酸の生産性を向上することができる。

Claims

請求の範囲
[1] アミノ酸の鏡像異性体混合物力 L アミノ酸を酵素的に生成する L アミノ酸の製 造方法であって、 D アミノ酸をケト酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、ケト 酸を L アミノ酸に変換する酵素をコードする塩基配列とが同一又は異なる発現べク ターに組み込まれた一又は複数の組換えベクターを同一宿主に導入して形成される 形質転換体又はその処理物を、アミノ酸鏡像異性体混合物と接触させる工程を含む ことを特徴とする L アミノ酸の製造方法。
[2] 形質転換体が、 D アミノ酸をケト酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、ケト酸 を L アミノ酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、補酵素再生酵素コードする 塩基配列とを、同一又は異なる発現ベクターに組み込んだ一又は複数の組換えべク ターを、同一宿主に導入して形成される形質転換体である請求の範囲第 1項記載の L アミノ酸の製造方法。
[3] 形質転換体が、 D アミノ酸をケト酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、ケト酸 を L アミノ酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、過酸化水素分解酵素をコー ドする塩基配列とを、同一又は異なる発現ベクターに組み込んだ一又は複数の組換 えベクターを、同一宿主に導入して形成される形質転換体である請求の範囲第 1項 又は第 2項記載の L アミノ酸の製造方法。
[4] D アミノ酸をケト酸に変換する酵素が、 D アミノ酸酸化酵素及び Z又は D ァミノ 酸脱水素酵素である請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれかの項に記載の Lーァミノ 酸の製造方法。
[5] D -アミノ酸酸化酵素が、キャンディダ ·ボイディ- (Candida boidinii)、トリゴノプシス · ノ リアビリス（Trigonopsis variabilis)由、及びシゾサッカロミセス 'ボンべ（Schizosaccha romyces pombe)力 選択される少なくとも一の微生物由来の D アミノ酸酸化酵素 である請求の範囲第 4項記載の L アミノ酸の製造方法。
[6] D—アミノ酸脱水素酵素力 ェシエリヒア'コリ (Escherichia coli)由来の D—アミノ酸脱 水素酵素である請求の範囲第 4項記載の L アミノ酸の製造方法。
[7] ケト酸を L アミノ酸に変換する酵素が、 L アミノ酸脱水素酵素及び Z又は L アミ ノ酸ァミノ基転移酵素である請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれかの項に記載の L アミノ酸の製造方法。
[8] L—アミノ酸脱水素酵素力 サーモアクチノマイセス.インターメディウス（Thermoactin omyces intermedius)由来フエ-ルァラニン脱水素酵素、ジォバチルス 'ステアロサー モフィラス（Geobacillus stearothermophilus)由来ァラニン脱水素酵素、バチルス'サ 一モカテ-ユラタス（Bacillus thermocatenulatus)由来ァラニン脱水素酵素、バチルス 'スフエリカス（Bacillus sphearicus)由来ァラニン脱水素酵素、シエワネラ 'スピーシー ズ（Shewanella species)由来ァラニン脱水素酵素、ジォバチルス'ステアロサーモフィ ラス（Geobacillus stearothermophilus)由来ロイシン脱水素酵素、及びバチルス 'スフ リカス（Bacillus sphaericus)由来ロイシン脱水素酵素から選択される少なくとも 1つ の微生物由来の L アミノ酸脱水素酵素である請求の範囲第 7項記載の L アミノ酸 の製造方法。
[9] 補酵素再生酵素がギ酸脱水素酵素である請求の範囲第 2項記載の L アミノ酸の製 造方法。
[10] ギ酸脱水素酵素が、マイコバクテリゥム 'パッカェ（Mycobacterium vaccae)由来ギ酸 脱水素酵素である請求の範囲第 9項記載の L アミノ酸の製造方法。
[11] 過酸ィ匕水素分解酵素がカタラーゼであることを特徴とする請求の範囲第 3項記載の L アミノ酸の製造方法。
[12] カタラーゼがェシエリヒア'コリ (Escherichia coli)由来のカタラーゼであることを特徴と する請求の範囲第 11項記載の L アミノ酸の製造方法。
[13] D アミノ酸をケト酸に変換する酵素が D アミノ酸酸ィ匕酵素であり、ケト酸を L アミ ノ酸に変換する酵素が L アミノ酸脱水素酵素であり、補酵素再生酵素がギ酸脱水 素酵素であり、過酸化水素分解酵素がカタラーゼである請求の範囲第 2項又は第 3 項記載の L アミノ酸の製造方法。
[14] D アミノ酸酸ィ匕酵素がキャンディダ'ボイディ-由来であり、 L アミノ酸脱水素酵素 がサーモアクチノマイセス.インターメディウス由来フエ-ルァラニン脱水素酵素であり
、ギ酸脱水素酵素がマイコバクテリゥム 'パッカェ由来であり、カタラーゼがェシエリヒ ァ'コリ由来である請求の範囲第 13項記載の L アミノ酸の製造方法。
[15] L アミノ酸が L ノルパリンである請求の範囲第 1項〜第 14項の何れかの項に記載 の L アミノ酸の製造方法。
[16] D アミノ酸をケト酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、ケト酸を L アミノ酸に 変換する酵素をコードする塩基配列と、補酵素再生酵素をコードする塩基配列と、過 酸ィ匕水素分解酵素をコードする塩基配列とが同一又は異なる発現ベクターに組み込 まれた一又は複数の組換えベクターを、同一宿主に導入して形成される形質転換体
[17] D アミノ酸をケト酸に変換する酵素が D アミノ酸酸ィ匕酵素であり、ケト酸を L アミ ノ酸に変換する酵素が L アミノ酸脱水素酵素であり、補酵素再生酵素がギ酸脱水 素酵素であり、過酸ィ匕水素分解酵素がカタラーゼである請求の範囲第 16項記載の 形質転換体。
[18] D アミノ酸酸ィ匕酵素がキャンディダ'ボイディ-由来であり、 L アミノ酸脱水素酵素 がサーモアクチノマイセス.インターメディウス由来フエ-ルァラニン脱水素酵素であり
、ギ酸脱水素酵素がマイコバクテリゥム 'パッカェ由来であり、カタラーゼがェシエリヒ ァ 'コリ由来である請求の範囲第 17項記載の形質転換体。
[19] D アミノ酸をケト酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、ケト酸を L アミノ酸に 変換する酵素をコードする塩基配列と、補酵素再生酵素をコードする塩基配列と、過 酸化水素分解酵素をコードする塩基配列とが同一の発現ベクターに組込まれた組換 えベクター。
[20] D アミノ酸をケト酸に変換する酵素が D アミノ酸酸ィ匕酵素であり、ケト酸を L アミ ノ酸に変換する酵素が L アミノ酸脱水素酵素であり、補酵素再生酵素がギ酸脱水 素酵素であり、過酸ィ匕水素分解酵素がカタラーゼである請求の範囲第 19項記載の 組換えベクター。
[21] D アミノ酸酸ィ匕酵素がキャンディダ'ボイディ-由来であり、 L アミノ酸脱水素酵素 がサーモアクチノマイセス.インターメディウス由来フエ-ルァラニン脱水素酵素であり
、ギ酸脱水素酵素がマイコバクテリゥム 'パッカェ由来であり、カタラーゼがェシエリヒ ァ'コリ由来である請求の範囲第 20項記載の組換えベクター。
[22] アミノ酸の鏡像異性体混合物力 L アミノ酸を酵素的に生成する L アミノ酸の製 造方法であって、少なくとも D アミノ酸をケト酸に酸化する酵素及び過酸化水素分 解酵素を共発現する形質転換体又はその処理物を用い、主に D アミノ酸を酸化す る酸化工程と、ケト酸から L アミノ酸を生成する酵素及び必要に応じて補酵素再生 酵素を共発現する形質転換体又はその処理物を用い、主にケト酸力 L アミノ酸を 合成する還元工程の、異なる 2つ以上の反応工程を併せ持つことを特徴とする Lーァ ミノ酸の製造方法。
[23] 請求の範囲第 16項〜第 18項の何れかの項に記載の形質転換体を用いる請求の範 囲第 22記載の L アミノ酸の製造方法。
[24] 酸ィ匕工程と還元工程とを異なる反応条件下で行う請求の範囲第 22項又は第 23項記 載の L アミノ酸の製造方法。
[25] 酸化工程を酸素含有気体の通気条件下で行!ヽ、還元工程を酸素含有気体を通気し な 、か又は酸素含有気体を酸ィ匕工程時より低 、通気量で通気する条件下で行う請 求の範囲第 24項記載の L アミノ酸の製造方法。
[26] 酸ィ匕工程における酸素含有気体の通気量が、反応液に対して毎分 1容量％以上で あり、還元工程における酸素含有気体の通気量力 反応液に対して毎分 10容量％ 未満である請求の範囲第 25項記載の L アミノ酸の製造方法。
[27] 酸ィ匕工程における酸素含有気体の通気量が、反応液に対して毎分 2容量％以上で あり、還元工程における酸素含有気体の通気量力 反応液に対して毎分 2容量％未 満である項 25項記載の L アミノ酸の製造方法。
[28] 酸ィ匕工程における酸素含有気体の通気量が、反応液に対して毎分 5容量％以上で あり、還元工程における酸素含有気体の通気量力 反応液に対して毎分 5容量％未 満である請求の範囲第 25項記載の L アミノ酸の製造方法。
[29] 酸ィ匕工程における酸素含有気体の通気量が、反応液に対して毎分 1容量％以上で あり、還元工程において酸素含有気体を実質的に通気しない請求の範囲第 25項記 載の L アミノ酸の製造方法。
[30] 酸ィ匕工程における反応液の pHより、還元工程における反応液の pHを低い値に調整 する請求の範囲第 24記載の L アミノ酸の製造方法。
[31] 酸ィ匕工程における反応液の pHを 7. 0〜9. 5に調整し、還元工程における反応液の pHを 6. 0〜8. 5であって酸ィ匕工程における pHより低い値に調整する請求の範囲第 30記載の L -アミノ酸の製造方法。
[32] 酸ィ匕工程における反応液の pHを 7. 5〜9. 0に調整し、還元工程における反応液の pHを 6. 5〜8. 0であって酸ィ匕工程における pHより低い値に調整する請求の範囲第
30項記載の L アミノ酸の製造方法。
[33] D アミノ酸をケト酸に変換する反応の pH調整をギ酸又はその塩を用いて行う請求 の範囲第 9項、第 10項、第 13項〜第 15項、及び第 22項〜第 32項の何れかの項に 記載の L アミノ酸の製造方法。
[34] 酸ィ匕工程カゝら還元工程へ移行前又は移行後に、請求の範囲第 16項〜第 18項の何 れかの項に記載の形質転換体又はその処理物を反応液に付加的に添加する請求 の範囲第 24項記載の L アミノ酸の製造方法。
[35] 原料アミノ酸鏡像異性体混合物に対して 0. 2当量以上のギ酸イオン及び Z又はアン モ -ゥムイオンを含む反応液を用いる請求の範囲第 1項〜第 15項及び請求の範囲 第 22項〜第 34項の何れかの項に記載の L アミノ酸の製造方法。
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