CN102686719A - 具有1,3-丁二醇生产功能的基因重组微生物及其应用 - Google Patents
具有1,3-丁二醇生产功能的基因重组微生物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明的目的是提供有效生产光学活性的1,3-丁二醇的基因重组微生物，所述1,3-丁二醇作为医药的合成原料等有利用价值，以及提供使用基因重组微生物有效生产光学活性的1,3-丁二醇的方法。本发明人等为了解决上述问题，进行了深入的研究，结果成功的生产了这样的基因重组微生物，其催化由式1代表的还原性反应的酶活性得到增强，并生产由式2代表的二醇化合物。
(式中R代表C1-3烷基或氢)
(式中R代表C1-3烷基或氢)
Description
技术领域
本发明涉及赋予了1,3-丁二醇生产功能的基因重组微生物，和使用所述微生物生产1,3-丁二醇的方法。
背景领域
1,3-丁二醇可用作具有多种用途的化学品，例如保湿剂、树脂原料、表面活性剂、吸湿剂和溶剂等，以及作为它们的原材料而具有利用价值。它的光学活性分子(R)-1,3-丁二醇和(S)-1,3-丁二醇也可用作医药、农药等的合成原料而具有利用价值。
常规上，1,3-丁二醇是通过以化石资源石油为基础通过化学方法制造的乙醛作为原料，形成丁间醇醛后，进行氢化的化学方法制造的。另一方面，可以通过专利文件1展示的方法生产光学活性的1,3-丁二醇，在专利文件1展示的方法中通过使能够优先同化其(S)-或(R)-异构体的微生物(例如，近平滑假丝酵母(Candida palapsilosis)或乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)等)作用于从化石资源化学合成的外消旋1,3-丁二醇，然后收集剩余的对映体，来生产(R)-或(S)-1,3-丁二醇。
此外，在专利文件2展示的方法中，通过使微生物(例如，乳酸克鲁维酵母或近平滑假丝酵母等)作用于从化石资源化学合成的4-羟基-2-丁酮，利用微生物的不对称还原活性，生产(R)-或(S)-1,3-丁二醇。
此外，还有在一个或两个步骤中使用立体选择性的氧化还原酶或大量表达此类酶的基因重组菌生产光学活性的1,3-丁二醇的方法。此类方法包括：使用地霉属(Geotricum sp.)来源的(S)-特异性的仲醇脱氢酶，由外消旋体生产(R)-1,3-丁二醇(非专利文件1)；使用表达近平滑假丝酵母来源的(S)-特异性的仲醇脱氢酶的基因重组大肠杆菌(Escherichia coli)，由外消旋体生产(R)-1,3-丁二醇(专利文件3)；使用表达乳酸克鲁维酵母来源的(R)-特异性的2,3-丁二醇脱氢酶的基因重组大肠杆菌，由4-羟基-2-丁酮生产(R)-1,3-丁二醇，或由外消旋体生产(S)-1,3-丁二醇(专利文件4)。然而，所有这些方法都使用需要非天然化合物作为底物，必须化学合成底物。
同时，在非专利文件2中，在含有木薯废弃物的培养基中培养Geotricumfragrans的培养液中检测到1,3-丁二醇。然而，1,3-丁二醇是作为一种挥发性的物质而被发现，其目的不在于生产1,3-丁二醇。
在近年，出于化石资源耗尽和全球变暖的观点，对于建立使用生物量(biomass)(植物资源)来源的原料作为可再生资源的化学品生产体系具有日益增长的社会需求。
例如，已知可以从一种生物量(biomass)来源的材料——葡萄糖，利用丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)所示的丙酮-丁醇发酵通路，通过CoA衍生物生产溶剂。对于该物种的典型菌株，丙酮丁醇梭菌ATCC824，已测序了其完整的基因组DNA序列，并已经揭示了丙酮-丁醇发酵细菌的特征性溶剂生产基因adhE(具有EC1.2.1.10和EC1.1.1.1两功能的醛-醇脱氢酶)(非专利文件3)。只有极少数关于丙酮丁醇梭菌来源的adhE的基因产物(具有EC1.2.1.10和EC1.1.1.1两功能的醛-醇脱氢酶)的酶学报告，并且在非专利文件4中，仅对使用丙酮丁醇梭菌DSM1732的无细胞提取液，以丁醇或丁醛作为底物，实施了对丁醇脱氢酶活性的评估，和使用丁醛或丁酰-CoA作为底物，实施了对丁醛脱氢酶活性的评估。adhE基因产物从未被用于除非专利文件5所示的生产1-丁醇以外的其他目的。
没有关于从生物量来源的原料生产1,3-丁二醇的报道，需要从可再生的资源(如生物量等)生产1,3-丁二醇的方法。
现有技术文件
专利文件
专利文件1：日本专利申请公开出版号：(JP-A)H02-195897(未审查，已出版的日本专利申请)
专利文件2：JP-A(公开)H02-31684
专利文件3：JP-A(公开)2000-197485
专利文件4：JP-A(公开)2002-345479
非专利文件
非专利文件1：Biosci.Biotech.Biochem.,1996,60(7),1191-1192
非专利文件2：Proc.Biochem.,2003,39,411-414
非专利文件3：J.Bacteriol.,2001,183(16),4823-4838
非专利文件4：Appl.Microbiol.Biotechnol.,1987,26,268-272
非专利文件5：Metabol.Engineer.,2008,10,305-311
发明概述
发明要解决的问题
本发明的目标是提供能够以生物量(植物资源)的可再生资源作为原料生产1,3-丁二醇的微生物。本发明的另一个目标是提供可以使用具有目的功能的微生物生产1,3-丁二醇的方法。
解决问题的方法
作为深入研究开发从可再生的资源即生物量作为原料生产1,3-丁二醇的方法的结果，本发明人发现丙酮丁醇梭菌来源的AdhE(CaAdhE)不仅通过NADH依赖性的方式还原乙酰-CoA和丁酰-CoA产生乙醛和丁醛，而且令人惊讶的通过还原在3位具有羟基的3-羟丁酰-CoA，产生3-羟基丁醛。本发明人还发现，CaAdhE具有以NADH依赖性的方式还原3-羟基丁醛的活性，从而催化产生1,3-丁二醇的反应。通过以葡萄糖作为碳源，培养能够共表达CaAdhE、β-酮硫解酶(β-ketothiolase)(催化从2分子的乙酰-CoA生成乙酰乙酰-CoA的反应)和3-羟丁酰-CoA脱氢酶(催化以NAD(P)H-依赖性的方式，还原乙酰乙酰-CoA的3-羰基生成3-羟丁酰-CoA的反应)的基因重组大肠杆菌，成功的实现了有效生产1,3-丁二醇。
基于上述发现，本发明人利用微生物所具有的代谢产物即乙酰-CoA，通过使在含上述酶的微生物中发生下述式8表示的反应，成功的生产了1,3-丁二醇，从而完成了本发明。
即本发明提供生产1,3-丁二醇的微生物。本发明还提供使用此类微生物有效生产1,3-丁二醇的方法。
[式8]
更具体而言，本发明提供以下[1]~[24]：
[1]下述(1)的酶活性得到增强的基因重组微生物，所述基因重组微生物由发酵底物生产式2代表的1,3-烷基二醇。
(1)按照式1所示，使用NADH和/或NADPH作为辅酶，通过还原3-羟基酰基-CoA，来催化生产3-羟基烷基醛的酶活性，
[式1]
(式中R代表C1-3烷基或氢；CoA代表辅酶A)
[式2]
(式中R代表C1-3烷基或氢)。
[2][1]的基因重组微生物，其中在[1]中所述的式1和2中的R均是甲基，由发酵底物生产1,3-丁二醇。
[3][1]或[2]的基因重组微生物，其中[2]所述的由发酵底物生产的1,3-丁二醇是(R)或(S)光学活性1,3-丁二醇。
[4][1]至[3]中任一项的基因重组微生物，其中催化[1](1)中所述的式1代表的反应的酶在国际酶学分类中分类为EC 1.2.1.10。
[5][1]至[4]中任一项的基因重组微生物，其中催化[1](1)中所述的式1代表的反应的酶是下述(a)~下述(e)中任一项所述的酶：
(a)具有SEQ ID NO:1、65或67的氨基酸序列的蛋白质；
(b)具有在SEQ ID NO:1、65或67的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列的酶；
(c)具有由SEQ ID NO:2、66或68的核苷酸序列编码的氨基酸序列的酶；
(d)具有由在严格的条件下与包括SEQ ID NO:2、66或68的核苷酸序列的DNA杂交的DNA编码的氨基酸序列的酶；和
(e)与SEQ ID NO:1、65或67的氨基酸序列具有85%或更高的同一性的蛋白质。
[6][1]至[5]中任一项的基因重组微生物，其是除[1]所述的下述(1)的酶活性外，下述(2)的酶活性也得到增强的基因重组微生物，所述基因重组微生物由发酵底物生产式2代表的1,3-烷基二醇。
(1)按照式1所示，使用NADH和/或NADPH作为辅酶，通过还原3-羟基酰基-CoA，来催化生产3-羟基烷基醛的酶活性；和
(2)按照式3所示，使用NADH和/或NADPH作为辅酶，通过还原3-羟基烷基醛，来催化生产式2代表的1,3-烷基二醇的酶活性(式3没有显示两个反应，而仅显示了由醛生产醇)：
[式1]
(式中R代表C1-3烷基或氢；CoA代表辅酶A)
[式2]
(式中R代表C1-3烷基或氢)
[式3]
(式中R代表C1-3烷基或氢)。
[7][6]的基因重组微生物，其中在[6]中所述的式1至3中的R均是甲基，由发酵底物生产1,3-丁二醇。
[8][6]或[7]的基因重组微生物，其中[7]中所述的由发酵底物生产的1,3-丁二醇是(R)或(S)光学活性1,3-丁二醇。
[9][6]至[8]中任一项的基因重组微生物，其中催化[6]中所述的式3代表的反应的酶是下述(a)~下述(e)中任一项所述的酶：
(a)具有SEQ ID NO:3、5或7的氨基酸序列的蛋白质；
(b)具有在SEQ ID NO:3、5或7的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列的酶；
(c)具有由SEQ ID NO:4、6或8的核苷酸序列编码的氨基酸序列的酶；
(d)具有由在严格的条件下与包括SEQ ID NO:4、6或8的核苷酸序列的DNA杂交的DNA编码的氨基酸序列的酶；和
(e)与SEQ ID NO:3、5或7的氨基酸序列具有85%或更高的同一性的酶。
[10][1]至[5]中任一项的基因重组微生物，其是除[1]所述的下述(1)的酶活性外，下述(3)的酶活性也得到增强的基因重组微生物，所述基因重组微生物由发酵底物生产式2代表的1,3-烷基二醇。
(1)按照式1所示，使用NADH和/或NADPH作为辅酶，通过还原3-羟基酰基-CoA，来催化生产3-羟基烷基醛的酶活性；和
(3)按照式4所示，以NADH和/或NADPH依赖性的方式还原3-氧代酰基-CoA，生产3-羟基酰基-CoA的酶活性，
[式1]
(式中R代表C1-3烷基或氢；CoA代表辅酶A)
[式2]
(式中R代表C1-3烷基或氢)
[式4]
(式中R代表C1-3烷基或氢；CoA代表辅酶A)。
[11][10]的基因重组微生物，其中在[10]中所述的式1和2中的R均是甲基，由发酵底物生产式5代表的(R)-1,3-丁二醇。
[式5]
[12][10]或[11]的基因重组微生物，其中催化[10]中所述的式4代表的反应的酶是R型特异性还原酶，且是下述(a)~下述(e)中任一项所述的酶：
(a)具有SEQ ID NO:9、11、13、15或17的氨基酸序列的蛋白质；
(b)具有在SEQ ID NO:9、11、13、15或17的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列的酶；
(c)具有由SEQ ID NO:10、12、14、16或18的核苷酸序列编码的氨基酸序列的酶；
(d)具有由在严格的条件下与包括SEQ ID NO:10、12、14、16或18的核苷酸序列的DNA杂交的DNA编码的氨基酸序列的酶；和
(e)与SEQ ID NO:9、11、13、15或17的氨基酸序列具有85%或更高的同一性的酶。
[13][10]的基因重组微生物，其中[10]中所述的式1和2中的R均是甲基，由发酵底物生产式6代表的(S)-1,3-丁二醇。
[式6]
[14][10]或[13]的基因重组微生物，其中催化[10]中所述的式4代表的反应的酶是S型特异性的还原酶，且是下述(a)~下述(e)中任一项所述的酶：
(a)具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的蛋白质；
(b)具有在SEQ ID NO:19的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列的酶；
(c)具有由SEQ ID NO:20的核苷酸序列编码的氨基酸序列的酶；
(d)具有由在严格的条件下与包括SEQ ID NO:20的核苷酸序列的DNA杂交的DNA编码的氨基酸序列的酶；和
(e)与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有85%或更高的同一性的酶。
[15][1]至[5]中任一项的基因重组微生物，其是除[1]所述的下述(1)的酶活性外，下述(4)的酶活性也得到增强的基因重组微生物，所述基因重组微生物由发酵底物生产式2代表的(R)或(S)光学活性1,3-丁二醇。
(1)按照式1所示，使用NADH和/或NADPH作为辅酶，通过还原β-羟丁酰-CoA，催化生产3-羟基丁醛的酶活性；和
(4)如式7所示，催化由2分子的乙酰-CoA生产乙酰乙酰-CoA生产的的β-酮硫解酶的活性，
[式1]
(式中R代表甲基；CoA代表辅酶A)
[式2]
(式中R代表甲基)
[式7]
(式中CoA代表辅酶A)。
[16][15]的基因重组微生物，其中催化[15]中所述的式7代表的反应的酶是下述(a)~下述(e)中任一项所述的酶：
(a)具有SEQ ID NO:21、23或25的氨基酸序列的蛋白质；
(b)具有在SEQ ID NO:21、23或25的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列的酶；
(c)具有由SEQ ID NO:22、24或26的核苷酸序列编码的氨基酸序列的酶；
(d)具有由在严格的条件下与包括SEQ ID NO:22、24或26的核苷酸序列的DNA杂交的DNA编码的氨基酸序列的酶；和
(e)与SEQ ID NO:21、23或25的氨基酸序列具有85%或更高的同一性的酶。
[17][1]至[5]中任一项的基因重组微生物，其是除[1]所述的下述(1)的酶活性外，下述(2)至(4)的酶活性也得到增强的基因重组微生物，所述基因重组微生物由发酵底物生产式2代表的(R)或(S)光学活性1,3-丁二醇。
(1)按照式1所示，使用NADH和/或NADPH作为辅酶，通过还原β-羟丁酰-CoA，催化生产3-羟基丁醛的酶活性；
(2)按照式3所示，使用NADH和/或NADPH作为辅酶，通过还原3-羟基丁醛，催化生产式2代表的1,3-丁二醇的酶活性(式3没有显示两个反应，而仅显示了由醛生产醇)；
(3)按照式4所示，以NADH和/或NADPH依赖性的方式，通过还原乙酰乙酰-CoA，生产3-羟丁酰-CoA的酶活性；和
(4)如式7所示，催化由2分子的乙酰-CoA生产乙酰乙酰-CoA的β-酮硫解酶的活性；
[式1]
(式中R代表甲基；CoA代表辅酶A)
[式2]
(式中R代表甲基)
[式3]
(式中R代表甲基)
[式4]
(式中R代表甲基；CoA代表辅酶A)
[式7]
(式中CoA代表辅酶A)；
[18][1]至[17]中任一项的基因重组微生物，其中宿主细胞是大肠杆菌；
[19]生产式2代表的二醇化合物的方法，其包括：
将发酵底物与至少一种活性物质接触的步骤，所述活性物质选自[1]至[18]中任一项的基因重组微生物的培养物、菌体、及其处理物；和收集式2代表的1,3-烷基二醇的步骤，
[式2]
(式中R代表C1-3烷基或氢)。
[20][19]的生产二醇化合物的方法，其中所述生产的二醇化合物是式5代表的(R)-1,3-丁二醇。
[式5]
[21][19]的生产二醇化合物的方法，其中所述生产的二醇化合物是式6代表的(S)-1,3-丁二醇。
[22][19]至[21]中任一项的生产二醇化合物的方法，其中所述发酵底物选自糖和甘油。
[23][22]的生产二醇化合物的方法，其中所述发酵底物选自葡萄糖、乳糖、木糖、蔗糖和甘油。
[24][19]至[23]中任一项的生产二醇化合物的方法，其中分别进行培养基因重组微生物的步骤和生产二醇化合物的步骤。
附图简介
图1显示了含有完整的ReTHL基因的质粒制作。
图2显示了含有完整的ZrTHL基因的质粒制作。
图3显示了含有完整的EcTHL基因的质粒制作。
图4显示了含有完整的ReTHL和ReAR1基因的质粒制作。
图5显示了含有完整的ReTHL和ZrAR1基因的质粒制作。
图6显示了含有完整的ReTHL和SvKR1基因的质粒制作。
图7显示了含有完整的ReTHL和BstKR1基因的质粒制作。
图8显示了含有完整的ReTHL和CaHBD基因的质粒制作。
图9显示了含有完整的ReTHL和PfODH基因的质粒制作。
图10显示了含有完整的CaAdhE基因的质粒制作。
图11显示了含有完整的TpAdhE基因的质粒制作。
图12显示了含有完整的PfALD基因的质粒制作。
图13显示了含有完整的ReTHL、ReAR1和CaAdhE基因的质粒制作。
图14显示了含有完整的CaBDHB基因的质粒制作。
图15显示了含有完整的ReTHL、ReAR1、CaAdhE和CaBDHB基因的质粒制作。
具体实施方式
本发明涉及下述(1)的酶活性得到增强的基因重组微生物，该基因重组微生物由发酵底物生产式2代表的二醇化合物(1,3-烷基二醇)。
(1)按照式1所示，使用NADH和/或NADPH作为辅酶，通过还原3-羟基酰基-CoA，催化生产3-羟基烷基醛的酶活性，
[式1]
[式2]
在本发明中，二醇化合物优选经过式1代表的还原反应，以式2代表的二醇化合物形式生产。在本发明中，式1中的R优选是C1-3烷基(甲基、乙基、丙基或异丙基)或氢。在式1中，CoA代表辅酶A。
本发明中生产的优选二醇化合物可以列举：在上式2的化合物中，例如R是C1-3烷基(甲基、乙基、丙基或异丙基)或氢的化合物。更具体而言，本发明中生产的二醇化合物的优选实例包括1,3-丁二醇(其中，式1和2中的R均是甲基)。本发明中生产的1,3-丁二醇的光学活性没有特别的限制，R型和S型光学活性的1,3-丁二醇((R)-和(S)-1,3-丁二醇)都包括在本发明生产的1,3-丁二醇中。
在本发明中，按照式1所示，使用NADH和/或NADPH作为辅酶，通过还原3-羟丁酰-CoA，催化生产3-羟基丁醛的酶包括分类为EC1.2.1.10的酶，具有由生物化学和分子生物学国际联合会(IUBMB)给出的系统名“乙醛：NAD+氧化还原酶(Co-A乙酰化)”，其催化醛+CoA+NAD+=酰基-CoA+NADH+H+的反应(http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/)。EC编号是由IUBMB的酶学委员会定义的，根据反应形式系统性分类酶的四个数字组成的编号。具体而言，上述酶包括在丁醇发酵路径的微生物中，丁醇的生物合成路径中的以NADH或NADPH依赖性的还原丁酰-CoA催化丁醛生产的酶(例如，丁醛脱氢酶)。编码这些酶或催化相似反应的酶的基因一般被称为adhE。
更具体而言，上述酶包括梭菌属(Clostridium)细菌来源的adhE基因产物，例如丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、糖丁酸梭菌(Clostridium saccharoacetobutylicum)和Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum等。
具有EC1.2.1.10的功能的优选的酶是具有根据UniProt推荐名称“醛-醇脱氢酶(aldehyde-alcohol dehydrogenase)”的酶(http://www.uniprot.org/)，包括催化由酰基-CoA生产醛的反应和由醛生产醇的反应的双功能酶，或仅催化由酰基-CoA生产醛的反应的酶。具体而言，丙酮丁醇梭菌来源的adhE1基因产物或adhE基因产物可用于本目的。还可以使用大肠杆菌、乳酸菌等具有的adhE基因或mhpF基因。具体而言，可以使用大肠杆菌来源的adhE基因、mhpF基因、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)来源的adhE基因产物。除上述基因外，适合用于本发明的基因还可以选自基因组DNA已被测序的微生物。具体而言，可以恰当的使用来自Thermoanaerobacterpseudethanolicus、费氏丙酸杆菌费氏亚种(Propionibacterium freudenreichiisubsp.freudenreichii)的基因。
在本发明中，具有丁醛脱氢酶活性的酶包括：
(a)具有SEQ ID NO:1、65或67的氨基酸序列的蛋白质；
(b)具有在SEQ ID NO:1、65或67的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加了一个或多个(2个以上，优选2~20个，更优选2~5个)氨基酸的氨基酸序列的酶；
(c)具有由SEQ ID NO:2、66或68的核苷酸序列编码的氨基酸序列的酶；
(d)具有由在严格的条件下与包括SEQ ID NO:2、66或68的核苷酸序列的DNA杂交的DNA编码的氨基酸序列的酶；和
(e)与SEQ ID NO:1、65或67的氨基酸序列具有85%或更高的同一性的蛋白质。
在本发明中，“包括某序列标识号(SEQ ID NO)的氨基酸序列的酶”的同源物可以改写为“在某序列标识号的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加了1个或多个(2个以上，优选2至20个，更优选2至5个)氨基酸的氨基酸序列的酶”。该同源物指与由所述序列标识号的氨基酸序列组成的酶功能上等价的蛋白质。在本发明中，“功能上等价”意指与本文所述的各个酶的酶活性(催化反应、化学反应等)具有相同功能。
在某序列标识号的氨基酸序列中，可以突变例如100个或更少的氨基酸残基，通常50个或更少的氨基酸残基，优选30个或更少的氨基酸残基，更优选15个或更少的氨基酸残基，甚至更优选10个或更少的氨基酸残基，或者5个或更少的氨基酸残基。一般而言，为了保持蛋白质的功能，进行取代的氨基酸优选与取代前的氨基酸具有类似性质的氨基酸。此类氨基酸取代被称为保守性取代。例如，Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe和Trp都分类为非极性氨基酸，因此具有相似的特性。不带电荷的氨基酸包括Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn和Gln。酸性氨基酸包括Asp和Glu。碱性氨基酸包括Lys、Arg和His。每一组内的氨基酸取代是可接受的。
本领域技术人员可以获得编码各个酶的同源物的多核苷酸，通过使用位点特异性诱变(Nucleic Acid Res.10，第6487页(1982),Methods inEnzymol.100，第448页(1983),Molecular Cloning第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989),PCR A Practical Approach IRL Press，第200页(1991))等方法，向由本文公开的核苷酸序列组成的各酶的DNA中恰当的导入取代、缺失、插入和/或添加来获得。可以在宿主中导入和表达编码各个酶的同源物的多核苷酸以获得各酶的同源物。
此外，在本发明中，各个酶的同源物指与对应于各酶的SEQ ID NO的氨基酸序列具有至少50%，优选至少70%，更优选80%，更优选85%，更优选90%，甚至更优选95%或更高的同一性(例如，95%、96%、97%、98%或99%或更高)的蛋白质。可以进行蛋白质同源性检索，例如以蛋白质的氨基酸序列数据库例如SWISS-PROT、PIR和DAD等、DNA序列数据库例如DDBJ、EMBL和Genbank等、以及基于DNA序列的推断的氨基酸序列数据库为对象，使用例如BLAST和FASTA等程序，通过因特网进行。
本文描述的各个酶都可以与额外的氨基酸序列连接，只要它保留了与该酶活性功能上等价的活性即可。例如，可以添加组氨酸标签和HA标签等标签序列。可选的，酶可以与另一个蛋白质融合。本发明的各个酶或其同源物可以是片段，只要它保留了与各个酶活性功能上等价的活性即可。
可以通过下文描述的方法分离编码本文描述的各个酶的多核苷酸。例如，可以通过使用基于与各个酶对应的SEQ ID NO的核苷酸序列设计的PCR引物，并使用酶生产菌株的染色体DNA或cDNA文库作为模板，实施PCR来获得本发明的DNA。此外，可以通过使用所获得的DNA片段作为探针，并使用cDNA文库或酶生产菌株的染色体DNA的限制性酶消化物导入噬菌体或质粒等，并转化至大肠杆菌而获得的文库，实施克隆杂交或噬菌斑杂交等来获得各个酶的多核苷酸。
此外，还可以如下获得各个酶的多核苷酸：测序通过PCR获得的DNA片段的核苷酸序列，使用所获得的序列设计用于延伸到已知的DNA外侧的PCR引物，通过恰当的限制性酶消化酶生产菌株的染色体DNA，并使用消化物自身环化获得的DNA作为模板实施反向PCR(Genetics 120,621-623(1988))。可选的，还可以实施RACE(cDNA末端的快速扩增)方法(“PCRExperiment Manual”，第25-33页，HBJ Publication Office)等。
在本发明中，各个酶的多核苷酸包括通过上述方法克隆的基因组DNA或cDNA，以及合成得到的DNA。
通过使用由与各个酶对应的SEQ ID NO的核苷酸序列的互补序列或其部分序列组成的核酸(DNA或RNA)作为探针，对对象核酸实施杂交，在严格条件下洗涤后，验证在探针与对象核酸之间是否存在显著的杂交。使用的探针长度是例如连续的20个或更多的核苷酸，优选25个或更多的核苷酸，更优选30个或更多的核苷酸，更优选40个或更多的核苷酸，更优选80个或更多的核苷酸，更优选100个或更多的核苷酸(例如，与各个酶对应的SEQID NO的核苷酸序列的全长)。如果探针含有与各个酶对应的SEQ ID NO的核苷酸序列或其互补序列之外的不相关的序列(例如载体来源的序列等)，则用作阴性对照，探针以相同的方式仅杂交该序列，并在相同条件下洗涤后，可以验证该探针和对象序列之间没有显著的杂交。可以通过使用硝酸纤维素膜或尼龙膜等的常规方法进行杂交(Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratories;Ausubel,F.M.等人，(1994)Current Protocolsin Molecular Biology,Greene Publishe Associates/John Wiley and Sons,NewYork.NY)。
杂交的严格条件的具体实例是例如，在含有6×SSC、0.5%(w/v)SDS、100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA和5×Denhardt溶液(1×Denhardt溶液含有0.2%聚乙烯吡咯烷酮、0.2%牛血清白蛋白以及0.2%聚蔗糖(Ficoll))的溶液中，在45℃，优选55℃，更优选60℃，甚至更优选65℃下杂交过夜，再在与杂交相同的温度下，在4×SSC和0.5%SDS中进行3次20分钟的杂交后洗涤。更优选的，在与杂交相同的温度下，在4×SSC和0.5%SDS中进行2次20分钟的洗涤，再在2×SSC和0.5%SDS中进行1次20分钟的洗涤，来进行杂交后洗涤。更优选的，在与杂交相同的温度下，在4×SSC和0.5%SDS中进行2次20分钟的洗涤，再在1×SSC和0.5%SDS中进行1次20分钟的洗涤，来进行杂交后洗涤。更优选的，在与杂交相同的温度下，在2×SSC和0.5%SDS中进行1次20分钟洗涤，再在1×SSC和0.5%SDS中进行1次20分钟洗涤，再在0.5×SSC和0.5%SDS中进行1次20分钟的洗涤，来进行杂交后洗涤。更优选的，在与杂交相同的温度下，在2×SSC和0.5%SDS中进行1次20分钟的洗涤，再在1×SSC和0.5%SDS中进行1次20分钟的洗涤，再在0.5×SSC和0.5%SDS中进行1次20分钟的洗涤和接下来在0.1×SSC和0.5%SDS中进行1次20分钟的洗涤，来进行杂交后洗涤。
可以例如如下验证可用于本发明目的的具有EC1.2.1.10的功能的酶的活性。
丁醛脱氢酶(CoA-乙酰化)(BCDH)活性测定(式1代表的酶活性)
在30℃下将100mM Tris-HCl缓冲液(pH 6.5)、70mM氨基脲(pH 6.5)、0.2mM NADH、0.2mM 3-羟丁酰-CoA或丁酰-CoA，以及需要时1mM DTT的混合溶液平衡3分钟，然后添加含BCDH的无细胞提取液，测定伴随酰基-CoA的还原过程中NADH减少的340nm处吸光度的减少。如果目标酶在存在氧的条件下失活，则在厌氧气氛(氮气气氛下)下制备反应溶液和进行反应。1U定义为在这些条件下每分钟催化减少1μmol NADH的酶量。使用由BioRad生产的蛋白质测定试剂盒，并使用牛血清白蛋白作为参照蛋白质，通过染料结合法进行蛋白质定量。
本发明涉及这样的基因重组微生物，所述基因重组微生物中除上述(1)的酶活性外，下述(2)的酶活性也得到增强，所述微生物由发酵底物生产式2代表的1,3-烷基二醇。
(1)按照式1所示，使用NADH和/或NADPH作为辅酶，通过还原3-羟基酰基-CoA，催化生产3-羟基烷基醛的酶活性；和
(2)按照式3所示，使用NADH和/或NADPH作为辅酶，通过还原3-羟基烷基醛，催化生产式2代表的1,3-烷基二醇的酶活性(式3没有显示两个反应，而仅显示了由醛生产醇)：
[式1]
(式中R代表C1-3烷基或氢；CoA代表辅酶A)
[式2]
(式中R代表C1-3烷基或氢)
[式3]
(式中R代表C1-3烷基或氢)。
在本发明中生产的优选的二醇化合物可以列举在上述式2的化合物中，例如R是C1-3烷基(甲基、乙基、丙基或异丙基)或氢的化合物。更具体而言，在本发明中生产的二醇化合物的优选实例包括1,3-丁二醇(在式1至3中R均是甲基)。在本发明中生产的1,3-丁二醇的光学活性没有特殊的限制，1,3-丁二醇的R型和S型((R)-和(S)-1,3-丁二醇)都包括在本发明中生产的1,3-丁二醇内。
在本发明中，按照式3所示、使用NADH和/或NADPH作为辅酶，通过还原3-羟基烷基醛，催化生产式2代表的1,3-烷基二醇的酶包括分类为EC1.1.1.1的酶，具有由生物化学和分子生物学国际联合会(IUBMB)给出的系统名“醇：NAD+氧化还原酶”，并催化醇+NAD+=醛或酮+NADH+H+的反应(http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/)。具体而言，上述酶包括丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)来源的丁醇脱氢酶(butanol dehydrogenase)。
在本发明中，具有丁醇脱氢酶活性的酶包括：
(a)具有SEQ ID NO:3、5或7的氨基酸序列的蛋白质；
(b)具有在SEQ ID NO:3、5或7的的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列的酶；
(c)包括由SEQ ID NO:4、6或8的核苷酸序列编码的氨基酸序列的酶；
(d)具有由在严格的条件下与包括SEQ ID NO:4、6或8的核苷酸序列的DNA杂交的DNA编码的氨基酸序列的酶；和
(e)与SEQ ID NO:3、5或7的氨基酸序列具有85%或更高的同一性的酶。
可以例如如下验证可用于本发明目的的具有EC1.1.1.1的功能的酶的活性。
丁醇脱氢酶(BDH)活性测定(式2代表的酶活性)
在30℃下将50mM MES缓冲液(pH 6.0)、0.2mM NADH、20mM 3-羟基丁醛或丁醛，以及需要时1mM DTT的混合溶液平衡3分钟，然后添加含BDH的无细胞提取液，测量伴随烷基醛还原中的NADH减少的340nm处吸光度的减少。如果目标酶在存在氧的条件下失活，则在厌氧气氛(氮气气氛下)下制备反应溶液和进行反应。1U定义为在每分钟催化减少1μmolNADH的酶量。使用由BioRad生产的蛋白质测定试剂盒，并使用牛血清白蛋白作为参照蛋白质，通过染料结合法进行蛋白质定量。
本发明涉及这样的基因重组微生物，所述基因重组微生物中除上述(1)的酶活性外，下述(3)的酶活性也得到增强，所述微生物由发酵底物生产式2代表的1,3-烷基二醇。
(1)按照式1所示，使用NADH和/或NADPH作为辅酶，通过还原3-羟基酰基-CoA，催化生产3-羟基烷基醛的酶活性；和
(3)按照式4所示，以NADH和/或NADPH依赖性的方式还原3-氧代酰基-CoA，生产3-羟基酰基-CoA的酶活性，
[式1]
(式中R代表C1-3烷基或氢；CoA代表辅酶A)
[式2]
(式中R代表C1-3烷基或氢)
[式4]
(式中R代表C1-3烷基或氢；CoA代表辅酶A)。
在本发明中生产的优选的二醇化合物可以列举上述式2的化合物中例如R是C1-3烷基(甲基、乙基、丙基或异丙基)或氢的化合物。更具体而言，在本发明中生产的二醇化合物的优选实例包括1,3-丁二醇(在式1、2和4中R均是甲基)。在本发明中生产的1,3-丁二醇的光学活性没有特殊的限制，1,3-丁二醇的R型和S型((R)-和(S)-1,3-丁二醇)都包括在本发明中生产的1,3-丁二醇内。
在本发明中，任何能够通过还原乙酰乙酰-CoA的3-羰基而催化生产3-羟丁酰-CoA的反应的酶都可用于式(4)所示的通过还原3-氧代酰基-CoA而生产3-羟基酰基-CoA的反应中(例如，式中R是甲基时，由乙酰乙酰-CoA生产3-羟丁酰-CoA的反应)。优选的，此类酶通常由具有聚(3-羟丁酸)(PHB)合成路径的微生物、或具有丁醇发酵路径的微生物。具有PHB合成路径的微生物包括真养雷氏菌(Ralstonia eutropha)和生枝动胶菌(Zoogloea ramigera)等，此类微生物所具有的乙酰乙酰-CoA还原酶(基因名通常标注为phaB或phbB)是优选酶的实例。具有丁醇发酵路径的微生物包括梭菌属细菌，如上所述称为丙酮-丁醇发酵细菌等，可以列举此类微生物所具有的3-羟丁酰-CoA脱氢酶(其基因名通常被标注为hdb)。此外，从酶的底物特异性的观点出发，还可以使用催化相似反应的酶。例如，可以使用脂肪酸合成路径中的β-酮脂酰-ACP还原酶，具体而言是嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)来源的β-酮脂酰-ACP还原酶(BstKR1)。此外，还可以使用紫红链霉菌(Streptomyces violaceoruber)来源的β-酮脂酰还原酶(SvKR1)，一种聚酮放线紫红素合成路径中的酶。作为其他实例，可使用还原β-酮羧酸或其酯的3-羰基的羰基还原酶。更具体而言，可以使用Pichia finlandica来源的(R)-2-辛醇脱氢酶(PfODH)等。如果这些还原酶具有高的立体异构选择性，则适合用于获得光学活性的1,3-丁二醇。为了获得(R)-1,3-丁二醇，可以使用高度(R)选择性的真养雷氏菌来源的乙酰乙酰-CoA还原酶(ReAR1)、生枝动胶菌来源的乙酰乙酰-CoA还原酶(ZrAR1)、BstKR1、SvKR1和PfODH，更优选ReAR1作为用于生产(R)-1,3-丁二醇的合适的酶。为了获得(S)-1,3-丁二醇，可以使用高度(S)选择性的梭菌属来源的HBD，和更优选丙酮丁醇梭菌来源的3-羟丁酰-CoA脱氢酶(CaHBD)作为用于生产(S)-1,3-丁二醇的合适的酶。这些化合物是可以通过本发明生产的优选的光学活性的醇。
就本发明中通过还原3-氧代酰基-CoA生产3-羟基酰基-CoA(例如，当R是甲基时，由乙酰乙酰-CoA生产3-羟丁酰-CoA的反应)的酶而言，用于生产(R)-1,3-丁二醇作为终产物时优选的酶，可以列举下述(a)~(e)中任一项所述的酶：
(a)具有SEQ ID NO:9、11、13、15或17的氨基酸序列的蛋白质；
(b)具有在SEQ ID NO:9、11、13、15或17的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列的酶；
(c)具有由SEQ ID NO:10、12、14、16或18的核苷酸序列编码的氨基酸序列的酶；
(d)具有由在严格的条件下与包括SEQ ID NO:10、12、14、16或18的核苷酸序列的DNA杂交的DNA编码的氨基酸序列的酶；和
(e)与SEQ ID NO:9、11、13、15或17的氨基酸序列具有85%或更高的同一性的酶。
就本发明中通过还原3-氧代酰基-CoA生产3-羟基酰基-CoA(例如，当R是甲基时，由乙酰乙酰-CoA生产3-羟丁酰-CoA的反应)的酶，用于生产(S)-1,3-丁二醇作为终产物的优选的酶，可以列举下述(a)~(e)中任一项所述的酶：
(a)具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的蛋白质；
(b)具有在SEQ ID NO:19的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列的酶；
(c)具有由SEQ ID NO:20的核苷酸序列编码的氨基酸序列的酶；
(d)具有由在严格的条件下与包括SEQ ID NO:20的核苷酸序列的DNA杂交的DNA编码的氨基酸序列的酶；和
(e)与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有85%或更高的同一性的酶。
可以例如如下验证可用于本发明目的的3-羟丁酰-CoA的3-羰基的还原酶的活性。
3-羟丁酰-CoA脱氢酶(3HBD)活性测定
在30℃下将100mM磷酸钾缓冲液(pH 6.5)、0.2mM NAD(P)H、0.2mM乙酰乙酰-CoA，以及需要时1mM DTT的混合溶液平衡3分钟，然后添加含3HBD的无细胞提取液，测量伴随乙酰乙酰-CoA还原中的NAD(P)H减少的340nm处吸光度的减少。1U定义为在每分钟催化减少1μmol NAD(P)H的酶量。使用由BioRad生产的蛋白质测定试剂盒，并使用牛血清白蛋白作为参照蛋白质，通过染料结合法进行蛋白质定量。
本发明涉及这样的基因重组微生物，所述基因重组微生物中除(1)的酶活性外，下述(4)的酶活性也得到增强，所述微生物由发酵底物生产式2代表的(R)或(S)光学活性的1,3-丁二醇：
(1)按照式1所示，使用NADH和/或NADPH作为辅酶，通过还原β-羟丁酰-CoA，催化生产3-羟基丁醛的酶活性；和
(4)如式7所示，催化由2分子的乙酰-CoA生产乙酰乙酰-CoA的β-酮硫解酶的活性；
[式1]
(式中R代表甲基；CoA代表辅酶A)
[式2]
(式中R代表甲基)
[式7]
(式中CoA代表辅酶A)。
在本发明中生产的优选的二醇化合物可以列举在1,3-丁二醇(在式1、2和7中R均是甲基)作为优选的例子。在本发明中生产的1,3-丁二醇的光学活性没有特殊的限制，1,3-丁二醇的R型和S型((R)-和(S)-1,3-丁二醇)都包括在本发明中生产的1,3-丁二醇内。
[式9]
在式9所示的反应中，可以使用任何能够通过缩合2分子的乙酰-CoA生产乙酰乙酰-CoA的酶来实施从乙酰-CoA至乙酰乙酰-CoA的反应(式7代表的反应)。优选的酶包括分类为EC2.3.1.9的酶，具有由IUBMB给出的系统名“乙酰-CoA:乙酰-CoA C-乙酰转移酶(acetyl-CoA:acetyl-CoAC-acetyltransferase)”，其催化2个乙酰-CoA=CoA+乙酰乙酰-CoA的反应；或分类为EC2.3.1.16的酶，具有系统名“酰基-CoA:乙酰-CoA C-酰基转移酶(acyl-CoA:acetyl-CoA C-acyltransferase)”，其催化酰基-CoA+乙酰-CoA=CoA+3-氧代酰基-CoA(http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/)。
具体而言，通常可以使用微生物等所具有的聚(3-羟丁酸)(PHB)合成路径的酶、丁醇发酵路径等的酶。更具体而言，具有PHB合成路径的微生物包括真养雷氏菌和生枝动胶菌等，此类微生物所具有的乙酰-CoA乙酰转移酶或β-酮硫解酶(其基因名一般被标注为phaA和phbA)是优选酶的实例。此外，具有丁醇发酵路径的微生物包括梭菌属细菌，如上所述称为丙酮-丁醇发酵细菌等，此类微生物所具有的乙酰-CoA乙酰转移酶或β-酮硫解酶(其基因名一般被标注为thl和thi)。其他实例包括一般标注为atoB的基因名的大肠杆菌等生产的atoB基因产物。此外，还可以使用通常微生物所具有的脂肪酸生物合成系统的β-酮脂酰-ACP合成酶。
在本发明中，具有乙酰-CoA乙酰转移酶活性的酶，可以列举下述(a)~(e)中任一项所述的酶：
(a)具有SEQ ID NO:21、23或25的氨基酸序列的蛋白质；
(b)具有在SEQ ID NO:21、23或25的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列的酶；
(c)具有由SEQ ID NO:22、24或26的核苷酸序列编码的氨基酸序列的酶；
(d)具有由在严格的条件下与包括SEQ ID NO:22、24或26的核苷酸序列的DNA杂交的DNA编码的氨基酸序列的酶；和
(e)与SEQ ID NO:21、23或25的氨基酸序列具有85%或更高的同一性的酶。
可以例如如下验证可用于本发明目的的乙酰-CoA乙酰转移酶(或β-酮硫解酶)的活性。
β-酮硫解酶(THL)活性测定-1
在30℃下将100mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)、10mM氯化镁、0.2mMCoA、0.05mM乙酰乙酰-CoA、以及需要时1mM DTT的混合溶液平衡3分钟，然后添加含β-酮硫解酶的无细胞提取液，利用303nm处吸光度的减少来测量Mg2+-乙酰乙酰-CoA复合物的分解。1U定义为在每分钟催化减少1μmol乙酰乙酰-CoA的酶量。使用由BioRad生产的蛋白质测定试剂盒，并使用牛血清白蛋白作为参照蛋白质，通过染料结合法进行蛋白质定量。
β-酮硫解酶(THL)活性测定-2
在30℃下将100mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)、2.0mM NADH、0.2mM乙酰-CoA和丙酮丁酸梭菌来源的2.0U的3-羟丁酰-CoA脱氢酶的混合溶液平衡3分钟，然后添加含β-酮硫解酶的无细胞提取液，测量伴随接着乙酰-CoA缩合的乙酰乙酰-CoA还原中的NADH减少的340nm处吸光度的减少。1U定义为在每分钟催化减少1μmol NADH的酶量。使用由BioRad生产的蛋白质测定试剂盒，并使用牛血清白蛋白作为参照蛋白质，通过染料结合法进行蛋白质定量。
本发明涉及这样的基因重组微生物，所述基因重组微生物中除下述(1)的酶活性外，下述(2)至(4)的酶活性也得到增强，所述微生物由发酵底物生产式2代表的(R)或(S)光学活性的1,3-丁二醇。
(1)按照式1所示，使用NADH和/或NADPH作为辅酶，通过还原β-羟丁酰-CoA，催化生产3-羟基丁醛的酶活性；
(2)按照式3所示，使用NADH和/或NADPH作为辅酶，通过还原3-羟基丁醛，催化生产式2代表的1,3-丁二醇的酶活性(式3没有显示两个反应，而仅显示了由醛生产醇)；
(3)按照式4所示，通过以NADH和/或NADPH依赖性的方式还原乙酰乙酰-CoA，生产3-羟丁酰-CoA的酶活性；和
(4)如式7所示，催化由2分子的乙酰-CoA生产乙酰乙酰-CoA的β-酮硫解酶的活性；
[式1]
(式中R代表甲基；CoA代表辅酶A)
[式2]
(式中R代表甲基)
[式3]
(式中R代表甲基)
[式4]
(式中R代表甲基；CoA代表辅酶A)
[式7]
(式中CoA代表辅酶A)。
在上述各个酶反应中，优选的酶可以使用在上述所述的各个阶段中优选的酶。
对于本发明的基因重组微生物，宿主细胞没有特殊的限制，但更优选的是使用大肠杆菌作为宿主细胞。
在本发明中，词组“活性得到增强”指如如下进行了重组的基因重组微生物：向不具有所述基因，或表达量极低的宿主中导入相同或不同物种来源的目标基因，由此具有例如与宿主相比2倍或更多倍，优选3倍或更多倍，更优选5倍或更多倍，甚至更优选10倍或更多倍的活性。
在本发明中，“光学活性的醇”指含有一种光学异构体的量多于其他光学异构体的量的醇。在本发明中，优选的光学活性的胺衍生物具有例如60%，通常70%或更高，优选80%或更高，仍然更优选90%或更高的光学纯度(对映体过量(enantiomeric excess;ee))。本发明的“光学异构体”一般还可以被称为“对映体(enantiomer)”。
可以通过下述方法分离编码本发明的各个酶(例如，具有EC1.2.1.10功能的酶)的多核苷酸。
可以如下获得本发明的DNA，基于与各个酶对应的已知核苷酸序列设计PCR引物，然后通过使用以从酶生产菌株获得的染色体DNA或cDNA文库作为模板来实施PCR。
此外，可以如下获得本发明的多核苷酸，通过使用所获得的DNA片段作为探针，并使用cDNA文库或酶生产菌株的染色体DNA的限制性酶消化物导入噬菌体或质粒等，并转化至大肠杆菌而获得的文库，实施克隆杂交或噬菌斑杂交等。
此外，还可以如下获得本发明的多核苷酸：测序通过PCR获得的DNA片段的核苷酸序列，使用所获得的序列设计用于延伸到已知的DNA外侧的PCR引物，通过恰当的限制性酶消化酶生产菌株的染色体DNA，并使用消化物自身环化获得的DNA作为模板实施反向PCR(Genetics 120,621-623(1988))。可选的，还可以实施RACE(cDNA末端的快速扩增)方法(“PCRExperiment Manual”，第25-33页，HBJ Publication Office)等。
本发明的多核苷酸包括通过上述方法克隆的基因组DNA或cDNA，以及合成得到的DNA。
通过将这样分离的、编码本发明的各个酶(例如，具有EC1.2.1.10功能的酶)的多核苷酸插入到已知的表达载体中，来提供所述酶的表达载体。优选的，将编码上述酶的多核苷酸和通过上述相同的方法获得的编码乙酰-CoA乙酰转移酶(或β-酮硫解酶)和/或立体选择性的3-羟丁酰-CoA脱氢酶和/或丁醇脱氢酶的多核苷酸同时插入到已知的载体中。
在本发明中，为了至少表达各个酶(例如，具有EC1.2.1.10功能的酶)的作为转化对象的微生物没有特殊的限制，只要其可以被含有编码具有各个酶(例如，具有EC1.2.1.10功能的酶)的多肽的多核苷酸的重组载体转化，并且可以表达各个酶的活性(例如，具有EC1.2.1.10功能的酶)即可。可以使用的微生物包括例如：
埃希氏菌属(Escherichia)
芽孢杆菌属(Bacillus)
假单胞菌属(Pseudomonas)
赛氏杆菌属(Serratia)
短杆菌属(Brevibacterium)
棒杆菌属(Corynebacterium)
链球菌属(Streptococcus)
乳杆菌属(Lactobacillus)等已经开发了宿主载体系统的细菌；
红球菌属(Rhodococcus)
链霉菌属(Streptomyces)等已经开发了宿主载体系统的放线菌；
酵母属(Saccharomyces)
克鲁维酵母属(Kluyveromyces)
裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)
接合酵母属(Zygosaccharomyces)
亚罗酵母属(Yarrowia)
毛孢子菌属(Trichosporon)
红冬孢酵母属(Rhodosporidium)
毕赤酵母属(Pichia)
假丝酵母属(Candida)等已经开发了宿主载体系统的酵母；
链孢霉属(Neurospora)
曲霉属(Aspergillus)
头孢霉属(Cephalosporium)
木霉属(Trichoderma)等已经开发了宿主载体系统的真菌。
可以根据分子生物学、生物工程和遗传工程中常用的技术(例如，Sambrook等人，Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratories)，进行转化体的制备和适合宿主的重组载体的构建。
为了在微生物菌体等中表达本发明的各个酶(例如，具有EC1.2.1.10功能的酶)的基因，首先将本发明的DNA导入可以稳定存在于微生物中的质粒或噬菌体载体中，并使得该遗传信息转录和反义。为了实现这一目的，在本发明的DNA链的5’侧上游插入启动子——一种用于转录/反义的调控单元，更优选的，在DNA的3’侧下游插入终止子。使用在作为宿主使用的微生物中已知发挥功能的启动子或终止子作为该启动子、终止子。可用于各种微生物中的载体、启动子、终止子等详细描述在例如“Fundamental Microbiology(Biseibutsugaku Kiso-kouza)8:Genetic Engineering,KYORITSU SHUPPANCO.,LTD.”中。特别的是，关于酵母的详细描述在Adv.Biochem.Eng.43,75-102(1990);Yeast 8,423-488(1992)等中。
对于埃希氏菌属，特别是大肠杆菌，可利用的质粒载体包括pBR系列和pUC系列质粒。可利用的启动子包括lac(β-半乳糖苷酶)、trp(色氨酸操纵子)、tac和trc(lac和trp的融合)、λ噬菌体PL和PR等来源的启动子。可利用的终止子是trpA来源、噬菌体来源、rrnB核糖体RNA来源的终止子等。
对于芽孢杆菌属，可利用的载体包括pUB110系列和pC194系列质粒等，其可以整合到染色体中。可利用的启动子或终止子是来自apr(碱性蛋白酶)、npr(中性蛋白酶)、或amy(α-淀粉酶)等的。
对于假单胞菌属，已开发了恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)等的宿主载体系统。可以使用宽宿主范围载体例如基于TOL质粒(含有RSF1010来源的自主复制所需的基因)构建的pKT240，所述TOL质粒涉及甲苯化合物的降解。可利用的启动子或终止子包括来自脂肪酶(JP-A(Kokai)H05-284973)的。
对于短杆菌属，特别是乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)，可以使用质粒载体例如pAJ43(Gene 39,281(1985))等。用于大肠杆菌的启动子或终止子可以不加修饰的使用。
对于棒杆菌属，特别是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，可以使用质粒载体例如pCS11(JP-A(Kokai)S57-183799)和pCB101(Mol.Gen.Genet.196,175(1984))等。
对于链球菌属，可以使用质粒载体例如pHV1301(FEMS Microbiol.Lett.26,239(1985))和pGK1(Appl.Environ.Microbiol.50,94(1985))等。
对于乳杆菌属，可以使用针对链球菌属开发的pAMβ1(J.Bacteriol.137,614(1979))等。可以使用用于大肠杆菌的启动子。
对于红球菌属，可以使用分离自紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)的质粒载体等(J.Gen.Microbiol.138,1003(1992))。
对于链霉菌属，可以通过Hopwood等人，Genetic Manipulation ofStreptomyces:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratories(1985)中描述的方法构建质粒。特别的是，对于浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)，可以使用pIJ486(Mol.Gen.Genet.203,468-478,1986)、pKC1064(Gene 103,97-99(1991))、pUWL-KS(Gene 165,149-150(1995))等。同样的质粒也可用于弗吉尼亚链霉菌(Streptomyces virginiae)(Actinomycetol.11,46-53(1997))。
对于酵母属，特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，可以使用YRp系列质粒、YEp系列质粒、YCp系列质粒、YIp系列质粒等。在染色体中多拷贝存在的、可以与核糖体DNA同源重组的整合型载体(例如EP 537456等)是非常有效地，因为所述载体允许导入并稳定的保持多拷贝的基因。此外，可以使用例如ADH(醇脱氢酶)、GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、PHO(酸性磷酸酶)、GAL(β-半乳糖苷酶)、PGK(磷酸甘油酸激酶)和ENO(烯醇化酶)等的启动子和终止子。
对于克鲁维酵母属，特别是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)，可以使用酿酒酵母来源的2μm系列质粒、pKD1系列质粒(J.Bacteriol.145,382-390(1981))、涉及杀伤活性的pGKl1来源的质粒、在克鲁维酵母属中自主复制基因KARS系列质粒、可以通过与核糖体DNA等同源重组整合到染色体中的载体质粒(例如EP 537456等)等。还可以使用ADH、PGK等来源的启动子和终止子。
对于裂殖酵母属，可以使用栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)来源的ARS(涉及自主复制的基因)、含有与酿酒酵母来源的营养缺陷型互补的选择标志物的质粒载体等(Mol.Cell.Biol.6,80(1986))。此外，可以使用栗酒裂殖酵母来源的ADH启动子等(EMBO J.6,729(1987))。特别的是，可以方便的使用可自Takara商购的pAUR224。
对于接合酵母属，可以使用鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)来源的pSB3的质粒载体(Nucleic Acids Res.13,4267(1985))等。可以使用酿酒酵母来源的PHO5启动子、酿酒酵母来源的GAP-Zr(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)的启动子(Agri.Biol.Chem.54,2521(1990))等。
对于毕赤酵母属，已针对安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)(之前称为汉逊酵母(Hansenula polymorpha))开发了宿主载体系统。虽然安格斯毕赤酵母来源的涉及自主复制的基因(HARS1和HARS2)可作为载体利用，但其是相当不稳定的，因此多拷贝的染色体整合是有效地(Yeast 7,431-443(1991))。此外，可利用利用甲醇诱导的AOX(醇氧化酶)和FDH(甲酸脱氢酶)的启动子等。此外，已开发了利用涉及自主复制的毕赤酵母等毕赤酵母属来源的基因(PARS1、PARS2)等的宿主载体系统(Mol.Cell.Biol.5,3376(1985))。还可以利用可以通过高浓度培养和甲醇诱导的AOX等强启动子(Nucleic Acids Res.15,3859(1987))。
对于假丝酵母属，已针对麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)、白色假丝酵母(Candida albicans)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、产朊假丝酵母(Candida utilis)等开发了宿主载体系统。已克隆了麦芽糖假丝酵母来源的ARS(Agri.Biol.Chem.51,51,1587(1987))，并针对麦芽糖假丝酵母开发了使用该序列的载体。还针对产朊假丝酵母开发了用于染色体整合型载体的强启动子(JP-A(Kokai)Hei 08-173170)。
对于曲霉属，黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)是研究最多的真菌，可利用质粒载体和染色体整合型载体。可以使用胞外蛋白酶和淀粉酶来源的启动子(Trends in Biotechnology 7,283-287(1989))。
对于木霉属，已针对里氏木霉(Trichoderma reesei)开发了宿主载体系统，并可利用胞外纤维素酶来源的启动子等(Biotechnology 7,596-603(1989))。
除微生物之外，还针对植物和动物开发了各种宿主载体系统。特别的是，已经开发了用在昆虫(尤其是蚕)中(Nature 315,592-594(1985))和植物(例如油菜子、玉米和土豆)中表达大量外源蛋白质的系统，可以恰当的使用所述系统。
本发明涉及使用基因重组微生物生产1,3-丁二醇的方法，所述微生物中上述各个酶活性得到增强，且生产式2代表的醇化合物。更具体而言，本发明涉及生产式2代表的二醇化合物的方法，其包括：将发酵底物与至少一种活性物质接触的步骤，所述活性物质选自功能性表达上述酶活性的基因重组微生物的培养物、菌体、及其处理物；和收集式2代表的1,3-烷基二醇的步骤。
[式2]
(式中R代表C1-3烷基或氢)。
本发明中生产的优选二醇化合物可以列举上述式2的化合物中，例如R是C1-3烷基(甲基、乙基、丙基或异丙基)或氢的化合物。更具体而言，本发明中生产的二醇化合物的优选实例包括1,3-丁二醇(其中，式1、2和4中的R均是甲基)。本发明中生产的1,3-丁二醇的光学活性没有特别的限制，R型和S型的1,3-丁二醇((R)-和(S)-1,3-丁二醇)都包括在本发明生产的1,3-丁二醇中。
可以通过将发酵底物与例如功能性表达上述酶活性的基因重组微生物等接触，从而使得基因重组微生物同化发酵底物，并进行目的酶反应，来生产1,3-丁二醇。在基因重组微生物和发酵底物之间的接触模式不限于这些特定的实例。也可以将发酵底物溶解在合适的溶剂中，为基因重组微生物同化发酵底物和表达目的酶活性提供理想的环境。
上述方法中优选的微生物包括功能性表达适合上述各阶段的酶的转化子。
在本发明中，催化式1代表的还原反应的酶活性得到增强的转化子的处理物具体包括：被表面活性剂或有机溶剂(例如甲苯等)处理而改变了细胞膜渗透性的微生物；通过冻干或喷雾干燥等制备的干燥菌体；通过用玻璃珠或酶处理破坏菌体而获得的无细胞提取液、或其部分纯化的产物；纯化的酶；固定了转化子或酶的固定化酶或固定化微生物等。
在本发明的生产1,3-丁二醇的方法中用作原料的发酵底物包括糖，例如葡萄糖、乳糖、木糖和蔗糖等。此外，根据使用的宿主微生物，可以使用任何可以被微生物异化代谢，其代谢产物为乙酰-CoA和/或乙酰乙酰-CoA和/或3-羟丁酰-CoA的底物(例如甘油和CO2等)。
用作本发明的只具有EC1.1.1.1的功能的酶的活性测定的底物的3-羟基丁醛，可以通过例如使醚溶剂中的两当量的乙醛反应而合成。
还可以通过向转化子中同时导入乙酰-CoA乙酰转移酶(或β-酮硫解酶)基因和/或3-羟丁酰-CoA脱氢酶基因，来更有效的生产1,3-丁二醇，其中所述转化子是催化式1的还原反应的酶活性得到增强的转化子。进一步的，可以同时导入丁醛脱氢酶和/或丁醇脱氢酶基因。可以通过如下的方法向宿主中导入两个或多个这些基因：为了避免不相容，分别将基因导入到多个具有不同复制起点的载体中的重组载体来转化宿主的方法；将各个基因导入单个载体中的方法；和将一个或多个基因导入染色体中的方法等。
当将多个基因导入到单个载体中时，每个基因可以连接到表达调控区，例如启动子和终止子等。还可以作为多顺反子操纵子(如乳糖操纵子)表达多个基因。
当通过将发酵底物与本发明的催化式1代表的还原反应的酶活性得到增强的转化子、或其处理物接触而生产1,3-丁二醇时，可以选择这样的条件，所述条件对催化式1代表的还原反应的酶的活性和稳定性是有利的，和/或对转化子同化发酵底物的活性是有利的，所述转化子是催化式1的还原反应的酶活性得到增强的转化子。
对于用于生产1,3-丁二醇的原料即发酵底物的浓度没有特殊的限制，但通常是约0.1-30%水平，优选0.5-15％，和更优选1-10%的浓度。
在本发明中，“%”通常意指“重量/体积(w/v)”。在(R)-1,3-丁二醇的情况下，[%e.e]是指通过(([(R)-1,3-丁二醇的浓度]–[(S)-1,3-丁二醇的浓度])/([(R)-1,3-丁二醇的浓度]+[(S)-1,3-丁二醇的浓度]))×100计算的值。同样的，在(S)-1,3-丁二醇的情况下，[%e.e]是指通过(([(S)-1,3-丁二醇的浓度]–[(R)-1,3-丁二醇的浓度])/([(S)-1,3-丁二醇的浓度]+[(R)-1,3-丁二醇的浓度]))×100计算的值。
可以在开始发酵时一起添加原料，但也可以向发酵液中连续的或间隔的添加。
作为本发明的基因重组微生物，优选可以使用这样制备的重组大肠杆菌，即通过分离催化式1代表的还原反应的酶的基因后，增强它在宿主大肠杆菌等中的活性。可以在常规用于培养大肠杆菌的培养基中培养用于本发明目的的重组大肠杆菌，并通过已知的方法诱导基因过表达。例如，在2×YT培养基(2.0%Bacto-胰蛋白胨，1.0%Bacto-酵母提取物，1.0%氯化钠，pH 7.2)中培养上述酶活性得到增强的大肠杆菌，并通过异丙基-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达，在充分增殖后，该培养液本身或回收的菌体可用于1,3-丁二醇生产。
用于1,3-丁二醇生产的本发明的基因重组微生物可以在含下述发酵底物的1,3-丁二醇生产用发酵液中边生长，边生产1,3-丁二醇，也可以使用预先培养增殖的培养液或收获的菌体。可以使用的预先培养增殖的培养液或收获的菌体的量通常是含发酵底物的1,3-丁二醇生产用发酵液的量的约0.1%-100％，优选0.5%-50%，和更优选1-20%(在此提及的“%”指向1,3-丁二醇生产用发酵液中接种细菌的比例，是指[预先增殖的培养液]/[1,3-丁二醇生产用发酵液](v/v))。
需要时，除了1,3-丁二醇生产用发酵底物外，根据需要，1,3-丁二醇生产用发酵液优选还含有促进1,3-丁二醇生产的物质。可以含有作为用于本发明目的的重组大肠杆菌的营养源的培养基成分。具体而言，此类成分包括用于培养大肠杆菌的培养基，例如LB(1.0%Bacto-胰蛋白胨、0.5%Bacto-酵母提取物、1.0%氯化钠、pH 7.2)、2×YT(2.0%Bacto-胰蛋白胨、1.0%Bacto-酵母提取物、1.0%氯化钠、pH 7.2)和M9培养基(6.8g/L Na2HPO4、3.0g/LKH2PO4、0.5g/L NaCl、1.0g/L NH4Cl、0.493g/L MgSO4·7H2O、14.7mg/LCaCl2·2H2O、pH7.5)等。当1,3-丁二醇生产用发酵液中提供预先培养的足够量的细胞时，可以在存在更高浓度的发酵底物的条件下生产1,3-丁二醇，还可以去除上述培养基。此外，根据需要，发酵液还可以含有在发酵过程中保持适合1,3-丁二醇生产的pH的成分，例如浓度为10mM至800mM，优选50mM至500mM，更优选100mM至250mM的缓冲试剂。具体而言，此类缓冲试剂包括MOPS缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、Tris缓冲液和磷酸缓冲液等。发酵可以在任何这样的温度下实施，所述温度下允许本发明的基因重组微生物表现出同化发酵底物的能力，且表达催化式1代表的还原反应的酶活性，从而生产1,3-丁二醇。此类温度通常是在5℃至60℃，优选10°C至50°C，更优选20°C至40°C的范围内。发酵还可以在任何这样的pH下实施，所述pH下允许催化式1代表的还原反应的酶活性的表达和1,3-丁二醇的生产。此类pH通常在pH 4至12的范围，优选pH 5至11，更优选pH 6至9。发酵可以在搅拌或静置下进行。此外，为了将发酵底物有效转化为1,3-丁二醇，可以在提供足量氧气的好氧条件下、在氧气供应受限的微好氧条件下、或者在不提供氧气的厌氧条件下的反应培养基中进行发酵。
本发明中的1,3-丁二醇的生产可以在水中、或在难以溶于水的有机溶剂中，例如乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、氯仿、正己烷、甲基异丁基酮、甲基叔丁基醚和二异丙酯等、或在具有含水基质的两相系统中，或者在含可溶于水的有机溶剂(例如，甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、丙酮和二甲基亚砜等)的混合系统中实施。本发明中的反应可以在分批、流加式或连续式系统中实施，还可以使用固定化菌体、固定化酶或膜反应器等实施。
实施反应生产的1,3-丁二醇的纯化可以通过恰当的组合以下的：离心分离、过滤等分离、有机溶剂抽提、色谱如离子交换色谱等、使用吸附剂的吸附、使用脱水剂或凝聚剂来脱水或凝聚、结晶、蒸馏等。
例如通过离心分离或膜过滤等将含有微生物菌体的发酵液中的微生物菌体和蛋白质除去，然后，可以通过已知的方法从该水溶液中纯化1,3-丁二醇，例如浓缩和蒸馏等。
本说明书中引用的所有现有技术文件都通过引用整合到本文中。
实施例
在下文中，将使用实施例具体描述本发明，但本发明不视为局限于此。
实施例1：克隆真养雷氏菌来源的β-酮硫解酶基因
将真养雷氏菌DSM 531接种到50mL由5g/L蛋白胨和3g/L肉提取物组成的液体培养基中，调节至pH 7.0。在30℃振荡培养21小时。
通过离心分离从所获得的培养液中收集菌体，从该菌体获得基因组DNA。使用Genomic Tip-100/G(QIAGEN)试剂盒制备基因组DNA。
为了克隆存在于真养雷氏菌DSM 531基因组DNA中的phbA基因(下文中称为ReTHL基因；DDBJ ID=J04987；氨基酸序列：SEQ ID NO:21；核苷酸序列：SEQ ID NO:22)，设计了2条PCR引物(ReTHL-A3和ReTHL-T3)。所设计的正义和反义引物的核苷酸序列显示如下：
ReTHL-A3(SEQ ID NO:27)
gacggtacctatatATGACTGATGTTGTCATCGTATCC
ReTHL-T3(SEQ ID NO:28)
cacaagcttaTTATTTACGTTCAACTGCCAGCGC
使用2条PCR引物和真养雷氏菌DSM 531的基因组DNA作为模板，克隆ReTHL基因。具体而言，制备在PfuUltra反应缓冲液中含有2种PCR引物、基因组DNA、0.2mM dNTP和2.5U PfuUltra的50μL溶液，经过30个循环的95℃下30秒；55℃下30秒；和72℃下1分钟。结果扩增了约1.2kb的DNA片段。
按图1所示制备含有完整ReTHL基因的质粒。具体而言，用KpnI和HindIII双重消化通过PCR获得的DNA片段，并与经KpnI-HindIII处理过的pSE420Q载体(WO 2006-132145)连接制备pSQ-RET1，这是ReTHL基因的表达质粒。
[实施例2]在大肠杆菌中表达ReTHL基因
通过Hanahan方法将实施例1中制备的质粒pSQ-RET1导入大肠杆菌JM109中，获得转化子大肠杆菌JM109(pSQ-RET1)。通过如下方法培养该转化子：
将转化子接种到21mm直径的试管中，试管含有7mL由10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物和10g/L NaCl组成的LB培养基，所述培养基调节至pH 7.2。在好氧条件下，30℃、250rpm的搅拌下培养18小时。然后添加终浓度为0.1mM的IPTG，在30.0℃、4小时、搅拌速度250rpm、以及好氧条件下进行诱导表达。
将所获得的培养液分别加注在2ml Eppendorf管中，离心收集菌体。然后，向菌体中添加含有1mM DTT的50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)，并经过超声破碎细胞。通过离心去除未破碎的菌体和菌体残渣，获得无细胞提取液。
通过THL活性测定-1评估所获得的无细胞提取液的ReTHL活性，确定为47.1U/mg。
[实施例3]克隆生枝动胶菌来源的β-酮硫解酶基因
通过实施例1所述方法从生枝动胶菌DSM 287中获得基因组DNA。
为了克隆存在于基因组DNA中的phbA基因(下文中称为ZrTHL基因；DDBJ ID=J02631；氨基酸序列：SEQ ID NO:23；核苷酸序列：SEQ ID NO:24)，设计了6条引物(ZrTHL-A2、ZrTHL-T2、ZrTHL-Nco-F1、ZrTHL-Nco-F2、ZrTHL-Nco-R1和ZrTHL-Nco-R2)。所设计的正义和反义引物的核苷酸序列显示如下：
ZrTHL-A2(SEQ ID NO:29)
gacggtacctatatATGAGTACTCCATCAATCGTC
ZrTHL-T2(SEQ ID NO:30)
cacaagcttaTTAAAGACTTTCGATGCACATCGC
ZrTHL-Nco-F1(SEQ ID NO:31)
GGAATCCATGTCAATGGCCCCG
ZrTHL-Nco-F2(SEQ ID NO:32)
GCTCGATTCAATGGCGAAGC
ZrTHL-Nco-R1(SEQ ID NO:33)
CAATGCGGGGCCATTGACATGG
ZrTHL-Nco-R2(SEQ ID NO:34)
CGGAGCTTCGCCATTGAATCGAG
使用生枝动胶菌DSM 287的基因组DNA作为模板，扩增DNA片段。具体而言，制备在PfuUltra反应缓冲液中含有2种PCR引物(ZrTHL-A2和ZrTHL-Nco-R1)、基因组DNA、0.2mM dNTP和2.5U PfuUltra的50μL溶液，经过30个循环的95℃下30秒；55℃下30秒；和72℃下30秒。结果扩增了约400bp的DNA片段1。使用2种PCR引物(ZrTHL-Nco-F1和ZrTHL-Nco-R2)按相同的方式再进行PCR，扩增了约300bp的DNA片段2。使用2种PCR引物(ZrTHL-Nco-F2和ZrTHL-T2)按相同的方式再进行PCR，扩增了约500bp的DNA片段3。
将这3个DNA片段作为模板，进行ZrTHL基因的全ORF的构建。具体而言，制备在PfuUltra反应缓冲液中含有3种DNA片段、2种PCR引物(ZrTHL-A2和ZrTHL-T2)、0.2mM dNTP和3.0U PfuUltra的50μL溶液，经过30个循环的95℃下30秒；55℃下30秒；和72℃下1分20秒。结果扩增了约1.2kb的DNA片段。
按图2所示制备含有ZrTHL基因的质粒。具体而言，用KpnI和HindIII双重消化通过PCR获得的DNA片段，并与经KpnI-HindIII处理过的pSE420Q载体(WO 2006-132145)连接制备pSQ-ZRT1，这是ZrTHL基因的表达质粒。
[实施例4]在大肠杆菌中表达ZrTHL基因
通过Hanahan方法将实施例3中制备的质粒pSQ-ZRT1导入大肠杆菌JM109中，获得转化子大肠杆菌JM109(pSQ-ZRT1)。通过实施例2中描述的方法培养该转化子。
将按照上述方法获得的培养液分别加注在2ml Eppendorf管中，离心收集菌体。然后，向该菌体中添加含有1mM DTT的50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)，并经过超声破碎细胞。通过离心去除未破碎的菌体和菌体残渣，获得无细胞提取液。
通过THL活性测定-1评估所获得的无细胞提取液的ZrTHL活性，确定为31.8U/mg。
[实施例5]克隆大肠杆菌来源的β-酮硫解酶基因
通过实施例1所述方法从大肠杆菌中获得基因组DNA。
为了克隆存在于所获得的基因组DNA中的atoB基因(下文中称为EcTHL基因；DDBJ ID=AP009048；氨基酸序列：SEQ ID NO:25；核苷酸序列：SEQ ID NO:26)，设计了2条引物(EcTHL-A1和EcTHL-T1)。所设计的正义和反义引物的核苷酸序列显示如下：
EcTHL-A1(SEQ ID NO:35)
gacggtacctatatATGAAAAATTGTGTCATCGTCAG
EcTHL-T1(SEQ ID NO:36)
cacaagcttaTTAATTCAAGCGTTCAATCACCATC
使用2条PCR引物和大肠杆菌JM109的基因组DNA作为模板，克隆EcTHL基因。具体而言，制备在PfuUltra反应缓冲液中含有2种PCR引物(EcTHL-A1和EcTHL-T1)、基因组DNA、0.2mM dNTP和2.5U PfuUltra的50μL溶液，经过30个循环的95℃下30秒；50℃下30秒；和72℃下1分20秒。结果扩增了约1.2kp的DNA片段。
按图3所示制备含有EcTHL基因的质粒。具体而言，用KpnI和HindIII双重消化通过PCR获得的DNA片段，并与经KpnI-HindIII处理过的pSE420Q载体(WO 2006-132145)连接制备pSQECTH1，这是EcTHL基因的表达质粒。
[实施例6]在大肠杆菌中表达EcTHL基因
通过Hanahan方法将实施例5中制备的质粒pSQECTH1导入大肠杆菌JM109中，获得转化子大肠杆菌JM109(pSQECTH1)。通过实施例2中描述的方法培养该转化子。
将按照上述方法获得的培养液分别加注在2ml Eppendorf管中，离心收集菌体。然后，向该菌体中添加含有1mM DTT的50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)，并经过超声破碎细胞。通过离心去除未破碎的菌体和菌体残渣，获得无细胞提取液。
通过THL活性测定-2评估所获得的无细胞提取液的EcTHL活性，确定为5.61U/mg。
[实施例7]克隆真养雷氏菌来源的phbB基因
为了克隆存在于实施例1制备的真养雷氏菌DSM 531基因组DNA中的phbB基因(下文中称为ReAR1基因；DDBJ ID=J04987；氨基酸序列：SEQ IDNO:9；核苷酸序列：SEQ ID NO:10)，设计了4条引物(ReAR1-A3、ReAR-T3、ReAR-Nco-F1和ReAR-Nco-R1)。所设计的正义和反义引物的核苷酸序列显示如下：
ReAR-A3(SEQ ID NO:37)
gaggaattcatatATGACTCAACGTATTGCGTATGTG
ReAR-T3(SEQ ID NO:38)
cagactagtaTTAGCCCATGTGCAGGCCG
ReAR-Nco-F1(SEQ ID NO:39)
CATGGCTTCACTATGGCACTGGC
ReAR-Nco-R1(SEQ ID NO:40)
GCCAGTGCCATAGTGAAGCCATG
使用真养雷氏菌DSM 531的基因组DNA作为模板扩增DNA片段。具体而言，制备在PfuUltra反应缓冲液中含有2种PCR引物(ReAR-A3和ReAR-Nco-R1)、基因组DNA、0.2mM dNTP和2.5U PfuUltra的50μL溶液，经过30个循环的95℃下30秒；55℃下30秒；和72℃下40秒。结果扩增了约500bp的DNA片段1。使用2种PCR引物(ReAR-Nco-F1和ReAR-T3)再进行PCR，扩增约300bp的DNA片段2。
使用这2个DNA片段，进行ZrTHL基因的全ORF的构建。具体而言，制备在PfuUltra反应缓冲液中含有2种DNA片段、2种PCR引物(ReAR-A3和ReAR-T3)、0.2mM dNTP和3.0U PfuUltra的50μL溶液，经过30个循环的95℃下30秒；55℃下30秒；和72℃下1分钟。结果扩增了约800bp的DNA片段。
按图4所示制备含有ReAR1基因的质粒。具体而言，用EcoRI和SpeI双重消化通过PCR获得的DNA片段，并与经EcoRI-SpeI处理过的实施例1中制备的pSQ-RET1载体连接制备pSQTHRA1，这是具有ReTHL基因和ReAR1基因的共表达质粒。
[实施例8]在大肠杆菌中表达ReTHL基因和ReAR1基因
通过Hanahan方法将实施例7中制备的质粒pSQTHRA1导入大肠杆菌JM109中，获得转化子大肠杆菌JM109(pSQTHRA1)。通过实施例2中描述的方法培养该转化子。
将获得的培养液分别加注在2ml Eppendorf管中，离心收集菌体。然后，向该菌体中添加含有1mM DTT的50mM磷酸钾缓冲液(pH 8.0)，并经过超声破碎细胞。通过离心去除未破碎的菌体和菌体残渣，获得无细胞提取液。
通过THL活性测定-1评估所获得的无细胞提取液的ReTHL活性，通过3HBD活性测定测量ReAR1活性，结果分别是41.3U/mg和6.12U/mg。
[实施例9]克隆生枝动胶菌来源的phbB基因
为了克隆存在于实施例3制备的生枝动胶菌DSM287基因组DNA中的phbB基因(下文中称为ZrAR1基因；WO 9100917；氨基酸序列：SEQ ID NO:11；核苷酸序列：SEQ ID NO:12)，设计了2条引物(ZrAR-A2和ZrAR-T2)。所设计的正义和反义引物的核苷酸序列显示如下：
ZrAR-A2(SEQ ID NO:41)
gaggaattcatatATGAGTCGTGTAGCATTGGTAAC
ZrAR-T2(SEQ ID NO:42)
cagactagtaTTAGACGAAGAACTGGCCG
使用2条PCR引物和生枝动胶菌的基因组DNA作为模板，克隆ZrAR1基因。具体而言，制备在PfuUltra反应缓冲液中含有2种PCR引物(ZrAR-A2和ZrAR-T2)、基因组DNA、0.2mM dNTP和2.5U PfuUltra的50μL溶液，经过30个循环的95℃下30秒；53℃下30秒；和72℃下40秒。结果扩增了约700bp的DNA片段。
按图5所示制备含有ZrAR1基因的质粒。具体而言，用EcoRI和SpeI双重消化通过PCR获得的DNA片段，并与经EcoRI-SpeI处理过的实施例1中制备的pSQ-RET1载体连接制备pSQTHZA1，这是具有ReTHL基因和ZrAR1基因的共表达质粒。
[实施例10]在大肠杆菌中表达ReTHL基因和ZrAR1基因
通过Hanahan方法将实施例9中制备的质粒pSQTHZA1导入大肠杆菌JM109中，获得转化子大肠杆菌JM109(pSQTHZA1)。通过实施例2中描述的方法培养该转化子。
将获得的培养液分别加注在2ml Eppendorf管中，离心收集菌体。然后，向该菌体中添加含有1mM DTT的50mM磷酸钾缓冲液(pH 8.0)，并经过超声破碎细胞。通过离心去除未破碎的菌体和菌体残渣，获得无细胞提取液。
通过THL活性测定-1评估所获得的无细胞提取液的ReTHL活性，通过3HBD活性测定测量ZrAR1活性，结果分别是72.9U/mg和0.582U/mg。
[实施例11]克隆紫红链霉菌来源的actIII基因
将紫红链霉菌IFO 15146接种到50mL由4g/L葡萄糖、4g/L酵母提取物和10g/L麦芽提取物组成的液体培养基(YM培养基)中，调节至pH 7.2。在28℃振荡培养24小时。
通过离心从所获得的培养液中收集菌体，从菌体获得基因组DNA。使用Genomic Tip-100/G(QIAGEN)试剂盒制备基因组DNA。
为了克隆存在于所获得的基因组DNA中的actIII基因(下文中称为SvKR1基因；DDBJ ID=M19536；氨基酸序列：SEQ ID NO:15；核苷酸序列：SEQ ID NO:16)，设计了2条引物(SvKR-A4和SvKR-T4)。所设计的正义和反义引物的核苷酸序列显示如下：
SvKR-A4(SEQ ID NO:43)
gaggaattcatatATGGCCACGCAGGACTCC
SvKR-T4(SEQ ID NO:44)
cagactagtaTTAGTAGTTCCCCAGCCCG
使用2条PCR引物和紫红链霉菌的基因组DNA作为模板，克隆SvKR1基因。具体而言，制备在PfuUltra反应缓冲液中含有2种PCR引物(SvKR-A4和SvKR-T4)、基因组DNA、0.2mM dNTP和2.5U PfuUltra的50μL溶液，经过30个循环的95℃下30秒；55℃下30秒；和72℃下1分钟。结果扩增了约800bp的DNA片段。
按图6所示制备含有SvKR1基因的质粒。具体而言，用EcoRI和SpeI双重消化通过PCR获得的DNA片段，并与经EcoRI-SpeI处理过的实施例1中制备的pSQ-RET1载体连接制备pSQTHSK1，这是具有ReTHL基因和SvKR1基因的共表达质粒。
[实施例12]在大肠杆菌中表达ReTHL基因和SvKR1基因
通过Hanahan方法将实施例11中制备的质粒pSQTHSK1导入大肠杆菌JM109中，获得转化子大肠杆菌JM109(pSQTHSK1)。通过实施例2中描述的方法培养该转化子。
将获得的培养液分别加注在2ml Eppendorf管中，离心收集菌体。然后，向该菌体中添加含有1mM DTT的50mM磷酸钾缓冲液(pH 8.0)，并经过超声破碎细胞。通过离心去除未破碎的菌体和菌体残渣，获得无细胞提取液。
通过THL活性测定-1评估所获得的无细胞提取液的ReTHL活性，通过3HBD活性测定测量SvKR1活性，结果分别是7.71U/mg和0.0547U/mg。
[实施例13]克隆嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)来源的β-酮酰-ACP还原酶基因
将嗜热脂肪芽孢杆菌NBRC 12550接种到50mL由10g/L聚胨、2g/L酵母提取物和1g/L MgSO4·H2O组成的液体培养基中，调节至pH 7.0。在50℃振荡培养21小时。
通过离心从所获得的培养液中收集菌体，从菌体获得基因组DNA。使用Genomic Tip-100/G(QIAGEN)试剂盒制备基因组DNA。
为了克隆存在于所获得的基因组DNA中的β-酮脂酰-ACP还原酶基因(下文中称为BstKR1基因；JP-A(Kokai)2002-209592；氨基酸序列：SEQ IDNO:13；核苷酸序列：SEQ ID NO:14)，设计了2条引物(BstKR-A3和BstKR-T3)。所设计的正义和反义引物的核苷酸序列显示如下：
BstKR-A3(SEQ ID NO:45)
gaggaattcatatATGTCTCAACGTTTTGCAGGTC
BstKR-T3(SEQ ID NO:46)
cagactagtaTTAACATTTTGGACCACCTGC
使用2条PCR引物和嗜热脂肪芽孢杆菌的基因组DNA作为模板，克隆BstKR1基因。具体而言，制备在PfuUltra反应缓冲液中含有2种PCR引物(BstKR-A3和BstKR-T3)、基因组DNA、0.2mM dNTP和2.5U PfuUltra的50μL溶液，经过30个循环的95℃下30秒；50℃下30秒；和72℃下1分钟。结果扩增了约800bp的DNA片段。
按图7所示制备含有BstKR1基因的质粒。具体而言，用EcoRI和SpeI双重消化通过PCR获得的DNA片段，并与经EcoRI-SpeI处理过的实施例1中制备的pSQ-RET1载体连接制备pSQTHBSK，这是具有ReTHL基因和BstKR1基因的共表达质粒。
[实施例14]在大肠杆菌中表达ReTHL基因和BstKR1基因
通过Hanahan方法将实施例13中制备的质粒pSQTHBSK导入大肠杆菌JM109中，获得转化子大肠杆菌JM109(pSQTHBSK)。通过实施例2中描述的方法培养该转化子。
将通过上述方法获得的培养液分别加注在2ml Eppendorf管中，离心收集菌体。然后，向该菌体中添加含有1mM DTT的50mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)，并经过超声破碎细胞。通过离心去除未破碎的菌体和菌体残渣，获得无细胞提取液。
通过THL活性测定-1评估所获得的无细胞提取液的ReTHL活性，通过3HBD活性测定测量BstKR1活性，结果分别是99.0U/mg和1.494U/mg。
[实施例15]克隆丙酮丁酸梭菌来源的3-羟丁酰-CoA脱氢酶基因
为了克隆存在于从ATCC购买的基因组DNA中的3-羟丁酰-CoA脱氢酶基因(下文中称为CaHBD基因；DDBJ ID=AE001437；氨基酸序列：SEQ IDNO:13；核苷酸序列：SEQ ID NO:14)，设计了2条引物(CaHBD-A1和CaHBD-T1)。所设计的正义和反义引物的核苷酸序列显示如下：
CaHBD-A1(SEQ ID NO:47)
gaggaattcatatATGAAAAAGGTATGTGTTATAGGTGC
CaHBD-T1(SEQ ID NO:48)
cagactagtaTTATTTTGAATAATCGTAGAAACCTTTTCC
使用2条PCR引物和丙酮丁酸梭菌的基因组DNA作为模板，克隆CaHBD基因。具体而言，制备在PfuUltra反应缓冲液中含有2种PCR引物(CaHBD-A1和CaHBD-T1)、基因组DNA、0.2mM dNTP和2.5U PfuUltra的50μL溶液，经过30个循环的95℃下30秒；50℃下30秒；和72℃下1分钟。结果扩增了约900bp的DNA片段。
按图8所示制备含有CaHBD基因的质粒。具体而言，用EcoRI和SpeI双重消化通过PCR获得的DNA片段，并与经EcoRI-SpeI处理过的实施例1中制备的pSQ-RET1载体连接制备pSQRTCH1，这是具有ReTHL基因和CaHBD基因的共表达质粒。
[实施例16]在大肠杆菌中表达ReTHL基因和CaHBD基因
通过Hanahan方法将实施例15中制备的质粒pSQRTCH1导入大肠杆菌JM109中，获得转化子大肠杆菌JM109(pSQRTCH1)。通过实施例2中描述的方法培养该转化子。
将通过上述方法获得的培养液分别加注在2ml Eppendorf管中，离心收集菌体。然后，向该菌体中添加含有1mM DTT的50mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)，并经过超声破碎细胞。通过离心去除未破碎的菌体和菌体残渣，获得无细胞提取液。
通过THL活性测定-1评估所获得的无细胞提取液的ReTHL活性，通过3HBD活性测定测量ReAR1活性，结果分别是13.8U/mg和63.2U/mg。
[实施例17]克隆Pichia finlandica来源的(R)-2-辛醇脱氢酶基因
将Pichia finlandica DSM 70280接种到50mL由10g/L葡萄糖、5g/L蛋白胨(大豆来源)、3g/L酵母提取物和3g/L麦芽提取物组成的液体培养基中，调节至pH 7.0。在25℃振荡培养24小时。
通过离心从所获得的培养液中收集菌体，从菌体获得基因组DNA。使用Genomic Tip-100/G(QIAGEN)试剂盒制备基因组DNA。
为了克隆存在于所获得的基因组DNA中的(R)-2-辛醇脱氢酶基因(下文中称为PfODH基因；DDBJID=AB259114；氨基酸序列：SEQ ID NO:17；核苷酸序列：SEQ ID NO:18)，设计了6条引物(PfODH-A3、PfODH-T3、PfODH-Xba-F 1、PfODH-Xba-R1、PfODH-Hind-F 1和PfOHD-Hind-R1)。所设计的正义和反义引物的核苷酸序列显示如下：
PfODH-A3(SEQ ID NO:49)
gaggAATTCTAAAATGTCTTATAATTTCCATAACAAGGTTGC
PfODH-T3(SEQ ID NO:50)
tcgACTAGTATTATTGTGCTGTGTACCCACCGTCAACC
PfODH-Xba-F1(SEQ ID NO:51)
GGCTCTGGAGTACGCATCTCATGGTATTCGTGTAAATTC
PfODH-Xba-R1(SEQ ID NO:52)
GAATTTACACGAATACCATGAGATGCGTACTCCAGAGCC
PfODH-Hind-F1(SEQ ID NO:53)
GTAAGCCTGCACCCTATTGGGCGTCTGGGTCGTC
PfODH-Hind-R1(SEQ ID NO:54)
GACGACCCAGACGCCCAATAGGGTGCAGGCTTAC
使用Pichia finlandica DSM 70280的基因组DNA作为模板，扩增DNA片段。具体而言，制备在PfuUltra反应缓冲液中含有2种PCR引物(PfODH-A3和PfODH-Xba-R1)、基因组DNA、0.2mM dNTP和2.5U PfuUltra的50μL溶液，经过30个循环的95℃下30秒；55℃下30秒；和72℃下30秒。结果扩增了约500bp的DNA片段1。使用2种PCR引物(PfODH-Xba-F1和PfODH-Hind-R1)再进行PCR，扩增DNA片段2。使用2种PCR引物(PfODH-Hind-F1和PfODH-T3)再进行PCR，扩增约200bp的DNA片段3。
使用这3个DNA片段，进行PfODH基因的全ORF的构建。具体而言，制备在PfuUltra反应缓冲液中含有3种DNA片段、2种PCR引物(PfODH-A3和PfODH-T3)、0.2mM dNTP和3.0U PfuUltra的50μL溶液，经过30个循环的95℃下30秒；50℃下30秒；和72℃下1分钟。结果扩增了约800bp的DNA片段。
按图9所示制备含有PfODH基因的质粒。具体而言，用EcoRI和SpeI双重消化通过PCR获得的DNA片段，并与经EcoRI和SpeI处理过的实施例1制备的pSQ-RET1载体连接制备pSQTHPO2，这是具有ReTHL基因和PfODH基因的共表达质粒。
[实施例18]在大肠杆菌中表达ReTHL基因和PfODH基因
通过Hanahan方法将实施例17中制备的质粒pSQTHPO2导入大肠杆菌JM109中，获得转化子大肠杆菌JM109(pSQTHPO2)。通过实施例2中描述的方法培养该转化子。
将通过上述方法获得的培养液分别加注在2ml Eppendorf管中，离心收集菌体。然后，向该菌体中添加含有1mM DTT的50mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)，并经过超声破碎细胞。通过离心去除未破碎的菌体和菌体残渣，获得无细胞提取液。
通过THL活性测定-1评估所获得的无细胞提取液的ReTHL活性，通过3HBD活性测定测量PfODH活性，结果分别是74.9U/mg和0.0120U/mg。
[实施例19]使用ReTHL-CaHBD的酶反应生产3-羟丁酰-CoA
向含有100mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)、2.5mM NADH和2.5mM乙酰-CoA的溶液中，添加6.2μL的含有根据实施例14制备的ReTHL和CaHBD的无细胞提取液，并在30℃反应1小时。通过向反应溶液中添加5μL的60%(v/v)高氯酸和5μL的5N氢氧化钠水溶液，终止反应。向该反应处理液中，添加510μL的200mM磷酸钾缓冲液，离心获得上清液。该上清液的HPLC分析显示生产了0.27mM 3-羟丁酰-CoA。
HPLC条件如下：
-HPLC柱：由Wako Pure Chemical Industries,Ltd.生产的Wakosil-II5C18HG(4.6mm×150mm)
-洗脱液：50mM磷酸缓冲液(pH 5.0):乙腈=95:5
-柱温：30°C
-流速：1.0mL/min
-检测：在254nm处的UV吸收
在上述条件下，在15.3min时洗脱3-羟丁酰-CoA。基于使用3-羟丁酰-CoA(Sigma)获得的标准曲线确定累积浓度。
[实施例20]克隆丙酮丁酸梭菌来源的醛/醇脱氢酶基因
为了克隆存在于实施例15中获得的大质粒中的醛/醇脱氢酶基因(下文中称为CaAdhE基因；DDBJ ID=AE001438；氨基酸序列：SEQ ID NO:1；核苷酸序列：SEQ ID NO:2)，设计了4条引物(CaAdhE2-A1、CaAdhE2-T1、CaAdhE2-Nde-F1和CaAdhE2-Nde-R1)。所设计的正义和反义引物的核苷酸序列显示如下：
CaAdhE2-A1(SEQ ID NO:55)
gaccatATGAAAGTTACAAATCAAAAAGAACTAAAAC
CaAdhE2-T1(SEQ ID NO:56)
ctgttaaTTAAAATGATTTTATATAGATATCCTTAAGTTC
CaAdhE2-Nde-F 1(SEQ ID NO:57)
CTATAGAAGCATACGTTTCGG
CaAdhE2-Nde-R1(SEQ ID NO:58)
CCGAAACGTATGCTTCTATAG
使用丙酮丁酸梭菌ATCC 824的大质粒DNA作为模板，扩增DNA片段。具体而言，制备在PfuUltra反应缓冲液中含有2种PCR引物(CaAdhE2-A1和CaAdhE2-Nde-R1)、基因组DNA、0.2mM dNTP和2.5U PfuUltra的50μL溶液，经过30个循环的95℃下30秒；50℃下30秒；和72℃下2分钟。结果扩增了约2kp的DNA片段1。使用2种PCR引物(CaAdhE2-Nde-F1和CaAdhE2-T1)再进行PCR，扩增约600bp的DNA片段2。
使用这2个DNA片段，进行CaAdhE基因的全ORF的构建。具体而言，制备在PfuUltra反应缓冲液中含有2种DNA片段、2种PCR引物(CaAdhE2-A1和CaAdhE2-T1)、0.2mM dNTP和3.0U PfuUltra的50μL溶液，经过30个循环的95℃下30秒；50℃下30秒；和72℃下2分30秒。结果扩增了约2.6kb的DNA片段。
按图10所示制备含有CaAdhE基因的质粒。具体而言，用NdeI和PacI双重消化通过PCR获得的DNA片段，并与经NdeI-PacI处理过的pSE420U载体(WO 2006-132145)连接制备pSUCAAH1，这是具有CaAdhE基因的表达质粒。
[实施例21]在大肠杆菌中表达CaAdhE基因
通过Hanahan方法将实施例20中制备的质粒pSUCAAH1导入大肠杆菌JM109中，获得转化子大肠杆菌JM109(pSUCAAH1)。通过实施例2中描述的方法培养该转化子。
将通过上述方法获得的培养液分别加注在2ml Eppendorf管中，离心收集菌体。在厌氧条件下，向该菌体中添加含有1mM DTT的50mM MOPS缓冲液(pH 7.0)，并经过超声破碎细胞。通过离心去除未破碎的菌体和菌体残渣，获得无细胞提取液。
使用丁酰-CoA作为底物，通过BCDH活性测定测量所获得的无细胞提取液中的BCDH活性，确定为0.129U/mg。
已知CaAdhE基因作用于乙酰-CoA和丁酰-CoA。然而，尚未报道过它对3-羟丁酰-CoA的活性，因此所述活性是未知的。因而，使用3-羟丁酰-CoA作为底物，测定BCDH活性。结果活性是0.0237U/mg，具有相对于丁酰-CoA为18%的相对活性。
[实施例22]使用CaAdhE的酶反应生产1,3-BG
向含有50mM MES缓冲液(pH 6.0)、36mM NADH和15mM 3-羟丁酰-CoA的溶液中，添加0.0938U的含有根据实施例21制备的CaAdhE酶的无细胞提取液，并在37℃反应24小时。离心反应溶液，去除沉淀，通过HPLC分析上清液。结果显示生产了3.66mM 1,3-BG。
HPLC条件如下：
-HPLC柱：由Shinwa Chemical Industries Ltd.生产的ULTRONPS-80H(8.0mm×300mm)
-洗脱液：10mM硫酸水溶液
-柱温：40°C
-流速：0.7mL/min
-检测：RI(折光率检测仪)
在上述条件下，在20.1min时洗脱1,3-BG。基于使用1,3-BG(Wako)获得的标准曲线确定累积浓度。
[实施例23]克隆Thermoanaerobacter pseudethanolicus来源的醛/醇脱氢酶基因
为了克隆从DSM购买的存在于基因组DNA的醛/醇脱氢酶基因(下文中称为TpAdhE基因；氨基酸序列：SEQ ID NO:65；核苷酸序列：SEQ ID NO:66)，设计了2条引物(TpadhE-A1和TpAdhE-T1)。所设计的正义和反义引物的核苷酸序列显示如下：
TpAdhE-A1(SEQ ID NO:69)
gaccatATGCCTAACTTATTACAAGAACGCCGCGAAGTAAAAGA
TpAdhE-T1(SEQ ID NO:70)
gctgttaattaaTTATTCTCCATAGGCTTTGCGATATATTTCTGC
使用Thermoanaerobacter pseudethanolicus的基因组DNA作为模板，实施PCR扩增TpAdhE片段。具体而言，制备在PfuUltra反应缓冲液中含有2种PCR引物(TpadhE-A1和TpAdhE-T1)、基因组DNA、0.2mM dNTP和2.5U PfuUltra的50μL溶液，经过30个循环的95℃下30秒；50℃下30秒；和72℃下2分钟。结果扩增了约2.6kb的DNA片段。
按图11所示制备含有TpAdhE基因的质粒。具体而言，用NdeI和PacI双重消化通过PCR获得的DNA片段，并与经NdeI-PacI处理过的pSE420Q载体(WO 2006-132145)连接制备pSQTPAH1，这是具有TpAdhE基因的表达质粒。
[实施例24]在大肠杆菌中表达TpAdhE基因
通过Hanahan方法将实施例23中制备的质粒pSQTPAH1导入大肠杆菌JM109中，获得转化子大肠杆菌JM109(pSQTPAH1)。通过实施例2中描述的方法培养该转化子。
将通过上述方法获得的培养液分别加注在2ml Eppendorf管中，离心收集菌体。在厌氧条件下，向该菌体中添加含有1mM DTT的50mM MOPS缓冲液(pH 7.0)，并经过超声破碎细胞。通过离心去除未破碎的菌体和菌体残渣，获得无细胞提取液。
确定所获得的无细胞提取液中的TpAdhE对3-羟丁酰-CoA的BCDH/BDH活性是0.00538U/mg，对制备的3-羟基丁醛的BDH活性是0.0619U/mg。
[实施例25]克隆费氏丙酸杆菌费氏亚种来源的醛/醇脱氢酶基因
为了克隆从DSM购买的基因组DNA中含有的醛/醇脱氢酶基因(下文中称为PfALD基因；氨基酸序列：SEQ ID NO:67；核苷酸序列：SEQ ID NO:68)，设计了2条引物(PfadhE-A1和PfAdhE-T1)。所设计的正义和反义引物的核苷酸序列显示如下：
PfAdhE-A1(SEQ ID NO:71)
gaccatATGGATTTCTCATTGACCGAAGACCAGCAG
PfAdhE-T1(SEQ ID NO:72)
gctgttaaTTAACTACGGTAGTCGCGCAGTGCACC
使用费氏丙酸杆菌费氏亚种的基因组DNA作为模板，实施PCR扩增PfALD片段。具体而言，制备在PfuUltra反应缓冲液中含有2种PCR引物(PfadhE-A1和PfAdhE-T1)、基因组DNA、0.2mM dNTP和2.5U PfuUltra的50μL溶液，经过30个循环的95℃下30秒；50℃下30秒；和72℃下2分钟。结果扩增了约1.1kb的DNA片段。
按图12所示制备含有PfALD基因的质粒。具体而言，用NdeI和PacI双重消化通过PCR获得的DNA片段，并与经NdeI-PacI处理过的pSE420Q载体(WO 2006-132145)连接制备pSQPFAH1，这是具有PfALD基因的表达质粒。
[实施例26]在大肠杆菌中表达PfALD基因
通过Hanahan方法将实施例25中制备的质粒pSQPFAH1导入大肠杆菌JM109中，获得转化子大肠杆菌JM109(pSQPFAH1)。通过实施例2中描述的方法培养该转化子。
将通过上述方法获得的培养液分别加注在2ml Eppendorf管中，离心收集菌体。在厌氧条件下，向该菌体中添加含有1mM DTT的50mM MOPS缓冲液(pH 7.0)，并经过超声破碎细胞。通过离心去除未破碎的菌体和菌体残渣，获得无细胞提取液。
确定所获得的无细胞提取液中的PfALD对3-羟丁酰-CoA的BCDH活性是0.0826U/mg。
[实施例27]用于发酵生产1,3-BG的质粒构建
为了构建用于发酵生产1,3-BG的质粒，通过图13所示方法将实施例20中制作的pSUCAAH1质粒中的CaAdhE基因亚克隆到pSQTRCA1中。具体而言，用NdeI和PacI双重消化pSUCAAH1，并与经NdeI-PacI处理过的pSQTHRA1载体连接成构建质粒pSQTRCA1，这是具有ReTHL基因、ReAR1基因和CaAdhE基因的共表达质粒。
[实施例28]在大肠杆菌中表达ReTHL基因、ReAR1基因和CaAdhE基因
通过Hanahan方法将实施例27中制备的质粒pSQTHRA1导入大肠杆菌JM109中，获得转化子大肠杆菌JM109(pSQTHRA1)。通过实施例2中描述的方法培养该转化子。
将通过上述方法获得的培养液分别加注在2ml Eppendorf管中，离心收集菌体。在厌氧条件下，向该菌体中添加含有1mM DTT的50mM MOPS缓冲液(pH 7.0)，并经过超声破碎细胞。通过离心去除未破碎的菌体和菌体残渣，获得无细胞提取液。
通过THL活性测定-1评估所获得的无细胞提取液的ReTHL活性，通过3HBD活性测定评估ReAR1活性，使用丁酰-CoA作为底物通过BCDH活性测定评估CaAdhE的BCDH活性，结果分别为6.46U/mg、0.952U/mg和0.118U/mg。
[实施例29]克隆丙酮丁酸梭菌来源的丁醇脱氢酶II基因
为了从丙酮丁酸梭菌中克隆bdhB基因(下文中称为CaBDHB基因；DDBJ ID=AE001437；氨基酸序列：SEQ ID NO:3；核苷酸序列：SEQ ID NO:4)，设计了6条引物(CaBDHB-A2、CaBDHB-T2、CaBDHB-Nco-F1、CaBDHB-Nco-R1、CaBDHB-Xba-F1和CaBDHB-Xba-R1)。所设计的正义和反义引物的核苷酸序列显示如下：
CaBDHB-A2(SEQ ID NO:59)
ggaccATGGTTGATTTCGAATATTCAATACCAACTAGAA
CaBDHB-T2(SEQ ID NO:60)
cgatctagaaTTACACAGATTTTTTGAATATTTGTAGGACTTCGGAG
CaBDHB-Nco-F1(SEQ ID NO:61)
GATGGAAATCCGTGGGATATTGTG
CaBDHB-Nco-R1(SEQ ID NO:62)
CACAATATCCCACGGATTTCCATC
CaBDHB-Xba-F1(SEQ ID NO:63)
GTTTACCATCTCGTCTGCGTGATGTTG
CaBDHB-Xba-R1(SEQ ID NO:64)
CAACATCACGCAGACGAGATGGTAAAC
使用丙酮丁酸梭菌的基因组DNA作为模板，扩增DNA片段。具体而言，制备在PfuUltra反应缓冲液中含有2种PCR引物(CaBDHB-A2和CaBDHB-Nco-R1)、基因组DNA、0.2mM dNTP和2.5U PfuUltra的50μL溶液，经过30个循环的95℃下30秒；50℃下30秒；和72℃下30秒。结果扩增了约350bp的DNA片段。使用2种PCR引物(CaBDHB-Nco-F1和CaBDHB-Nco-R1)再进行PCR，扩增DNA片段2。使用2种PCR引物(CaBDHB-Xba-F1和CaBDHB-T2)再进行PCR，扩增约100bp的DNA片段3。
使用这三个DNA片段，进行CaBDHB基因的全ORF的构建。具体而言，制备在PfuUltra反应缓冲液中含有2种DNA片段、2种PCR引物(CaBDHB-A2和CaBDHB-T2)、0.2mM dNTP和3.0U PfuUltra的50μL溶液，经过30个循环的95℃下30秒；50℃下30秒；和72℃下1分30秒。结果扩增了约1.2kb的DNA片段。
按图14所示制备含有完整CaBDHB基因的质粒。具体而言，用NcoI和XbaI双重消化通过PCR获得的DNA片段，并与经NcoI-XbaI处理过的pSE420Q载体(WO 2006-132145)连接制备pSQCABB2，这是具有CaBDHB基因的表达质粒。
[实施例30]在大肠杆菌中表达CaBDHB基因
通过Hanahan方法将实施例29中制备的质粒pSQCABB2导入大肠杆菌JM109中，获得转化子大肠杆菌JM109(pSQCABB2)。通过实施例2中描述的方法培养该转化子。
将通过上述方法获得的培养液分别加注在2ml Eppendorf管中，离心收集菌体。在厌氧条件下，向该菌体中添加含有1mM DTT的50mM MOPS缓冲液(pH 7.0)，并经过超声破碎细胞。通过离心去除未破碎的菌体和菌体残渣，获得无细胞提取液。
使用丁醛作为底物，通过BDH活性测定测量所获得的无细胞提取液的CaBDHB活性，确定为0.0971U/mg。
已知CaBDHB作用在乙醛和丁醛上。然而，尚未报道过它对3-羟基丁醛的活性，因此所述活性是未知的。因而，使用制备的3-羟基丁醛(3-羟基丁醛:乙醛=3:1)作为底物，测定CaBDHB活性。结果活性是0.0462U/mg，以对丁醛的活性为100%，其具有48%的相对活性。
[实施例31]用于发酵生产1,3-BG的质粒构建——2
为了构建用于发酵生产1,3-BG的质粒2，通过图15所示方法将实施例29中制作的pSQCABB质粒中的CaBDHB基因亚克隆到pSQTRCA1中。具体而言，用NcoI和XbaI双重消化pSQCABB2，并与经NcoI-XbaI处理过的pSQTRCA1载体连接成构建质粒pSQTRCB1，这是具有ReTHL基因、ReAR1基因、CaAdhE基因和CaBDHB基因的共表达质粒。
[实施例32]在大肠杆菌中表达ReTHL基因、ReAR1基因和CaAdhE基因及CaBDHB基因
通过电穿孔将实施例31中制备的质粒pSQTRCB1导入大肠杆菌W3110中，获得转化子大肠杆菌W3110(pSQTRCB1)。通过实施例2中描述的方法培养该转化子。
将通过上述方法获得的培养液分别加注在2ml Eppendorf管中，离心收集菌体。在厌氧条件下，向该菌体中添加含有1mM DTT的50mM MOPS缓冲液(pH 7.0)，并经过超声破碎细胞。通过离心去除未破碎的菌体和菌体残渣，获得无细胞提取液。
通过THL活性测定-1评估所获得的无细胞提取液的ReTHL活性，通过3HBD活性测定评估ReAR1活性，通过BCDH活性测定(底物：丁酰-CoA)评估CaAdhE的BCDH活性，通过BDH活性测定(底物：丁醛)评估CaBDHB活性，结果分别为10.0U/mg、2.08U/mg、0.0298U/mg和0.124U/mg。
[实施例33]在大肠杆菌中表达ReTHL基因、ReAR1基因和CAadhE基因——2
通过电穿孔将实施例27中制备的质粒pSQTHRA1导入大肠杆菌HB101中，获得转化子大肠杆菌HB101(pSQTHRA1)。通过实施例2中描述的方法培养该转化子。
将通过上述方法获得的培养液分别加注在2ml Eppendorf管中，离心收集菌体。在厌氧条件下，向该菌体中添加含有1mM DTT的50mM MOPS缓冲液(pH 7.0)，并经过超声破碎细胞。通过离心去除未破碎的菌体和菌体残渣，获得无细胞提取液。
通过THL活性测定-1评估所获得的无细胞提取液的ReTHL活性，通过3HBD活性测定评估ReAR1活性，通过BCDH活性测定(底物：丁酰-CoA)和BDH活性测定(丁醛)评估CaAdhE的BCDH活性，结果分别为7.36U/mg、1.18U/mg、0.0434U/mg和0.151U/mg。
[实施例34]通过发酵生产1,3-BG
本实施例的目标是使用大肠杆菌JM109(pSQTRCA1)通过发酵从葡萄糖生产1,3-BG。
将转化的大肠杆菌JM109(pSQTRCA1)接种到21mm直径的试管中，试管含有7mL由10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L NaCl和50mg/L青霉素组成的LB培养基，所述培养基调节至pH 7.2。在30℃下、在250rpm下、在好氧条件下，振荡18小时进行预培养。
将预培养物接种到500-mL有挡板的三角烧瓶中，烧瓶含有50L由20g/L胰蛋白胨、10g/L酵母提取物、10g/L NaCl和50mg/L青霉素组成的液体培养基，所述培养基调节至pH 7.0。在30℃下、在140rpm下振荡18小时进行主培养。使用0.02mM IPTG实施诱导表达。
发酵液1：将从上述大肠杆菌JM109(pSQTRCA1)的主培养液获得的洗涤过菌体添加到100-mL有挡板的三角烧瓶中，烧瓶具有10mL含有56g/L葡萄糖和液体培养基(由20g/L胰蛋白胨、10g/L酵母提取物和10g/L NaCl组成，调节至pH 7.0)的组成液，使得接种比例为100%。用硅胶塞密封烧瓶，在30℃的不通气条件下、在100rpm的搅拌速度下、进行72小时的发酵。
发酵液2：将来自上述大肠杆菌JM109(pSQTRCA1)的主培养物的10-倍浓缩的洗涤过的菌体添加到100-mL带挡板的三角烧瓶中，烧瓶具有10mL含有56g/L葡萄糖和MES缓冲液(pH 6.0)的组成液，使得接种比例为100%。用硅胶塞密封烧瓶，在30℃的不通气条件下、在100rpm的搅拌速度下、进行72小时的发酵。
在开始发酵72小时后，取样2ml发酵液，离心去除菌体和不溶物。通过Millex-LH(Millipore)过滤上清液，在与实施例22相同的条件下通过HPLC分析滤液。所生产的1,3-BG的浓度显示在表1中。不具有任何质粒的大肠杆菌JM109也在相同条件下进行发酵，但未发现产生了任何可检测的1,3-BG。
[表1]大肠杆菌JM109(pSQTRCA1)的1,3-BG生产
| No. | 发酵液 | 1,3-BG(g/L)1) | 摩尔收率(%)2) |
| 发酵液1 | 2×YT | 0.560 | 2.0 |
| 发酵液2 | MES(pH 6.0) | 0.819 | 2.9 |
1)通过HPLC计算的
2)摩尔收率(%)=100×((生产的1,3-BG[mM])/(初始葡萄糖浓度[mM]))
[实施例35]通过发酵生产1,3-BG——2
通过实施例34中描述的方法进行大肠杆菌HB101(pSQTRCA1)和大肠杆菌HB101(pSQTRCB1)的预培养和主培养。
发酵液3：将来自大肠杆菌HB101(pSQTRCA1)的主培养物的10-倍浓缩的洗涤过的菌体添加到500-mL带挡板的三角烧瓶中，烧瓶具有100mL含有30g/L葡萄糖、0.02mM IPTG、100mM HEPES缓冲液和M9培养基(由6.8g/L Na2HPO4、3.0g/L KH2PO4、0.5g/L NaCl、1.0g/L NH4Cl、493mg/LMgSO4·7H2O和14.7mg/L CaCl2·2H2O组成，调节至pH7.5)的组成液，使得接种比例为20%。用硅胶塞密封烧瓶，在30℃、140rpm的搅拌速度下、进行发酵48小时。
发酵液4：按与发酵液3相同的方式实施发酵，除了发酵温度是37°C以外。
发酵液5：按与发酵液4相同的方式实施发酵，除了接种的转化子是大肠杆菌HB101(pSQTRCB1)以外。
在开始发酵48小时后，取样2ml发酵液，离心去除菌体和不溶物。通过Millex-LH(Millipore)过滤上清液，在与实施例22相同的条件下通过HPLC分析滤液。所生产的1,3-BG的浓度显示在表2中。
[表2]大肠杆菌HB101(pSQTRCA1)和大肠杆菌HB101(pSQTRCB1)的1,3-BG生产
| No. | 菌株 | 1,3-BG(g/L)1) | 摩尔收率(%)2) |
| 发酵液3 | W3110(pSQTRCA1) | 0.435 | 2.9 |
| 发酵液4 | W3110(pSQTRCA1) | 1.028 | 6.9 |
| 发酵液5 | W3110(pSQTRCB1) | 0.075 | 0.5 |
1)通过HPLC计算的
2)摩尔收率(%)=100×((生产的1,3-BG[mM])/(初始葡萄糖浓度[mM]))
[实施例36]确定所生产的1,3-BG的光学纯度
在发酵液4的发酵48小时后，用乙酸乙酯从1mL样品中抽提有机层，并用氯化钠盐析。在浓缩所获得的提取液后，加入0.1mL乙酰氯并在25°C反应10分钟。使用饱和的碳酸氢钠中和得到的反应溶液，然后用1mL己烷抽提有机层。该提取液的HPLC分析显示(R)-1,3-BG的光学纯度是86.6%。
HPLC条件如下：
-HPLC柱：由Daicel Chemical Industries,Ltd.生产的CHIRALCEL(4.6mm×250mm)
-洗脱液：己烷:异丙醇=19:1
-柱温：40°C
-流速：1.0mL/min
-检测：220nm处的UV吸光值
在所述条件下，(S)-1,3-BG和(R)-1,3-BG分别在6.8min和8.5min时洗脱。基于各个级分在220nm处UV的吸收确定光学纯度。
工业实用性
本发明提供了能够从可再生资源来源的原料即碳水化合物原料(例如葡萄糖等)有效生产1,3-丁二醇的基因重组微生物。此外，提供了使用此类微生物生产1,3-丁二醇的方法。本发明的方法在工业上是有利的，这是因为可以使用廉价的原料生产1,3-丁二醇。本发明能够以可再生的资源作为原料生产1,3-丁二醇。
Claims (15)
1.下述(1)的酶活性得到增强的基因重组微生物，所述基因重组微生物由发酵底物生产式2代表的1,3-烷基二醇，
(1)按照式1所示，使用NADH和/或NADPH作为辅酶，通过还原3-羟基酰基-CoA，来催化生产3-羟基烷基醛的酶活性：
[式1]
式中R代表C1-3烷基或氢；CoA代表辅酶A，
[式2]
式中R代表C1-3烷基或氢。
2.权利要求1的基因重组微生物，其中在权利要求1中所述的式1和2中的R均是甲基，由发酵底物生产1,3-丁二醇。
3.权利要求1或2的基因重组微生物，其中权利要求2所述的由发酵底物生产的1,3-丁二醇是(R)-1,3-丁二醇。
4.权利要求1至3中任一项的基因重组微生物，其中催化权利要求1的(1)所述的式1代表的反应的酶在国际酶学分类中分类为EC 1.2.1.10。
5.权利要求1至4中任一项的基因重组微生物，其中催化权利要求1的(1)所述的式1代表的反应的酶是下述(a)~下述(e)中任一项所述的酶：
(a)具有SEQ ID NO:1、65或67的氨基酸序列的蛋白质；
(b)具有在SEQ ID NO:1、65或67的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列的酶；
(c)具有由SEQ ID NO:2、66或68的核苷酸序列编码的氨基酸序列的酶；
(d)具有由在严格的条件下与包括SEQ ID NO:2、66或68的核苷酸序列的DNA杂交的DNA编码的氨基酸序列的酶；和
(e)与SEQ ID NO:1、65或67的氨基酸序列具有85%或更高的同一性的蛋白质。
6.权利要求1至5中任一项的基因重组微生物，其是除权利要求1所述的下述(1)的酶活性之外，下述(2)的酶活性也得到增强的基因重组微生物，所述基因重组微生物由发酵底物生产式2代表的1,3-烷基二醇，
(1)按照式1所示，使用NADH和/或NADPH作为辅酶，通过还原3-羟基酰基-CoA，来催化生产3-羟基烷基醛的酶活性；和
(2)按照式3所示，使用NADH和/或NADPH作为辅酶，通过还原3-羟基烷基醛，来催化生产式2代表的1,3-烷基二醇的酶活性，
式3没有显示两个反应，而仅显示了由醛生产醇：
[式1]
式中R代表C1-3烷基或氢；CoA代表辅酶A，
[式2]
式中R代表C1-3烷基或氢，
[式3]
式中R代表C1-3烷基或氢。
7.权利要求6的基因重组微生物，其中在权利要求6中所述的式1至3中的R均是甲基，由发酵底物生产1,3-丁二醇。
8.权利要求6或7的基因重组微生物，其中权利要求7所述的由发酵底物生产的1,3-丁二醇是(R)-1,3-丁二醇。
9.权利要求6至8中任一项的基因重组微生物，其中催化权利要求6中所述的式3代表的反应的酶是下述(a)~下述(e)中任一项所述的酶：
(a)具有SEQ ID NO:3、5或7的氨基酸序列的蛋白质；
(b)具有在SEQ ID NO:3、5或7的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列的酶；
(c)具有由SEQ ID NO:4、6或8的核苷酸序列编码的氨基酸序列的酶；
(d)具有由在严格的条件下与包括SEQ ID NO:4、6或8的核苷酸序列的DNA杂交的DNA编码的氨基酸序列的酶；和
(e)与SEQ ID NO:3、5或7的氨基酸序列具有85%或更高的同一性的酶。
10.权利要求1至5中任一项的基因重组微生物，其是除权利要求1所述的下述(1)的酶活性之外，下述(3)的酶活性也得到增强的基因重组微生物，所述基因重组微生物由发酵底物生产式2代表的1,3-烷基二醇：
(1)按照式1所示，使用NADH和/或NADPH作为辅酶，通过还原3-羟基酰基-CoA，来催化生产3-羟基烷基醛的酶活性；和
(3)按照式4所示，以NADH和/或NADPH依赖性的方式还原3-氧代酰基-CoA，生产3-羟基酰基-CoA的酶活性，
[式1]
式中R代表C1-3烷基或氢；CoA代表辅酶A，
[式2]
式中R代表C1-3烷基或氢，
[式4]
式中R代表C1-3烷基或氢；CoA代表辅酶A。
11.权利要求10的基因重组微生物，其中在权利要求10中所述的式1和2中的R均是甲基，由发酵底物生产式5代表的(R)-1,3-丁二醇，
[式5]
12.权利要求10或11的基因重组微生物，其中催化权利要求10中所述的式4代表的反应的酶是R型特异性还原酶，且是下述(a)~下述(e)中任一项所述的酶：
(a)具有SEQ ID NO:9、11、13、15或17的氨基酸序列的蛋白质；
(b)具有在SEQ ID NO:9、11、13、15或17的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列的酶；
(c)具有由SEQ ID NO:10、12、14、16或18的核苷酸序列编码的氨基酸序列的酶；
(d)具有由在严格的条件下与包括SEQ ID NO:10、12、14、16或18的核苷酸序列的DNA杂交的DNA编码的氨基酸序列的酶；和
(e)与SEQ ID NO:9、11、13、15或17的氨基酸序列具有85%或更高的同一性的酶。
13.生产式2代表的二醇化合物的方法，其包括：
将发酵底物与至少一种活性物质接触的步骤，所述活性物质选自权利要求1至12中任一项的基因重组微生物的培养物、菌体、及其处理物；和
收集式2代表的1,3-烷基二醇的步骤，
[式2]
式中R代表C1-3烷基或氢。
14.权利要求13的生产二醇化合物的方法，其中生产的二醇化合物是式5代表的(R)-1,3-丁二醇，
[式5]
15.权利要求13或14的生产二醇化合物的方法，其中分别进行培养基因重组微生物的步骤和生产二醇化合物的步骤。
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