CN111647616B - 一种生产原儿茶酸的大肠杆菌工程菌构建方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生产原儿茶酸的大肠杆菌构建方法及应用，该方法包括：PCR扩增获取PmLAAD、HmaS、HMO、BFD、HFD1、HpaBC、PobA七种基因；构建质粒pET‑PmLAAD‑HmaS、质粒pCDF‑HMO‑BFD、质粒pACYC‑HpaBC和质粒pACYC‑PobA和质粒pRSF‑HFD1；将上述部分质粒共同转入大肠杆菌MG1655RARE感受态细胞中，分别得到第一重组大肠杆菌工程菌和第二重组大肠杆菌工程菌。根据本发明实施例，该方法获得的重组大肠杆菌可使原儿茶酸达最大收率，具有广阔的工业化应用前景。

Description

一种生产原儿茶酸的大肠杆菌工程菌构建方法及应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种生产原儿茶酸的大肠杆菌工程菌构建方法及应用。
背景技术
原儿茶酸也称为3,4-二羟基苯甲酸，存在于木犀科植物紫丁香、蓼科植物头花蓼、冬青科植物冬青等植物的叶中，是具有独特生理活性及药理特性的次级代谢产物。针对不同的分子靶点，原儿茶酸具有多种多样的生物活性：可预防一些慢性变性、心血管和神经退行性疾病；可作为一种新型合成多聚物和塑料的组成部分；具有良好的电化学活性的与多糖物质结合的复合物；可合成生物塑料；在药理特性上具有抗菌、抗炎、抗氧化、防衰老等作用，还可潜在地用于药物和功能食品中。基于原儿茶酸的优异特性，其在医药、饲料、环保等领域的需求量不断增长，具有十分明显的生产意义。而植物提取的方法价格昂贵且产率低；化学合成法是市场目前普遍采用的方法，但其产生过多三废，不符合我国环保国情；采取的生物合成法使用廉价原料和易操作底盘细胞，具有成本低、能耗低，绿色环保等优势。
生物合成原儿茶酸的研究有Okai等利用过生产苯丙氨酸的谷氨酸棒状杆菌ATCC21420菌株，通过模拟大肠杆菌莽草酸途径，过表达大肠杆菌CPL基因(Ubic)，终以分批补料方式喂养117.0g/L葡萄糖，培养72小时后产出1.14g/L原儿茶酸。Kallscheuer等以谷氨酸棒状杆菌MB001(DE3)为底盘细胞，敲除nagIKL-nagR-nagT-genH(cg3349-c54)基因簇，以防止目的化合物对羟基苯甲酸和原儿茶酸的降解，再通过表达天然编码转酮醇酶基因(tkt)，以葡萄糖为底物，优化后生产2.0g/L原儿茶酸。Luo等利用电脑设计大肠杆菌莽草酸代谢途径，将大肠杆菌遗传中心株系4474敲除莽草酸脱氢酶(aroG)阻断下游合成途径，再通过自身启动子与强启动子交换，产生4.74g/L原儿茶酸。Weber等描述了在工程酵母中通过异种生物合成途径，将芳香氨基酸生物合成途径的中间体3-脱氢莽草酸合成原儿茶酸和邻苯二酚，再转化为顺,顺-己二酸。Curran等利用BY4741酵母菌株，敲除aro3，aro4基因，进行强启动子替换，过表达经密码子优化的莽草酸脱水酶和邻苯二酚-1,2-加双氧酶，经40g/L的葡萄糖发酵培养后，产生约0.3g/L的原儿茶酸。原儿茶酸从头合成通常伴随着对宿主细胞的毒性，这可能会导致非完全的生长和产量。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种生产原儿茶酸的大肠杆菌工程菌构建方法。该方法可使原儿茶酸达最大收率，具有广阔的工业化应用前景。
为此，在本发明的一方面，本发明提出了一种生产原儿茶酸的大肠杆菌工程菌构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
PCR扩增获取PmLAAD、HmaS、HMO、BFD、HFD1、HpaBC、PobA七种基因，将PmLAAD和HmaS基因双片段、HMO和BFD基因双片段用BsaI酶切，随后分别连接进入经BamHI和XhoI双酶切的表达载体pETDuet-1、pCDFDuet-1，得到质粒pET-PmLAAD-HmaS和质粒pCDF-HMO-BFD；将HFD1酶切后，连接进入表达载体pRSFDuet-1中得到质粒pRSF-HFD1；将HpaBC、PobA基因单片段酶切，分别连接经BamHI和XhoI双酶切的pACYCDuet-1载体，获得质粒pACYC-HpaBC和质粒pACYC-PobA；
将质粒pET-PmLAAD-HmaS、质粒pCDF-HMO-BFD、质粒pRSF-HFD1和质粒pACYC-HpaBC共同转入大肠杆菌MG1655 RARE感受态细胞中，得到第一重组大肠杆菌工程菌MG1655-PCA1；
将质粒pET-PmLAAD-HmaS、质粒pCDF-HMO-BFD、质粒pRSF-HFD1和质粒pACYC-PobA共同转入大肠杆菌MG1655 RARE感受态细胞中，得到第二重组大肠杆菌工程菌MG1655-PCA2。
根据本发明实施例的一种生产原儿茶酸的大肠杆菌工程菌构建方法，该方法表达6种酶：L-α-氨基酸转氨酶(L-α-amino acid deaminase,PmLAAD)、羟基扁桃酸合成酶(hydroxymandelate synthase,HmaS)、羟基扁桃酸氧化酶(hydroxymandelate oxidase,HMO)、苯甲酰甲酸脱羧酶(benzoylformate decarboxylase,BFD)、乙醛脱氢酶(aldehydedehydrogenase,HFD1)和大肠杆菌羟化酶(two-component flavin-dependentmonooxygenase,HpaBC)的一株菌培养12h后，生产摩尔收率达64.4％的原儿茶酸；含有替代大肠杆菌羟化酶的4-羟基苯甲酸羟化酶(4-hydroxybenzonate hydroxylase,PobA)的6种酶级联催化后生产接近100％收率的原儿茶酸。
在本发明的第二个方面，本发明提出了由上述方法构建的生产原儿茶酸的大肠杆菌工程菌。
在本发明的第三个方面，本发明提出由上述生产原儿茶酸的大肠杆菌工程菌用于生产原儿茶酸的用途。
在本发明的第四个方面，本发明提出由上述的生产原儿茶酸的大肠杆菌工程菌生产原儿茶酸的方法，其包括以下步骤：
将第一重组大肠杆菌工程菌和第二重组大肠杆菌工程菌分别进行活化和扩大培养，先接种于LB培养基中，之后按1:100比例将过夜培养物转接入TB培养液中培养，然后加入诱导剂进行诱导培养，离心收集细胞；
采用10g/L新鲜细胞干重，5mM L-酪氨酸底物，20g/L葡萄糖，磷酸盐缓冲液反应体系，在30℃，250rpm下催化1～12h，每隔两小时液相色谱检测原儿茶酸产量。
根据本发明实施例的生产原儿茶酸的方法，其以L-酪氨酸为底物生产高产率原儿茶酸。生产可接近100％收率的原儿茶酸，达到了大肠杆菌重组菌株生产原儿茶酸的最大收率，具有广阔的工业化应用前景。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为根据本发明实施例的PmLAAD、HmaS、HMO、BFD、HFD1、HpaBC六种酶催化合成原儿茶酸路径；
图2为根据本发明实施例的PobA替代HpaBC六种酶催化合成原儿茶酸路径；
图3为根据本发明实施例的第一重组大肠杆菌菌株MG1655-PCA1生产原儿茶酸的时间曲线图；
图4为根据本发明实施例的第二重组大肠杆菌菌株MG1655-PCA2生产原儿茶酸的时间曲线图；
图5为根据本发明实施例的第一重组大肠杆菌菌株MG1655-PCA1催化反应12h的HPLC验证图；
图6为根据本发明实施例的第二重组大肠杆菌菌株MG1655-PCA2催化反应12h的HPLC验证图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得；涉及的实验如无特别说明，均为常规实验方法。
所用材料来源：大肠杆菌菌株MG1655 RARE和TOP10为市售，大肠杆菌菌株MG1655RARE用于本发明中所有基因的表达，TOP10用于载体构建。大肠杆菌表达载体pETDuet-1，pCDFDuet-1,pRSFDuet-1,pACYCDuet-1来源于Novagen，Phusion高保真DNA聚合酶、限制性内切酶购买自厦门鹭隆生物科技发展有限公司。质粒提取试剂盒、DNA纯化试剂盒、胶回收试剂盒和细菌基因组DNA提取试剂盒购买自上海生物工程有限公司。
LB培养基组成为：10g L-1蛋白胨、5g L-1酵母粉、5g L-1NaCl，余量为双蒸水，0.1Mpa压力121℃下灭菌20min。
TB培养基组成为：12g L-1蛋白胨、24g L-1酵母粉、2.31g L-1KH2PO4、12.54g L- 1K2HPO4、0.4％甘油，余量为双蒸水，培养基在0.1Mpa压力121℃下灭菌20min。
本发明实施例的羟基酪醇生物合成路径见图1和图2：
以L-酪氨酸为底物，通过L-α-氨基酸脱氨酶LAAD催化合成4-羟基苯丙酮酸，4-羟基苯丙酮酸在大肠杆菌羟化酶的作用下生成3,4-二羟基苯丙酮酸，经羟基扁桃酸合酶HmaS的催化作用下合成3,4-二羟基扁桃酸，再经羟基扁桃酸氧化酶HMO、苯甲酰甲酸脱羧酶BFD的催化下合成3,4-二羟基苯甲醛，最后在醇脱氢酶HFD1作用下合成原儿茶酸。由于HpaBC酶具有底物广泛性，会伴随着副产物产生，将4-羟基苯甲酸羟化酶PobA替代HFD1，可避免副产物积累。
为减少中间产物苯甲醛的还原，本发明以大肠杆菌MG1655 RARE为生产宿主，MG1655 RARE三个编码醇脱氢酶/醛酮还原酶的基因(ΔendA ΔrecA derivative withΔdkgBΔyeaEΔ(yqhC-dkgA)ΔyahK andΔyjgB)均被敲除。
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
实施例1构建重组大肠杆菌
1、构建pET-PmLAAD-HmaS质粒：以核苷酸序列为SEQ ID No:17的合成PmLAAD基因为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列为上、下游引物(表1)，PCR扩增PmLAAD所示基因片段，以核苷酸序列为SEQ ID No:18的合成HmaS基因为模板，以SEQ ID NO:03和SEQID NO:04为引物PCR扩增HmaS基因片段，胶回收目的条带；随后在37℃，BsaI酶切2小时后；PCR纯化回收酶切片段；将纯化回收的片段与经过BamHI和XhoI双酶切的表达载体pETDuet-1连接，16℃连接1小时转入大肠杆菌Top10感受态细胞中，之后用T7 universival引物验证获取阳性克隆菌落，提取pET-PmLAAD-HmaS质粒。
2、构建pCDF-HMO-BFD质粒
以SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示序列为引物(表1)，以天蓝链霉菌M145(Streptomyces coelicolor M145)基因组为模板，PCR扩增BFD基因；以SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10所示序列为引物，以恶臭假单胞菌KT2440基因组为模板扩增获得HMO基因片段，将HMO和BFD基因片段用BsaI酶切，随后连接进入经过BamHI和XhoI双酶切的表达载体pCDFDuet-1，得到质粒pCDF-HMO-BFD。
3、构建pRSF-HFD1质粒
以SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示序列为上、下游引物(表1)，以酿酒酵母BY4741基因组为模板扩增HFD1基因，将HFD1基因片段用BamHI和XhoI酶切，随后连接进入经过BamHI和XhoI双酶切的表达载体pRSFDuet-1,得到质粒pRSF-HFD1。
4、构建pACYC-HpaBC质粒
以SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示序列为上、下游引物(表1)，以大肠杆菌全基因组为模板扩增HpaBC基因，将HpaBC基因片段用BamHI和XhoI酶切，随后连接进入经过BamHI和XhoI双酶切的表达载体pACYCDuet-1,得到质粒pACYC-HpaBC。
5、构建pACYC-PobA质粒
以SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示序列为上、下游引物(表1)，以恶臭假单胞菌KT2440基因组为模板扩增PobA基因，将PobA基因片段用BamHI和XhoI酶切，随后连接进入经过BamHI和XhoI双酶切的表达载体pACYCDuet-1,得到质粒pACYC-PobA。
6、获取大肠杆菌重组菌株MG1655-PCA1
将上述1、2、3、4获取的pET-PmLAAD-HmaS、pCDF-HMO-BFD、pRSF-HFD1和pACYC-HpaBC质粒电击法导入大肠杆菌MG1655 RARE菌种中，以含有氨苄霉素、卡纳霉素、壮观霉素和氯霉素四种抗生素的培养基中筛选，获取阳性克隆MG1655-PCA1大肠杆菌重组菌株。
7、获取大肠杆菌重组菌株MG1655-PCA2
将上述1、2、3、5获取的pET-PmLAAD-HmaS、pCDF-HMO-BFD、pRSF-HFD1和pACYC-PobA质粒电击法导入大肠杆菌MG1655 RARE菌种中，以含有氨苄霉素、卡纳霉素、壮观霉素和氯霉素四种抗生素的培养基中筛选，获取阳性克隆MG1655-PCA2大肠杆菌重组菌株。
表1：PCR扩增所用引物
Figure GDA0003504972280000071
Figure GDA0003504972280000081
实施例2全细胞生物转化重组菌株
将实施例1制备的MG1655-PCA1菌株接种在2ml LB培养液中，之后按1:100比例接入TB培养液中扩大培养2-3h后，OD600达0.4-06后，加入0.5mM IPTG后低温诱导蛋白表达16-24h，离心获取菌体。按1ml的反应体系催化(10g/L细胞干重、5mM底物L-酪氨酸、20g/L葡萄糖)，最后加入磷酸缓冲液补齐(200mM，pH＝8.0)，全细胞催化1-12h后，液相色谱检测原儿茶酸产量。
将实施例1制备的MG1655-PCA2菌株接种在2ml LB培养液中，之后按1:100比例接入TB培养液中扩大培养2-3h后，OD600达0.4-06后，加入0.5mM IPTG后低温诱导蛋白表达16-24h，离心获取菌体。按1ml的反应体系催化(10g/L细胞干重、5mM底物L-酪氨酸、20g/L葡萄糖)，最后加入磷酸缓冲液补齐(200mM，pH＝8.0)，全细胞催化1-12h后，液相色谱检测原儿茶酸产量。
产品定量分析：转化液采用Shimadzu高效液相色谱仪检测分析，采用光电二极管阵列检测器(工作波长210nm)；色谱条件为：流动相是50％甲醇，30％乙腈(含0.1％三氟乙酸)、采用Shimadzu C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流速1ml/min、柱温40℃、进样量10μL；流动相：70％双蒸水，0.1％三氟乙酸，30％乙腈。
结果如图3-图6所示，将MG1655-PCA1菌株以5mM L-酪氨酸全细胞催化后，得到3.22mM原儿茶酸，摩尔收率为64.4％；MG1655-PCA1菌株同等条件全细胞催化后，得到5.03mM原儿茶酸，摩尔收率>99％。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
序列表
<110> 厦门大学
<120> 一种生产原儿茶酸的大肠杆菌工程菌构建方法及应用
<130> 无
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttggtctcgg atccgatgaa catttcacgt cgcaagc 37
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttggtctcat cctttacttc ttaaaacgat ccaaac 36
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttggtctcaa ggagatatat tatgcagaat ttcgaaatc 39
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttggtctcct cgagctaacg cctcgcggct cc 32
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttggtctcgg atccgatgcg tgaaccgctg acgc 34
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttggtctcat cctttagccg tgagaacgat cg 32
<210> 7
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttggtctcaa ggagatatat aatggcttcg gtacacggc 39
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cacccggaga ctgtgttcga c 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtcgaacaca gtctccgggt g 21
<210> 10
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttggtctcct cgagctactt caccgggctt acgg 34
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cgggatccga tgtcaaacga cggctca 27
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agagactcga gtcaggaaga acaatgagcg 30
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agagactcga gtcaggaaga acaatgagcg 30
<210> 14
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ttggtctcat cctttaaatc gcagcttcca tttc 34
<210> 15
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ttggtctcgg atccgatgaa aactcaggtt gcaattattg 40
<210> 16
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ttggtctcct cgagtcaggc aacttcctcg aacg 34
<210> 17
<211> 1422
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
atgaacattt cacgtcgcaa gctgctgctg ggtgttggtg ctgctggtgt gttggcgggt 60
ggtgcagctc tggttccaat ggtgcgtcgt gatggtaaat ttgttgaagc aaagagccgt 120
gcgagcttcg tggaaggtac ccaaggtgcg ctgccgaaag aagctgacgt tgtgattatc 180
ggtgctggta ttcagggtat catgaccgct attaatctgg cagaacgtgg tatgagcgtt 240
accattctgg aaaagggtca aatcgcaggt gaacagagcg gtcgtgcgta cagccaaatt 300
atcagctatc agaccagccc ggaaattttt ccgctgcatc actacggtaa aatcctgtgg 360
cgtggtatga acgaaaagat tggtgcggat accagctatc gtacccaagg tcgtgttgaa 420
gctctggcag atgaaaaagc actggacaag gcgcaggctt ggatcaaaac cgcgaaggaa 480
gctgcaggtt ttgacacccc gctgaatacc cgtattatca aaggtgaaga actgagcaac 540
cgtctggttg gtgctcaaac cccgtggacc gtggctgctt tcgaagaaga tagcggtagc 600
gttgacccgg aaaccggtac cccggcactg gctcgttacg ctaaacagat tggtgttaag 660
atctatacca actgcgctgt gcgtggtatt gaaaccgcgg gtggtaaaat cagcgatgtt 720
gtgagcgaaa aaggtgcgat caagaccagc caagtggtgc tggcgggtgg tatttggagc 780
cgtctgttta tgggtaatat gggtattgac atcccgaccc tgaacgttta cctgagccaa 840
caacgtgtta gcggtgtgcc aggtgcgccg cgtggtaatg tgcatctgcc gaacggtatc 900
cactttcgtg aacaagctga tggtacctat gctgttgcac cgcgtatttt caccagcagc 960
atcgtgaaag acagctttct gctgggtccg aagttcatgc atctgctggg tggtggtgaa 1020
ctgccgctgg aattttctat cggtgaagac ctgtttaata gcttcaaaat gccgaccagc 1080
tggaacctgg acgaaaagac cccgtttgaa caattccgtg ttgcgaccgc tacccaaaat 1140
acccagcacc tggatgcagt ttttcagcgt atgaaaaccg aatttccggt gttcgaaaag 1200
agcgaagttg tggaacgttg gggtgctgtt gtgagcccga ccttcgacga actgccgatt 1260
atcagcgaag ttaaggaata cccgggtctg gttattaaca ccgctaccgt gtggggtatg 1320
accgaaggtc cggcagcggg tgaagttacc gcagatattg tgatgggtaa aaagccggtt 1380
attgatccga ccccgtttag tttggatcgt tttaagaagt aa 1422
<210> 18
<211> 1074
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
atgcagaatt tcgaaatcga ctatgttgag atgtatgtgg agaatctgga agtggcggct 60
ttctcatggg tcgacaagta cgcattcgcc gtggctggta cgagccgttc agcggaccac 120
aggagcatcg cgttgagaca agggcaggtg acacttgttc ttactgaacc gacgtcagat 180
agacatccgg ccgccgcgta tttgcagact catggcgatg gtgtagcgga tattgctatg 240
gccacctccg acgttgctgc ggcctacgag gcggcagtac gtgccggtgc tgaagctgtt 300
agagcaccag ggcaacacag tgaagctgct gtgacgaccg cgaccatagg tgggtttgga 360
gatgtcgtcc atactctgat ccaaagggac ggcactagcg ctgaattacc ccccggattt 420
accggctcca tggacgttac gaaccatggt aaaggagacg tagatcttct ggggatagat 480
cactttgcga tatgtcttaa cgccggagat ctgggaccta ctgtggaata ctacgagaga 540
gctttaggtt ttaggcaaat atttgacgag catatagttg ttggcgctca ggcgatgaac 600
tcaactgtcg tgcaaagtgc gagtggggcg gtaacactaa ccttgataga acccgatcgt 660
aatgccgacc ccgggcaaat tgatgagttc ctaaaagatc accagggtgc gggtgtgcag 720
cacatcgcct ttaattctaa tgacgctgtg cgtgcagtga aagcactgtc agagagaggg 780
gtcgagtttt tgaaaacccc gggggcgtat tacgatcttc taggagagag aataaccctg 840
caaacgcata gtctggatga tttgagagcg accaatgttt tggcagatga ggatcacgga 900
ggtcaacttt ttcaaatctt cacagcgagt acgcacccaa gacacaccat tttttttgaa 960
gtcatcgaaa gacaaggagc gggcactttt ggttccagta atatcaaggc tttatatgag 1020
gcagtggaac tagaacgtac aggtcaaagt gagtttggag ccgcgaggcg ttag 1074

Claims (4)

1.一种生产原儿茶酸的大肠杆菌工程菌构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
PCR扩增获取PmLAAD、HmaS、HMO、BFD、HFD1、PobA六种基因，将PmLAAD和HmaS基因双片段、HMO和BFD基因双片段用BsaI酶切，随后分别连接进入经BamHI和XhoI双酶切的表达载体pETDuet-1、pCDFDuet-1，得到质粒pET-PmLAAD-HmaS和质粒pCDF-HMO-BFD；将HFD1酶切后，连接进入表达载体pRSFDuet-1中得到质粒pRSF-HFD1；将PobA基因单片段酶切，连接经BamHI和XhoI双酶切的pACYCDuet-1载体，获得质粒pACYC-PobA；其中，PmLAAD基因是以核苷酸序列为SEQ ID No:17的合成PmLAAD基因为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2所示序列为引物进行PCR扩增；HmaS基因是以核苷酸序列为SEQ ID No:18的合成HmaS基因为模板，以SEQ ID NO:03和SEQ ID NO:04所示序列为引物进行PCR扩增；BFD基因是以天蓝链霉菌M145基因组为模板，以SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6所示序列为引物进行PCR扩增；HMO基因是以恶臭假单胞菌KT2440基因组为模板，以SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10所示序列为引物进行PCR扩增；HFD1基因是以酿酒酵母BY4741基因组为模板，以SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示序列为引物进行PCR扩增；PobA基因是以恶臭假单胞菌KT2440基因组为模板，以SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示序列为引物进行PCR扩增；
将质粒pET-PmLAAD-HmaS、质粒pCDF-HMO-BFD、质粒pRSF-HFD1和质粒pACYC-PobA共同转入大肠杆菌MG1655 RARE感受态细胞中，得到重组大肠杆菌工程菌MG1655-PCA2。
2.权利要求1所述的方法构建的生产原儿茶酸的大肠杆菌工程菌。
3.权利要求2所述的大肠杆菌工程菌用于生产原儿茶酸的用途。
4.一种使用权利要求2所述的大肠杆菌工程菌生产原儿茶酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将重组大肠杆菌工程菌进行活化和扩大培养，先接种于LB培养基中，之后按1:100比例将过夜培养物转接入TB培养液中培养，然后加入诱导剂进行诱导培养，离心收集细胞；
采用10 g/L新鲜细胞干重，5 mM L-酪氨酸底物，20 g/L葡萄糖，磷酸盐缓冲液反应体系，在30℃，250 rpm下催化1~12 h，每隔两小时液相色谱检测原儿茶酸产量。
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