JPWO2006132145A1 - Ｌ−アミノ酸の製造方法 - Google Patents

Ｌ−アミノ酸の製造方法 Download PDF

Info

Publication number
JPWO2006132145A1
JPWO2006132145A1 JP2007520078A JP2007520078A JPWO2006132145A1 JP WO2006132145 A1 JPWO2006132145 A1 JP WO2006132145A1 JP 2007520078 A JP2007520078 A JP 2007520078A JP 2007520078 A JP2007520078 A JP 2007520078A JP WO2006132145 A1 JPWO2006132145 A1 JP WO2006132145A1
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
amino acid
enzyme
dehydrogenase
derived
reaction solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2007520078A
Other languages
English (en)
Inventor
素子 林
素子 林
山本　浩明
浩明 山本
木本　訓弘
訓弘 木本
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Daicel Corp
Original Assignee
Daicel Chemical Industries Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Daicel Chemical Industries Ltd filed Critical Daicel Chemical Industries Ltd
Publication of JPWO2006132145A1 publication Critical patent/JPWO2006132145A1/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12N9/0022—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with oxygen as acceptor (1.4.3)
    • C12N9/0024—D-Amino acid oxidase (1.4.3.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/001—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by metabolizing one of the enantiomers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/002—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by oxidation/reduction reactions

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本発明のＬ−アミノ酸の製造方法は、アミノ酸の鏡像異性体混合物からＬ−アミノ酸を酵素的に生成するＬ−アミノ酸の製造方法であって、Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素をコードする塩基配列とが同一又は異なる発現ベクターに組み込まれた一又は複数の組換えベクターを同一宿主に導入して形成される形質転換体又はその処理物を、アミノ酸鏡像異性体混合物と接触させる工程を含むことを特徴とする。本発明のＬ−アミノ酸の製造方法によれば、Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する反応とケト酸をＬ−アミノ酸に変換する反応を一工程で行うことができ、且つ高い蓄積濃度でＬ−アミノ酸に変換可能な形質転換体、及び前記形質転換体を用いて安価な原料から効率よくＬ−アミノ酸を生成することができる。

Description

本発明は、アミノ酸の鏡像異性体混合物を原料とし、Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素と、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素を発現する形質転換体を用いてＬ−アミノ酸を製造する方法に関する。
近年、医薬品、農薬、食品、飼料、香料などの分野で光学活性体を合成する重要性が増大している。これは、対掌体間で生理活性が異なる場合があるためであり、純粋な光学活性体をいかにして入手するかは産業上重要な課題になっている。中でも、Ｌ−アミノ酸、特に天然型のものは入手容易なキラルシントンとして積極的に誘導体合成が研究されてきた。更に、非天然型の構造を有するものについても利用展開が行われ、純粋な光学活性体を入手する重要性は益々高まっている。
従来、非天然型のＬ−アミノ酸の合成法として次のような方法が知られていた。
（１）アシル化したラセミ体を原料とし、Ｌ−アミノアシラーゼによりＬ−アミノ酸を生成する方法（Method Enzymol., 3, 554, (1957)）
（２）ヒダントインをＬ−ヒダントイナーゼによって開環した後にＬ−カルバモイラーゼなどによってカルバモイル基を脱離させ、Ｌ−アミノ酸を生成する方法（Agric. Biol. Chem., 51, 729 (1087)）
（３）アミド化したラセミ体を原料とし、アミダーゼによりＬ−アミノ酸を生成する方法（Method Enzymol., 3, 554, (1957)）
（４）ラセミ体を原料とし、Ｄ体を選択的に分解してＬ−アミノ酸を残存させる方法（Biotechnol. Bioeng., 14, 1288 (1994)）
（５）ケト酸の還元的アミノ化によりＬ−アミノ酸を合成する方法（特開平１０−２３８９６号公報）
しかし、上記いずれの方法も工業的に実施するには満足できるものではなく、例えば、前記方法（５）は、原料に用いられるケト酸が一般的に高価であり工業用原料として不適当であるという問題がある。Ｌ−アミノ酸を製造する際に、アミノ酸の構造によっては、原料としてケト酸ではなくラセミアミノ酸を用いた方が安価となる場合がある。一方、ラセミ体を原料として単に光学分割する製法では、Ｌ−アミノ酸の理論収率は５０％を越えることはない。収率向上にはラセミ化が別途必要となるが、光学分割のみでは不要なＤ体が廃棄物となり、理論収率を１００％に近づけることは困難である。
不要なＤ体をリサイクルして収率を向上させる方法として、Ｄ体を立体反転させる工程を設けたり、酵素活性を利用して不要なＤ体をケト酸に変換する工程とケト酸をアミノ化してＬ−アミノ酸に変換する工程とを組み合わせる方法が試みられている。例えば、ラセミ体を原料とし、全量をＬ−アミノ酸とする方法として次のような例が報告されている。
（６）ラセミアミノ酸を原料とし、酵母細胞又はＤ−アミノ酸酸化酵素とカタラーゼの作用によりＤ体をケト酸に変換し、次いでＬ−アミノ酸脱水素酵素とグルコース脱水素酵素の作用によりケト酸をＬ体に変換する酵素的合成法（Biomolecular Engineering, 17, 167 (2001)）。
（７）ラセミアミノ酸を原料とし、Ｄ−アミノ酸酸化酵素の作用によりＤ体を酸化して中間体としてイミンを生成させ、次いでヒドリド還元剤の利用又は金属触媒を用いた接触水素化によりイミンを還元してラセミアミノ酸を再生させる（ラセミ化）工程を繰り返してＬ体を得ることを特徴とする酵素的手法と化学的手法を併用した合成法（Chem. Comm., 246 (2002)）。
しかし、前記（６）の方法は、微生物等を利用して各工程に用いる少なくとも２種の酵素を多量発現させ、回収、精製するか、又は酵素の市販品を別途購入するなどして精製酵素を準備する必要があるため経済的に不利であり、複数の酵素を添加するため反応液の調製方法が煩雑となるなどの問題があった。また、前記（７）の方法では、還元反応に有害な金属触媒が利用されること、加圧条件が必要であること、生成物の蓄積濃度が低いことなどの問題があった。
また、国際公開ＷＯ２００５−０９０５９０号パンフレットには、Ｄ−アミノ酸酸化酵素、Ｌ−アミノ酸脱水素酵素、補基質ＮＡＤＨ再生酵素および場合によりカタラーゼの濃度または活性が高められている組換え微生物、及びそれを利用したＬ−アミノ酸類を製造する方法が開示されている。実施例には、アルスロバクター・プロトフォルミエ由来又はトリゴノプシス・バリアビリス由来のＤ−アミノ酸酸化酵素、バチルス・セレウス由来のロイシン脱水素酵素、及び補基質ＮＡＤＨ再生酵素のうち１又は２種類の酵素を発現する２つの組換えベクターが導入された形質転換体を用いる方法により、Ｌ−メチオニン又はＬ−ロイシンを製造した例が記載されている。しかし、この方法では、基質濃度が２５ｍＭ程度と極めて低いことから、工業化は困難であるという問題があった。また、カタラーゼを併用した実施例はなく、カタラーゼを併用する効果が具体的に示されていなかった。
Method Enzymol., 3, 554, (1957) Agric. Biol. Chem., 51, 729 (1087) Biotechnol. Bioeng., 14, 1288 (1994) Biomolecular Engineering, 17, 167 (2001) Chem. Comm., 246 (2002) 特開平１０−２３８９６号公報 国際公開ＷＯ２００５−０９０５９０号パンフレット
本発明の目的は、Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する反応とケト酸をＬ−アミノ酸に変換する反応をワンポット（同一系内）で行うことができ、しかも高い蓄積濃度でＬ−アミノ酸に変換可能な形質転換体、及び前記形質転換体を用いて安価な原料から効率よくＬ−アミノ酸を生成しうるＬ−アミノ酸の製造方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、上記の特性に加えて、主反応を補う酵素活性を利用してより高い効率でＬ−アミノ酸に変換可能な形質転換体、及び前記形質転換体を用いたＬ−アミノ酸の製造方法を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、高い基質濃度を用いた場合にも高収率でＬ−アミノ酸を得ることができる生産性に優れたＬ−アミノ酸の製造方法、及び該方法に用いる形質転換体を提供することにある。
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討した結果、Ｄ体をケト酸に変換する酵素と、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素を共に発現する形質転換体を利用することにより、２種の反応をワンポット（同一系内）で行うことができ、且つ安価な原料を用いてＬ−アミノ酸を高濃度で蓄積できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、アミノ酸の鏡像異性体混合物からＬ−アミノ酸を酵素的に生成するＬ−アミノ酸の製造方法であって、Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素をコードする塩基配列とが同一又は異なる発現ベクターに組み込まれた一又は複数の組換えベクターを同一宿主に導入して形成される形質転換体又はその処理物を、アミノ酸鏡像異性体混合物と接触させる工程を含むことを特徴とするＬ−アミノ酸の製造方法を提供する（以下、「本発明のＬ−アミノ酸の製造方法１」又は「方法１」と称する場合がある）。
本発明の方法１において、前記形質転換体は、Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、補酵素再生酵素をコードする塩基配列とを、同一又は異なる発現ベクターに組み込んだ一又は複数の組換えベクターを、同一宿主に導入して形成される形質転換体であってもよい。前記形質転換体は、また、Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、過酸化水素分解酵素をコードする塩基配列とを、同一又は異なる発現ベクターに組み込んだ一又は複数の組換えベクターを、同一宿主に導入して形成される形質転換体であってもよい。
本発明において、Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素は、Ｄ−アミノ酸酸化酵素及び／又はＤ−アミノ酸脱水素酵素であってもよい。前記Ｄ−アミノ酸酸化酵素には、例えばキャンディダ・ボイディニ（Candida boidinii）、トリゴノプシス・バリアビリス（Trigonopsis variabilis）、及びシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）から選択される少なくとも一つの微生物由来のＤ−アミノ酸酸化酵素が含まれる。前記Ｄ−アミノ酸脱水素酵素は、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)由来のＤ−アミノ酸脱水素酵素であってもよい。前記ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素は、Ｌ−アミノ酸脱水素酵素及び／又はＬ−アミノ酸アミノ基転移酵素であってもよい。前記Ｌ−アミノ酸脱水素酵素には、サーモアクチノマイセス・インターメディウス（Thermoactinomyces intermedius）由来フェニルアラニン脱水素酵素、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス（Geobacillus stearothermophilus）由来アラニン脱水素酵素、バチルス・サーモカテニュラタス（Bacillus thermocatenulatus）由来アラニン脱水素酵素、バチルス・スフェリカス（Bacillus sphearicus）由来アラニン脱水素酵素、シェワネラ・スピーシーズ（Shewanella species）由来アラニン脱水素酵素、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス（Geobacillus stearothermophilus）由来ロイシン脱水素酵素、及びバチルス・スフェリカス（Bacillus sphaericus）由来ロイシン脱水素酵素が含まれる。
本発明における補酵素再生酵素は、ギ酸脱水素酵素であってもよい。前記ギ酸脱水素酵素には、マイコバクテリウム・バッカエ（Mycobacterium vaccae）由来ギ酸脱水素酵素が含まれる。前記過酸化水素分解酵素はカタラーゼであってもよい。前記カタラーゼには、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)由来のカタラーゼであってもよい。
本発明の方法１の好ましい態様として、例えば、Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素がＤ−アミノ酸酸化酵素であり、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素がＬ−アミノ酸脱水素酵素であり、補酵素再生酵素がギ酸脱水素酵素であり、過酸化水素分解酵素がカタラーゼである方法が挙げられ、より好ましくは、Ｄ−アミノ酸酸化酵素がキャンディダ・ボイディニ由来であり、Ｌ−アミノ酸脱水素酵素がサーモアクチノマイセス・インターメディウス由来フェニルアラニン脱水素酵素であり、ギ酸脱水素酵素がマイコバクテリウム・バッカエ由来であり、カタラーゼがエシェリヒア・コリ由来である方法が挙げられる。
本発明におけるＬ−アミノ酸としては、Ｌ−ノルバリン等が好ましく用いられる。
また、本発明は、Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、補酵素再生酵素をコードする塩基配列と、過酸化水素分解酵素をコードする塩基配列とが同一又は異なる発現ベクターに組み込まれた一又は複数の組換えベクターを、同一宿主に導入して形成される形質転換体を提供する。
本発明の形質転換体の好ましい態様として、例えば、Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素がＤ−アミノ酸酸化酵素であり、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素がＬ−アミノ酸脱水素酵素であり、補酵素再生酵素がギ酸脱水素酵素であり、過酸化水素分解酵素がカタラーゼである形質転換体が挙げられ、より好ましくは、Ｄ−アミノ酸酸化酵素がキャンディダ・ボイディニ由来であり、Ｌ−アミノ酸脱水素酵素がサーモアクチノマイセス・インターメディウス由来フェニルアラニン脱水素酵素であり、ギ酸脱水素酵素がマイコバクテリウム・バッカエ由来であり、カタラーゼがエシェリヒア・コリ由来である形質転換体が挙げられる。
さらに、本発明は、Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、補酵素再生酵素をコードする塩基配列と、過酸化水素分解酵素をコードする塩基配列とが同一の発現ベクターに組込まれた組換えベクターを提供する。
本発明の組換えベクターの好ましい態様として、例えば、Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素がＤ−アミノ酸酸化酵素であり、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素がＬ−アミノ酸脱水素酵素であり、補酵素再生酵素がギ酸脱水素酵素であり、過酸化水素分解酵素がカタラーゼである組換えベクターが挙げられ、より好ましくは、Ｄ−アミノ酸酸化酵素がキャンディダ・ボイディニ由来であり、Ｌ−アミノ酸脱水素酵素がサーモアクチノマイセス・インターメディウス由来フェニルアラニン脱水素酵素であり、ギ酸脱水素酵素がマイコバクテリウム・バッカエ由来であり、カタラーゼがエシェリヒア・コリ由来である組換えベクターが挙げられる。
本発明は、また、アミノ酸の鏡像異性体混合物からＬ−アミノ酸を酵素的に生成するＬ−アミノ酸の製造方法であって、少なくともＤ−アミノ酸をケト酸に酸化する酵素及び過酸化水素分解酵素を共発現する形質転換体又はその処理物を用い、主にＤ−アミノ酸を酸化する酸化工程と、ケト酸からＬ−アミノ酸を生成する酵素及び必要に応じて補酵素再生酵素を共発現する形質転換体又はその処理物を用い、主にケト酸からＬ−アミノ酸を合成する還元工程の、異なる２つ以上の反応工程を併せ持つことを特徴とするＬ−アミノ酸の製造方法を提供する（以下、「本発明のＬ−アミノ酸の製造方法２」又は「方法２」と称する場合がある）。本発明の方法２において、上記本発明の形質転換体を用いてもよい。
本発明の方法２は、酸化工程と還元工程とを異なる反応条件下で行う方法であってもよい。本発明の方法２は、例えば、酸化工程を酸素含有気体の通気条件下で行い、還元工程を酸素含有気体を通気しないか又は酸素含有気体を酸化工程時より低い通気量で通気する条件下で行うことができる。
本発明の方法２には、例えば、酸化工程における酸素含有気体の通気量が、反応液に対して毎分１容量％以上であり、還元工程における酸素含有気体の通気量が、反応液に対して毎分１０容量％未満である方法、好ましくは、酸化工程における酸素含有気体の通気量が、反応液に対して毎分２容量％以上であり、還元工程における酸素含有気体の通気量が、反応液に対して毎分２容量％未満である方法、より好ましくは、酸化工程における酸素含有気体の通気量が、反応液に対して毎分５容量％以上であり、還元工程における酸素含有気体の通気量が、反応液に対して毎分５容量％未満である方法が挙げられる。また、本発明の方法２は、酸化工程における酸素含有気体の通気量が、反応液に対して毎分１容量％以上であり、還元工程において酸素含有気体を実質的に通気しない方法であってもよい。
本発明の方法２は、酸化工程における反応液のｐＨを７．０〜９．５に調整し、還元工程における反応液のｐＨを６．０〜８．５であって酸化工程におけるｐＨより低い値に調整する方法であってもよく、特に、酸化工程における反応液のｐＨを７．５〜９．０に調整し、還元工程における反応液のｐＨを６．５〜８．０に調整する方法であってもよい。
さらに、本発明の方法２は、酸化工程から還元工程へ移行前又は移行後に、上記本発明の形質転換体又はその処理物を反応液に付加的に添加してもよい。
本発明の方法１及び方法２は、Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する反応のｐＨ調整をギ酸又はその塩を用いて行うこともできる。
また、本発明の方法１及び方法２は、原料アミノ酸鏡像異性体混合物に対して０．２当量以上のギ酸イオン及び／又はアンモニウムイオンを含む反応液を用いてもよい。
なお、本願明細書における「酵素」は、目的の酵素活性を有すれば、該酵素を構成するアミノ酸の一部を欠失、置換、及び／又は付加等の手段で遺伝子工学的に変異させた変異体であってもよい。また、「本発明の方法」は、上記本発明の方法１及び方法２を総称する意味に用いる。
本発明によれば、特定の酵素を発現する一の形質転換体を用いて、酵素活性を利用したＤ−アミノ酸をケト酸に変換する反応とケト酸をＬ−アミノ酸に変換する反応をワンポット（同一系内）で行うことができるため、Ｌ−アミノ酸を効率よく且つ高い濃度で蓄積することができる。このため、安価なアミノ酸の鏡像異性体混合物を原料に用いて、少ない工程でＬ−アミノ酸を理論収率１００％で製造することができる。
特に、Ｄ−アミノ酸をケト酸に酸化する酸化工程を含む場合には、過酸化水素分解酵素を同一宿主内で発現させるため、穏和な反応条件を用いてケト酸の分解を回避でき、優れた生産性でＬ−アミノ酸を得ることができる。
製造例１で用いたプラスミドpSE420Uの制限酵素地図である。 製造例１で用いたプラスミドpSUCBDO1の制限酵素地図である。 製造例２で用いたプラスミドpUCTVDOTの制限酵素地図である。 製造例２で用いたプラスミドpSUTVDO1の制限酵素地図である。 製造例３で用いたプラスミドpUCECDD1の制限酵素地図である。 製造例３で用いたプラスミドpETECDD1の制限酵素地図である。 製造例４で用いたプラスミドpSU-MF26の制限酵素地図である。 製造例５で用いたプラスミドpSF-GSA2の制限酵素地図である。 製造例６で用いたプラスミドpSF-BTA1の制限酵素地図である。 製造例７で用いたプラスミドpSFBPAD1の制限酵素地図である。 製造例８で用いたプラスミドpSF-SAD1の制限酵素地図である。 製造例９で用いたプラスミドpEGSLED2の制限酵素地図である。 製造例９で用いたプラスミドpFGSLED1の制限酵素地図である。 製造例１０で用いたプラスミドpSFBPLD1の制限酵素地図である。 製造例１１で用いたプラスミドpSU-TIP2の制限酵素地図である。 製造例１１で用いたプラスミドpSF-TIP2の制限酵素地図である。 製造例１２で用いたプラスミドpSE-ECB1の制限酵素地図である。 製造例１３で用いたプラスミドpSE-BSB1の制限酵素地図である。 実施例１で構築プラスミドpSFTPCO1の制限酵素地図である。 実施例２で構築プラスミドpSFGACO1の制限酵素地図である。
本発明のＬ−アミノ酸の製造方法１は、アミノ酸の鏡像異性体混合物からＬ−アミノ酸を酵素的に生成する方法であって、Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素をコードする塩基配列とが同一又は異なる発現ベクターに組み込まれた一又は複数の組換えベクターを同一宿主に導入して形成される形質転換体又はその処理物を、アミノ酸鏡像異性体混合物と接触させる工程を含むことを特徴としている。すなわち、アミノ酸の鏡像異性体混合物を原料とし、一の形質転換体より発現させた酵素を利用して、Ｄ−アミノ酸からケト酸に変換する反応と、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する反応（以下、両反応をまとめて「主反応」と称する場合がある）とをワンポット（同一系内）で行うことにより、理論収率１００％でＬ−アミノ酸を生成する方法である。
本発明のＬ−アミノ酸の製造方法１は、上記構成の形質転換体に対して発現を誘導し、目的の変換酵素を有する培養物を得る培養工程と、該培養物を用いた酵素的反応によりアミノ酸鏡像異性体混合物に含まれるＤ−アミノ酸をＬ−アミノ酸に変換する反応工程とで構成されている。
培養工程は、Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素をコードする塩基配列とを同一又は異なる発現ベクターに組み込んだ一又は複数の組換えベクターを同一宿主に導入し、形成された形質転換体に対して発現を誘導することにより目的の変換酵素を有する培養物を得る工程である。
本発明に用いるＤ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素としては、Ｄ−アミノ酸に作用して対応するケト酸を生成する酵素であれば特に限定されず、例えば、Ｄ−アミノ酸酸化酵素、及びＤ−アミノ酸脱水素酵素などが挙げられる。
Ｄ−アミノ酸酸化酵素としては、例えば、Ｄ−アミノ酸酸化酵素、前記酵素を構成するアミノ酸の一部が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ前記Ｄ−アミノ酸酸化酵素を発現しうるポリペプチド等を利用できる。
前記Ｄ−アミノ酸酸化酵素は、EC 1.4.3.1、EC 1.4.3.3、EC 1.4.3.7、EC 1.4.3.15、EC 1.4.3.19等に分類され、酸素を電子受容体とし、水の存在下でＤ−アミノ酸を酸化的に脱アミノ化して対応するケト酸と過酸化水素を生成する酵素活性を有している。また、酸素を電子受容体としてアミノ酸を酸化してイミンを形成するが過酸化水素を生成しないＤ−アミノ酸酸化酵素も見出されており、本発明のＤ−アミノ酸酸化酵素にはこれらの酵素も含まれる。
Ｄ−アミノ酸酸化酵素は、いかなる生物由来であってもよく、例えば、キャンディダ（Candida）属、トリゴノプシス（Trigonopsis）属、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属、アルスロバクター（Arthrobacter）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属などの微生物に由来する酵素；ヒト・マウス・ブタ・ラビットなどの哺乳類の肝臓に由来する酵素（Biochemistry, 26, 3612 (1987)）などが利用できる。
前記微生物に由来する酵素の具体例には、例えば、アルスロバクター・プロトフォルメ(Arthrobacter protophormiae)由来（欧州特許出願公開第１３７５６４９号明細書）、キャンディダ・ボイディニ(Candida boidinii)由来（Yeast, 16, 1217 (2000)）、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)由来（J. Biotechnol. 104, 5 (2003))、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)由来（Environ. Microbiol. 4, 799 (2002))、ロドトルラ・グラシリス(Rhodotorula gracilis)由来（J. Bacteriol., 58, 115 (1997))、トリゴノプシス・バリアビリス(Trigonopsis variabilis)由来（特公平７−１０８２２５号公報）、フザリウム・ソラニ(Fusarium solani)由来（J. Biochem., 108, 1063 (1990)）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来の酵素などが含まれる。
なかでも、キャンディダ・ボイディニ(Candida boidinii)DSM 70026株などのキャンディダ（Candida）属由来のＤ−アミノ酸酸化酵素、トリゴノプシス・バリアビリス(Trigonopsis variabilis) CBS 4095株などのトリゴノプシス（Trigonopsis）属由来のＤ−アミノ酸酸化酵素などが好ましく用いられる。
Ｄ−アミノ酸脱水素酵素としては、例えば、Ｄ−アミノ酸脱水素酵素、前記酵素を構成するアミノ酸の一部が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ前記Ｄ−アミノ酸脱水素酵素を発現しうるポリペプチド等を利用できる。
前記Ｄ−アミノ酸脱水素酵素は、EC 1.4.99.1等に分類され、２，６−ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）等を電子受容体とし、Ｄ−アミノ酸を酸化的に脱アミノ化して対応するケト酸を生成する酵素活性を有している。
Ｄ−アミノ酸脱水素酵素は、いかなる生物由来であってもよく、例えば、エシェリヒア（Escherichia）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、サルモネラ（Salmonella）属、
フラボバクテリウム（Flavobacterium）属等の微生物に由来する酵素などが挙げられる。
前記微生物に由来する酵素の具体例としては、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)由来(J. Bacteriol., 176, 1500 (1994))、シュードモナス・エルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)由来(Curr. Microbiol. 41, 290 (2000))、サルモネラ・チフィミラム(Salmonella typhimurium)由来(Nature, 413, 852 (2001))、フラボバクテリウム・エスピー（Flavobacterium sp）由来（J. Gen. Microbiol. 133, 745-754 (1987)）等の微生物由来酵素等が挙げられる。
なかでも、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli) K-12株等のエシェリヒア（Escherichia）属由来のＤ−アミノ酸脱水素酵素が好ましく用いられる。
本発明におけるＤ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素活性は、次の方法を用いて測定することができる。すなわち、Ｄ−アミノ酸酸化酵素の酵素活性は、１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ Ｄ−アミノ酸、０．５ｍＭ ４−アミノアンチピリン、２ｍＭ フェノール、５Ｕ／ｍＬ 過酸化酵素を含む反応液を３０℃で反応させる方法を用いて、１分間に０．５μｍｏｌのキノンイミン生成を触媒する酵素量を１Ｕとして測定される。Ｄ−アミノ酸脱水素酵素の酵素活性は、１００ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ Ｄ−アミノ酸、０．１ｍＭ ２，６−ジクロロインドフェノールナトリウム塩（ＤＣＩＰ）を含む反応液を３０℃で反応させる方法を用いて、１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを減少させる酵素量を１Ｕとして測定される。
本発明に用いるケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素としては、ケト酸に作用して対応するＬ−アミノ酸を生成する酵素であれば特に限定されず、例えば、Ｌ−アミノ酸脱水素酵素、及びＬ−アミノ酸アミノ基転移酵素を有するポリペプチド等が挙げられる。
前記Ｌ−アミノ酸脱水素酵素は、例えば、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈとアンモニアの存在下、α−ケト酸を還元的にアミノ化して対応するＬ−アミノ酸を生成する酵素活性を有している。このようなＬ−アミノ酸脱水素酵素には、例えば、アラニン脱水素酵素（EC 1.4.1.1）、グルタミン酸脱水素酵素（EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3、EC 1.4.1.4）、Ｌ−アミノ酸脱水素酵素（EC 1.4.1.5）、セリン脱水素酵素（EC 1.4.1.7）、バリン脱水素酵素（EC 1.4.1.8）、ロイシン脱水素酵素（EC 1.4.1.9）、グリシン脱水素酵素（EC 1.4.1.10）、リジン脱水素酵素（EC 1.4.1.15）、トリプトファン脱水素酵素（EC 1.4.1.19）、フェニルアラニン脱水素酵素（EC 1.4.1.20）などが含まれる。
Ｌ−アミノ酸脱水素酵素は、いかなる生物由来であってもよく、例えば、微生物に由来する酵素；ヒト・マウス・ブタ・ウシなどの哺乳類に由来する酵素などが利用できる。
前記アラニン脱水素酵素（EC 1.4.1.1）としては、例えば、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス(Geobacillus stearothermophilus)由来(Biochemistry, 29, 1009 (1990))、バチルス・サーモカテニュラタス (Bacillus thermocatenulatus)由来(Biochimie, 71, 559 (1989))、シェワネラ・スピーシーズ(Shewanella sp)由来(Appl. Environ. Microbiol., 65, 4014 (1999))、バチルス・スフェリカス(Bacillus sphaericus IFO 3525)由来（Biochemistry, 29, 1009 (1990)；Accession No. M33298）等の生物由来アラニン脱水素酵素等が挙げられる。
前記グルタミン酸脱水素酵素（EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3、EC 1.4.1.4）としては、例えば、ウシ肝臓由来(J. Biochem. Mol. Biol., 36, 545 (2003)、バチルス・サブチリス (Bacillus subtilis)由来(J. Bacteriol., 180, 6298 (1998))、スルホロバス・ソルファタリカス (Sulfolobus solfataricus)由来(Biochemistry, 203, 81 (1992))、サッカロマイセス・セレビジエ (Saccharomyces cerevisiae)由来(Biochemistry, 217, 469 (1993))等の生物由来グルタミン酸脱水素酵素が挙げられる。
前記Ｌ−アミノ酸脱水素酵素（EC 1.4.1.5）としては、例えば、絶対嫌気性菌（obligate anaerobes）などの生物由来Ｌ−アミノ酸脱水素酵素が挙げられる。
前記セリン脱水素酵素（EC 1.4.1.7）としては、例えば、アグロバクテリウム・チュメファセンス(Agrobacterium tumefaciens)由来(Accession No. AB032242)等の微生物由来酵素などが挙げられる。
前記バリン脱水素酵素（EC 1.4.1.8）としては、例えば、サイトファーガ・スピーシーズ(Cytophaga sp)由来(Accession No. AF339150)等の生物由来バリン脱水素酵素などが挙げられる。
前記ロイシン脱水素酵素（EC 1.4.1.9）としては、例えば、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス (Geobacillus stearothermophilus)由来(Biochemistry, 27, 9056 (1988))、バチルス・スフェリカス（Bacillus sphaericus）由来ロイシン脱水素酵素等の生物由来酵素などが挙げられる。
前記グリシン脱水素酵素（EC 1.4.1.10）としては、例えば、エシェリヒア・コリ (Escherichia coli)由来(Eur. J. Biochem. 216, 539 (1993))等の生物由来グリシン脱水素酵素などが挙げられる。
前記リジン脱水素酵素（EC 1.4.1.15）としては、例えば、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス(Geobacillus stearothermophilus)由来(Appl. Environ. Microbiol. 70, 937 (2004))等の生物由来酵素などが挙げられる。
前記フェニルアラニン脱水素酵素（EC 1.4.1.20）としては、例えば、サーモアクチノマイセス・インターメディウス（Thermoactinomyces intermedius）由来（J. Biochem., 109, 371 (1991)）、ブレビバクテリウム・スピーシーズ (Brevibacterium sp)由来（特開昭６３−１５７９８６号公報）、スポロサルシナ・ウレア (Sporosarcina urea)由来（特開昭６１−２３９８８７号公報）、バチルス・スフェリカス (Bacillus sphaericus)由来（特開昭６３−１５７９８６号公報）、バチルス・バディウス (Bacillus badius)由来（特開昭６３−１５７９８６号公報）、ロドコッカス・スピーシーズ (Rhodococcus sp)由来（特開昭６１−１４６１８３号公報）、ノカルディア・スピーシーズ (Nocardia sp)由来(Arch. Microbiol., 153, 12 (1989))、ハロモナ・パシフィカ (Halomona pacifica)由来（特開２００２−６５２７０号公報）等の生物由来フェニルアラニン脱水素酵素などが挙げられる。
なかでも、ジオバチルス(Geobacillus)属、バチルス(Bacillus)属、シェワネラ（Shewanella）属、サーモアクチノマイセス（Thermoactinomyces）属等の微生物由来Ｌ−アミノ酸脱水素酵素が好ましい。好ましいＬ−アミノ酸脱水素酵素の具体例としては、サーモアクチノマイセス・インターメディウス（Thermoactinomyces intermedius）由来フェニルアラニン脱水素酵素、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス（Geobacillus stearothermophilus）由来アラニン脱水素酵素、バチルス・サーモカテニュラタス（Bacillus thermocatenulatus）由来アラニン脱水素酵素、バチルス・スフェリカス（Bacillus sphearicus）由来アラニン脱水素酵素、シェワネラ・スピーシーズ（Shewanella species）由来アラニン脱水素酵素、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス（Geobacillus stearothermophilus）由来ロイシン脱水素酵素、及びバチルス・スフェリカス（Bacillus sphaericus）由来ロイシン脱水素酵素等が挙げられる。
Ｌ−アミノ酸アミノ基転移酵素は、Ｌ−グルタミン酸やＬ−アスパラギン酸などのアミノ基供与体からアミノ基をα−ケト酸に転移させて対応するＬ−アミノ酸を生成する酵素活性を有している。このようなＬ−アミノ酸アミノ基転移酵素には、例えば、アラニンアミノ基転移酵素（EC 2.6.1.2）、システインアミノ基転移酵素（EC 2.6.1.3）、グリシンアミノ基転移酵素（EC 2.6.1.4）、チロシンアミノ基転移酵素（EC 2.6.1.5）、ロイシンアミノ基転移酵素（EC 2.6.1.6）、トリプトファンアミノ基転移酵素（EC 2.6.1.27）、ヒスチジンアミノ基転移酵素（EC 2.6.1.38）、分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素（EC 2.6.1.42）、芳香族Ｌ−アミノ酸アミノ基転移酵素（EC 2.6.1.57）などが含まれる。
Ｌ−アミノ酸アミノ基転移酵素は、いかなる生物由来であってもよく、例えば、微生物に由来する酵素；ヒト・ラット・マウスなどの哺乳類に由来する酵素などが利用できる。
Ｌ−アミノ酸アミノ基転移酵素の代表的な例としては、例えば、オリザ・サティバ (Oryza sativa)由来アラニンアミノ基転移酵素(Plant Mol. Biol. 39, 149 (1999))；ラット等の哺乳類由来システインアミノ基転移酵素(Physiol. Chem. Phys., 10, 483 (1978))；ヒトやラット等の哺乳類由来グリシンアミノ基転移酵素(J. Biol. Chem., 242, 3614 (1967))；ラットなどの哺乳類由来チロシンアミノ基転移酵素(Anal. Biochem., 95, 188 (1979))；ラットなどの哺乳類由来ロイシンアミノ基転移酵素(Biochim. Biophys. Acta, 445, 622 (1976))；ストレプトマイセス・グリシウス(Streptomyces griseus)由来トリプトファンアミノ基転移酵素(J. Biol. Chem., 250, 7819 (1975))；シュードモナス・テストステロニ(Pseudomonas testosteroni)由来ヒスチジンアミノ基転移酵素(Biochem. J., 147, 327 (1975))などが挙げられる。
また、分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素としては、例えば、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)由来(J. Biochem., 97, 993 (1985))、バチルス・サブチリス (Bacillus subtilis)由来(J. Bacteriol., 179, 496 (1997))等の生物由来分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素が挙げられる。芳香族アミノ酸アミノ基転移酵素としては、例えば、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)由来(Biochem. Biophys. Res. Commun., 133, 134 (1985))、パラコッカス・デニトリフィカンズ(Paracoccus denitrificans)由来（特開平０１−１５３０８４号公報）等の生物由来芳香族アミノ酸アミノ基転移酵素が例示できる。
なかでも、分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素が好ましく、特に、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)K-12株等のエシェリヒア（Escherichia）属由来分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素；バチルス・サブチリス (Bacillus subtilis)等のバチルス属(Bacillus)由来分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素などの微生物由来アミノ酸アミノ基転移酵素が好ましく用いられる。
本発明におけるケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素活性は、次の方法により測定することができる。すなわち、Ｌ−アミノ酸脱水素酵素活性は、２００ｍＭ グリシン−塩化カリウム−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ１０．５）、１０ｍＭ Ｌ−アミノ酸、２．５ｍＭ ＮＡＤ＋を含む反応液を３０℃で反応させる方法により、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨを生成する酵素量を１Ｕとして測定できる。Ｌ−アミノ酸アミノ基転移酵素活性は、１００ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ 塩化アンモニウム、１０ｍＭ α−ケトイソカプロン酸ナトリウム、４０ｍＭ Ｌ−アミノ酸（アミノ基供与体）、０．０５ｍＭ ピリドキサール−５’−リン酸、０．２ｍＭ ＮＡＤＰＨ、５Ｕ／ｍＬプロテウス・スピーシーズ(Proteus species)由来グルタミン酸脱水素酵素（東洋紡社製）を含む反応液を３０℃で反応させる方法により、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨを減少させる酵素量を１Ｕとして測定できる。
本発明においては、上記酵素活性を阻害しない範囲で、他の酵素をコードする塩基配列が、目的の変換酵素をコードする塩基配列を組み込んだ発現ベクターと同一又は異なる発現ベクターに組み込まれていてもよい。前記他の酵素としては、例えば、主反応の進行を阻害する物質を分解する酵素（例えば過酸化水素分解酵素等）、主反応で消費される基質を再生する酵素（例えば補酵素再生酵素等）等を用いることができる。
前記過酸化水素分解酵素は、Ｄ−アミノ酸酸化酵素を利用した反応で副生され、主反応の進行を阻害する過酸化水素を分解、除去する作用により、効率よく反応を進行させることができる。前記過酸化水素分解酵素としては、例えばカタラーゼ及び該カタラーゼを構成するアミノ酸の一部が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、過酸化水素分解活性を発現しうるポリペプチド（カタラーゼ様酵素）等を利用できる。前記カタラーゼとしては、微生物等に由来する公知のものを利用でき、例えば、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)由来のカタラーゼ等が挙げられる。エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)由来のカタラーゼの具体例として、ｋａｔＥ（J. Biol. Chem., 254, 11664-11668 (1979)）及びｋａｔＧ（J. Biol. Chem., 254, 4245-4252 (1979)）などが好適に挙げられる。
過酸化水素の分解活性（カタラーゼ活性）は、例えば、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、０．０３５％過酸化水素からなる反応液を３０℃で反応させる方法により、１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を分解する酵素量を１Ｕとして測定できる。
前記補酵素再生酵素は、Ｌ−アミノ酸脱水素酵素を利用した反応の進行に伴って消費される補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを再生する作用により、主反応を円滑に進行させることができる。本発明において、補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを再生する作用を有する形質転換体としては、例えば、目的の変換酵素に対応する塩基配列を組み込んだ一又は複数の組換えベクターを、補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを再生する活性を保持する宿主に導入して形成される形質転換体、及び／又はＤ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、Ｌ−アミノ酸脱水素酵素をコードする塩基配列と、補酵素再生酵素をコードする塩基配列とを、同一又は異なる発現ベクターに組み込んだ一又は複数の組換えベクターを、同一宿主に導入して形成される形質転換体を用いることができる。
前記ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ再生する作用を有する宿主としては、広範な微生物を用いることができ、該微生物が持つ解糖系、メチロトローフのＣ１化合物資化経路等により補酵素が再生される。
前記補酵素再生酵素としては、例えば、補酵素再生酵素、該補酵素再生酵素を構成するアミノ酸の一部が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ補酵素再生酵素活性を発現しうるポリペプチド等を利用できる。
前記補酵素再生酵素としては、例えば、ギ酸脱水素酵素、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素）などが挙げられる。補酵素再生酵素は、いかなる生物由来であってもよいが、好ましくは、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属由来のギ酸脱水素酵素；バチルス（Bacillus）属、サーモプラズマ（Thermoplasma）属由来のグルコース脱水素酵素等が用いられる。具体的な補酵素再生酵素として、例えば、ＮＡＤＨ再生酵素にはマイコバクテリウム・バッカエ（Mycobacterium vaccae）由来などのギ酸脱水素酵素；ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ再生用酵素にはバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）由来、サーモプラズマ・アシドフィラム（Thermoplasma acidphilum）由来、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）由来、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）由来などのグルコース脱水素酵素等が利用できる。
前記補酵素再生酵素活性は、次の方法により測定することができる。例えば、ギ酸脱水素酵素活性は、１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ ギ酸ナトリウム、２．５ｍＭ ＮＡＤ＋を含む反応液を３０℃で反応させる方法により、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨ生成を触媒する酵素量を１Ｕとして測定できる。
本発明において、酵素をコードする塩基配列は、目的の酵素活性を発現するポリペプチドをコードする塩基配列であればよく、例えば、一部又は全部がＤＤＢＪに公開されている公知の塩基配列、精製した酵素からアミノ酸配列を特定し、当該アミノ酸配列に対応するよう定めた塩基配列などが含まれる。これらの塩基配列は、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法、化学的に合成する方法等の公知の方法を利用して調製することができる。
発現ベクターとしては、プラスミドベクターやファージベクターを利用することができる。発現ベクターは、宿主の種類、組み込む遺伝子の種類や数等に応じて適宜選択することができる。これらの発現ベクターは、単独で又は複数を組み合わせて用いてもよい。宿主に対応する発現ベクターの具体例としては後述のものが例示される。
本発明においては、組換えベクターとして、Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素をコードする塩基配列とが同一又は異なる発現ベクターに組み込まれた一又は複数の組換えベクターが用いられる。なかでも、Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素をコードする塩基配列とが同一の発現ベクターに組み込まれた組換えベクターが好ましく用いられる。組換えベクターは、さらに、他の酵素に対応する塩基配列を、上記塩基配列を組み込んだ発現ベクターと同一又は異なる発現ベクターに組み込まれていてもよい。
本発明における組換えベクターの代表的な例としては、例えば、Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素に対応する塩基配列と、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素に対応する塩基配列とが同一の発現ベクターに組み込まれた２遺伝子発現組換えベクター；Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素に対応する塩基配列と、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素に対応する塩基配列と、任意の他の酵素に対応する塩基配列とが同一の発現ベクターに組み込まれた複数遺伝子発現組換えベクター；Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素に対応する塩基配列が組み込まれた１遺伝子発現組換えベクターと、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素に対応する塩基配列が前者と異なる発現ベクターに組み込まれた１遺伝子発現組換えベクターの組み合わせ；Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素に対応する塩基配列と、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素に対応する塩基配列と、任意の他の酵素に対応する塩基配列のうち少なくとも２種以上の塩基配列が同一の発現ベクターに組み込まれた複数遺伝子発現組換えベクターと、１種の塩基配列がこれとは異なる発現ベクターに組み込まれた１遺伝子発現組換えベクターの組み合わせ；Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素に対応する塩基配列を発現ベクターに組み込んだ１遺伝子発現組換えベクターと、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素に対応する塩基配列を前者とは異なる発現ベクターに組み込んだ１遺伝子発現組換えベクターと、任意の他の酵素に対応する塩基配列を前２者とは異なる発現ベクターに組み込んだ組換えベクターとの組み合わせ等が挙げられる。
なかでも、不和合性等の問題なく形質転換体が得られ、作業性、取扱性に優れるため、複数遺伝子を発現する一の組換えベクターを用いることが好ましい。このような組換えベクターとしては、例えば、Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素をコードする塩基配列とが同一の発現ベクターに組み込まれた組換えベクター；Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素に対応する塩基配列と、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素に対応する塩基配列と、任意の他の酵素に対応する塩基配列とが同一の発現ベクターに組み込まれた複数遺伝子発現組換えベクター等が挙げられる。
Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素がＤ−アミノ酸酸化酵素である場合には、副生する過酸化水素によるケト酸の分解を抑制し、Ｄ−アミノ酸酸化反応に必要な酸素量を低減させて、主反応を円滑に進行させるため、「任意の他の酵素」として、過酸化水素分解酵素、好ましくはカタラーゼを用いた組換えベクター又はその組み合わせが好ましく用いられる。このような組換えベクター及びその組み合わせの具体例としては、例えばＤ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素に対応する塩基配列と、Ｌ−アミノ酸脱水素酵素に対応する塩基配列と、過酸化水素分解酵素に対応する塩基配列と、補酵素再生酵素に対応する塩基配列とが同一の発現ベクターに組み込まれた４遺伝子発現組換えベクター；Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素に対応する塩基配列と、Ｌ−アミノ酸脱水素酵素に対応する塩基配列と、過酸化水素分解酵素に対応する塩基配列が同一の発現ベクターに組み込まれた３遺伝子発現組換えベクター；Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素に対応する塩基配列と過酸化水素分解酵素に対応する塩基配列が同一の発現ベクターに組み込まれた２遺伝子発現組換えベクター、及びＬ−アミノ酸脱水素酵素に対応する塩基配列と補酵素再生酵素に対応する塩基配列が前者とは異なる発現ベクターに組み込まれた２遺伝子発現組換えベクターの組み合わせ等が挙げられる。
また、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素がＬ−アミノ酸脱水素酵素である場合には、主反応を円滑に進行させるため、「任意の他の酵素」として、補酵素再生酵素を用いた組換えベクター又はその組み合わせが好ましく用いられる。このような組換えベクター及びその組み合わせの具体例としては、例えば、Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素に対応する塩基配列と、Ｌ−アミノ酸脱水素酵素に対応する塩基配列と、補酵素再生酵素に対応する塩基配列が同一の発現ベクターに組み込まれた３遺伝子発現組換えベクター；Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素に対応する塩基配列と、Ｌ−アミノ酸脱水素酵素に対応する塩基配列と、補酵素再生酵素に対応する塩基配列のうち少なくとも２種以上の塩基配列が同一の発現ベクターに組み込まれた複数遺伝子発現組換えベクターと、１種の塩基配列がこれとは異なる発現ベクターに組み込まれた１遺伝子発現組換えベクターの組み合わせ；Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素に対応する塩基配列を発現ベクターに組み込んだ１遺伝子発現組換えベクターと、Ｌ−アミノ酸脱水素酵素に対応する塩基配列を前者とは異なる発現ベクターに組み込んだ１遺伝子発現組換えベクターと、補酵素再生酵素に対応する塩基配列を前２者とは異なる発現ベクターに組み込んだ組換えベクターとの組み合わせなどが挙げられる。
組換えベクターにより宿主内に導入された塩基配列は、組換えベクターから直接転写・翻訳されて酵素活性が発現されてもよく、導入された塩基配列が宿主の染色体上に組み込まれた形態で発現されていても良い。組換えベクターの構築は、発現ベクターに、目的の変換酵素に対応する塩基配列を発現可能に組み込む方法により行われる。前記目的の変換酵素に対応する塩基配列を発現可能に組み込む方法としては、通常、プロモーター、ターミネーター等の発現制御に関わる領域（発現制御ユニット）を目的の塩基配列の近傍に組み込む方法が用いられる。例えば、複数の遺伝子をコードする塩基配列を任意の順で同一の発現ベクター導入する場合には、プロモーター、ターミネーターなどの発現制御ユニットをそれぞれの遺伝子に連結する方法や、ラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させる方法等、宿主となる生物の種類に応じて適宜選択して利用できる。
このような組換えベクターの好ましい構成としては、例えば目的の塩基配列の５´側上流にプロモーターを配置した構成、より好ましくは、前記プロモーターに加えて３´側下流にターミネーターを配置した構成等が挙げられる。宿主となる生物の種類に応じて利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターについては、「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 (1990)、Yeast 8, 423-488 (1992)、などに詳細に記述されている。また、蚕等の昆虫（Nature 315, 592-594 (1985))等の動物や、菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物を宿主として、当該宿主中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。宿主の種類に応じた組換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレキュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laboratories）。
組換えベクターの具体的な構成例としては、例えば、pSE420D（特開２０００−１８９１７０号公報）を改変した３遺伝子発現ベクターpSE420U上にキャンディダ・ボイディニ由来のＤ−アミノ酸酸化酵素遺伝子、マイコバクテリウム・バッカエ由来ギ酸脱水素酵素、サーモアクチノマイセス・インターメディウス由来フェニルアラニン脱水素酵素遺伝子の順で挿入したプラスミドpSFTPCO1；キャンディダ・ボイディニ由来のＤ−アミノ酸酸化酵素遺伝子、マイコバクテリウム・バッカエ由来ギ酸脱水素酵素、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス由来アラニン脱水素酵素遺伝子を様々な順番で挿入したプラスミドpSFGACO1、pSFTPCO2、pSFTPCO3などが挙げられる。更に、キャンディダ・ボイディニ由来のＤ−アミノ酸酸化酵素遺伝子及び大腸菌由来のカタラーゼ遺伝子を共発現させた組換えベクターpSCCBDO1、マイコバクテリウム・バッカエ由来ギ酸脱水素酵素をコードする遺伝子及びサーモアクチノマイセス・インターメディウス由来フェニルアラニン脱水素酵素遺伝子をコードする遺伝子を共発現する組換えベクターpSF-TIP2、キャンディダ・ボイディニ由来のＤ−アミノ酸酸化酵素遺伝子、大腸菌由来のカタラーゼ遺伝子、サーモアクチノマイセス・インターメディウス由来フェニルアラニン脱水素酵素遺伝子、マイコバクテリウム・バッカエ由来ギ酸脱水素酵素遺伝子の４遺伝子を共発現するpSFCPCO1、等が挙げられる。
組換えベクターを導入する宿主としては、上記酵素に対応する塩基配列を含む一又は複数の組換えベクターを導入でき、目的の酵素を発現可能な生物であれば特に限定されず、微生物、植物、動物などの広範な生物から適宜選択して利用できる。
宿主として利用可能な微生物としては、通常、宿主としたときに利用可能な発現ベクター系が開発されている微生物を用いることができ、例えば、エシェリヒア(Escherichia)属、バチルス(Bacillus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、セラチア(Serratia)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、コリネバクテリイウム(Corynebacterium)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、ラクトバチルス(Lactobacillus)属など細菌；ロドコッカス(Rhodococcus)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属など宿主ベクター系の開発されている放線菌；サッカロマイセス(Saccharomyces)属、クライベロマイセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、トリコスポロン(Trichosporon)属、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属、ピキア(Pichia)属、キャンディダ(Candida)属などの宿主ベクター系の開発されている酵母；ノイロスポラ(Neurospora)属；アスペルギルス(Aspergillus)属、セファロスポリウム(Cephalosporium)属などが挙げられる。
本発明において、宿主の種類に応じて用いられる発現ベクターと発現制御ユニット（プロモーターやターミネータ）との組み合わせの具体例を以下に示す。
宿主がエシェリヒア(Escherichia)属、例えばエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)等のの場合には、pBR、pUC系プラスミドベクター；lac(β−ガラクトシダーゼ)、trp(トリプトファンオペロン)、tac、trc (lac、trpの融合)、λファージ PL、PRなどに由来するプロモーター；ターミネーターがtrpA由来、ファージ由来、rrnBリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーターからなる組み合わせが挙げられる。なかでも、市販のpSE420（Invitrogen製）のマルチクローニングサイトを一部改変したベクターpSE420D（特開２０００−１８９１７０号公報）、３遺伝子の共発現が可能なベクターpSE420U、４遺伝子の共発現が可能なベクターpSE420Qが好適に利用できる。
宿主がバチルス(Bacillus)属の場合には、pUB110系プラスミド、pC194系プラスミドなどのプラスミドベクターが利用可能であり、染色体にインテグレートすることもできる。また、プロモーター、ターミネーターとして、apr(アルカリプロテアーゼ)、npr(中性プロテアーゼ)、amy(α−アミラーゼ)などが利用できる。
宿主がシュードモナス(Pseudomona）属の場合には、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepacia)などを宿主とするベクター系が開発されている。トルエン化合物の分解に関与するプラスミドTOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター(RSF1010などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む)pKT240などが利用可能であり、プロモーター、ターミネーターとして、リパーゼ遺伝子（特開平５−２８４９７３号公報）などが利用できる。
宿主がブレビバクテリウム(Brevibacterium）属、例えば、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)の場合には、pAJ43(Gene 39, 281 (1985))などのプラスミドベクターが利用可能である。プロモーター、ターミネーターとしては、大腸菌で使用されているプロモーター、ターミネーターをそのまま利用できる。
宿主がコリネバクテリウム(Corynebacterium）属、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)の場合には、pCS11(特開昭５７−１８３７９９号公報)、pCB101(Mol. Gen. Genet. 196, 175 (1984))などのプラスミドベクターが利用可能である。
宿主がストレプトコッカス(Streptococcus)属の場合には、pHV1301(FEMS Microbiol. Lett. 26, 239 (1985)、pGK1（Appl. Environ. Microbiol. 50, 94 (1985))などがプラスミドベクターとして利用可能である。
宿主がラクトバチルス(Lactobacillus)属の場合には、ストレプトコッカス(Streptococcus)属用に開発されたpAMβ1（J. Bacteriol. 137, 614 (1979))などが利用可能である。プロモーターには、上記バチルス(Bacillus)属におけるプロモーターとして例示のものを利用可能である。
宿主がロドコッカス(Rhodococcus)属の場合には、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)から単離されたプラスミドベクターが使用可能である (J. Gen. Microbiol. 138, 1003 (1992))。
宿主がストレプトマイセス(Streptomyces)属の場合には、HopwoodらのGenetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories (1985)に記載の方法に従って、プラスミドを構築することができる。特に、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)においては、pIJ486 (Mol. Gen. Genet. 203, 468-478 (1986))、pKC1064(Gene 103, 97-99 (1991))、pUWL-KS (Gene 165,149-150 (1995))が使用できる。また、ストレプトマイセス・バージニア(Streptomyces virginiae)においても、同様のプラスミドを使用することができる（Actinomycetol. 11, 46-53 (1997))。
宿主がサッカロマイセス(Saccharomyces)属、例えばサッカロマイセス・セレビジアエ(Saccharomyces cerevisiae)の場合には、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プラスミドが利用可能であり、染色体内に多コピー存在するリボソームDNAとの相同組み換えを利用したインテグレーションベクター（EP 537456など）は、多コピーで遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため極めて有用である。また、ADH(アルコール脱水素酵素)、GAPDH(グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素)、PHO(酸性フォスファターゼ)、GAL(β−ガラクトシダーゼ)、PGK(ホスホグリセレートキナーゼ)、ENO(エノラーゼ)などのプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
宿主がクライベロマイセス(Kluyveromyces）属、例えばクライベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)の場合には、サッカロマイセス・セレビジアエ由来2μm系プラスミド、pKD1系プラスミド（J. Bacteriol. 145, 382-390 (1981))、キラー活性に関与するpGKl1由来プラスミド、クライベロマイセス（Kluyveromyces）属における自律増殖遺伝子KARS系プラスミド、リボソームDNAなどとの相同組み換えにより染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミド（EP 537456など）などが利用可能である。また、ADH、PGKなどに由来するプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
宿主がシゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属の場合には、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のARS (自律複製に関与する遺伝子)およびサッカロマイセス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マーカーを含むプラスミドベクターが利用可能である（Mol. Cell. Biol. 6, 80 (1986))。また、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のADHプロモーターなどが利用できる（EMBO J. 6, 729 (1987))。特に、pAUR224は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
宿主がチゴサッカロマイセス属(Zygosaccharomyces)の場合には、チゴサッカロマイセス・ロウキシ(Zygosaccharomyces rouxii)由来のpSB3（Nucleic Acids Res. 13, 4267 (1985))などに由来するプラスミドベクターが利用可能であり、サッカロマイセス・セレビジアエ由来PHO5 プロモーターや、チゴサッカロマイセス・ロウキシ由来GAP-Zr (グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素)のプロモーター（Agri. Biol. Chem. 54, 2521 (1990))などが利用可能である。
宿主がピキア(Pichia)属の場合には、ピキア・アンガスタ（旧名：ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)）において宿主ベクター系が開発されている。ベクターとしては、ピキア・アンガスタ由来自律複製に関与する遺伝子（HARS1、HARS2）も利用可能であるが、比較的不安定であるため、染色体への多コピーインテグレーションが有効である（Yeast 7, 431-443 (1991)）。また、メタノールなどで誘導されるAOX（アルコールオキシダーゼ）、FDH(ギ酸脱水素酵素)のプロモーターなどが利用可能である。また、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)などにピキア由来自律複製に関与する遺伝子 (PARS1、 PARS2)などを利用した宿主ベクター系が開発されており（Mol. Cell. Biol. 5, 3376 (1985))、高濃度培養とメタノールで誘導可能なAOXなど強いプロモーターが利用できる（Nucleic Acids Res. 15, 3859 (1987))。
宿主がキャンディダ(Candida)属の場合には、キャンディダ・マルトーサ(Candida maltosa)、キャンディダ・アルビカンス(Candida albicans)、キャンディダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、キャンディダ・ウチルス(Candida utilis)などにおいて宿主ベクター系が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおいてはキャンディダ・マルトーサ由来ARSがクローニングされ（Agri. Biol. Chem. 51, 1587 (1987))、これを利用したベクターが開発されている。また、キャンディダ・ウチルスにおいては、染色体インテグレートタイプのベクターは強力なプロモーターが開発されている（特開平８−１７３１７０号公報）。
宿主がアスペルギルス(Aspergillus)属の場合には、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリジー (Aspergillus oryzae) などがカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Trends in Biotechnology 7, 283-287 (1989))。
宿主がトリコデルマ(Trichoderma)属の場合には、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)を利用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ遺伝子由来プロモーターなどが利用できる（Biotechnology 7, 596-603 (1989))。
宿主としては、上記の微生物以外に、植物、動物等の生物を利用することもできる。当該宿主に対応して利用可能なベクター、プロモーター等が開発されている。例えば、蚕等の昆虫（Nature 315, 592-594 (1985))や、菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物を宿主として、当該宿主中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。
組換えベクターを宿主へ導入する方法としては、宿主の種類等に応じて公知乃至慣用の手段及び方法を利用できる。
上記方法により、目的の酵素を発現可能な一又は複数の組換えベクターが、同一宿主に導入された形質転換体が形成される。
本発明の形質転換体は、上記に例示の組換えベクターを同一宿主に導入して形成される。本発明の形質転換体の代表的な例としては、例えば、Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素をコードする塩基配列とが同一の発現ベクターに組み込まれた一の組換えベクターを含む形質転換体、及び前記両塩基配列が異なる発現ベクターに組み込まれた複数の組換えベクターを同一の宿主に導入して形成される一の形質転換体；Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、補酵素再生酵素をコードする塩基配列及び／又は過酸化水素分解酵素をコードする塩基配列とが同一の発現ベクターに組み込まれた一又は複数の組換えベクター、及び前３又は４塩基配列が２以上の異なる発現ベクターに組込まれた複数の組換えベクターを同一の宿主に導入して形成される一の形質転換体等が挙げられる。なかでも、複数ベクター間の不和合性等の問題が生じにくい点で、一の組換えベクターが導入された形質転換体が好ましく用いられる。
好ましい形質転換体としては、上記構成におけるＤ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素がＤ−アミノ酸酸化酵素であり、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素がＬ−アミノ酸脱水素酵素であり、補酵素再生酵素がギ酸脱水素酵素であり、過酸化水素分解酵素がカタラーゼである形質転換体、より好ましくは、Ｄ−アミノ酸酸化酵素がキャンディダ・ボイディニ由来であり、Ｌ−アミノ酸脱水素酵素がサーモアクチノマイセス・インターメディウス由来フェニルアラニン脱水素酵素であり、ギ酸脱水素酵素がマイコバクテリウム・バッカエ由来であり、カタラーゼがエシェリヒア・コリ由来である形質転換体が挙げられる。
本発明の好ましい形質転換体の具体例としては、少なくともＤ−アミノ酸をケト酸に酸化する酵素と、過酸化水素分解酵素と、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素とを共発現する形質転換体が挙げられる。この形質転換体によれば、Ｄ−アミノ酸の酸化反応で副生される過酸化水素によるケト酸の分解を抑制して、ケト酸の収率をより向上できる。前記好ましい形質転換体は、必要に応じてさらに補酵素再生酵素を共発現する態様であってもよい。この場合には、補酵素再生酵素の活性によりケト酸の還元的アミノ化反応を効率よく進行させて、Ｌ−アミノ酸を高い収率で得ることができる。
本発明では、上記構成の形質転換体を単独で培養することにより、Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素と、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素を共に発現することができる。このため、Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する反応と、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する反応（主反応）をワンポット（同一系内）で進行させることができるため製造工程を少なくできる。また、本発明では、ベクターによる強制発現系を利用するため、高濃度に蓄積された酵素により主反応を効率よく進行させることができる。このため、安価なアミノ酸の鏡像異性体混合物を原料としてＬ−アミノ酸を理論収率１００％で製造することができるという利点がある。
形質転換体の培養に用いる培地としては、宿主の生育に必要なタンパク質、脂質、糖質、ビタミン、ミネラルなどの有用成分を少なくとも含む液体培地又は固体培地を用いることができる。なかでも、培養物をそのまま酵素的反応に利用することができる点で、液体培地が好ましく用いられる。培地は、各種添加物等を含んでいても良い。
培養工程により、Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素、及び必要に応じて他の酵素が高濃度に蓄積された培養物が生成される。
反応工程においては、培養工程で得た培養物又はその処理物を用い、酵素的反応により、アミノ酸の鏡像異性体混合物に含まれるＤ−アミノ酸をＬ−アミノ酸に変換する反応が進行する。すなわち、反応工程は、アミノ酸の鏡像異性体混合物を原料として、Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素反応と、生成したケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素反応を同一系内で進行させて、Ｌ−アミノ酸の高濃度蓄積物を生成する工程である。
反応工程における反応液は、培養工程で得た培養物又はその処理物と、原料としてのアミノ酸の鏡像異性体混合物とを少なくとも含んでいる。
培養工程で得た培養物は、少なくとも発現誘導された形質転換体と培地とで構成されている。前記培養物は、そのまま反応工程に用いることも可能であるが、酵素反応に適した反応液が調製しやすい点で、培養物の処理物として、培養物から培地を除去して得られる形質転換体が好ましく利用される。なお、培養物の処理物として、培養物に発現誘導された目的の酵素活性を保持しうる範囲で、培養物に、破砕、濃縮、希釈、濾過、遠心分離、抽出、固定化等の適宜な処理を施した処理物を用いることができる。培養物の処理物としては、具体的には、界面活性剤や有機溶媒により膜透過性が高められた菌や固定化菌体、ホモジナイザーや超音波等用いて破砕処理を施して調製される無細胞抽出液等を利用できる。
原料に用いるアミノ酸の鏡像異性体混合物とは、Ｄ−アミノ酸とＬ−アミノ酸の混合物であり、Ｄ体とＬ体の比率が、例えばＤ体：Ｌ体＝１０：９０〜９０：１０、好ましくは２５：７５〜７５：２５、より好ましくは５０：５０（ラセミ体）である混合物が含まれる。
鏡像異性体混合物を構成するアミノ酸としては、例えば、下記式（１）
Figure 2006132145
 （式中、Ｒは置換基を有していても良い炭化水素基を示す）
で表される化合物が挙げられる。Ｒにおける炭化水素基としては、メチル、エチル、プロピル、プロペニル、ブチル、イソブチル、ブテニルなどの等の直鎖または分岐鎖状炭化水素基；シクロペンタン、シクロヘキサン等の脂環式炭化水素基；フェニル等の芳香族系炭化水素基等が挙げられる。炭化水素基が有していてもよい置換基としては、例えば、ハロゲン原子、アミノ基、ニトロ基、アルキル基、アルコキシ基などが挙げられる。
本発明に用いられるアミノ酸の代表的な例としては、例えば、ノルバリン、ノルロイシン、ホモフェニルアラニン、ｏ−ニトロフェニルアラニン、ｍ−ニトロフェニルアラニン、ｐ−ニトロフェニルアラニン、２−アミノ酪酸、β−ナフチルアラニンなどが挙げられる。なかでも、ノルバリンの鏡像異性体混合物が好ましく用いられる。
アミノ酸の鏡像異性体混合物の使用量は、形質転換体より発現される酵素の種類や量に応じて適宜選択できるが、反応液全体に対して、例えば０．１〜５０重量％、好ましくは１〜３０重量％、より好ましくは２〜２０重量％程度である。
反応液は、培養物又はその処理物、及びアミノ酸の鏡像異性体混合物以外に、他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、例えば、反応溶媒、酵素活性に対応する基質や補酵素、消泡剤等を用いることができる。反応溶媒としては、水；炭化水素、エステル、アルコール等の適宜な有機溶媒、ｐＨ調整剤や緩衝液等の液性調整剤等が用いられる。これらの反応溶媒は単独で又は２種以上組み合わせて用いてもよい。酵素活性に対応する基質及び補酵素は、形質転換体が発現する酵素に応じて適宜選択して用いられる。
反応液に添加する補酵素として、例えば、アミノ酸脱水素酵素を発現する形質転換体にはＮＡＤ（Ｐ）Ｈを、ギ酸脱水素酵素やグルコース脱水素酵素等の補酵素再生酵素を発現する形質転換体にはＮＡＤ（Ｐ）＋を用いることができる。これらの補酵素を反応液中に添加した場合には、各酵素を補強、安定化することにより主反応の進行を促すことができる。前記補酵素（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、ＮＡＤ（Ｐ）＋）は、反応液全量に対して例えば０．００１〜１００ｍＭ、好ましくは０．０１〜１０ｍＭ、より好ましくは０．１〜１ｍＭ程度の濃度で添加することができる。
形質転換体がアミノ酸脱水素酵素と補酵素再生酵素とを共に発現する場合には、系中に前記補酵素再生酵素活性に対応する基質を共存させる必要がある。前記補酵素再生酵素とその基質の組み合わせの具体例としては、ギ酸脱水素酵素とギ酸又はその塩、グルコース脱水素酵素とグルコース、アルコール脱水素酵素とエタノール又は２−プロパノール、リンゴ酸脱水素酵素とリンゴ酸又はその塩、グリセロール脱水素酵素とグリセロールなどが反応系に添加される。前記基質は、原料として用いた鏡像異性体混合物に含まれるＤ−アミノ酸に対して、例えば０．１〜２０当量、好ましくは１〜５当量程度添加することができる。
また、形質転換体がＬ−アミノ酸アミノ基転移酵素を発現する場合には、アミノ基供与体が添加される。アミノ基供与体としては、例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸等の各種アミノ酸、及びこれらの塩などが用いられる。アミノ基供与体は、原料の鏡像異性体混合物に含まれるＤ−アミノ酸に対して、例えば０．１〜１００等量、好ましくは１〜２０当量程度添加することができる。
形質転換体がＬ−アミノ酸脱水素酵素を発現する場合は、系中にアンモニウムイオン等のアミノ基供与体を存在させることが好ましい。アンモニウムイオンを反応液に添加する形態は特に限定されず、例えばアンモニウムバッファーとして添加してもよく、補酵素再生酵素であるギ酸脱水素酵素の基質となるギ酸の供与を兼ねることができるギ酸アンモニウム又はギ酸とアンモニアとを別個に添加してもよい。アンモニウムイオンの添加量は、反応開始時に系中に存在するＤ−アミノ酸に対して、例えば０．１〜２０当量、好ましくは０．２〜１０当量、より好ましくは０．５〜４当量程度である。
消泡剤は、液性の改善に有効であり、例えば、アデカプルロニックＬ−６１、アデカプルロニックＬ−７１、アデカプルロニック２５Ｒ−１、アデカプルロニック２５Ｒ−２、アデカノールＬＧ−２９４、カラリン、シリコンなどが利用できる。消泡剤の添加量は、反応液全量に対して例えば０．００１〜０．５重量％、好ましくは０．００５〜０．１重量％、より好ましくは０．０１〜０．０５重量％程度である。
また、反応液のｐＨの維持を目的として、各種緩衝液や緩衝能のある化合物を添加することもできる。特に、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素としてＬ−アミノ酸脱水素酵素を用いた場合は、アンモニアバッファー、ギ酸アンモニウム等が好適に用いられる。これらは、培地全量に対して、例えば１０ｍＭ〜３Ｍ、好ましくは５０ｍＭ〜１．５Ｍ程度の濃度で添加することができる。
また、形質転換体が発現する酵素の種類によっては酸素存在下で酵素反応が行われる。Ｄ−アミノ酸酸化酵素を発現する形質転換体は、例えば、純粋酸素や酸素分圧を高めた空気、空気等を反応液中へ通気しながら反応することができる。この場合、通気量は、例えば０．０１〜１０ｖｖｍ、好ましくは０．０５〜２ｖｖｍ程度である。通気方法は、撹拌、振盪等の手段により酸素等を反応液に接触させる方法、加圧による方法のいずれであってもよい。これらの条件は溶存酸素量によってコントロールしてもよい。
反応工程における反応は、培養物又はその処理物及び他の成分と、原料としてのアミノ酸の鏡像異性体混合物を混合して行われる。原料等は、反応溶媒等に一括して添加しても良く、逐次的、連続的または間欠的に添加してもよい。反応は、静置又は撹拌下で行われる。
反応条件は、酵素反応の進行を阻害しない範囲で適宜選択される。反応開始時の反応液のｐＨは、目的の酵素活性を維持できる範囲から選択され、通常はｐＨ５〜１１、好ましくはｐＨ６〜１０、より好ましくはｐＨ７〜９程度である。また、反応中及び反応終了時のｐＨは適当な範囲内でコントロールすることもできるし、反応の進行に伴って変化するに任せてもよい。反応温度は、目的の酵素活性を維持できる範囲から適宜選択でき、例えば５〜７０℃、好ましくは１０〜５５℃、より好ましくは２０〜４０℃程度である。
反応工程の好ましい態様としては、培養工程で得た培養物から回収した形質転換体、アミノ酸の鏡像異性体混合物、及び酵素に対応する基質とその他適当な添加剤を混合した反応液を、通気条件下で撹拌する方法が挙げられる。
反応工程によれば、培養工程で発現させた酵素をアミノ酸の鏡像異性体混合物に作用させることにより、Ｄ−アミノ酸がケト酸に変換する酵素反応とケト酸がＬ−アミノ酸に変換する酵素反応がワンポット（同一系内）で進行してＬ−アミノ酸が生成される。
反応の終結は、反応液中のＤ−アミノ酸濃度が低下し、Ｌ−アミノ酸が高濃度に蓄積した時点で確認できる。すなわち、本発明における反応の終結時点は、培養系中におけるＬ−アミノ酸蓄積濃度が、例えば９０％ｅ．ｅ以上、好ましくは９５％ｅ．ｅ以上、より好ましくは９９％ｅ．ｅ以上である。ここで、「％ｅ．ｅ」とは、以下の式で示される値のことを言う。
ｅ．ｅ．（％）＝｛（Ｌ−アミノ酸の濃度）−（Ｄ−アミノ酸の濃度）｝×１００／
｛（Ｌ−アミノ酸の濃度）＋（Ｄ−アミノ酸の濃度）｝
上記反応により、Ｌ−アミノ酸が高濃度に蓄積された反応液が生成される。Ｌ−アミノ酸を高濃度に含む反応液は、例えば、反応液中に溶解度以上に蓄積したＬ−アミノ酸を可溶化した後、適宜な分離手段を用いて除菌、除タンパク等の処理が施され、得られた処理液を必要に応じて精製することにより、Ｌ−アミノ酸を回収することができる。
前記Ｌ−アミノ酸の可溶化処理は、例えば、液体培養を行った場合の培養液中にその溶解度以上に目的物のＬ−アミノ酸が蓄積している場合に、例えば、培養系の酸性化、塩基性化、もしくは希釈等の手段により施すことができる。酸性化は、系内に塩酸、硫酸等の酸を添加することにより、塩基性化は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の塩基を添加することにより行われる。可溶化処理後の処理液は、酸性、塩基性、中性の何れであっても良い。前記分離手段としては、例えば、濾過、遠心分離等の慣用の手段を用いることができる。
前記除菌、除タンパク処理後の処理液は、添加剤を添加することにより不要な無機塩を析出させ、ろ過等の分離手段を施すことにより、無機塩が除去されたＬ−アミノ酸溶液とすることができる。このような添加剤としては、Ｌ−アミノ酸の溶解度を保持しつつ不要な無機塩の溶解度を下げることができれば特に限定されないが、好ましくはメタノール、エタノール、２−プロパノール、アセトン、アセトニトリルなどの水溶性有機溶媒を用いることができる。これらの添加剤は蒸留等の操作によって系中から除去してもよいし、残存したままで以降の精製を行ってもよい。
精製は、例えば、濃縮、等電点沈殿、冷却や目的物の溶解度を低下させる作用を有する添加物の添加などによる晶析処理、イオン交換樹脂処理、膜分離、有機溶媒による抽出、イオン交換クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、吸着剤による吸着、凝集剤、脱水剤による脱水もしくは凝集、蒸留等の公知の精製手段及びこれらの組み合わせて行われる。上記精製手段は、アミノ酸の種類に応じて適宜選択することができる。
反応液中からＬ−アミノ酸を分離・精製する好ましい方法としては、例えば、Ｌ−アミノ酸を含む反応液を濃縮後、等電点付近にｐＨを調整し、上記に例示の水溶性有機溶媒を添加して晶析処理を施して、析出した精製Ｌ−アミノ酸を分離、回収する方法が挙げられる。
アミノ酸としてＬ−ノルバリンを分離、精製する場合には、例えば、次の方法を利用できる。すなわち、Ｌ−ノルバリンを含む反応液に硫酸を添加して酸性化することにより溶反応液中に蓄積したＬ−ノルバリンを可溶化した後、遠心分離により除菌処理を施す。得られたＬ−ノルバリン含有溶液にメタノールを添加して不要な無機塩を析出させ、ろ過により除去する。回収したろ液にアンモニア、水酸化ナトリウムなどの塩基を添加して中和し、さらにアセトンを添加して晶析処理を施すことにより精製ノルバリンを得ることができる。
本発明の方法１によれば、Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素的反応と、生成したケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素的反応を、ワンポット（同一系内）で進行させるため、Ｄ−アミノ酸からケト酸を生成する酵素反応とケト酸からＬ−アミノ酸を生成する酵素反応を一の形質転換体の培養工程として行うことができ、しかもＬ−アミノ酸を高い蓄積量で得ることができる。このため、ラセミ体などのＤ体とＬ体が混合した安価なアミノ酸混合物を原料とした場合にも、理論収率１００％でＬ−アミノ酸を製造することができる。
本発明のＬ−アミノ酸の製造方法２は、アミノ酸の鏡像異性体混合物からＬ−アミノ酸を酵素的に生成するＬ−アミノ酸の製造方法であって、少なくともＤ−アミノ酸をケト酸に酸化する酵素及び過酸化水素分解酵素を共発現する形質転換体又はその処理物を用い、主にＤ−アミノ酸を酸化する酸化工程と、ケト酸からＬ−アミノ酸を生成する酵素及び必要に応じて補酵素再生酵素を共発現する形質転換体又はその処理物を用い、主にケト酸からＬ−アミノ酸を合成する還元工程の、異なる２つ以上の反応工程を併せ持つことを特徴としている。
前記「酸化工程」とは、主にＤ−アミノ酸をケト酸へ酸化する酸化反応を含む工程であることを意味しており、酸化反応以外に他の反応が進行していてもよい。前記酸化工程における他の反応として、例えば酸化反応を促進する反応（過酸化水素分解酵素の作用による反応等）、後述する還元反応等が挙げられる。
前記「還元工程」とは、主にケト酸の還元的アミノ化によりＬ−アミノ酸を合成する還元反応を含む工程であることを意味しており、還元反応以外に他の反応が進行していてもよい。前記還元工程における他の反応として、例えば還元反応を促進する反応（補酵素再生酵素の作用による反応等）、上記酸化反応等が挙げられる。還元工程における「ケト酸からＬ−アミノ酸を生成する酵素及び必要に応じて補酵素再生酵素を共発現する形質転換体」とは、ケト酸からＬ−アミノ酸を生成する酵素を発現する形質転換体、及びケト酸からＬ−アミノ酸を生成する酵素と補酵素再生酵素を共発現する形質転換体を含む意味である。
なお、本発明のＬ−アミノ酸の製造方法２は、上記酸化工程及び還元工程からなる少なくとも２つの異なる反応工程を有していればよく、さらに精製工程等の他の工程を含んでいてもよい。
本発明者らの検討によれば、Ｄ−アミノ酸をケト酸に酸化する酵素を用いる酸化反応は、反応液中の基質濃度が高いと、反応生成物（ケト酸）の収率［原料アミノ酸鏡像異性体混合物（ＤＬ−アミノ酸）に対するＬ−アミノ酸の割合］が低くなる傾向にあり、例えば、基質濃度が５重量％を超える反応条件では、前記収率が７０％程度にとどまることから、工業的生産に耐えられないという課題があった。収率が低くなる原因として、Ｄ−アミノ酸酸化酵素の作用により生成されたケト酸は、同反応で副生される過酸化水素と接触して脱炭酸され、生成したアルデヒドがさらに酵素的酸化もしくは空気酸化を受けて有機酸を生成する一連の反応によって分解される結果、主反応の進行が阻害されることが推察された。
上記課題に対し、本発明者らは、Ｄ−アミノ酸酸化酵素と過酸化水素分解酵素（特にカタラーゼ）を共発現させた形質転換体を用いると、Ｌ−アミノ酸の収率が著しく向上しうることを見いだした。一方、Ｄ−アミノ酸酸化酵素を発現する形質転換体を含む反応液に、別途カタラーゼを添加した場合には、ほとんど効果を示さなかった。このことは、菌体内で生成されたα−ケト酸が、同時に副生された過酸化水素により菌体内において速やかに分解されるのであって、菌体外へ漏出したα−ケト酸が同じく菌体外に漏出した過酸化水素によって徐々に分解されるのではないことを示唆している。すなわち、α−ケト酸の分解抑制に高い効果を得るためには、反応混合液に過酸化水素分解酵素を添加するより、むしろＤ−アミノ酸酸化酵素と過酸化水素分解酵素（特にカタラーゼ）を同一の菌体内で発現することにより特別の価値があることを示している。
また、Ｄ−アミノ酸酸化酵素の作用によるＤ−アミノ酸の酸化反応は、通常、酸素通気が律速となるため、高通気、高撹拌条件が求められることが多い。これらの条件は、工業的な規模の発酵槽においては設備上の負荷が大きくなったり、溶菌や反応液の発泡を引き起こし、収率が低下しやすいという問題があった。本発明者らは、過酸化水素分解酵素（カタラーゼ等）を併用することにより、上記のような問題を解決しうるという副次的な効果が得られることを見出した。以下に詳述する。
Ｄ−アミノ酸を酸化してケト酸を生成する酸化工程において、Ｄ−アミノ酸酸化酵素を単独で利用した場合には、例えば下記反応式（１）が進行する。式（１）に示されるように、１分子のＤ−アミノ酸を酸化するために酸素１分子が必要であり、同時に１分子の過酸化水素が副生される。これに対し、Ｄ−アミノ酸酸化酵素と過酸化水素分解酵素を併用した場合には、下記反応式（２）が進行する。式（２）に示されるように、過酸化水素分解酵素の作用により分解された１分子の過酸化水素から１／２分子の酸素が生成されて反応系に供給されるため、全体として反応系外から導入する酸素の量を半減することができる。このため、酸化工程における通気、攪拌をより緩和な条件で行うことが可能になり、反応時間の短縮もできるという有利な効果を得ることができる。
（１） Ｄ−アミノ酸 ＋ Ｏ２ + Ｈ２Ｏ → ケト酸 ＋ 過酸化水素 ＋ アンモニア （２） Ｄ−アミノ酸 ＋ １／２Ｏ２ → ケト酸 ＋ アンモニア
過酸化水素分解酵素（カタラーゼ等）の使用に際しては、例えばカタラーゼのもつペルオキシダーゼ活性により、中間生成物であるケト酸の分解が促進されることも予想されたが、実際にカタラーゼを併用したところ、Ｌ−アミノ酸の収率の著しい向上効果を得ることができた。このように、本発明の方法２は、カタラーゼの併用により、ペルオキシダーゼ活性に起因する弊害（ケト酸の分解促進）はほとんど問題なく、過酸化水素の分解によるケト酸の分解抑制に極めて高い効果を発揮しうるため、高収率に極めて有利である。
本発明の方法２は、上記構成を有するため、穏和な反応条件を用いて、ケト酸を高収率で得ることができる。本発明の方法２に用いる酵素、組換えベクター、形質転換体、及び培養条件等は上記方法１と同様のものを利用できる。また、本発明の方法２は、方法１に記載の反応条件を用いることができる。
本発明の方法２においては、酸化工程と還元工程とを異なる反応条件下で行うことが好ましい。前記酸化工程は、酸素を必要とするＤ−アミノ酸の酸化反応で主に構成され、還元工程は、酸素を必要としないケト酸の還元的アミノ化反応で主に構成されるため、各工程に適した条件を設定することにより、Ｌ−アミノ酸の生成反応を促進して収率を向上することができる。
本発明者らは、更に検討した結果、酸化工程におけるＤ−アミノ酸の酸化反応を促進する高通気条件では、還元工程におけるケト酸の還元反応に必要な基質や補酵素が酸化される結果、還元反応の進行を阻害してしまうことを見いだした。そして、その主な原因が、（１）本来、還元工程において還元的アミノ化反応に有効に利用されるべき還元型補酵素（ＮＡＤＨ等）が、高通気条件下では酸化されて無駄に消費されやすく、さらに（２）還元型補酵素の酸化生成物（ＮＡＤ等）が、反応系内に存在する補酵素再生酵素の活性により再生（ＮＡＤＨ等を生成）する反応が進行する結果、補酵素再生酵素の基質（例えばギ酸脱水素酵素の基質であるギ酸など）が無駄に消費されやすい点にあるという知見を得た。このことは、還元工程におけるケト酸の還元的アミノ化反応には、むしろ酸素がない方が好ましい反応であることを意味している。本発明においては、ワンポット（同一系内）で行われる還元工程と酸化工程とを異なる反応条件下で行うことにより、α−ケト酸の還元的アミノ化反応を促進して、最終目的物であるＬ−アミノ酸の収率をさらに向上するという効果を得ることができる。酸化工程と還元工程に対して異なって設定される反応条件としては、例えば、酸素の通気条件、撹拌条件、ｐＨ、触媒（酵素を含む）や形質転換体等の追加等が挙げられる。
本発明の方法２の好ましい態様としては、酸化工程を酸素含有気体の通気条件下で行い、還元工程を酸素含有気体を通気しないか又は酸素含有気体を酸化工程時より低い通気量で通気する条件下で行う方法が挙げられる。この方法によれば、還元工程において、還元型補酵素が無駄に酸化されたり、酸化された補酵素を補酵素再生酵素の作用で再還元することにより、該酵素の基質が無駄に消費されることにより、還元的アミノ化反応の進行が阻害されるなどの問題を回避しうるため、特にケト酸からＬ−アミノ酸の生成効率をより向上することができる。
前記酸素含有気体とは、少なくとも酸素を含む気体であればよく、例えば、酸素、及び空気等の酸素と他の気体との混合気体が含まれる。他の気体には、二酸化炭素、窒素等の不活性ガス等が含まれる。酸素含有気体として空気等が好ましく用いられる。酸素含有気体における酸素の含有量は、例えば０．１容量％以上（０．１〜１００容量％）、好ましくは１容量％以上、より好ましくは５容量％以上である。
具体的な酸素含有気体の通気条件としては、例えば、酸化工程における酸素含有気体の通気量が、反応液に対して毎分１容量％以上であり、還元工程における酸素含有気体の通気量が、反応液に対して毎分１０容量％未満、好ましくは、酸化工程における酸素含有気体の通気量が、反応液に対して毎分２容量％以上であり、還元工程における酸素含有気体の通気量が、反応液に対して毎分２容量％未満、より好ましくは、酸化工程における酸素含有気体の通気量が、反応液に対して毎分５容量％以上であり、還元工程における酸素含有気体の通気量が、反応液に対して毎分５容量％未満であり、特に酸化工程における酸素含有気体の通気量が、反応液に対して毎分１容量％以上であり、還元工程において酸素含有気体を実質的に通気しない条件が挙げられる。このような通気条件によれば、Ｌ−アミノ酸の収率をより一層向上する効果を得ることができる。
本発明の方法２の好ましい態様としては、上記方法の他に、酸化工程における反応液と還元工程における反応液を異なるｐＨに調整する方法、例えば酸化工程における反応液のｐＨより、還元工程における反応液のｐＨを低い値に調整する方法が挙げられる。具体的なｐＨの条件としては、例えば酸化工程における反応液のｐＨを７．０〜９．５に調整し、還元工程における反応液のｐＨを６．０〜８．５であって酸化工程におけるｐＨより低い値に調整する条件、好ましくは酸化工程における反応液のｐＨを７．５〜９．０に調整し、還元工程における反応液のｐＨを６．５〜８．０であって酸化工程におけるｐＨより低い値に調整する条件が挙げられる。
酸化工程及び還元工程のｐＨ調整には、主反応の進行を阻害しない限り特に限定されず、公知の酸又は塩基を、種類に応じて適当量用いられる。本発明の方法１及び方法２において、Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する反応のｐＨ調整をギ酸又はその塩（例えばギ酸アンモニウム等）を用いた場合には、上述したように酸化工程で無駄に消費されるギ酸を効率よく補充できる点で好ましい。
本発明の方法は、原料アミノ酸鏡像異性体混合物に対して０．２当量以上のギ酸イオン及び／又はアンモニウムイオンを含む反応液を用いることが好ましい。前記ギ酸イオンとしては、反応系内でギ酸イオンを生成可能な化合物を添加することができ、このような化合物として、例えばギ酸；ギ酸アンモニウム、ギ酸ナトリウム等のギ酸塩等を利用できる。前記アンモニウムイオンとしては、反応系内でアンモニウムイオンを生成可能な化合物を添加することができ、このような化合物として、例えばアンモニア；塩化アンモニウム、ギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩等を用いることができる。
上記方法によれば、Ｄ−アミノ酸からケト酸を生成する反応において、ギ酸イオンがｐＨ調整剤として働き、ケト酸を収率よく得ることができる。特に、補酵素再生酵素としてギ酸脱水素酵素を用いたケト酸をＬ−アミノ酸に変換する反応を含む場合には、ギ酸イオンがギ酸脱水素酵素の基質の供給源となって補酵素を効率よく再生するため、ケト酸の還元的アミノ化反応が促進されてＬ−アミノ酸を高収率で得ることができる。このため、反応終了後の反応液中におけるケト酸の残存量をより低減することができる。さらに、上記方法は、Ｄ−アミノ酸酸化酵素を用いる反応を含む場合により高い効果が得られる。
また、上記方法によれば、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する反応において、アンモニアイオンがｐＨ調整剤として働くと同時に、アンモニウムイオンがアミノ基供給源となり、ケト酸の還元的アミノ化反応を促進して、Ｌ−アミノ酸を効率よく生成することができる。さらに、上記方法は、Ｌ−アミノ酸脱水素酵素を用いる場合により高い効果を得ることができる。
本発明者らは、Ｄ−アミノ酸をケト酸へ変換する反応（特に酸化反応）には本来影響しないと思われるギ酸アンモニウムを、原料アミノ酸鏡像異性体混合物（Ｄ，Ｌ−アミノ酸）に対して０．２当量以上添加することによりケト酸の生成が促進されることを見出した。すなわち、本発明の方法は、原料アミノ酸鏡像異性体混合物に対して０．２当量以上のギ酸イオンと０．２当量以上のアンモニウムイオンとを共に含む反応液によれば、上述の効果をより向上することができる。特にギ酸酵素脱水素酵素を用いてケト酸をＬ−アミノ酸に変換する反応を含む方法においては、ギ酸イオンとアンモニウムイオンとが、共にｐＨ調整剤として作用するのに加えて、前者がギ酸酵素脱水素酵素の基質となって補酵素を効率よく再生し、後者がさらにアンモニウムイオンがアミノ基を供給源となることにより、ケト酸からＬ−アミノ酸を変換する反応の効率を著しく向上することができる。
反応収率を向上させる目的で、本発明の方法２において、酸化工程から還元工程へ移行前又は移行後に、上記本発明の形質転換体又はその処理物を反応液に付加的に添加することが好ましい。この方法によれば、酸化工程で消費された酵素を補い、還元工程における還元的アミノ化反応をスムーズに行われるため、中間体であるケト酸が反応終了後に残存するのを防いで、Ｌ−アミノ酸を高い収率で得ることができる。
本発明の方法２によれば、過酸化水素分解酵素を共発現させたＤ−アミノ酸酸化酵素を用いたケト酸に変換する酵素的反応と、生成したケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素的反応を、ワンポット（同一系内）で進行させるため、Ｄ−アミノ酸の酸化工程を穏和な条件で行うことができ、しかも生成後のケト酸の分解を防いでケト酸を高い濃度で蓄積し、続く還元工程においてＬ−アミノ酸を高い収率で効率よく得ることができる。特に、還元工程を酸化工程と異なる条件で進行させるにより、ケト酸からＬ−アミノ酸の変換反応が促進されて、反応終了後の反応液中に中間生成物であるケト酸が残存しにくく、Ｌ−アミノ酸の収率をより向上することができる。このため、ラセミ体などのＤ体とＬ体が混合した安価なアミノ酸混合物を原料とした場合にも、理論収率１００％でＬ−アミノ酸を製造することができる。
以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。なお、「ＬＢ培地」としては、１％ バクトトリプトン、０．５％ バクト酵母エキス、１％ 塩化ナトリウム、ｐＨ７．２の構成の培地を用いた。また、「アンピシリンを含むＬＢ培地」には、上記構成のＬＢ培地にアンピシリンを５０μｇ／ｍＬ濃度で添加した培地が使用されている。表１〜表５中、「Nva」とは「ノルバリンの基質濃度（重量％）」を示し、「Nva残存率[%]」とは、「反応液中のノルバリンのモル濃度／反応液調製時のノルバリンのモル濃度×１００」を示し、「Nva生成率[%]」とは、「反応液中のノルバリンのモル濃度／反応液調製時の２−オキソペンタン酸のモル濃度×１００」を示している。
酵素活性の測定
製造例又は実施例で調製したプラスミドで大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、得られた形質転換株をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含む液体ＬＢ培地中、３０℃で終夜培養し、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して遺伝子の発現を誘導し、更に３０℃で４時間培養を行った。得られた菌体を集菌後、０．０２％ ２−メルカプトエタノールを含む５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して、密閉式超音波破砕装置ＵＣＤ−２００ＴＭ（コスモバイオ製）で破砕し、遠心分離することにより上清（無細胞抽出液）を回収した。
得られた無細胞抽出液を用いて、それぞれ下記の方法で酵素活性を測定した。
（Ｄ−アラニン酸化酵素活性の測定）
無細胞抽出液、１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ Ｄ−アラニン、０．５ｍＭ ４−アミノアンチピリン、２ｍＭ フェノール、５Ｕ／ｍＬ過酸化酵素からなる反応液を３０℃に保持して反応を進行させることにより、Ｄ−アラニン酸化活性を測定した。１Ｕは、１分間に０．５μｍｏｌのキノンイミン生成を触媒する酵素量とした。
（Ｄ−アミノ酸脱水素酵素活性の測定）
無細胞抽出液、１００ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ Ｄ−アラニン、０．１ｍＭ ２，６−ジクロロインドフェノールナトリウム塩（ＤＣＩＰ）からなる反応液を３０℃に保持して反応を進行させることにより、Ｄ−アラニン酸化活性を測定した。１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰの減少を触媒する酵素量とした。
（Ｌ−アミノ酸脱水素酵素活性の測定）
無細胞抽出液、２００ｍＭ グリシン−塩化カリウム−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ１０．５）、１０ｍＭ Ｌ−アミノ酸、２．５ｍＭ ＮＡＤ＋からなる反応液を３０℃に保持して反応を進行させることにより、Ｌ−アミノ酸脱水素酵素活性を測定した。１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨ生成を触媒する酵素量とした。なお、Ｌ−アミノ酸として、Ｌ−アラニン脱水素酵素活性の測定にはＬ−アラニンを、Ｌ−ロイシン脱水素酵素活性の測定にはＬ−ロイシンを、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素活性の測定にはＬ−フェニルアラニンを、それぞれ用いた。
（ギ酸脱水素酵素活性の測定）
無細胞抽出液、１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ ギ酸ナトリウム、２．５ｍＭ ＮＡＤ＋からなる反応液を３０℃に保持して反応を進行させることにより、ギ酸酸化活性を測定した。１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨ生成を触媒する酵素量とした。
（Ｌ−アミノ酸アミノ基転移酵素活性の測定）
無細胞抽出液、１００ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ 塩化アンモニウム、１０ｍＭ α−ケトイソカプロン酸ナトリウム、４０ｍＭ Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、０．０５ｍＭ ピリドキサール−５’−リン酸、０．２ｍＭ ＮＡＤＰＨ、５Ｕ／ｍＬプロテウス・スピーシーズ（Proteus species）由来グルタミン酸脱水素酵素（東洋紡製）からなる反応液を３０℃に保持して反応を進行させることにより、Ｌ−アミノ酸アミノ基転移酵素活性を測定した。１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨの減少を触媒する酵素量とした。
（カタラーゼ活性の測定）
無細胞抽出液、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、０．０３５％過酸化水素からなる反応液を３０℃に保持して反応を進行させることにより、カタラーゼ活性を測定した。１Ｕは、１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を分解する酵素量とした。
製造例１
Ｄ−アミノ酸酸化酵素遺伝子含有プラスミドpSUCBDO1の構築
pSE420D（特開２０００−１８９１７０号公報）をNde Iで消化し、Klenow fragmentにより末端平滑化処理を行ない、セルフライゲーションすることによりNde I 制限酵素サイトがつぶれたベクターpSE420-Nを構築した。pSE420-Nの260-263位 CTAGを部位特異的変異によりAGCTに置換し、同部位にSac Iサイトが組み込まれたpSE420Sを構築した。pSE420SをCla I, Nco Iで2重消化し、同部位に合成ＤＮＡ（配列番号：１、配列番号：２）をアニール後、ライゲーションすることによりプラスミドpSE420U（図１）を構築した。
配列番号１：CGATTAACTTTATTATTAAAAATTAAAGAGGTATATACATATGAAATATTTAATTAAGGAGGAATAATC
配列番号２：CATGGATTATTCCTCCTTAATTAAATATTTCATATGTATATACCTCTTTAATTTTTAATAATAAAGTTAAT
キャンディダ・ボイディニ DSM 70026 (Candida boidinii DSM 70026) 株をYEPD培地（２％ バクトペプトン、１％ バクト酵母エキス、２％ ガラクトース、ｐＨ６．０）で培養し、菌体を調製した。Meth. Cell Biol., 29, 39 (1975)に記載の方法に従い、菌体から染色体ＤＮＡを分離、精製した。
Yeast, 16, 1217 (2000)に記載のキャンディダ・ボイディニ TK 62（Candida boidinii TK 62）株由来のＤ−アミノ酸酸化酵素遺伝子の塩基配列（Accession No. AB042032）を元にクローニング用のセンスプライマーCbDAO-A1（配列番号：３）、アンチセンスプライマーCbDAO-T1（配列番号：４）を合成した。
配列番号３：CACCATATGGGTGATCAAATTGTTGTTCTTGGTTC
配列番号４：CGACTTAAGTCTAGATTAAAGTTTAGCTTTAACTTTTTGGTTATCAACTAAAAG
前記キャンディダ・ボイディニ DSM 70026（Candida boidinii TK 62）株から精製した染色体ＤＮＡ５０ｎｇ、３．７５Ｕ PfuUltra DNAポリメラーゼ、PfuUltra用緩衝液、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、及びセンスプライマーCbDAO-A1とアンチセンスプライマーCbDAO-T1各２０ｐｍｏｌからなる５０μｌ反応液について、変性（９５℃、３０秒）、アニール（５２℃、３０秒）、伸長（７２℃、７０秒）を３０サイクル、GeneAmp PCR System 2400（パーキンエルマー製）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異的な約１．１ｋｂｐのバンドが検出された。このバンドを切り出し、GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（ファルマシア製）で精製してＤＮＡ断片を回収した。
得られたＤＮＡ断片を制限酵素Nde I、Afl IIで二重消化し、フェノール−クロロホルム処理後、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンド部分を切り出し、Sephaglas Band Prep Kit（ファルマシア製）により精製して、目的のＤＮＡ断片を回収した。プラスミドpSE420Uを制限酵素Nde I、Afl IIで二重消化し、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ製）を用いて目的のＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドにより大腸菌JM109株を形質転換した。形質転換株をアンピシリンを含むＬＢ培地プレート上で生育させ、センスプライマーCbDAO-A1とアンチセンスプライマーCbDAO-T1を用いてコロニーダイレクトＰＣＲを行い、挿入断片のサイズを確認した。１．１ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されていると考えられるコロニーをアンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、FlexiPrep Kit（ファルマシア製）を用いて精製することによりプラスミドpSUCBDO1（図２）を得た。
精製したプラスミドpSUCBDO1について、BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit（パーキンエルマー製）、及びABI PRISMTM 310（パーキンエルマー製）を用いてプライマーウォーキング法により挿入ＤＮＡの塩基配列を解析した。プラスミドに挿入されたキャンディダ・ボイディニ DSM 70026 (Candida boidinii DSM 70026) 株由来のＤ−アミノ酸酸化酵素の塩基配列を、Yeast, 16, 1217 (2000)に記載のキャンディダ・ボイディニ TK 62（Candida boidinii TK 62）株由来のＤ−アミノ酸酸化酵素遺伝子の塩基配列（Accession No. AB042032）と比較すると、ＯＲＦの開始位置を1位として、77G→T（Cys27→Phe）、83C→A（Ala28→Asp）、198A→C、243C→A（His81→Gln）、501A→G、525A→Gという3つのアミノ酸置換を含む６つの塩基置換が認められた。こうして、プラスミドpSUCBDO1に、キャンディダ・ボイディニ DSM 70026 (Candida boidinii DSM 70026)株由来のＤ−アミノ酸酸化酵素遺伝子が組み込まれていることを確認した。
上記酵素活性の測定方法に従い、プラスミドpSUCBDO1によるＤ−アラニン酸化活性を測定したところ、比活性は４．６８Ｕ／ｍｇ−タンパク質であった。
製造例２
Ｄ−アミノ酸酸化酵素遺伝子含有プラスミドpSUTVDO1の構築
製造例１に記載の方法と同様の方法を用いて、トリゴノプシス・バリアビリス CBS 4095 (Trigonopsis variabilis CBS 4095) 株を培養して菌体を調製し、菌体から染色体ＤＮＡを分離、精製した。
特表2001-506868号公報（Accession No. Z50019）に記載のトリゴノプシス・バリアビリス CBS 4095 (Trigonopsis variabilis CBS 4095) 株由来のD-アミノ酸酸化酵素遺伝子には、ORFの内部にイントロンを含んでいるため、まず2番目のエキソン部分のクローニングを行った。該遺伝子の第2エキソンの上流にあるイントロン部分の5'-及び3'-末端翻訳領域よりクローニング用のセンスプライマーTvDAO-e2A1（配列番号：５）、アンチセンスプライマーTvDAO-T2（配列番号：６）を合成した。
配列番号５：GACGCCGGCGTTGCAGGTTTAACTAC
配列番号６：CTCAAGCTTCTAGATTAAAGATTTGGACGAGTAAGAGCTC
前記トリゴノプシス・バリアビリス CBS 4095 (Trigonopsis variabilis CBS 4095) 株から精製した染色体ＤＮＡを鋳型とし、プライマーTvDAO-e2A1とTvDAO-T2を用いて製造例１と同様の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異性の高い約１．１ｋｂｐのバンドが検出された。このバンドを切り出し、GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（ファルマシア製）で精製して、第２エキソンを含むＤＮＡ断片を回収した。
得られたＤＮＡ断片を制限酵素Hind IIIで消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンド部分を切り出し、Sephaglas Band Prep Kit（ファルマシア製）により精製した。プラスミドベクターpUC119を制限酵素Hind III、Hinc IIで二重消化し、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ製）を用いて第２エキソンを含むＤＮＡ断片を連結してプラスミドを形成し、大腸菌JM109株を形質転換した。
形質転換株をアンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、FlexiPrep Kit（ファルマシア製）を用いてプラスミドを精製することによりプラスミドpUCTVDOT（図３）を得た。
精製したプラスミドpUCTVDOTについて、プライマーウォーキング法を用いて製造例１に記載の条件で挿入ＤＮＡの塩基配列を解析し、特表2001-506868号公報（Accession No. Z50019）に記載のトリゴノプシス・バリアビリス CBS 4095株由来のD-アミノ酸酸化酵素遺伝子の塩基配列と比較したところ、プライマーORFの開始位置を１位として、1002G→Aという１つの塩基置換が認められた。こうして、プラスミドpUCTVDOTに、トリゴノプシス・バリアビリス CBS 4095(Trigonopsis variabilis CBS 4095) 株由来のＤ−アミノ酸酸化酵素遺伝子の第２エキソン部分が組み込まれていることを確認した。
トリゴノプシス・バリアビリス CBS 4095(Trigonopsis variabilis CBS 4095)株染色体DNA中に含まれるＤ−アミノ酸酸化酵素遺伝子中の第１エキソン部分を、TvDAO-e5（配列番号：７）とTvDAO-e3（配列番号：８）として合成した。
配列番号７：CAGCCATGGCTAAAATCGTTGTTATTGGTG
配列番号８：CCGGCACCAATAACAACGATTTTAGCCATGGCTG
TvDAO-e3とTvDAO-e5を各1.25 μmol、0.1 mM EDTA、10 mM トリス−塩酸緩衝液（pH 8.0）からなる50 μL反応液を94 ℃で1分変性させ、次いで61 ℃で1分アニールさせた後、制限酵素Nco Iで消化し、フェノール−クロロホルム処理後、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンド部分を切り出し、Sephaglas Band Prep Kit（ファルマシア製）により精製して、第２エキソンを含むＤＮＡ断片を得た。pUCTVDOTを制限酵素NgoM IV、Hind IIIで二重消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンド部分を切り出し、Sephaglas Band Prep Kit（ファルマシア製）により精製して、第１エキソンを含むＤＮＡ断片を得た。
製造例１に記載のpSE420Uを制限酵素Nco I、Hind IIIで二重消化し、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ製）を用いて第１エキソン及び第２エキソンを含む各ＤＮＡ断片を連結して、トリゴノプシス・バリアビリス CBS 4095(Trigonopsis variabilis CBS 4095)株由来のＤ−アミノ酸酸化酵素遺伝子が組み込まれたプラスミドpSUTVDO1（図４）を構築した。
上記酵素活性の測定方法に従い、プラスミドpSUTVDO1によるＤ−アラニン酸化活性を測定したところ、比活性は５．２６Ｕ／ｍｇ−タンパク質であった。
製造例３
Ｄ−アミノ酸脱水素酵素遺伝子含有プラスミドpETECDD1の構築
エシェリヒア・コリ JM 109 (Escherichia coli JM 109) 株をＬＢ培地で培養し、菌体を調製した。Nucleic Acids Res., 8, 4321 (1980)に記載の方法に従って、菌体から染色体DNAを分離、精製した。
J. Bacteriol., 176, 1500 (1994)に記載のエシェリヒア・コリ K-12 （Escherichia coli K-12）株由来のD-アミノ酸脱水素酵素遺伝子（Accession No. L02948）を元にクローニング用のセンスプライマーEcDadA-A1（配列番号：９）、アンチセンスプライマーEcDadA-T1（配列番号：１０）を合成した。
配列番号９：TGGCCATGGCTCGTGTTGTAATTCTGGGAAGTGGTGTG
配列番号１０：CAGTCTAGATTAAGAATGTGCACCATGTAAATGGCCC
前記エシェリヒア・コリK-12（Escherichia coli K-12）株から精製した染色体ＤＮＡを鋳型とし、プライマーEcDadA-A1とEcDadA-T1を用いて製造例１と同様の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異性の高い約１．３ｋｂｐのバンドが検出された。このバンドを切り出し、GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（ファルマシア製）で精製して目的のＤＮＡ断片を回収した。
プラスミドベクターpUC118を制限酵素Hinc IIで消化し、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ製）を用いて目的のＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドで大腸菌JM109株を形質転換し、製造例１と同様の方法で精製することによりプラスミドpUCECDD1（図５）を得た。
精製したプラスミドpUCECDD1について、プライマーウォーキング法を用いて製造例１に記載の条件で挿入ＤＮＡの塩基配列を解析した結果、J. Bacteriol., 176, 1500 (1994)に記載のエシェリヒア・コリ K-12 （Escherichia coli K-12）株由来のD-アミノ酸脱水素酵素遺伝子の塩基配列（Accession No. L02948）と完全に一致していた。こうして、プラスミドpUCECDD1に、エシェリヒア・コリ K-12 （Escherichia coli K-12）株由来のＤ−アミノ酸脱水素酵素遺伝子が組み込まれていることを確認した。
得られたpUCECDD1を制限酵素Nco I、EcoR Iで二重消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンド部分を切り出し、Sephaglas Band Prep Kit（ファルマシア製）により精製して、目的とするＤＮＡ断片を得た。
プラスミドベクターpET-21dを制限酵素Nco I、EcoR Iで二重消化し、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ製）を用いて目的のＤＮＡ断片を連結し、得られたプラスミドでエシェリヒア・コリ（Escherichia coli)BL21(DB3)pLysS株を形質転換した。製造例１と同様の操作を用いて形質転換株よりプラスミドを精製し、エシェリヒア・コリ K-12 （Escherichia coli K-12）株由来のＤ−アミノ酸脱水素酵素遺伝子が組み込まれたプラスミドpETECDD1（図６）を得た。
精製したプラスミドpETECDD1で形質転換されたエシェリヒア・コリBL21(DB3)pLysS株をアンピシリンとクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地中、２８℃で終夜培養し、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して遺伝子の発現を誘導し、更に３０℃で４時間培養を行った。得られた菌体を集菌後、０．０２％ ２−メルカプトエタノールを含む５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して、密閉式超音波破砕装置ＵＣＤ−２００ＴＭ（コスモバイオ製）で破砕し、遠心分離することにより上清（無細胞抽出液）を回収した。得られた無細胞抽出液を用いて、上記酵素活性の測定方法に従いＤ−アラニン酸化活性を測定したところ、その比活性は４９．２ｍＵ／ｍｇ−タンパク質であった。
製造例４
ギ酸脱水素酵素変異体遺伝子含有プラスミドpSU-MF26の構築
マイコバクテリウム・バッカエ（Mycobacterium vaccae）由来のギ酸脱水素酵素遺伝子の変異体遺伝子を含む発現プラスミドpSE-MF26（特開２００３−１９９５９５号公報）を制限酵素Nco IとXba Iで二重消化し、フェノール−クロロホルム処理後、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンド部分を切り出し、Sephaglas Band Prep Kit（ファルマシア製）により精製した。得られたＤＮＡ断片と、同じ制限酵素Nco IとXba Iで消化したプラスミドpSE420U（製造例１）とT4リガーゼ（タカラバイオ製）を用いて連結してプラスミドを得た。得られたプラスミドで大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリンを含むＬＢ培地で培養して選別した形質転換株よりプラスミドを精製することにより、マイコバクテリウム・バッカエ（Mycobacterium vaccae）由来のギ酸脱水素酵素の変異体遺伝子を組み込んだpSU-MF26（図７）を得た。
製造例５
２遺伝子含有プラスミドpSF-GSA2の構築（Ｌ−アラニン脱水素酵素とギ酸脱水素酵素）
Biochemistry, 29, 1009 (1990)に記載のジオバチルス・ステアロサーモフィラス IFO 12550 (Geobacillus stearothermophilus IFO 12550) 株由来のＬ−アラニン脱水素酵素遺伝子の塩基配列（Accession No. M33299）よりクローニング用のセンスプライマーBstAlaDH-A1（配列番号：１１）とアンチセンスプライマーBstAlaDH-T1（配列番号：１２）を合成した。
配列番号１１：GAGGAATTCTGTCATGAAAATTGGTATTCCAAAAGAAATCAAAAACAATG
配列番号１２：CTGAAGCTTCTAGATTATCCATGTAACAACGAATGAACATCTG
Biochemistry, 29, 1009 (1990)に記載のジオバチルス・ステアロサーモフィラス IFO 12250株由来のロイシン脱水素酵素発現プラスミドpICD301を鋳型とし、センスプライマーBstAlaDH-A1とアンチセンスプライマーBstAlaDH-T1を用いて製造例１に記載の方法に従ってＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異的な約１．１ｋｂｐのバンドが検出された。このバンドを切り出し、GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（ファルマシア製）で精製した後、制限酵素EcoR I、Hind IIIで二重消化し、フェノール−クロロホルム処理後、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンド部分を切り出し、Sephaglas Band Prep Kit（ファルマシア製）により精製して、目的のＤＮＡ断片を得た。
製造例４で得たpSU-MF26を制限酵素EcoR I、Hind IIIで二重消化し、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ製）を用いて目的のＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドで大腸菌JM109株を形質転換し、製造例１と同様の方法で精製することによりプラスミドpSF-GSA2（図８）を得た。
精製したプラスミドpSF-GSA2について、プライマーウォーキング法を用いて製造例１に記載の条件で挿入ＤＮＡの塩基配列を解析し、Biochemistry, 29, 1009 (1990)に記載のジオバチルス・ステアロサーモフィラス IFO 12550株の塩基配列と比較したところ、20塩基の置換、3塩基の欠失、3塩基の挿入が認められた。これに伴い、16アミノ酸の置換、1アミノ酸の欠失、1アミノ酸の挿入が起きていた。得られた塩基配列を配列番号：１３に示す。こうして、プラスミドpSF-GSA2に、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス IFO 12550 (Geobacillus stearothermophilus IFO 12550) 株由来のＬ−アラニン脱水素酵素遺伝子とマイコバクテリウム・バッカエ（Mycobacterium vaccae）由来ギ酸脱水素酵素の変異体遺伝子とが組み込まれていることを確認した。
上記酵素活性の測定方法に従い、プラスミドpSF-GSA2によるＬ−アラニン酸化活性とギ酸酸化活性を測定したところ、その比活性はそれぞれ２．４０Ｕ／ｍｇ−タンパク質、０．７４Ｕ／ｍｇ−タンパク質であった。
製造例６
２遺伝子含有プラスミドpSF-BTA1の構築（Ｌ−アラニン脱水素酵素とギ酸脱水素酵素）
Biochimie, 71, 559 (1989)に記載のバチルス・サーモカテニュラタス DSM 730 (Bacillus thermocatenulatus DSM 730) 株由来のアラニン脱水素酵素遺伝子の塩基配列よりクローニング用のセンスプライマーBthAlaDH-A1（配列番号：１４）とアンチセンスプライマーBthAlaDH-T1（配列番号：１５）を合成した。
配列番号１４：GAGGAATTCTATTCATGATTATTGGTGTGCCAAAGGAA
配列番号１５：CAGAAGCTTCTAGATTAATTAGCAGCCAACGTTTTCC
プラスミドpKUAD103を鋳型とし、センスプライマーBthAlaDH-A1とアンチセンスプライマーBthAlaDH-T1を用いて製造例１記載の方法に従ってＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異性の高い約1.2 kbpのバンドが検出された。このバンドを切り出し、GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（ファルマシア製）で精製した後、制限酵素EcoR I、Hind IIIで二重消化し、フェノール−クロロホルム処理後、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンド部分を切り出し、Sephaglas Band Prep Kit（ファルマシア製）により精製して、目的のＤＮＡ断片を得た。
製造例４で得たpSE-MF26を制限酵素EcoR I、Hind IIIで二重消化し、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ製）を用いて目的のＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドで大腸菌JM109株を形質転換し、製造例１と同様の方法で精製することによりプラスミドpSF-BTA1（図９）を得た。
精製したプラスミドpSF-BTA1について、プライマーウォーキング法を用いて挿入DNAの塩基配列を解析した結果、Biochimie, 71, 559 (1989)に記載のバチルス・サーモカテニュラタス DSM 730 (Bacillus thermocatenulatus DSM 730) 株由来のＬ−アラニン脱水素酵素遺伝子の塩基配列と完全に一致した。こうして、プラスミドpSF-BTA1に、バチルス・サーモカテニュラタス DSM 730 (Bacillus thermocatenulatus DSM 730) 株由来のＬ−アラニン脱水素酵素遺伝子とマイコバクテリウム・バッカエ（Mycobacterium vaccae）由来ギ酸脱水素酵素の変異体遺伝子とが組み込まれていることを確認した。
２５℃で終夜培養した点以外は、上記酵素活性の測定方法に従ってプラスミドpSF-BTA1を用いて無細胞抽出液を調製し、Ｌ−アラニン酸化活性とギ酸酸化活性を測定したところ、その比活性はそれぞれ３．３８Ｕ／ｍｇ−タンパク質、１．２４Ｕ／ｍｇ−タンパク質であった。
製造例７
２遺伝子含有プラスミドpSFBPAD1の構築（Ｌ−アラニン脱水素酵素とギ酸脱水素酵素）
バチルス・スフェリカス IFO 3525 (Bacillus sphaericus IFO 3525) 株をＬＢ培地で培養し、菌体を調製した。Genome tip 100（Qiagen製）を用いて菌体から染色体DNAを分離、精製した。
Biochemistry, 29, 1009 (1990)に記載のバチルス・スフェリカス IFO 3525 (Bacillus sphaericus IFO 3525) 株由来アラニン脱水素酵素遺伝子の塩基配列（Accession No. M33298）を元にセンスプライマーBspAlaDH-A1（配列番号：１６）とアンチセンスプライマーBspAlaDH-T1（配列番号：１７）を合成した。
配列番号１６：GTGGAATTCTATCATGAAAATTGGTATTCCAAAGGAAATTAAAAACAACG
配列番号１７：CTGAAGCTTCTAGATTATTGGATTAATTCATCCACATTCACATATGG
前記バチルス・スフェリカス IFO 3525 (Bacillus sphaericus IFO 3525) 株から精製した染色体ＤＮＡを鋳型とし、プライマーBspAlaDH-A1とBspAlaDH-T1を用いて製造例１と同様の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異性の高い約１．１ｋｂｐのバンドが検出された。このバンドを切り出し、GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（ファルマシア製）で精製した後、制限酵素EcoR I、Hind IIIで二重消化し、フェノール−クロロホルム処理後、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンド部分を切り出し、Sephaglas Band Prep Kit（ファルマシア製）により精製して、目的のＤＮＡ断片を得た。
製造例４で得たpSU-MF26を制限酵素EcoR I、Hind IIIで二重消化し、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ製）を用いて連結した。得られたプラスミドで大腸菌JM109株を形質転換し、製造例１と同様の方法で精製することによりプラスミドpSFBPAD1（図１０）を得た。
精製したプラスミドpSFBPAD1について、プライマーウォーキング法を用いて製造例１に記載の条件で挿入ＤＮＡの塩基配列を解析し、Biochemistry, 29, 1009 (1990)に記載のバチルス・スフェリカス IFO 3525 （Bacillus sphaericus IFO 3525）株の塩基配列（Accession No. M33298）と比較すると、ORFの開始位置を1位として、99GT→TG、119G→C、150G→T、537G→C、888T→Cという6塩基の置換、96G、103G、104C、169G、297C、505Cという6塩基の欠失、186CA→CAA、302CT→CGT、499CA→CAAという3塩基の挿入が認められた。その塩基配列を配列番号：１８に示す。こうして、プラスミドpSFBPAD1に、バチルス・スフェリカス IFO 3525 (Bacillus sphaericus IFO 3525) 株由来のＬ−アラニン脱水素酵素遺伝子とマイコバクテリウム・バッカエ（Mycobacterium vaccae）由来ギ酸脱水素酵素の変異体遺伝子とが組み込まれていることを確認した。
２５℃で終夜培養した点以外は、上記酵素活性の測定方法に従い、プラスミドpSFBPAD1を用いて無細胞抽出液を調製し、Ｌ−アラニン酸化活性とギ酸酸化活性を測定したところ、その比活性はそれぞれ８．４４Ｕ／ｍｇ−タンパク質、０．８３Ｕ／ｍｇ−タンパク質であった。
製造例８
２遺伝子含有プラスミドpSF-SAD1の構築（Ｌ−アラニン脱水素酵素とギ酸脱水素酵素）
Appl. Environ. Mictobiol., 65, 4014 (1999)に記載のシェワネラ・スピーシーズ Ac10 （Shewanella sp. Ac10）株由来のＬ−アラニン脱水素酵素遺伝子を有するプラスミドpSheAlaDH2の塩基配列（Accession No. AF070715）を元に、センスプライマーSheAlaDH-A2（配列番号：１９）とアンチセンスプライマーSheAlaDH-T2（配列番号：２０）を合成した。
配列番号１９：AGAGAATTCTATCATGATTATTGGTGTTCCAACAGAAATC
配列番号２０：GACAAGCTTCTAGATTAAGCAAGTAGGCTTTTTGGTTCAG
プラスミドpSheAlaDH2を鋳型とし、センスプライマーSheAlaDH-A2とアンチセンスプライマーSheAlaDH-T2を用いて製造例１記載の方法に従ってＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異性の高い約１．１ｋｂｐのバンドが検出された。このバンドを切り出し、GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（ファルマシア製）で精製した後、制限酵素EcoR I、Hind IIIで二重消化し、フェノール−クロロホルム処理後、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンド部分を切り出し、Sephaglas Band Prep Kit（ファルマシア製）により精製して、目的のＤＮＡ断片を得た。
製造例４で得たpSE-MF26を制限酵素EcoR I、Hind IIIで二重消化し、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ製）を用いて目的のＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドで大腸菌JM109株を形質転換し、製造例１と同様の方法で精製することによりプラスミドpSF-SAD1（図１１）を得た。
精製したプラスミドpSF-SAD1について、プライマーウォーキング法を用いて挿入DNAの塩基配列を解析した結果、Appl. Environ. Mictobiol., 65, 4014 (1999)に記載の塩基配列と完全に一致した。こうして、プラスミドpSF-SAD1に、シェワネラ・スピーシーズ Ac10 （Shewanella sp. Ac10）株由来のＬ−アラニン脱水素酵素遺伝子とマイコバクテリウム・バッカエ（Mycobacterium vaccae）由来ギ酸脱水素酵素の変異体遺伝子とが組み込まれていることを確認した。
２５℃で終夜培養した点以外は、上記酵素活性の測定方法に従い、プラスミドpSF-SAD1を用いて無細胞抽出液を調製し、Ｌ−アラニン酸化活性とギ酸酸化活性を測定したところ、その比活性はそれぞれ３．５０Ｕ／ｍｇ−タンパク質、１．０２Ｕ／ｍｇ−タンパク質であった。
製造例９
２遺伝子含有プラスミドpFGSLED1の構築（Ｌ−ロイシン脱水素酵素とギ酸脱水素酵素） ジオバチルス・ステアロサーモフィラスIFO 12550 (Geobacillus stearohtermophilus IFO 12550)株をＬＢ培地で培養し、菌体を調製した。Genome tip 100（Qiagen製）を用いて菌体からの染色体ＤＮＡを分離、精製した。
Biochemistry, 27, 9056 (1988)に記載のジオバチルス・ステアロサーモフィラス IFO 12550 (Geobacillus stearohtermophilus IFO 12550) 株由来のＬ−ロイシン脱水素酵素遺伝子の塩基配列（Accession No. M22977）を元に、センスプライマーGSTLEUDH-A2（配列番号：２１）とアンチセンスプライマーGSTLEUDH-T2（配列番号：２２）を合成した。
配列番号２１：GTCTCTAGAGGAATTCTACCATGGAATTGTTCAAATATATGGAAACTTACGATTATGAGC
配列番号２２：CTGAAGCTTCTAGATTATATTGCCGAAGCACCTGCC
前記ジオバチルス・ステアロサーモフィラス IFO 12550 (Geobacillus stearohtermophilus IFO 12550)株由来の染色体DNAを鋳型とし、センスプライマーGSTLEUDH-A2とアンチセンスプライマーGSTLEUDH-T2を用いて製造例１記載の方法に従ってＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異性の高い約１．３ｋｂｐのバンドが検出された。このバンドを切り出し、GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（ファルマシア製）で精製した後、制限酵素Xba I、Not Iで二重消化し、フェノール−クロロホルム処理後、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンド部分を切り出し、Sephaglas Band Prep Kit（ファルマシア製）により精製して、目的のＤＮＡ断片を得た。また、残りのＰＣＲ反応液の一部を制限酵素Not I、Hind IIIで二重消化し、上記と同様の方法で精製してＤＮＡ断片を調製した。
pSE420D（特開２０００−１８９１７０号公報）を制限酵素Xba IとHind IIIで二重消化し、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ製）を用いて上記の２種類のＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドで大腸菌JM109株を形質転換し、製造例１と同様の方法で精製することによりプラスミドpEGSLED2（図１２）とした。
精製したプラスミドを用い、プライマーウォーキング法を用いて製造例１に記載の条件で挿入ＤＮＡの塩基配列を解析し、Biochemistry, 27, 9056 (1988)記載の登録配列（M22977）と比較したところ、同登録配列の3'-末端に１８６ｂｐの非翻訳配列の挿入が認められた。その塩基配列を配列番号：２３に示す。こうして、プラスミドpEGSLED2に、ジオバチルス・ステアロサーモフィラスIFO 12550 (Geobacillus stearohtermophilus IFO 12550)株由来のＬ−ロイシン脱水素酵素遺伝子を組み込まれていることを確認した。
ジオバチルス・ステアロサーモフィラス IFO 12550 (Geobacillus stearohtermophilus IFO 12550)株由来のＬ−ロイシン脱水素酵素遺伝子の中間部分及び3'-末配列を元に、クローニング用のセンスプライマーGstLeuDH-SalI（配列番号：２４）とアンチセンスプライマーGstLeuDH-TAA1（配列番号：２５）を合成した。
配列番号２４：GCGGTCGACCCGAACGAC
配列番号２５：CTGAAGCTTCTAGATTAACGTGCACGACGGCGGCTTAA
前記プラスミドpLGSLED2を鋳型とし、センスプライマーGstLeuDH-SalIとアンチセンスプライマーGstLeuDH-TAA1を用いて製造例１記載の方法に従ってＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異性の高い約０．７ｋｂｐのバンドが検出された。このバンドを切り出し、GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（ファルマシア製）で精製した後、制限酵素Sal I、Hind IIIで二重消化し、フェノール−クロロホルム処理後、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンド部分を切り出し、Sephaglas Band Prep Kit（ファルマシア製）により精製して、目的のＤＮＡ断片を得た。また、前記プラスミドpLGSLED2を制限酵素Xba IとSal Iで二重消化し、前記と同様の方法で精製してＤＮＡ断片を調製した。
製造例４で得たpSU-MF26を制限酵素Xba IとHind IIIで二重消化し、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ製）を用いて上記２種のＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドで大腸菌JM109株を形質転換し、製造例１と同様の方法で精製することによりプラスミドpFGSLED1（図１３）を得た。
精製したプラスミドpFGSLED1について、プライマーウォーキング法を用いて製造例１に記載の条件で挿入ＤＮＡの塩基配列を解析したところ、プラスミドpFGSLED1に、配列番号：２３に示す塩基配列からなるジオバチルス・ステアロサーモフィラス IFO 12550 (Geobacillus stearohtermophilus IFO 12550)株由来のＬ−ロイシン脱水素酵素遺伝子とマイコバクテリウム・バッカエ（Mycobacterium vaccae）由来ギ酸脱水素酵素の変異体遺伝子とが組み込まれていることを確認した。
２４℃で終夜培養した点以外は、上記酵素活性の測定方法に従い、プラスミドpFGSLED1を用いて無細胞抽出液を調製し、Ｌ−ロイシン酸化活性とギ酸酸化活性を測定したところ、その比活性はそれぞれ４．０３Ｕ／ｍｇ−タンパク質、０．６３Ｕ／ｍｇ−タンパク質であった。
製造例１０
２遺伝子含有プラスミドpSFBPLD1の構築（Ｌ−ロイシン脱水素酵素とギ酸脱水素酵素）
DDBJ/EMBL/GenBankデータベースに記載のバチルス・スフェリカス (Bacillus sphaericus)由来のＬ−ロイシン脱水素酵素遺伝子の塩基配列（Accession No. AB103119）を元に、センスプライマーBspLeuDH-A1（配列番号：２６）とアンチセンスプライマーBspLeuDH-T1（配列番号：２７）を合成した。
配列番号２６：GTGGAATTCTACCATGGAAATCTTCAAGTATATGGAAAAGTATG
配列番号２７：CTCCTTAAGTCTAGATTAACGACCGTTCAAAATGTTTTTTTCATTTTTTAAGAACTG
製造例７で調製したバチルス・スフェリカス (Bacillus sphaericus) IFO 3525株由来の染色体DNAを鋳型とし、センスプライマーBspLeuDH-A1とアンチセンスプライマーBspLeuDH-T1を用いて製造例１記載の方法に従ってＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異性の高い約１．１ｋｂｐのバンドが検出された。このバンドを切り出し、GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（ファルマシア製）で精製した後、制限酵素EcoR I、Afl IIで二重消化し、フェノール−クロロホルム処理後、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンド部分を切り出し、Sephaglas Band Prep Kit（ファルマシア製）により精製して、目的のＤＮＡ断片を得た。
製造例４で得たpSU-MF26を制限酵素で二重消化し、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ製）を用いて目的のＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドで大腸菌JM109株を形質転換し、製造例１と同様の方法で精製することによりプラスミドpSFBPLD1（図１４）を得た。
精製したプラスミドを用い、プライマーウォーキング法を用いて製造例１に記載の条件で挿入ＤＮＡの塩基配列を解析したところ、DDBJ/EMBL/GenBankデータベースに記載のバチルス・スフェリカス (Bacillus sphaericus)由来のＬ−ロイシン脱水素酵素遺伝子の塩基配列（Accession No. AB103119）と完全に一致した。こうして、プラスミドpSFBPLD1に、バチルス・スフェリカス (Bacillus sphaericus) IFO 3525株由来のＬ−ロイシン脱水素酵素遺伝子が組み込まれていることを確認した。
２４℃で終夜培養した点以外は、上記酵素活性の測定方法に従い、プラスミドpSFBPLD1を用いて無細胞抽出液を調製し、Ｌ−ロイシン酸化活性とギ酸酸化活性を測定したところ、その比活性はそれぞれ５．７６Ｕ／ｍｇ−タンパク質、０．５４Ｕ／ｍｇ−タンパク質であった。
製造例１１
２遺伝子含有プラスミドpSF-TIP2の構築（フェニルアラニン脱水素酵素とギ酸脱水素酵素）
サーモアクチノマイセス・インターメディウス IFO 14230 (Thermoactinomyces intermedius IFO14230) 株をＭ−６４培地（１％ ペプトン、０．２５％ 酵母エキス、０．２％ 肉エキス、０．２％ グリセロール、０．２％ 塩化ナトリウム、０．２％ リン酸水素二カリウム、０．２％ リン酸二水素カリウム、０．０１％ 硫酸マグネシウム七水和物、痕跡量のビオチン（２０ｍｇ／１００ｍＬを培地１Ｌにつき２μＬ）、ｐＨ７．２）を用いて５５℃で培養し、菌体を調製した。Methods Enzymol., 152, 116 (1987)に記載の方法に従って菌体から染色体ＤＮＡを精製した。
J. Biochem., 109, 371 (1991)に記載のサーモアクチノマイセス・インターメディウス IFO 14230 (Thermoactinomyces intermedius IFO14230)株由来フェニルアラニン脱水素酵素遺伝子の塩基配列（Accession No. D00631）を元に、センスプライマーTIP-ATG1（配列番号：２８）とアンチセンスプライマーTIP-TAA1（配列番号：２９）を合成した。
配列番号２８：CAGGAATTCTATAATGCGTGATGTATTTGAAATGATGGAC
配列番号２９：CTGAAGCTTCTAGATTAACGACGTGCACTATTACGGGGATCCTCCAA
前記サーモアクチノマイセス・インターメディウス IFO 14230(Thermoactinomyces intermedius IFO14230)株由来の染色体ＤＮＡを鋳型とし、センスプライマーTIP-ATG1とアンチセンスプライマーTIP-TAA1を用いて製造例１記載の方法と同様の方法によりＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異的な約１．１ｋｂｐのバンドが検出された。このバンドを切り出し、フェノール−クロロホルム沈殿し、エタノール沈殿してＤＮＡ断片を回収した後、制限酵素EcoR I、Hind IIIで二重消化し、フェノール−クロロホルム処理後、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンド部分を切り出し、Sephaglas Band Prep Kit（ファルマシア製）により精製して、目的のＤＮＡ断片を得た。
製造例１で調製したpSE420Uを制限酵素EcoR I、Hind IIIで二重消化し、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ製）を用いて目的のＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドで大腸菌JM109株を形質転換し、製造例１と同様の方法で精製することによりプラスミドpSU-TIP2（図１５）を得た。
精製したプラスミドpSU-TIP2について、プライマーウォーキング法を用いて製造例１に記載の条件で挿入ＤＮＡの塩基配列を解析し、J. Biochem., 109, 371 (1991)に記載のサーモアクチノマイセス・インターメディウス IFO 14230 (Thermoactinomyces intermedius IFO14230)株由来のＬ−フェニルアラニン脱水素酵素遺伝子の塩基配列（Accession No. D00631）と比較したところ、ＯＲＦの開始位置を1位として、431AG→GC (Lys144→Ser)、846T→G (Cys282→Trp) という2つのアミノ酸置換を含む塩基置換が認められた。こうして、プラスミドpSU-TIP2に、サーモアクチノマイセス・インターメディウス IFO 14230 (Thermoactinomyces intermedius IFO14230)株由来のＬ−フェニルアラニン脱水素酵素遺伝子が組み込まれていることを確認した。
製造例４で得たプラスミドpSE-MF26を制限酵素Nco I、EcoR Iで二重消化し、フェノール−クロロホルム処理後、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンド部分を切り出し、Sephaglas Band Prep Kit（ファルマシア製）により精製して、目的のＤＮＡ断片を得た。プラスミドpSU-TIP2を制限酵素Nco I、EcoR Iで二重消化し、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ製）を用いて目的のＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドで大腸菌JM109株を形質転換し、製造例１と同様の方法で精製することにより、サーモアクチノマイセス・インターメディウス IFO 14230 (Thermoactinomyces intermedius IFO 14230) 株由来のＬ−フェニルアラニン脱水素酵素とマイコバクテリウム・バッカエ（Mycobacterium vaccae）由来のギ酸脱水素酵素遺伝子とが組み込まれたプラスミドpSF-TIP2（図１６）を得た。
２４℃で終夜培養した点以外は、上記酵素活性の測定方法に従い、プラスミドpSF-TIP2を用いて無細胞抽出液を調製し、Ｌ−フェニルアラニン酸化活性とギ酸酸化活性を測定したところ、その比活性はそれぞれ９．５６Ｕ／ｍｇ−タンパク質、０．７６Ｕ／ｍｇ−タンパク質であった。
製造例１２
分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素遺伝子含有プラスミドpSE-ECB1の構築
J. Biochem., 97, 993 (1985)に記載のエシェリヒア・コリK-12(Escherichia coli K-12)株由来の分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素遺伝子の塩基配列（Accession No. X02413）を元に、センスプライマーEcBCA-A1（配列番号：３０）とアンチセンスプライマーEcBCA-T1（配列番号：３１）を合成した。
配列番号３０：CTGTCATGACTACTAAGAAAGCTGATTACATTTGGTTCAATGG
配列番号３１：GTCTCTAGATTATTGATTAACTTGATCTAACCAGCCCCA
製造例３で調製したエシェリヒア・コリ(Escherichia coli) JM109株由来の染色体DNAを鋳型とし、センスプライマーEcBCA-A1とアンチセンスプライマーEcBCA-T1を用いて製造例１と同様の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異性の高いバンドが検出された。このバンドを切り出し、GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（ファルマシア製）で精製した後、制限酵素BspH I、Xba Iで二重消化し、フェノール−クロロホルム処理後、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンド部分を切り出し、Sephaglas Band Prep Kit（ファルマシア製）により精製して目的のＤＮＡ断片を得た。
pSE420D（特開２０００−１８９１７０号公報）を制限酵素Nco IとXba Iで二重消化し、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ製）を用いて目的のＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドで大腸菌JM109株を形質転換し、製造例１と同様の方法で精製することによりプラスミドpSE-ECB1（図１７）を得た。
精製したプラスミドpSFBPAD1について、プライマーウォーキング法を用いて製造例１に記載の条件で挿入ＤＮＡの塩基配列を解析したところ、J. Biochem., 97, 993 (1985)に記載のエシェリヒア・コリK-12(Escherichia coli K-12)株由来の分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素遺伝子の塩基配列（Accession No. X02413）と完全に一致した。こうして、プラスミドpSE-ECB1に、エシェリヒア・コリK-12(Escherichia coli K-12)株由来の分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素遺伝子が組み込まれていることを確認した。
２４℃で終夜培養した点以外は、上記酵素活性の測定方法に従い、プラスミドpSE-ECB1を用いて無細胞抽出液を調製し、上記酵素活性の測定方法に従いアミノ基転移活性をを測定したところ、その比活性は１．４４Ｕ／ｍｇ−タンパク質であった。
製造例１３
分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素遺伝子含有プラスミドpSE-BSB1の構築
バチルス・サブチリス DB 104（Bacillus subtilis DB 104）株をＬＢ培地で培養し、菌体を調製した。Nucleic Acids Res., 8, 4321 (1980)に記載の方法に従って菌体からの染色体DNAを分離、精製した。
J. Bacteriol., 179, 496 (1997)に記載のバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）由来の分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素の塩基配列（Z49992）を元に、プライマーBsBCA-A1（配列番号：３２）とアンチセンスプライマーBsBCA-T1（配列番号：３３）を合成した。
配列番号３２：TGATCATGACTAAACAAACAATTCGCGTTGA
配列番号３３：GCTTCTAGATTATTTACTTTCAGTCAGCGCTGCGA
前記バチルス・サブチリス DB 104（Bacillus subtilis DB 104）株由来の染色体DNA を鋳型とし、センスプライマーBsBCA-A1とアンチセンスプライマーBsBCA-T1を用いて製造例１記載の方法に従ってＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異性の高いバンドが検出された。このバンドを切り出し、GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（ファルマシア製）で精製した後、制限酵素BspH I、Xba Iで二重消化し、フェノール−クロロホルム処理後、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンド部分を切り出し、Sephaglas Band Prep Kit（ファルマシア製）により精製して、目的のＤＮＡ断片を得た。
pSE420D（特開２０００−１８９１７０号公報）を制限酵素Nco IとXba Iで二重消化し、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ製）を用いて目的のＤＮＡ断片と連結した。、大腸菌JM109株を形質転換した。得られたプラスミドで大腸菌JM109株を形質転換し、製造例１と同様の方法で精製することによりプラスミドpSE-BSB1（図１８）とした。
精製したプラスミドを用い、プライマーウォーキング法を用いて製造例１に記載の条件で挿入ＤＮＡの塩基配列を解析し、J. Bacteriol., 179, 496 (1997)に記載のバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）由来の分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素の塩基配列（Z49992）と比較したところ、ORFの開始位置を1位として、177A→G、178A→G（Thr60→Ala）という1つのアミノ酸置換を含む2つの塩基置換が認められた。こうして、プラスミドpSE-BSB1に、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）由来の分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素遺伝子が組み込まれていることを確認した。
２４℃で終夜培養した点以外は、上記酵素活性の測定方法に従い、プラスミドpSE-BSB1を用いて無細胞抽出液を調製し、上記酵素活性の測定方法に従いアミノ基転移活性を測定したところ、その比活性は０．３０Ｕ／ｍｇ−タンパク質であった。
製造例１４
ＤＬ−ノルバリンから２−オキソペンタン酸の製造
製造例１で得たプラスミドpSUCBDO1で大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、得られた形質転換体を２×ＹＴ培地（２％ バクトトリプトン、１％ バクト酵母エキス、１％ 塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）を用いて３３℃で終夜培養した。培地に０．１ｍＭ ＩＰＴＧを添加してＤ−アミノ酸酸化酵素遺伝子の発現を誘導した後、菌体を集菌して、Ｄ−アミノ酸酸化酵素を発現する大腸菌を得た。
基質の各終濃度が１重量％（８５ｍＭ）、４重量％（３４１ｍＭ）、１０重量％（８５０ｍＭ）となるようにＤＬ−ノルバリン（ノルバリンの鏡像異性体混合物）を加えた３つの反応容器に、それぞれ４００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）と、培養液１０ｇ分から調製した菌体とを加えて総重量１０ｇの反応液を調製し、振盪しながら３０℃で終夜反応を行った。反応液から０．１ｇずつサンプルとして採取し、後述するノルバリンの分析条件１に基づき反応液中に含まれるノルバリンの光学純度分析と定量を行った。その結果を表１に示す。
製造例１５
製造例１４において、プラスミドとして、製造例１で得たpSUCBDO1の代わりに製造例２で得たpSUTVDO1を用いた点以外は製造例１４と同様の操作を行ってＤ−アミノ酸酸化酵素を発現する大腸菌を調製した。得られた大腸菌を用いて、製造例１４と同様の方法で反応を行い、反応液中に含まれるノルバリンの光学純度分析と定量を行った。その結果を表１に示す。
製造例１６
製造例３で得たプラスミドpETECDD1で大腸菌BL21(DE3)pLysS株を形質転換し、得られた形質転換体を２×ＹＴ培地（２％ バクトトリプトン、１％ バクト酵母エキス、１％ 塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）を用いて３３℃で終夜培養した。培地に０．１ｍＭ ＩＰＴＧを添加してＤ−アミノ酸脱水素酵素遺伝子の発現を誘導した後、菌体を集菌して、Ｄ−アミノ酸脱水素酵素を発現する大腸菌を得た。
基質の各終濃度が１重量％（８５ｍＭ）、４重量％（３４１ｍＭ）となるようにＤＬ−ノルバリン（ノルバリンの鏡像異性体混合物）を加えた２つの反応容器に、それぞれ４００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）と、培養液１０ｇ分から調製した菌体とを加えて総重量１０ｇの反応液を調製し、振盪しながら３０℃で終夜反応を行った。反応液から０．１ｇずつサンプルとして採取し、後述するノルバリンの分析条件１に基づき反応液中に含まれるノルバリンの光学純度分析と定量を行った。その結果を表１に示す。
製造例１７
２−オキソペンタン酸からＬ−ノルバリンの製造（Ｌ−アミノ酸脱水素酵素利用）
製造例５で得たプラスミドpSF-GSA2で大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、得られた形質転換体を２×ＹＴ培地（製造例１４と同様）を用いて３３℃で終夜培養した。培地に０．１ｍＭ ＩＰＴＧを添加してＬ−アラニン脱水素酵素遺伝子の発現を誘導した後、菌体を集菌して、Ｌ−アラニン脱水素酵素とギ酸脱水素酵素を共発現する大腸菌を得た。
２−オキソペンタン酸ナトリウム塩を各終濃度２重量％（１４５ｍＭ）、４重量％（２９０ｍＭ）、１０重量％（７２４ｍＭ）、ギ酸ナトリウムを各終濃度１７４ｍＭ、３４８ｍＭ、８６９ｍＭとなるように加えた３つの反応容器に、それぞれ４００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）と、培養液１０ｇ分から調製した菌体とを加えて総重量１０ｇの反応液を調製し、振盪しながら３０℃で終夜反応を行った。反応液から０．１ｇずつサンプルとして採取し、ノルバリンの分析条件１に基づき反応液中に含まれるノルバリンの光学純度分析と定量を行った。その結果を表２に示す。
製造例１８
製造例１７において、プラスミドとして、製造例５で得たpSF-GSA2の代わりに製造例６で得たpSF-BTA1を用いた点以外は製造例１７と同様の操作を行ってＬ−アラニン脱水素酵素とギ酸脱水素酵素を共発現する大腸菌を調製した。得られた大腸菌を用いて、製造例１７と同様の方法で反応を行い、反応液中に含まれるノルバリンの光学純度分析と定量を行った。その結果を表２に示す。
製造例１９
製造例１７において、プラスミドとして、製造例５で得たpSF-GSA2の代わりに製造例７で得たpSFBPAD1を用いた点以外は製造例１７と同様の操作を行ってＬ−アラニン脱水素酵素とギ酸脱水素酵素を共発現する大腸菌を調製した。得られた大腸菌を用いて、製造例１７と同様の方法で反応を行い、反応液中に含まれるノルバリンの光学純度分析と定量を行った。その結果を表２に示す。
製造例２０
製造例１７において、プラスミドとして、製造例５で得たpSF-GSA2の代わりに製造例８で得たpSF-SAD1を用いた点以外は製造例１７と同様の操作を行ってＬ−アラニン脱水素酵素とギ酸脱水素酵素を共発現する大腸菌を調製した。得られた大腸菌を用いて、製造例１７と同様の方法で反応を行い、反応液中に含まれるノルバリンの光学純度分析と定量を行った。その結果を表２に示す。
製造例２１
製造例１７において、プラスミドとして、製造例５で得たpSF-GSA2の代わりに製造例９で得たpFGSLED1を用いた点以外は製造例１７と同様の操作を行ってＬ−ロイシン脱水素酵素とギ酸脱水素酵素を共発現する大腸菌を調製した。得られた大腸菌を用いて、製造例１７と同様の方法で反応を行い、反応液中に含まれるノルバリンの光学純度分析と定量を行った。その結果を表２に示す。
製造例２２
製造例１７において、プラスミドとして、製造例５で得たpSF-GSA2の代わりに製造例１０で得たpSFBPLD1を用いた点以外は製造例１７と同様の操作を行ってＬ−ロイシン脱水素酵素とギ酸脱水素酵素を共発現する大腸菌を調製した。得られた大腸菌を用いて、製造例１７と同様の方法で反応を行い、反応液中に含まれるノルバリンの光学純度分析と定量を行った。その結果を表２に示す。
製造例２３
製造例１７において、プラスミドとして、製造例５で得たpSF-GSA2の代わりに製造例１１で得たpSF-TIP2を用いた点以外は製造例１７と同様の操作を行ってＬ−アミノ酸脱水素酵素とギ酸脱水素酵素を共発現する大腸菌を調製した。得られた大腸菌を用いて、製造例１７と同様の方法で反応を行い、反応液中に含まれるノルバリンの光学純度分析と定量を行った。その結果を表２に示す。
製造例２４
２−オキソペンタン酸からＬ−ノルバリンの製造（Ｌ−アミノ酸アミノ基転移酵素利用）
製造例１７において、プラスミドとして、製造例５で得たpSF-GSA2の代わりに製造例１２で得たpSE-ECB1を用いた点以外は製造例１７と同様の操作を行って分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素を発現する大腸菌を調製した。
２−オキソペンタン酸ナトリウム塩を各終濃度２重量％（１４５ｍＭ）、４重量％（２９０ｍＭ）アミノ基供与体としてのＬ−グルタミン酸ナトリウムを各終濃度２９０ｍＭ、５８０ｍＭとなるように加えた２つの反応容器に、それぞれ４００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ８．０に調製した後、培養液１０ｇ分から調製した菌体とを加えて総重量１０ｇの反応液を調製し、振盪しながら３０℃で終夜反応を行った。反応液から０．１ｇずつサンプルとして採取し、後述するノルバリンの分析条件１に基づき反応液中に含まれるノルバリンの光学純度分析と定量を行った。その結果を表３に示す。
製造例２５
製造例２４で調製した分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素を発現する大腸菌を以下の反応に用いた。製造例２４において、アミノ基供与体として、Ｌ−グルタミン酸ナトリウムの代わりにＬ−アスパラギン酸を用いた点以外は製造例２４と同様の方法で反応を行い、反応液中に含まれるノルバリンの光学純度分析と定量を行った。その結果を表３に示す。
製造例２６
製造例１７において、プラスミドとして、製造例５で得たpSF-GSA2の代わりに製造例１３で得たpSE-BSB1を用いた点以外は製造例１７と同様の操作を行って分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素を発現する大腸菌を調製した。得られた大腸菌を用いて、製造例２４と同様の方法で反応を行い、反応液中に含まれるノルバリンの光学純度分析と定量を行った。その結果を表３に示す。
製造例２７
製造例２６で調製した分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素を発現する大腸菌を以下の反応に用いた。製造例２６において、アミノ基供与体として、Ｌ−グルタミン酸ナトリウムの代わりにＬ−アスパラギン酸を用いた点以外は製造例２６と同様の方法で反応を行い、反応液中に含まれるノルバリンの光学純度分析と定量を行った。その結果を表３に示す。
製造例２８
混合菌体を用いたＬ−ノルバリンの製造
製造例１で得たプラスミドpSUCBDO1で大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、得られた形質転換体を２×ＹＴ培地（製造例１４と同様）５０ｍｌを用いて３３℃で終夜培養した。培地に０．１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して遺伝子の発現を誘導した後、菌体を集菌して、Ｄ−アミノ酸酸化酵素を発現する大腸菌を得た。
製造例１１で得たプラスミドpSF-TIP2で大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、得られた形質転換体を２×ＹＴ培地（製造例１４と同様）５０ｍｌを用いて３３℃で終夜培養した。培地に０．１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して遺伝子の発現を誘導した後、菌体を集菌して、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素とギ酸脱水素酵素を共発現する大腸菌を得た。
上記２種の培養液各５ｇ分から調製した菌体を、４重量％ ＤＬ−ノルバリン、０．２０Ｍ ギ酸ナトリウム、０．７５Ｍ アンモニア緩衝液（ｐＨ８．０）を含む反応液に加えて総重量１０ｇとし、通気条件で振盪し、３０℃で反応を行った。反応開始から２０時間後、４５時間後に反応液から０．１ｇずつサンプルとして採取し、後述するノルバリンの分析条件１に基づき反応液中に含まれるノルバリンの光学純度分析と定量を行った。これらの結果を表４に示す。
製造例２９
製造例２８において、反応液として、１０重量％ ＤＬ−ノルバリン、０．５１Ｍ ギ酸ナトリウム、０．７５Ｍ アンモニア緩衝液（ｐＨ８．０）を含む反応液を用いた点以外は、製造例２８と同様の方法により反応を行った。反応開始から２０時間後、４５時間後に反応液から０．１ｇずつサンプルとして採取し、後述するノルバリンの分析条件１に基づき反応液中に含まれるノルバリンの光学純度分析と定量を行った。これらの結果を表４に示す。
製造例３０
混合菌体を用いたＬ−ノルバリンの製造
製造例１で得たプラスミドpSUCBDO1で大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、得られた形質転換体を２×ＹＴ培地（製造例１４と同様）５０ｍｌを用いて３３℃で終夜培養した。培地に０．１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して遺伝子の発現を誘導した後、菌体を集菌して、Ｄ−アミノ酸酸化酵素を発現する大腸菌を得た。
製造例５で得たプラスミドpSF-GSA2で大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、得られた形質転換体を２×ＹＴ培地（製造例１４と同様）５０ｍｌを用いて３３℃で終夜培養した。培地に０．１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して遺伝子の発現を誘導した後、菌体を集菌して、Ｌ−アラニン脱水素酵素とギ酸脱水素酵素を共発現する大腸菌を得た。
上記２種の培養液各５ｇ分から調製した菌体を、４重量％ ＤＬ−ノルバリン、０．２０Ｍ ギ酸ナトリウム、０．７５Ｍ アンモニア緩衝液（ｐＨ８．０）を含む反応液に加えて総重量１０ｇとし、通気条件で振盪し、３０℃で反応を行った。反応開始から２０時間後、４５時間後に反応液から０．１ｇずつサンプルとして採取し、後述するノルバリンの分析条件１に基づき反応液中に含まれるノルバリンの光学純度分析と定量を行った。これらの結果を表４に示す。
製造例３１
製造例３０において、反応液として、１０重量％ ＤＬ−ノルバリン、０．５１Ｍ ギ酸ナトリウム、０．７５Ｍ アンモニア緩衝液（ｐＨ８．０）を含む反応液を用いた点以外は、製造例３０と同様の方法により反応を行った。反応開始から２０時間後、４５時間後に反応液から０．１ｇずつサンプルとして採取し、後述するノルバリンの分析条件１に基づき反応液中に含まれるノルバリンの光学純度分析と定量を行った。これらの結果を表４に示す。
製造例３２
４遺伝子発現可能なベクターpSE420Qの構築
製造例１で得たプラスミドpSE420UをSpeI, で2重消化し、同部位に合成ＤＮＡ（配列番号：３５、配列番号：３６）をアニール後、ライゲーションすることによりプラスミドpSE420Qを構築した。
配列番号３５：CTAGTAGAGGTACCTATATATGCATGTGCACGC
配列番号３６：TTAAGCGTGCACATGCATATATAGGTACCTCTA
製造例３３
大腸菌由来カタラーゼ遺伝子katE含有プラスミドpSQECKE1の構築
大腸菌K12（Escherichia coli K12）株由来のカタラーゼ遺伝子katEの塩基配列（Accession No. NC_000913 REGION: 1811891..1814152)を元にクローニング用のセンスプライマーEckatE-A1（配列番号：３７）、アンチセンスプライマーEckatE-T1（配列番号：３８）を合成した。
配列番号３７：gacggtacctatacATGTCTCAACATAACGAAAAGAACCCACA
配列番号３８：tcgaagcttaagaTTATGCAGGAATTTTGTCAATCTTAGGAATGC
前記大腸菌K12（Escherichia coli K12）株から生成した染色体DNAを鋳型とし、前記センスプライマーEckatE-A1（配列番号：３７）と、アンチセンスプライマーEckatE-T1（配列番号：３８）を用いて製造例１記載の方法と同様の方法によりＰＣＲを行い、配列番号３９の塩基配列からなるＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素KpnI, HindIIIで二重消化し、同制限酵素で二重消化した製造例３２で得たpSE420QとライゲーションしてpSQECKE1を構築した。
上記酵素活性の測定方法に従い、プラスミドpSQECKE1によるカタラーゼ活性を測定したところ、比活性は２６０Ｕ／ｍｇ−タンパク質であった。
なお、プラスミドpSQECKE1が含む大腸菌由来カタラーゼEckatEは、製造例３４で得られるプラスミドpSQECKG1が含む大腸菌由来カタラーゼEckatGと比較して、カタラーゼ活性及び安定性がいずれも高く、しかもペルオキシダーゼ活性は低いことが報告され、前記特性は本発明の目的にも合致するため、EckatEを発現するプラスミドpSQECKE1を以後の実験に用いた。
製造例３４
大腸菌由来カタラーゼ遺伝子katG含有プラスミドpSQECKG1の構築
大腸菌K12（Escherichia coli K12）株由来のカタラーゼ遺伝子katGの塩基配列（Accession NC_000913 REGION: 4131858..4134038)を元にクローニング用のセンスプライマーEckatG-A1（配列番号：４０）、アンチセンスプライマーEckatG-T1（配列番号：４１）を合成した。
配列番号４０：gacggtaccatatcATGAGTACTTCAGACGATATCCATAACAC
配列番号４１：gacaagcttaagaTTAAAGCAGATCAAAACGGTCGAGG
前記大腸菌K12（Escherichia coli K12）株から生成した染色体DNAを鋳型とし、前記センスプライマーEckatG-A1（配列番号：４０）と、アンチセンスプライマーEckatG-T1（配列番号：４１）を用いて製造例１記載の方法と同様の方法によりＰＣＲを行い、配列番号４２の塩基配列からなるＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素KpnI, HindIIIで二重消化し、同制限酵素で二重消化した製造例３２で得たpSE420QとライゲーションしてpSQECKG1を構築した。
上記酵素活性の測定方法に従い、プラスミドpSQECKG1によるカタラーゼ活性を測定したところ、比活性は１０８Ｕ／ｍｇ−タンパク質であった。
製造例３５
２遺伝子含有プラスミドpSQTIP2の構築（フェニルアラニン脱水素酵素とカタラーゼ）
J. Biochem., 109, 371 (1991)に記載のサーモアクチノマイセス・インターメディウス IFO 14230 (Thermoactinomyces intermedius IFO14230)株由来フェニルアラニン脱水素酵素遺伝子の塩基配列（Accession No. D00631）を元に、センスプライマーTIP-ATG4（配列番号：４３）とアンチセンスプライマーTIP-TAA4（配列番号：４４）を合成した。
配列番号４３：CAGGAATTCTATAATGCGTGATGTATTTGAAATGATGGAC
配列番号４４：gtcaggtacctcTTAACGACGTGCACTATTACGG
製造例１１で得たフェニルアラニン脱水素酵素発現プラスミドpSU-TIP2を鋳型とし、センスプライマーTIP-ATG4とアンチセンスプライマーTIP-TAA4を用いて製造例１記載の方法と同様の方法によりＰＣＲを行い、ＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素KbaI, KpnIで二重消化し、同制限酵素で二重消化した製造例３３で得たpSQECKE1とライゲーションして、サーモアクチノマイセス・インターメディウス IFO 14230 (Thermoactinomyces intermedius IFO 14230) 株由来のＬ−フェニルアラニン脱水素酵素と大腸菌K12（Escherichia coli K12）株由来のカタラーゼ遺伝子katEとが組み込まれたプラスミドpSQTIP4を得た。
実施例１
３遺伝子含有プラスミドpSFTPCO1の構築
キャンディダ・ボイディニ DSM 70026株由来のＤ−アミノ酸酸化酵素遺伝子のアンチセンスプライマーCbDAO-T2（配列番号：３４）を合成した。
配列番号３４：GTCTTAATTAAAGTTTAGCTTTAACTTTTTGGTTATCAACTAA
製造例１１で得たプラスミドpSUCBDO1を鋳型とし、製造例１１記載で用いたセンスプライマーCbDAO-A1（配列番号：３）とアンチセンスプライマーCbDAO-T1（配列番号：４）を用いて製造例１１記載の方法に従ってＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異的な約１．１ｋｂｐのバンドが検出された。このバンドを切り出し、GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（ファルマシア製）で精製した後、制限酵素Nde IとPac Iで二重消化し、フェノール−クロロホルム処理後、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンド部分を切り出し、Sephaglas Band Prep Kit（ファルマシア製）により精製して、目的のＤＮＡ断片を得た。
製造例１１で得たプラスミドpSF-TIP2を制限酵素Nde IとPac Iで二重消化し、フォスファターゼ処理、次いでフェノール−クロロホルム処理後、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ製）を用いて目的のＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドで大腸菌JM109株を形質転換し、製造例１と同様の方法で精製してプラスミドpSFTPCO1（図１９）を得た。
精製したプラスミドを用い、プライマーウォーキング法を用いて製造例１に記載の条件で挿入ＤＮＡの塩基配列を解析し、キャンディダ・ボイディニ (Candida boidinii)由来のＤ−アラニン酸化酵素、サーモアクチノマイセス・インターメディウス(Thermoactinomyces intermedius)由来のＬ−フェニルアラニン脱水素酵素、マイコバクテリウム・バッカエ（Mycobacterium vaccae）由来のギ酸脱水素酵素が組み込まれていることを確認した。
２６℃で終夜培養した点以外は、上記酵素活性の測定方法に従い、プラスミドpSFTPCO1を用いて無細胞抽出液を調製し、各酵素活性を測定したところ、比活性はそれぞれ、Ｄ−アラニン酸化活性が２．９３Ｕ／ｍｇ−タンパク質、Ｌ−フェニルアラニン酸化活性が７．０３Ｕ／ｍｇ−タンパク質、ギ酸酸化活性が０．７１Ｕ／ｍｇ−タンパク質であった。
実施例２
３遺伝子含有プラスミドpSFGACO1の構築
製造例１におけるＰＣＲで得たキャンディダ・ボイディニ由来のＤ−アミノ酸酸化酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片と、製造例５で得たプラスミドpSF-GSA2とをそれぞれ制限酵素Nde IとPac Iで二重消化し、フォスファターゼ処理、次いでフェノール−クロロホルム処理したものを、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ製）を用いて連結し、大腸菌JM109株を形質転換した。目的とするDNA断片が挿入した形質転換株をアンピシリンを含む液体LB培地で培養し、FlexiPrep Kit（ファルマシア製）を用いてプラスミドを精製し、キャンディダ・ボイディニ由来のＤ−アミノ酸酸化酵素、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス由来アラニン脱水素酵素、マイコバクテリウム・バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の遺伝子を共発現する３遺伝子含有プラスミドpSFGACO1（図２０）を得た。精製したプラスミドpSFGACO1を用い、プライマーウォーキング法を用いて挿入DNAの塩基配列を確認した。
２６℃で終夜培養した点以外は、上記酵素活性の測定方法に従い、プラスミドpSFGACO1を用いて無細胞抽出液を調製し、各酵素活性を測定したところ、比活性はそれぞれ、Ｄ−アラニン酸化活性が２．４２Ｕ／ｍｇ−タンパク質、Ｌ−アラニン酸化活性が２．６３Ｕ／ｍｇ−タンパク質、ギ酸酸化活性が０．７９Ｕ／ｍｇ−タンパク質であった。
実施例３
３遺伝子含有プラスミドpSFTPCO1を用いたＬ−ノルバリンの製造
実施例１で構築した３遺伝子含有プラスミドpSFTPCO1で大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、得られた形質転換体を２×ＹＴ培地（製造例１４と同様）５０ｍｌを用いて３３℃で終夜培養した。培地に０．１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して遺伝子の発現を誘導した後、菌体を集菌して、３遺伝子を発現する大腸菌を得た。
培養液１０ｇ分から調製した菌体を、４重量％ ＤＬ−ノルバリン、０．２０Ｍ ギ酸ナトリウム、０．１７Ｍ アンモニア緩衝液（ｐＨ８．０）を含む反応液に加えて総重量１０ｇとし、通気条件で振盪し、３０℃で反応を行った。反応開始から２０時間後、４５時間後に反応液から０．１ｇずつサンプルとして採取し、後述するノルバリンの分析条件１に基づき反応液中に含まれるノルバリンの光学純度分析と定量を行った。これらの結果を表５に示す。
実施例４
実施例３において、反応液として、１０重量％ ＤＬ−ノルバリン、０．５１Ｍ ギ酸ナトリウム、０．４３Ｍ アンモニア緩衝液（ｐＨ８．０）を含む反応液を用いた点以外は、実施例３と同様の方法により反応を行った。反応開始から２０時間後、４５時間後に反応液から０．１ｇずつサンプルとして採取し、後述するノルバリンの分析条件１に基づき反応液中に含まれるノルバリンの光学純度分析と定量を行った。これらの結果を表５に示す。
実施例５
実施例３において、反応液として、１２重量％ ＤＬ−ノルバリン、０．６１Ｍ ギ酸ナトリウム、０．５１Ｍ アンモニア緩衝液（ｐＨ８．０）を含む反応液を用いた点以外は、実施例３と同様の方法により反応を行った。反応開始から２０時間後、４５時間後に反応液から０．１ｇずつサンプルとして採取し、後述するノルバリンの分析条件１に基づき反応液中に含まれるノルバリンの光学純度分析と定量を行った。これらの結果を表５に示す。
実施例６
実施例３において、３遺伝子含有プラスミドとして、pSFTPCO1に代えて実施例２で構築した３遺伝子含有プラスミドpSFGACO1を用いた点以外は実施例３と同様の方法により反応を行った。反応開始から２０時間後、４５時間後に反応液から０．１ｇずつサンプルとして採取し、後述するノルバリンの分析条件１に基づき反応液中に含まれるノルバリンの光学純度分析と定量を行った。これらの結果を表５に示す。
実施例７
実施例６において、反応液として、１０重量％ ＤＬ−ノルバリン、０．５１Ｍ ギ酸ナトリウム、０．２１Ｍ アンモニア緩衝液（ｐＨ８．０）を含む反応液を用いた点以外は、実施例６と同様の方法により反応を行った。反応開始から２０時間後、４５時間後に反応液から０．１ｇずつサンプルとして採取し、後述するノルバリンの分析条件１に基づき反応液中に含まれるノルバリンの光学純度分析と定量を行った。これらの結果を表５に示す。
実施例８
実施例６において、反応液として、１２重量％ ＤＬ−ノルバリン、０．６１Ｍ ギ酸ナトリウム、０．２６Ｍ アンモニア緩衝液（ｐＨ８．０）を含む反応液を用いた点以外は、実施例６と同様の方法により反応を行った。反応開始から２０時間後、４５時間後に反応液から０．１ｇずつサンプルとして採取し、後述するノルバリンの分析条件１に基づき反応液中に含まれるノルバリンの光学純度分析と定量を行った。これらの結果を表５に示す。
実施例９
３遺伝子含有プラスミドpSFTPCO1を用いたＬ−ノルバリンの製造
実施例１で構築した３遺伝子発現プラスミドpSFTPCO1で大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、得られた形質転換体を２×ＹＴ培地（製造例１４と同様）４００ｍｌを用いて３３℃で終夜培養した。培地に０．１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して遺伝子の発現を誘導した後、菌体を集菌して、３遺伝子を発現する大腸菌を得た。
得られた大腸菌を、１２重量％（１．０２Ｍ）ＤＬ−ノルバリン、２．８％（０．６１Ｍ）ギ酸ナトリウム、１．１％（０．６２Ｍ）アンモニア緩衝液（ｐＨ８．０）を含む反応液に加えて４００ｇとし、通気条件で撹拌下、３０℃で２４時間反応させた。反応液から０．１ｇサンプルとして採取し、後述するノルバリンの分析条件１に基づき反応液中に含まれるノルバリンの光学純度分析と定量を行ったところ、Ｌ−ノルバリンの濃度は９．１重量％（０．７７９Ｍ）、Ｄ−ノルバリンは検出されず、光学純度は１００％であった。
実施例１０
実施例９で得た反応液の一部を以下の方法で精製した。
実施例９で得た反応液３０．５ｇに濃硫酸１．７ｇを添加してｐＨ２．５に調整し、３０℃で１７時間加熱撹拌した。得られた酸性懸濁液を遠心分離することによって除菌後、上清にメタノール５０ｍｌを添加し、生成した固体を濾過により除去して除タンパクを行った。得られたろ液にアンモニア水を添加してｐＨ６に調整し、さらにアセトン６０ｍｌを添加した。析出した固体をろ取、乾燥し、精製ノルバリンを含む白色固体を２．４２ｇ得た。得られた固体について、マレイン酸を内部標準として１Ｈ−ＮＭＲを測定したところ化学純度は９５％であり、後述するノルバリンの分析条件２に基づく光学純度は１００％（Ｌ体）であった。
実施例１１
実施例９で得た反応液の一部を以下の方法で精製した。
実施例９で得た反応液９．１ｇに水４．５ｍｌを添加し、６０℃で２．５時間加熱撹拌した。得られた懸濁液を遠心分離することによって除菌後、分画分子量１００００の限外濾過膜（CentriCon YM10、ミリポア製）を用いて２０００×ｇ、３０℃で遠心することにより除タンパクを行った。次いで、ろ液を固体の析出が見られるまで減圧濃縮した。濃縮液にギ酸を０．１ｇ添加してｐＨ６．２に調整し、更にアセトンを１４．８ｍＬ添加した。析出した固体をろ取、乾燥し、精製ノルバリンを含む白色固体を０．４３３ｇ得た。得られた固体について、マレイン酸を内部標準として１Ｈ−ＮＭＲを測定したところ化学純度は９５％であり、後述するノルバリンの分析条件２に基づく光学純度は１００％（Ｌ体）であった。
実施例１２
４遺伝子含有プラスミドpSFCPC01の構築（Ｄ−アミノ酸酸化酵素、ギ酸脱水素酵素、フェニルアラニン脱水素酵素、カタラーゼ）
実施例１で得た３遺伝子発現プラスミドpSFTP01を制限酵素NdeI, XbaIで二重消化し、Ｄ−アラニン酸化酵素及びギ酸脱水素酵素遺伝子を含むDNA断片を調製した。製造例３５で得た２遺伝子発現プラスミドpSQTIP4を同制限酵素で二重消化し、前記Ｄ−アラニン酸化酵素及びギ酸脱水素酵素遺伝子を含むDNA断片をライゲーションして、キャンディダ・ボイディニ (Candida boidinii)由来のＤ−アラニン酸化酵素、マイコバクテリウム・バッカエ（Mycobacterium vaccae）由来のギ酸脱水素酵素、サーモアクチノマイセス・インターメディウス IFO 14230 (Thermoactinomyces intermedius IFO 14230) 株由来のＬ−フェニルアラニン脱水素酵素、大腸菌K12（Escherichia coli K12）株由来のカタラーゼ遺伝子katEからなる４遺伝子を共発現するプラスミドpSFCPC01を得た。
得られた４遺伝子発現プラスミドpSFCPCO1を用いて、上記「酵素活性の測定」に記載の方法に従って無細胞抽出液を調製し、上記各酵素に応じた方法に従って活性を測定した結果、Ｄ−アラニン酸化酵素活性は２．４０Ｕ／mg−タンパク質、ギ酸脱水素酵素活性は０．６３Ｕ／mg−タンパク質、、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素活性は５．３０Ｕ／mg−タンパク質、カタラーゼ活性は３９９Ｕ／mg−タンパク質であり、いずれの酵素も十分な活性で発現されていることが確認できた。
実施例１３
３遺伝子含有プラスミドpSFTPCO1を用いたＬ−ノルバリンの製造
実施例１２で構築した３遺伝子含有プラスミドpSFTPCO1で大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、得られた形質転換体を２×ＹＴ培地（製造例１４と同様）を用いて３３℃で終夜培養した。培地に０．１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して遺伝子の発現を誘導した後、菌体を集菌して、３遺伝子を発現する大腸菌を得た。
培養液５ｇ分から調製した菌体を、８重量％ ＤＬ−ノルバリン、ノルバリンに対して０．６当量のギ酸アンモニウムを含む反応液（ｐＨ８．０）に加えて総重量１０ｇとし、通気条件で振盪し、３０℃で振盪下、４４時間反応させた。反応液から０．１ｇ採取し、後述するノルバリンの分析条件１に基づき反応液中に含まれるノルバリンの光学純度分析と定量を行ったところ、Ｌ−ノルバリンの光学純度は１００％ｅｅであり、収率は６５．９％であった。
また、反応終了後の反応液に対して高速液体クロマトグラフィー分析を行ったところ、α−ケト吉草酸は検出されなかった。
実施例１４
４遺伝子含有プラスミドpSFCPC01を用いたＬ−ノルバリンの製造
実施例１３において、３遺伝子含有プラスミドpSFTPCO1に代えて実施例１２で得た４遺伝子含有プラスミドpSFCPC01を用いた点以外は実施例１３と同様の方法で反応を行い、ノルバリンの光学純度分析と定量を行ったところ、Ｌ−ノルバリンの光学純度は１００％ｅｅであり、収率は７６．６％であった。
また、実施例１３と同様の方法に従って、反応終了後に残存するα−ケト吉草酸の濃度を測定したところ、原料ＤＬ−ノルバリンに対して２１．３モル％検出された。この結果は、Ｄ−アミノ酸からケト酸を生成する酸化工程後の還元工程において、ケト酸からＬ−アミノ酸を生成するケト酸の還元的アミノ化反応が完全には進行せず、α−ケト酸が蓄積されたままことを示している。
実施例１５
酸化工程と還元工程に異なる条件を用いる方法
実施例１２で得た４遺伝子含有プラスミドpSFCPC01で大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、得られた形質転換体を２×ＹＴ培地（製造例１４と同様）を用いて３３℃で終夜培養した。培地に０．１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して遺伝子の発現を誘導した後、菌体を集菌して、４遺伝子を発現する大腸菌を得た。
培養液１３２ｇから調製した菌体を、８重量％ＤＬ−ノルバリン、ノルバリンに対して０．６当量のギ酸アンモニウム、０．０２％アデカノール（消泡剤；旭電化工業社製）と混合し、硫酸を用いてｐＨ８．０に調整した反応液４００ｍｌを１Ｌ用のミニジャーに入れ、酸化工程として空気の通気量０．５ｖｖｍ、撹拌速度５００ｒｐｍ、３０℃の条件で４３時間反応を行った。酸化工程終了後の反応液から０．１ｇ採取し、後述するノルバリンの分析条件１に基づき反応液中に含まれるノルバリンの光学純度分析と定量を行ったところ、Ｌ−ノルバリンの光学純度は９８．３％ｅｅであり、収率は６４．４％であった。
次いで、還元工程として、酸素含有気体の通気を停止し、撹拌速度３００ｒｐｍ、原料ＤＬ−ノルバリン（培養液１３２ｇから調製した菌体）に対して０．３７当量のギ酸アンモニウムを追加し、反応液のｐＨ８．０、３０℃の条件で６２時間反応を行った。反応終了後の反応液から０．１ｇ採取し、後述するノルバリンの分析条件１に基づき反応液中に含まれるノルバリンの光学純度分析と定量を行ったところ、Ｌ−ノルバリンの光学純度は１００％ｅｅであり、収率は８６．６％であった。
また、反応終了後の反応液に対して高速液体クロマトグラフィー分析を行ったところ、α−ケト吉草酸はわずかに残存していた（原料ＤＬ−ノルバリン基準で４重量％程度）。
実施例１６
酸化工程のｐＨ調整をギ酸で行い、還元工程にギ酸アンモニウムを追加する方法
実施例１５において、酸化工程における反応液のｐＨを調整する際に、硫酸に代えてギ酸を用いた点以外は実施例１５と同様の方法により酸化工程及び還元工程を行ったところ、Ｌ−ノルバリンの光学純度は１００％ｅｅであり、収率は９２．８％であった。
また、反応終了後の反応液に対して高速液体クロマトグラフィー分析を行ったところ、、α−ケト吉草酸は検出されなかった。
実施例１７
酸化工程のｐＨ調整をギ酸で行い、還元工程にギ酸アンモニウムを追加しない方法
実施例１５において、酸化工程における反応液のｐＨを調整する際に、硫酸に代えてギ酸を用い、還元工程においてギ酸アンモニウムを追加しなかった点以外は実施例１５と同様の方法により酸化工程及び還元工程を行ったところ、Ｌ−ノルバリンの光学純度は１００％ｅｅであり、収率は９３．３％であった。
また、実施例１３の方法に従い、反応終了後に残存するα−ケト吉草酸の濃度を測定したが、α−ケト吉草酸は検出されなかった。
以上の結果から、酸化工程のｐＨ調整に硫酸を用いた場合には、反応終了後にα−ケト酸が残存し、還元工程における還元的アミノ化反応が十分に進行されなかった（実施例１５）。これに対し、酸化工程のｐＨ調整にギ酸を用いた場合には還元工程が完全に進行し、反応終了後にα−ケト酸の残存も見られなかった（実施例１６，１７）。この際、還元工程においてギ酸アンモニウムを追加しても（実施例１６）、しなくても（実施例１７）収率に影響がなかった。このことは、酸化工程においてギ酸が無駄に消費された場合に、酸化工程のｐＨ調整にギ酸を用いることにより、効率的にギ酸が補充されていることが示された。
参考例１
実施例１２で得た４遺伝子含有プラスミドpSFCPC01で大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、得られた形質転換体を２×ＹＴ培地（製造例１４と同様）を用いて３３℃で終夜培養した。培地に０．１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して遺伝子の発現を誘導した後、菌体を集菌して、４遺伝子を発現する大腸菌を得た。
培養液１３２ｇから調製した菌体と、８重量％ＤＬ−ノルバリン、０．０２％アデカノール（消泡剤；旭電化工業社製）、ギ酸アンモニウムを原料ＤＬ−ノルバリンに対して０（無添加），０．２当量、０．４当量、０．６当量の各条件で混合し、ギ酸を用いてｐＨ８．０に調整した反応液てｐＨ８．０に調整した反応液４００ｍｌを１Ｌ用のミニジャーに入れ、酸化工程として空気の通気量０．５ｖｖｍ、撹拌速度５００ｒｐｍ、３０℃の条件で酸化反応を行った。各条件について酸化工程の終了に要した時間は、それぞれ２８時間以上、２８時間、２４時間、２８時間であった。酸化工程終了後の反応液から０．１ｇ採取し、後述するノルバリンの分析条件１に基づき反応液中に含まれるノルバリンの光学純度分析を行った結果を表６に示す。これらの結果より、酸化工程において、反応開始時にギ酸アンモニウムを添加しなかった場合は、２８時間を超えて反応を行っても光学純度が４９．３％ｅｅに留まり、ギ酸アンモニウムを原料ＤＬ−ノルバリンに対して０．２当量以上添加した場合の光学純度が９９％ｅｅ以上であるのに対して、極めて反応の進行が遅い結果であった。なお、ギ酸アンモニウムの添加量が０．２当量以上では、Ｌ−ノルバリンの光学純度は十分に高く、差が見られなかった。
参考例２
参考例１において、ｐＨ調整をギ酸アンモニウムに代えてギ酸を用いて行い、且つ反応液のｐＨを７．０、７．５、８．０、８．５の各値で調整した点以外は参考例１と同様の方法により酸化工程を行った。酸化工程終了後の反応液から０．１ｇ採取し、後述するノルバリンの分析条件１に基づき反応液中に含まれるノルバリンの光学純度分析を行った結果を表７に示す。
実施例１８（貴社案：追加実施例１３，前回の参考例３）
実施例１２で得た４遺伝子含有プラスミドpSFCPC01で大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、得られた形質転換体を２×ＹＴ培地（製造例１４と同様）を用いて３３℃で終夜培養した。培地に０．１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して遺伝子の発現を誘導した後、菌体を集菌して、４遺伝子を発現する大腸菌を得た。
培養液１３２ｇから調製した菌体を、８重量％ＤＬ−ノルバリン、ノルバリンに対して０．６当量のギ酸アンモニウム、０．０２％アデカノール（消泡剤；旭電化工業社製）と混合し、硫酸を用いてｐＨ８．０に調整した反応液４００ｍｌを１Ｌ用のミニジャーに入れ、酸化工程として空気の通気量０．５ｖｖｍ、撹拌速度５００ｒｐｍ、３０℃の条件で４３時間反応を行った。酸化工程終了後の反応液から０．１ｇ採取し、後述するノルバリンの分析条件１に基づき反応液中に含まれるノルバリンの光学純度分析と定量を行ったところ、Ｌ−ノルバリンの光学純度は９８．３％ｅｅであり、収率は６４．４％であった。
次いで、還元工程として、酸素含有気体の通気を停止し、撹拌速度３００ｒｐｍ、温度３０℃の条件下、ギ酸を用いて反応液のｐＨを６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０の各値に調整し、６２時間反応を行った。反応終了後の反応液から０．１ｇ採取し、後述するノルバリンの分析条件１に基づき反応液中に含まれるノルバリンの光学純度分析と定量を行ったところ、Ｌ−ノルバリンの光学純度は１００％ｅｅであり、収率は８６．６％であった。
また、反応終了後の反応液に対して高速液体クロマトグラフィー分析を行ったところ、α−ケト吉草酸はわずかに残存していた（原料ＤＬ−ノルバリン基準で４重量％程度）。
（評価試験）
ノルバリンの分析条件１
ノルバリン含有反応液サンプル０．１ｇに０．１Ｍ 塩酸を加えて懸濁し、遠心分離して得た上清を０．４％ トリエチルアミンを含む５０％ アセトニトリル水溶液で希釈した。この希釈液１００μＬを０．２％ ２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルイソチオシアネート（ＧＩＴＣ）１００μＬと混合し、４０℃で９０分反応させた。得られた反応液を高速液体クロマトグラフィーにより以下の条件で分析した。
カラム：イナートシルＯＤＳ−３（φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）（ジーエルサイエンス製）
温度：２５℃
検出：ＵＶ２５０ｎｍ
溶離液：１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．５）／メタノール＝４５／５５
流速：１ｍＬ／分
以上の条件でＧＩＴＣ化したＬ−ノルバリンは保持時間８．８分に、ＧＩＴＣ化したＤ−ノルバリンは１１．８分に検出された。
ノルバリンの分析条件２
ノルバリンを含む固体５ｍｇを水１ｍＬに溶解し、以下の条件で分析した。
カラム：ＣＲＯＷＮＰＡＫ ＣＲ（＋）（φ４ｍｍ×１５０ｍｍ）（ダイセル化学工業（株）製）
温度：４０℃
検出：ＵＶ ２１０ｎｍ
溶離液：過塩素酸水溶液（ｐＨ２．０）
流速：０．８ｍＬ／分
以上の条件でＬ−ノルバリンは保持時間２．５分に、Ｄ−ノルバリンは保持時間３．３分に検出された。
２−オキソペンタン酸の分析条件
反応液調製時の反応液サンプル０．１ｇに、０．１Ｍ 塩酸を加えて懸濁し、遠心分離して得た上清を以下の条件で分析した。
カラム：Wakosil-II 5C18 HG（φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）（和光純薬（株）製）
温度：４０℃
検出：ＵＶ２３０ｎｍ
溶離液：０．１容積％トリフルオロ酢酸水溶液／アセトニトリル＝９５／５
流速：１ｍＬ／分
以上の条件で２−オキソペンタン酸は保持時間８．６分に検出された。
Figure 2006132145
Figure 2006132145
Figure 2006132145
Figure 2006132145
Figure 2006132145
Figure 2006132145
Figure 2006132145
本発明のＬ−アミノ酸の製造方法は、酵素反応を利用して同一系内で効率よくＬ−アミノ酸を生成する方法等として有用である。この方法によれば、安価なアミノ酸鏡像異性体混合物から光学収率の高いＬ−アミノ酸を得ることができる。特に、過酸化水素分解酵素を同一宿主内で発現させる方法は、穏和な反応条件を用いて中間生成物のケト酸の分解を回避しうるため、Ｌ−アミノ酸の生産性を向上することができる。

Claims (35)

  1. アミノ酸の鏡像異性体混合物からＬ−アミノ酸を酵素的に生成するＬ−アミノ酸の製造方法であって、Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素をコードする塩基配列とが同一又は異なる発現ベクターに組み込まれた一又は複数の組換えベクターを同一宿主に導入して形成される形質転換体又はその処理物を、アミノ酸鏡像異性体混合物と接触させる工程を含むことを特徴とするＬ−アミノ酸の製造方法。
  2. 形質転換体が、Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、補酵素再生酵素コードする塩基配列とを、同一又は異なる発現ベクターに組み込んだ一又は複数の組換えベクターを、同一宿主に導入して形成される形質転換体である請求の範囲第１項記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
  3. 形質転換体が、Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、過酸化水素分解酵素をコードする塩基配列とを、同一又は異なる発現ベクターに組み込んだ一又は複数の組換えベクターを、同一宿主に導入して形成される形質転換体である請求の範囲第１項又は第２項記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
  4. Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素が、Ｄ−アミノ酸酸化酵素及び／又はＤ−アミノ酸脱水素酵素である請求の範囲第１項〜第３項のいずれかの項に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
  5. Ｄ−アミノ酸酸化酵素が、キャンディダ・ボイディニ（Candida boidinii）、トリゴノプシス・バリアビリス（Trigonopsis variabilis）由、及びシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）から選択される少なくとも一の微生物由来のＤ−アミノ酸酸化酵素である請求の範囲第４項記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
  6. Ｄ−アミノ酸脱水素酵素が、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)由来のＤ−アミノ酸脱水素酵素である請求の範囲第４項記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
  7. ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素が、Ｌ−アミノ酸脱水素酵素及び／又はＬ−アミノ酸アミノ基転移酵素である請求の範囲第１項〜第３項のいずれかの項に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
  8. Ｌ−アミノ酸脱水素酵素が、サーモアクチノマイセス・インターメディウス（Thermoactinomyces intermedius）由来フェニルアラニン脱水素酵素、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス（Geobacillus stearothermophilus）由来アラニン脱水素酵素、バチルス・サーモカテニュラタス（Bacillus thermocatenulatus）由来アラニン脱水素酵素、バチルス・スフェリカス（Bacillus sphearicus）由来アラニン脱水素酵素、シェワネラ・スピーシーズ（Shewanella species）由来アラニン脱水素酵素、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス（Geobacillus stearothermophilus）由来ロイシン脱水素酵素、及びバチルス・スフェリカス（Bacillus sphaericus）由来ロイシン脱水素酵素から選択される少なくとも１つの微生物由来のＬ−アミノ酸脱水素酵素である請求の範囲第７項記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
  9. 補酵素再生酵素がギ酸脱水素酵素である請求の範囲第２項記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
  10. ギ酸脱水素酵素が、マイコバクテリウム・バッカエ（Mycobacterium vaccae）由来ギ酸脱水素酵素である請求の範囲第９項記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
  11. 過酸化水素分解酵素がカタラーゼであることを特徴とする請求の範囲第３項記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
  12. カタラーゼがエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)由来のカタラーゼであることを特徴とする請求の範囲第１１項記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
  13. Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素がＤ−アミノ酸酸化酵素であり、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素がＬ−アミノ酸脱水素酵素であり、補酵素再生酵素がギ酸脱水素酵素であり、過酸化水素分解酵素がカタラーゼである請求の範囲第２項又は第３項記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
  14. Ｄ−アミノ酸酸化酵素がキャンディダ・ボイディニ由来であり、Ｌ−アミノ酸脱水素酵素がサーモアクチノマイセス・インターメディウス由来フェニルアラニン脱水素酵素であり、ギ酸脱水素酵素がマイコバクテリウム・バッカエ由来であり、カタラーゼがエシェリヒア・コリ由来である請求の範囲第１３項記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
  15. Ｌ−アミノ酸がＬ−ノルバリンである請求の範囲第１項〜第１４項の何れかの項に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
  16. Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、補酵素再生酵素をコードする塩基配列と、過酸化水素分解酵素をコードする塩基配列とが同一又は異なる発現ベクターに組み込まれた一又は複数の組換えベクターを、同一宿主に導入して形成される形質転換体。
  17. Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素がＤ−アミノ酸酸化酵素であり、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素がＬ−アミノ酸脱水素酵素であり、補酵素再生酵素がギ酸脱水素酵素であり、過酸化水素分解酵素がカタラーゼである請求の範囲第１６項記載の形質転換体。
  18. Ｄ−アミノ酸酸化酵素がキャンディダ・ボイディニ由来であり、Ｌ−アミノ酸脱水素酵素がサーモアクチノマイセス・インターメディウス由来フェニルアラニン脱水素酵素であり、ギ酸脱水素酵素がマイコバクテリウム・バッカエ由来であり、カタラーゼがエシェリヒア・コリ由来である請求の範囲第１７項記載の形質転換体。
  19. Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素をコードする塩基配列と、補酵素再生酵素をコードする塩基配列と、過酸化水素分解酵素をコードする塩基配列とが同一の発現ベクターに組込まれた組換えベクター。
  20. Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する酵素がＤ−アミノ酸酸化酵素であり、ケト酸をＬ−アミノ酸に変換する酵素がＬ−アミノ酸脱水素酵素であり、補酵素再生酵素がギ酸脱水素酵素であり、過酸化水素分解酵素がカタラーゼである請求の範囲第１９項記載の組換えベクター。
  21. Ｄ−アミノ酸酸化酵素がキャンディダ・ボイディニ由来であり、Ｌ−アミノ酸脱水素酵素がサーモアクチノマイセス・インターメディウス由来フェニルアラニン脱水素酵素であり、ギ酸脱水素酵素がマイコバクテリウム・バッカエ由来であり、カタラーゼがエシェリヒア・コリ由来である請求の範囲第２０項記載の組換えベクター。
  22. アミノ酸の鏡像異性体混合物からＬ−アミノ酸を酵素的に生成するＬ−アミノ酸の製造方法であって、少なくともＤ−アミノ酸をケト酸に酸化する酵素及び過酸化水素分解酵素を共発現する形質転換体又はその処理物を用い、主にＤ−アミノ酸を酸化する酸化工程と、ケト酸からＬ−アミノ酸を生成する酵素及び必要に応じて補酵素再生酵素を共発現する形質転換体又はその処理物を用い、主にケト酸からＬ−アミノ酸を合成する還元工程の、異なる２つ以上の反応工程を併せ持つことを特徴とするＬ−アミノ酸の製造方法。
  23. 請求の範囲第１６項〜第１８項の何れかの項に記載の形質転換体を用いる請求の範囲第２２記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
  24. 酸化工程と還元工程とを異なる反応条件下で行う請求の範囲第２２項又は第２３項記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
  25. 酸化工程を酸素含有気体の通気条件下で行い、還元工程を酸素含有気体を通気しないか又は酸素含有気体を酸化工程時より低い通気量で通気する条件下で行う請求の範囲第２４項記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
  26. 酸化工程における酸素含有気体の通気量が、反応液に対して毎分１容量％以上であり、還元工程における酸素含有気体の通気量が、反応液に対して毎分１０容量％未満である請求の範囲第２５項記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
  27. 酸化工程における酸素含有気体の通気量が、反応液に対して毎分２容量％以上であり、還元工程における酸素含有気体の通気量が、反応液に対して毎分２容量％未満である項２５項記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
  28. 酸化工程における酸素含有気体の通気量が、反応液に対して毎分５容量％以上であり、還元工程における酸素含有気体の通気量が、反応液に対して毎分５容量％未満である請求の範囲第２５項記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
  29. 酸化工程における酸素含有気体の通気量が、反応液に対して毎分１容量％以上であり、還元工程において酸素含有気体を実質的に通気しない請求の範囲第２５項記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
  30. 酸化工程における反応液のｐＨより、還元工程における反応液のｐＨを低い値に調整する請求の範囲第２４記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
  31. 酸化工程における反応液のｐＨを７．０〜９．５に調整し、還元工程における反応液のｐＨを６．０〜８．５であって酸化工程におけるｐＨより低い値に調整する請求の範囲第３０記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
  32. 酸化工程における反応液のｐＨを７．５〜９．０に調整し、還元工程における反応液のｐＨを６．５〜８．０であって酸化工程におけるｐＨより低い値に調整する請求の範囲第３０項記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
  33. Ｄ−アミノ酸をケト酸に変換する反応のｐＨ調整をギ酸又はその塩を用いて行う請求の範囲第９項、第１０項、第１３項〜第１５項、及び第２２項〜第３２項の何れかの項に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
  34. 酸化工程から還元工程へ移行前又は移行後に、請求の範囲第１６項〜第１８項の何れかの項に記載の形質転換体又はその処理物を反応液に付加的に添加する請求の範囲第２４項記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
  35. 原料アミノ酸鏡像異性体混合物に対して０．２当量以上のギ酸イオン及び／又はアンモニウムイオンを含む反応液を用いる請求の範囲第１項〜第１５項及び請求の範囲第２２項〜第３４項の何れかの項に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
JP2007520078A 2005-06-09 2006-06-02 Ｌ−アミノ酸の製造方法 Withdrawn JPWO2006132145A1 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005169919 2005-06-09
JP2005169919 2005-06-09
PCT/JP2006/311081 WO2006132145A1 (ja) 2005-06-09 2006-06-02 Ｌ－アミノ酸の製造方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPWO2006132145A1 true JPWO2006132145A1 (ja) 2009-01-08

Family

ID=37498345

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2007520078A Withdrawn JPWO2006132145A1 (ja) 2005-06-09 2006-06-02 Ｌ−アミノ酸の製造方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20090209012A1 (ja)
EP (1) EP1900821A4 (ja)
JP (1) JPWO2006132145A1 (ja)
CN (1) CN101194020A (ja)
WO (1) WO2006132145A1 (ja)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010067578A1 (ja) * 2008-12-09 2010-06-17 株式会社カネカ 新規なアミノ酸脱水素酵素、およびｌ－アミノ酸、２－オキソ酸、又はｄ－アミノ酸の製造方法
CN102174632A (zh) * 2009-05-19 2011-09-07 重庆邮电大学 一种非天然l-氨基酸的生物催化去消旋化制备方法
CN102686719A (zh) 2009-10-30 2012-09-19 株式会社大赛璐 具有1,3-丁二醇生产功能的基因重组微生物及其应用
JP2014036576A (ja) 2010-12-10 2014-02-27 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
WO2014092496A1 (ko) * 2012-12-13 2014-06-19 연세대학교 산학협력단 탈라세믹화를 이용한 광학 활성 아민 화합물의 제조방법
CN104557911B (zh) * 2013-10-17 2016-08-31 苏州同力生物医药有限公司 一种左旋吡喹酮的制备方法
SG11201608272RA (en) * 2014-04-30 2016-11-29 Evonik Degussa Gmbh Method for producing l-amino acids using an alkaliphilic bacteria
CN104152498A (zh) * 2014-07-31 2014-11-19 洛阳华荣生物技术有限公司 一种酶法生产α-酮戊二酸的方法
CN109971802B (zh) * 2017-12-28 2023-04-07 苏州同力生物医药有限公司 一种酶法拆分制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸及其衍生物的方法
CN110317849B (zh) * 2018-03-30 2020-12-08 浙江大学 一种制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸及其衍生物的方法
CN111254181B (zh) * 2018-11-30 2023-06-06 苏州同力生物医药有限公司 一种化学酶法制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的方法
CN114196642B (zh) * 2021-11-10 2023-12-05 浙江大学杭州国际科创中心 谷氨酸脱氢酶变体及其在制备l-氨基酸中的应用
CN113956154A (zh) * 2021-11-15 2022-01-21 长沙贝塔医药科技有限公司 D-乳酸-14c及制备方法和应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5316943A (en) * 1988-06-14 1994-05-31 Kidman Gene E Racemic conversion of using a transaminase
JPH1023896A (ja) * 1996-05-07 1998-01-27 Unitika Ltd 組換えプラスミド、それにより形質転換された大腸菌、その培養物及びそれを用いたアミノ酸又はその誘導体の製造方法
DE102004008445A1 (de) * 2004-02-19 2005-09-08 Degussa Ag Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren aus D-Aminosäuren

Also Published As

Publication number Publication date
CN101194020A (zh) 2008-06-04
EP1900821A4 (en) 2011-12-21
EP1900821A1 (en) 2008-03-19
US20090209012A1 (en) 2009-08-20
WO2006132145A1 (ja) 2006-12-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPWO2006132145A1 (ja) Ｌ−アミノ酸の製造方法
JP4651896B2 (ja) （ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素、該酵素の製造方法、該酵素をコードするｄｎａおよびこれを利用したアルコールの製造方法
JP5291934B2 (ja) Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、およびｌ−アミノ酸、２−オキソ酸、又は環状イミンの製造方法。
WO2010024445A1 (ja) 光学活性なアミン誘導体を製造するための方法
US7452704B2 (en) Dehydrogenase and a gene encoding the same
WO2007119575A1 (en) Novel aldolase and production process of 4-hydroxy-l-isoleucine
US9267116B2 (en) Amino acid dehydrogenase, and process for producing L-amino acid, 2-oxo acid or D-amino acid
EP1188826B1 (en) 5-substituted hydantoin racemase, DNA coding for the same, and process for producing optically active amino acids
JP4693301B2 (ja) マイコバクテリウムバッカエ由来ギ酸脱水素酵素の変異体、およびその用途
JP4590981B2 (ja) 光学活性環状アミノ酸の製造方法
JP4154182B2 (ja) α−ケト酸還元酵素、その製造方法、およびこれを利用した光学活性α−ヒドロキシ酸の製造方法
US6887697B2 (en) D-aminoacylase and gene encoding the same
JP5005293B2 (ja) Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、およびｌ−アミノ酸、２−オキソ酸、又は環状イミンの製造方法。
JP4231709B2 (ja) 新規デヒドロゲナーゼ及びそれをコードする遺伝子
JP4402446B2 (ja) Ｄ−アミノアシラーゼの変異体
JP7386616B2 (ja) Ｌ体環状アミノ酸の製造方法
JP2006246815A (ja) Ｌ−フェニルセリン脱水素酵素の製造法
WO2011001889A1 (ja) 光学活性α－アミノ酸のラセミ化方法
JP2011024572A (ja) 光学活性アミノ酸の製造法

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20090316

A761 Written withdrawal of application

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761

Effective date: 20110601