CN102197141A

CN102197141A - 制备光学活性胺衍生物的方法

Info

Publication number: CN102197141A
Application number: CN2009801428589A
Authority: CN
Inventors: 长泽透; 吉田丰和; 石田浩一; 山本浩明; 木本训弘
Original assignee: Daicel Chemical Industries Ltd
Current assignee: Daicel Corp
Priority date: 2008-09-01
Filing date: 2009-09-01
Publication date: 2011-09-21
Also published as: WO2010024445A1; EP2330210A1; US20110262977A1; KR20110049907A; JPWO2010024445A1

Abstract

本发明通过使能够立体选择地还原亚胺衍生物的微生物培养物、微生物菌体或其处理物与亚胺衍生物作用来制备光学活性胺衍生物，然后回收所产生的光学活性胺衍生物。本发明中获得的光学活性胺衍生物作为药物的原料是有用的。本发明能够制备例如式(IV)代表的光学活性化合物(式中，R基团代表具有1～3个碳原子的烷基；以及n代表1～4的整数)。

Description

制备光学活性胺衍生物的方法

技术领域

本发明涉及通过立体选择地还原亚胺衍生物来制备光学活性胺衍生物的方法，该光学活性胺衍生物用作合成各种药物的原料或中间体。

背景技术

除了下述报道以外，对有关通过立体选择地还原亚胺衍生物来制备光学活性胺衍生物的方法知之甚少。

非专利文献1：Tetrahedron Asymmetry，19，93-96，2008

Reduction of N-benzylidenebenzylamine by Acetobacterium woodi

然而，由于N-亚苄基苯甲胺(N-benzylidenebenzylamine)的还原产物没有手性，所以还不清楚该反应的立体选择性。此外，近平滑假丝酵母还原N-((E)-N-(1-苯基亚乙基)苯胺衍生物的效率非常低，因此并不适于工业应用。另外，还没有鉴别出负责所述亚胺还原的酶。

另一方面，已知下面的方法可用于制备2-甲基吡咯烷：

非专利文献2：Acta.Pharm.Suec.，15，255-263，1978

使用酒石酸，通过光学拆分外消旋2-甲基吡咯烷来制备手性2-甲基吡咯烷的方法，其中，外消旋2-甲基吡咯烷是使用硼氢化钠还原2-甲基-1-吡咯啉来制备的。

非专利文献3：J.Org.Chem.，54，209-216，1989。

制备2-甲基吡咯烷的方法，其中，使用亚硫酰氯将L-脯氨酸衍生的L-脯氨醇(L-prolinol)的羟基转变为氯基团；用苄氧基羰基保护氮原子；然后使用三正丁基氢锡(tributyltin hydride)，通过基于自由基(radical)的还原来制备(R)-1-苄氧基羰基-2-甲基吡咯烷，然后进行脱保护。

专利文献1：WO2005/073388

制备2-甲基吡咯烷的方法，其中光学活性1，4-戊二醇转变为二磺酸酯，并通过与胺反应进行环化。

然而，所有这些方法均具有下面的问题：

-过程长；

-使用危险的氢化物试剂；

-以及由于通过拆分方法制备产物，因此产率不超过50％

[现有技术文献]

[非专利文献]

[非专利文献1]Tetrahedron Asymmetry，19，93-96(2008)

[非专利文献2]Acta.Pharm.Suec.，15，255-263(1978)

[非专利文献3]J.Org.Chem.，54，209-216(1989)

[专利文献]

[专利文献1]WO2005/073388

发明内容

[本发明要解决的问题]

本发明的目的是提供由亚胺衍生物来制备光学活性胺衍生物的方法。本发明的另一个目的是提供微生物和酶，这些微生物和酶能够使用亚胺衍生物作为底物来制备光学活性胺衍生物。本发明的另一个目的是通过分离编码具有目标性质的酶的DNA来获得重组体。本发明的又一个目的是提供使用重组体来制备光学活性胺衍生物的方法。

[解决问题的方法]

本发明人进行了深入研究，从而发现了符合上述这些先进需要的方法。结果，本发明人发现，可以使用微生物的立体选择地进行还原的能力，通过立体选择地还原亚胺衍生物来制备光学活性胺衍生物。

如上所述，已知涉及立体选择地还原亚胺衍生物的生物合成的酶。然而，所有已知的酶都与代谢有关。因此，当酶用于制备药物中间体或诸如此类的物质时，不能预期工业应用需要的底物特异性和活性。尤其是，没有利用还原环状烷基亚胺衍生物(例如2-甲基-1-吡咯啉)来制备光学活性环状烷基胺衍生物的合适方法。

因此，令人非常惊讶的是发现了具有底物特异性和催化活性的微生物，其适于制备药物等的中间体。更意外的是，微生物的立体选择地还原亚胺的能力十分地高，并且满足工业应用的需要。例如，链霉菌(Streptomycessp.)GF3546是具有解决上述问题的有用性质的微生物。本发明人利用大量GF3546的培养物来制备无细胞提取物，然后通过进行下述步骤成功地纯化了亚胺还原酶：

-使用苯基琼脂糖凝胶(Phenylsepharose)的疏水色谱；和

-使用MonoQ的离子交换色谱。

此外，本发明人分离了编码亚胺还原酶的DNA，然后制备了高水平表达该酶的重组细菌，从而完成了本发明。

具体地说，本发明提供了下述制备光学活性胺的方法。本发明还涉及可用于该方法的微生物和亚胺还原酶，包含编码这种酶的DNA的多核苷酸，制备该酶的方法。

[1]一种亚胺还原酶，其具有下述物理化学性质(1)～(5)：

(1)活性：以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(在下文简写为NADPH)-依赖性方式还原2-甲基-1-吡咯啉从而产生(S)-2-甲基吡咯烷，和以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(在下文简写为NADP⁺)-依赖性方式氧化(S)-2-甲基吡咯烷，从而产生2-甲基-1-吡咯啉；

(2)辅酶依赖性：使用NADPH作为还原反应的辅酶，使用NADP⁺作为氧化反应的辅酶；

(3)最适pH值：针对还原为pH 7.4～8.0，针对氧化为pH 10.5；

(4)最适温度：针对还原为35～45℃；和

(5)分子量：利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(在下文简写为SDS-PAGE)约为30500，利用凝胶过滤法约为81500；

[2]一种亚胺还原酶，其具有[1]项的物理化学性质(1)和(2)，并且其由下面(a)～(e)中所述的任意多核苷酸编码：

(a)包括SEQ ID NO：2所述的核苷酸序列的多核苷酸；

(b)编码蛋白质的多核苷酸，其中该蛋白质包括SEQ ID NO：3所述的氨基酸序列；

(c)编码蛋白质的多核苷酸，其中该蛋白质包括在SEQ ID NO：3所述的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列；

(d)在严格条件下与DNA杂交的多核苷酸，其中该DNA包括SEQ IDNO：2所述的核苷酸序列；以及

(e)编码氨基酸序列的多核苷酸，其中该氨基酸序列与SEQ ID NO：3所述的氨基酸序列具有80％或更高的序列同一性；

[3]制备光学活性S-异构体胺衍生物的方法，该方法包括下述步骤：

使式(I)代表的亚胺衍生物与至少一种选自下述的酶活性物质接触：[1]或[2]项的亚胺还原酶、产生该亚胺还原酶的微生物和其处理物；以及

回收式(II)代表的光学活性S-异构体胺衍生物：

(其中R1和R2基团各自代表具有1～3个碳原子的烷基；R3基团代表氢或具有1～3个碳原子的烷基；以及R1和R3任选一起形成环)；

[4]制备光学活性S-异构体胺衍生物的方法，该方法包括下述步骤：

使式(I)代表的亚胺衍生物与至少一种选自下述的酶活性物质接触：能够立体选择地还原该化合物的微生物的培养物、菌体和其处理物；以及

回收式(II)代表的光学活性S-异构体胺衍生物：

[5][4]项所述的方法，其中式(I)的化合物是下式(III)代表的亚胺衍生物，式(II)的化合物是式(IV)代表的胺衍生物：

(其中R基团代表具有1～3个碳原子的烷基；以及n代表1～4的整数)；

[6][5]项所述的制备光学活性S-异构体胺衍生物的方法，其中式(III)代表的化合物是2-甲基-1-吡咯啉，式(IV)代表的化合物是2-甲基吡咯烷；

[7][4]～[6]项中任一项所述的制备光学活性S-异构体胺衍生物的方法，其中所述微生物属于链霉菌属(Streptomyces)；

[8][4]～[6]项中任一项所述的制备光学活性S-异构体胺衍生物的方法，其中所述微生物是链霉菌(Streptomyces sp)；

[9][4]～[6]项中任一项所述的制备光学活性S-异构体胺衍生物的方法，其中所述微生物是链霉菌NITE P-593；

[10]一种多核苷酸，其编码具有[1]项的物理化学性质(1)和(2)的亚胺还原酶，其是下面多核苷酸中的任意多核苷酸：

(a)包括SEQ ID NO：2所述的核苷酸序列的多核苷酸；

[11]一种重组载体，其插入有[10]项所述的多核苷酸；

[12][11]项所述的重组载体，其还插入有编码脱氢酶的多核苷酸，所述脱氢酶能够使用NADP⁺作为辅酶催化氧化还原反应；

[13][12]项所述的载体，其中所述脱氢酶是葡糖脱氢酶；

[14][12]项所述的重组载体，其中所述葡糖脱氢酶来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；

[15]一种转化体，其以能表达的方式保持[10]项所述的多核苷酸或[12]项所述的载体；和

[16]制备由[10]项所述的多核苷酸所编码的蛋白质的方法，该方法包括培养[15]项所述的转化体并回收表达产物的步骤。

[本发明的效果]

本发明提供了有效制备光学活性胺(S)异构体的方法，该方法使用微生物的还原能力、通过立体选择地还原亚胺来进行。本发明还提供了催化该反应的亚胺还原酶。另外，通过分离编码上述亚胺还原酶的DNA，本发明提供了高水平表达该酶的重组细菌。使用微生物的高立体选择性的本发明方法在工业上是有利的，这是因为作为底物来合成光学活性胺的亚胺衍生物能够以较低的成本合成。本发明对于制备(S)-2-甲基吡咯烷特别有用。(S)-2-甲基吡咯烷是在药物合成中用作中间体的有用化合物。通过使用微生物或酶的活性，本发明能够简单、有效地制备所述化合物。

附图说明

图1是示出分子系统树的图，该分子系统树基于链霉菌GF3546的16SrDNA(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列构建。

图2是示出链霉菌GF3546还原2-甲基-1-吡咯啉(2-MPN)的结果的图。纵轴表示所产生的(S)-2-甲基吡咯烷的量(mM)，而横轴表示反应时间(小时)。

图3是示出评价链霉菌GF3546来源的亚胺还原酶的最适pH值(还原)的结果的图。纵轴表示将最大活性视为100时的相对活性(％)，而横轴表示酶反应混合物的pH值。

图4是示出评价链霉菌GF3546来源的亚胺还原酶的最适pH值(氧化)的结果的图。纵轴表示将最大活性视为100时的相对活性(％)，而横轴表示酶反应混合物的pH值。

图5是示出评价链霉菌GF3546来源的亚胺还原酶的最适温度(还原)的结果的图。纵轴表示将最大活性视为100时的相对活性(％)，而横轴表示酶反应混合物的温度(℃)。

图6是示出插入有链霉菌GF3546来源的亚胺还原酶基因的质粒(pSUS2MP1)的构建过程的图。

图7是示出插入有链霉菌GF3546来源的亚胺还原酶基因和芽孢杆菌属来源的葡糖脱氢酶基因的质粒(pSG-S2MP)的构建过程的图。

具体实施方式

本发明涉及制备光学活性S-异构体胺衍生物的方法，该方法包括下述步骤：

使式(I)代表的亚胺衍生物与至少一种选自下述的酶活性物质接触：具有立体选择地还原所述化合物能力的微生物的培养物、菌体、和其处理物；以及

回收式(II)代表的光学活性S-异构体胺衍生物。

(其中R1和R2基团各自代表具有1～3个碳原子的烷基；R3基团代表氢或具有1～3个碳原子的烷基；以及R1和R3任选一起形成环)。

在本发明中，环状亚胺化合物优选是式(I)的化合物。在本发明中，环状亚胺化合物包括，例如，下式(III)代表的亚胺衍生物。

(其中R基团代表具有1～3个碳原子的烷基；以及n代表1～4的整数)。

作为光学活性胺衍生物，式(IV)代表的化合物可以通过使用上式(III)所代表的化合物作为底物来制备。优选，所述化合物是可以按照本发明制备的光学活性胺衍生物。

在本发明优选的化合物中，例如，在上式(III)中，R是甲基、乙基或丙基，以及n是2或3。更具体来说，本发明优选的亚胺衍生物包括：

2-甲基-1-吡咯啉；

2-甲基-1-四氢吡啶(piperideine)；

2-乙基-1-吡咯啉；和

2-乙基-1-四氢吡啶。

如下所示的光学活性胺衍生物可以使用上述化合物作为底物来制备。

2-甲基-1-吡咯啉→(S)-2-甲基吡咯烷

2-甲基-1-四氢吡啶→(S)-2-甲基哌啶

2-乙基-1-吡咯啉→(S)-2-乙基吡咯烷

2-乙基-1-四氢吡啶→(S)-2-乙基哌啶

在本文中，立体选择地还原亚胺衍生物的能力是指：使用上式(I)所代表或优选式(III)所代表的亚胺衍生物作为底物来产生S-异构体胺衍生物的能力。本发明的微生物可以是任何微生物，只要它可以产生S-异构体胺衍生物即可。通过比较例如属于下述微生物中的微生物产生S-异构体胺衍生物的能力，可以获得这种本发明的微生物。

例如，在含化合物(I)(优选化合物(III))所代表的亚胺衍生物的培养基中培养测试微生物，然后对培养物进行分析，以测定所产生的光学活性胺衍生物的光学纯度。结果，如果能够证明形成了光学活性(S)-胺衍生物，则该微生物可以在本发明中使用。

或者，预先让测试微生物在培养基中生长，收集微生物菌体，并悬浮在合适的缓冲液中。然后，使菌体与化合物(I)(优选化合物(III))所代表的亚胺衍生物接触并反应。测定在反应缓冲液中所产生的光学活性胺衍生物的光学纯度。当证明生成光学活性胺衍生物时，则该微生物可以在本发明中使用。在这种情况下，在培养试验微生物期间，当将化合物(I)(优选化合物(III))加入到培养基中时，可以预期诱导出用于还原该化合物的酶。此外，当在反应期间加入还原能量源时，可以预期产物会更为有效的积累。用于还原的这种能源通常包括葡萄糖。

例如，利用下面的方法，可以评价微生物还原2-甲基-1-吡咯啉的能力。在合适培养基(如果需要包含2-甲基-1-吡咯啉)中培养微生物。将得到的菌体悬浮在反应混合物中，反应混合物可以含10mM 2-甲基-1-吡咯啉、25mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)，以及根据需要含葡萄糖。将该悬浮液在25℃振荡24小时，然后通过TLC或HPLC分析产物。

TLC条件包括，例如如下方法，使用硅胶60F254平板，并且使用展开剂1-丁醇/乙酸/水＝2/1/1进行展开，然后使用茚三酮进行显色反应。

例如利用下面的方法，可以测定所产生的胺衍生物的光学纯度。

将下述组份加入到50μl测试样品中并在40℃温育该混合物1小时，以用GITC衍生所产生的胺，然后通过HPLC分离并定量。

50μl的2mg/ml三乙胺和100μl的8mg/ml 2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡糖基异硫氰酸酯(GITC)

例如，可以在下述条件下进行HPLC。

-HPLC柱：Wakosil II 5C18(4.6mm x 150mm)，来自Wako Pure ChemicalIndustries

-洗脱缓冲液：10mM磷酸盐缓冲液(pH2.5)∶甲醇＝55∶45

-流速：1ml/min

-检测：254nm处的UV吸光度

在上述条件下，在26.3分钟时洗脱出(R)-2-甲基吡咯烷衍生物，而在24.9分钟时洗脱出(S)-2-甲基吡咯烷衍生物。

当然，使用具有高立体选择性的微生物来获得高光学纯度的产物是有利的。具体地说，可以使用能够合成光学纯度例如为60％，通常是70％或更高，优选80％或更高，且更优选90％或更高的光学活性S-异构体胺衍生物的微生物。

在本文中，“光学活性胺衍生物”是指胺衍生物，其中，某一类型的光学活性异构体比其它光学活性异构体的量更丰富。在本发明中，优选的光学活性胺衍生物具有例如60％光学纯度，通常是70％或更高，优选80％或更高，更加优选90％或更高的光学纯度(对映异构体过量(enantiomeric excess)(ee))。例如利用光学拆分柱，可以确定光学活性胺衍生物的光学纯度。通常，本发明的“光学活性异构体”泛指“光学活性物质”，有时还称为“对映异构体”。

例如，通过还原上式(I)代表的亚胺衍生物，属于链霉菌属的微生物产生S-异构体胺衍生物。

更具体来说，属于链霉菌属的微生物可以列举下述微生物。该微生物产生高光学纯度的(S)-胺衍生物，因此是本发明优选的微生物。

链霉菌GF3546。

该微生物保藏在下述保藏机构(保藏日期：2008年6月24日)。

(1)保藏机构的名称：独立行政法人制品评价技术基础机构

(2)地址：邮政编码：292-0818日本千叶县木更津市Kazusa镰足2-5-8

(3)识别显示和保藏号：

链霉菌GF3546

保藏号：NITE P-593

此外，基于布达佩斯条约，该微生物已经转入下述国际保藏机构。

(1)国际保藏机构：独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(NPMD)

(2)地址：邮政编码：292-0818日本千叶县木更津市Kazusa镰足2-5-8

(3)识别显示和保藏号：

链霉菌GF3546

保藏号：NITE BP-593(转交日期：2009年8月4日)

在本发明中，具有立体选择地还原上述式(I)或(III)所代表的亚胺衍生物能力的微生物不局限于上述保藏的菌株。这种微生物可以由各种微生物学来源获得。微生物学来源包括从自然环境中分离的那些以及保藏在微生物保藏机构中的那些。例如，链霉菌属的微生物是优选的具有立体选择地还原上述式(I)或(III)所代表亚胺衍生物能力的微生物。因此，例如，上述选择方法可用于从保藏在微生物保藏机构的链霉菌属中选择具有目标活性的微生物。保藏的这种微生物可以例如从下述保藏机构获得。

生物遗传资源中心(NBRC)

理化学研究所(JCM)

NODAI(东京农业大学)菌株保藏中心(IAM)

美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)

德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen)(DSM)

或者，可以基于核糖体DNA(rDNA)的核苷酸序列信息来选择本发明的微生物。众所周知，有关rDNA的核苷酸序列信息通常在生物体之间用作表征遗传距离的标志。特别是，编码16S rRNA的DNA(在下文简写为“16SrDNA”)已经被用作测定微生物之间的遗传同一性或同源性的工具。

16S rRNA存在于所有的生物体中。虽然生物体之间的结构不同，但序列特征可以保守到一定程度从而能够实现序列比对。16S rRNA在生物体之间的水平传递的频率较低，因此通常利用16S rRNA来对生物体进行分类。

具体地说，小亚基核糖体RNA(SSU rRNA)是构成蛋白质合成位点的核糖体的核酸分子。虽然核苷酸序列的长度稍有不同，但认为从细菌到人的核苷酸序列的起源是相同的。因此，在进化过程中，rRNA的核苷酸序列是高度保守的，并且在生物体的系统发生分析中是最常被使用的(Microbiol.Rev.，58，1-9(1994))。原核生物的SSU rRNA具有约1500个核苷酸。基于16S rRNA的核苷酸序列的系统分类学通常用于原核生物的鉴定和分类(ASM News，65，752-757(1999)；Seibutsu Kogaku Jikkensho(Experimental manual ofbioengineering)p.113，Ed.The Society of Biotechonogy，Japan，Baifukan)。

现行的放线菌的分类系统是基于16S rDNA的核苷酸序列的同源性形成的(Stackebrandt等人(1997)Int.J.Syst.Bacteriol.，47，479-491)。在主要的细菌系统分类中，基于16S rDNA的核苷酸序列的同源性，不但以属的水平、而且以种的水平来鉴定菌株(“Housenkin no Bunrui to Doutei(放线菌的鉴别和分类)”(The Society of Actinomycetes Japan)p.19)。

发现本发明人鉴定的菌株的16S rDNA包括SEQ ID NO：1的核苷酸序列。可以用这种核苷酸序列信息来检索核苷酸序列信息数据库，以从已经测定16S rDNA的微生物中发现在16S rDNA方面具有高度同源的核苷酸序列的菌株。公共数据库服务提供者，例如，DNA Data Bank of Japan(DDBJ)，提供面向16S rRNA(原核生物)的核苷酸序列信息的数据检索服务。在用这种方法展现的微生物当中，通过特别选择属于链霉菌属的微生物，并且可以在本发明中使用。如果需要的话，可以预先评价用上述方法选择的微生物对亚胺衍生物的活性。

这些微生物可以按照发酵学领域已知的方法来培养。培养基可以是合成或天然培养基，只要它包含合适量的碳源、氮源、无机物质及其它营养素即可。培养基可以是液体或固体培养基。

具体地说，考虑所使用的微生物的同化作用，从下述通常使用的碳源中适当地选择一种、两种或多种碳源。

糖：葡萄糖，果糖，麦芽糖，半乳糖；

天然碳水化合物：淀粉，淀粉水解产物，糖蜜，赤糖糊(blackstrapmolasses)，小麦，玉米等；

醇：甘油，甲醇，乙醇等；

有机酸：乙酸，葡糖酸，丙酮酸，酮戊二酸，柠檬酸等；

烃：正链烷(normal paraffin)等；和

脂质：棕榈油，大豆油，橄榄油等。

考虑所使用的微生物的同化作用，从下述通常使用的的氮源中适当地选择一个、两个或多个氮源。

有机氮化合物：肉膏，蛋白胨，酵母提取物，大豆水解产物，乳酪蛋白，酪蛋白氨基酸，各种氨基酸，玉米浆，其它动物、植物和微生物的水解产物等。

无机氮化合物：氨，硝酸铵，硫酸铵，氯化钠等铵盐或类似的物质，硝酸盐例如硝酸钠或类似的物质，脲等。

此外，可以使用诱导物质来提高微生物立体选择地还原亚胺衍生物的能力。根据所使用的微生物，亚胺衍生物可以用作诱导物质。

此外，可以适当地选择和使用无机盐，少量的一种或多种镁、锰、钾、钙、钠、铜、锌或类似物质的磷盐、盐酸盐、硝酸盐、乙酸盐等。另外，如果需要的话，可以将消泡剂例如植物油、表面活性剂和硅加入到培养基中。

这些细菌可以用常规培养方法，利用含有上述组份的液体培养基来进行培养。例如，可以使用下述培养方法。

振荡培养

通风搅拌培养

连续培养

流加培养，补料分批培养

可以根据微生物的类型、培养类型和培养方法来选择合适的培养条件。对条件没有特别限制，只要细菌可以利用该培养基生长、并且能够立体选择地还原亚胺衍生物即可。常规培养条件如下所述。

将培养的起始pH值调节至4～10，优选6～8。

培养温度是15～70℃，优选20～40℃。

对培养期没有特别限制，只要它能够使具有还原亚胺衍生物能力的微生物菌体得到增殖即可。常规的培养期是1～14天，优选1～7天。

本文中，“微生物菌体的处理物”是指在使微生物菌体保持目标酶活性的条件下处理微生物菌体所得到的物质。酶活性的保持是指：与活微生物菌体的酶活性相比较，一般20％，通常30％或更大，优选50％或更大，且更优选70％或更高的酶活性得到保持。通过检验活微生物菌体的活性和由相同量的活微生物菌体制备的处理物的活性，可以在活微生物菌体与其处理物之间对酶活性进行定量地比较。在某些情况下，本发明的处理物的酶活性可以比活微生物菌体的酶活性高。

制备这种处理物的方法包括冷冻干燥、用有机溶剂脱水干燥、微生物菌体的自溶作用、酶活性馏份的提取和超声处理。这种处理方法可以获得例如冷冻干燥的微生物菌体、丙酮干燥的微生物菌体、微生物菌体的自溶产物、微生物菌体的提取物、微生物菌体的破碎产物和微生物菌体的超声处理产物。

可以单独使用或组合使用这些处理方法。例如，在合适的培养基中培养微生物之后，可以将微生物菌体破碎，然后离心，制备无细胞提取物。可以将微生物菌体机械破碎或进行超声处理、高压处理、酶消化、自溶作用或类似的方法。无细胞提取物包括在本发明的微生物菌体的处理物中。

此外，在本发明中，可以通过部分或完全纯化微生物菌体来获得催化反应的酶。更具体来说，本发明涉及亚胺还原酶，其可以从本发明所提供的、具有亚胺还原酶活性的微生物的菌体中纯化。本发明的亚胺还原酶具有下述物理化学性质：

(1)活性：以NADPH-依赖性方式还原2-甲基-1-吡咯啉产生(S)-2-甲基吡咯烷，和以NADP⁺-依赖性方式氧化(S)-2-甲基吡咯烷产生2-甲基-1-吡咯啉；以及

(2)辅酶依赖性：使用NADPH作为还原辅酶，使用NADP⁺作为氧化辅酶。

在优选实施方案中，本发明人发现的亚胺还原酶除了具有上述性质(1)和(2)之外，还具有如下所述的物理化学性质。这种亚胺还原酶可以例如由链霉菌GF3546制备。

(3)最适pH值：针对还原为pH7.4～8.0，以及针对氧化为pH 10.5；

(4)最适温度：针对还原为35～45℃。

(5)分子量：利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(在下文简写为SDS-PAGE)约为30500，利用凝胶过滤法约为81500。

本发明的亚胺还原酶可以从上述微生物、其无细胞提取物或诸如此类的物质中纯化出来。更具体来说，可以通过使用下述纯化步骤的合适组合，从无细胞提取物中获得基本上纯的亚胺还原酶：

分级，基于溶解性，使用硫酸铵、丙酮或诸如此类的物质；

离子交换色谱；

疏水色谱；

亲和色谱，使用2′，5′-ADP琼脂糖凝胶、蓝色或红色琼脂糖凝胶或诸如此类的物质；和

凝胶过滤。

收集微生物菌体之后，可以将本发明的亚胺还原酶分离为基本上纯的酶，例如，利用下述纯化步骤：

通过超声处理或玻璃珠将微生物菌体破碎，然后制备无细胞提取物；

使用苯基琼脂糖凝胶的疏水色谱；和

利用离子交换色谱法(使用MonoQ)分离具有亚胺还原酶活性的馏份。

本文中，“基本上纯”是指除了酶本身之外基本上不包含生物大分子化合物或化学物质。除了酶以外，这种生物大分子化合物包括，例如，蛋白质，糖，脂质和核苷酸，它们来源于微生物菌体和培养基。本发明的基本上纯的酶的纯度至少为75％或更高，通常是80％或更高，优选85％或更高，更优选90％或更高，更加优选95％或更高，或99％或更高。测定酶纯度的方法是已知的。测定蛋白质纯度的已知方法包括，例如，各种色谱法和聚丙烯酰胺凝胶电泳。

本发明还提供了分离的、具有上述物理化学性质(1)和(2)的亚胺还原酶。本文中，分离的亚胺还原酶是指从其最初存在的自然环境分离的还原酶。因此，从微生物菌体分离的亚胺还原酶包括在本发明的分离的亚胺还原酶的范围内。

在纯化或分离之后，可以将本发明的基本上纯的亚胺还原酶或本发明的分离的亚胺还原酶配制成酶组合物。例如，通过与合适载体一起配制纯化或分离的亚胺还原酶，可以制备包含本发明的亚胺还原酶的酶组合物。这种载体包括非活性的蛋白质，例如白蛋白；糖，例如蔗糖，和糖醇。酶组合物可以是液体或冷冻干燥形式。通过将包含酶和载体的水溶液冷冻干燥而制备的酶组合物是本发明的优选组合物。

可以利用下述方法，定量测定本发明的亚胺还原酶的活性。更具体来说，使还原酶在含有下述组合物的反应溶液(1mL)中、于30℃温育。检测该反应混合物，以测定由于NADPH的降低而造成的吸光度的降低(在340nm处)。

10mM 2-甲基-1-吡咯啉；

100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)；

0.1mM NADPH；和

酶。

定义在上述条件下每分钟能够催化减少1μmol的NADPH的酶的量为1U。

本发明涉及包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的蛋白质。本发明还包括包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的蛋白质的同系物。本发明的亚胺还原酶的同系物是指蛋白质，该蛋白质包含在SEQ ID NO：3的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且其与包含SEQ IDNO：3的氨基酸序列的蛋白质是功能等效的。在SEQ ID NO：3的氨基酸序列中可以接受的突变是，例如，100个氨基酸残基或更少，通常50个或更少，优选30个或更少，更优选15个或更少，更加优选10个或更少，或5个或更少。

本发明涉及编码亚胺还原酶和其同系物的多核苷酸。本发明的多核苷酸包括天然多核苷酸，例如DNA和RNA，和包含人工核苷酸衍生物的人工分子。本发明的多核苷酸还包括嵌合DNA-RNA分子。编码本发明的亚胺还原酶的多核苷酸包括例如SEQ ID NO：2的核苷酸序列。SEQ ID NO：2的核苷酸序列编码包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的蛋白质。在一个优选实施方案中，本发明的亚胺还原酶是包含该氨基酸序列的蛋白质。

编码本发明的亚胺还原酶的多核苷酸的同系物是指：编码包含在SEQID NO：3的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且具有上述物理化学性质(1)和(2)的蛋白质的多核苷酸。利用定位突变(Nucleic Acid Res.10，pp.6487(1982)；Methods in Enzymol.100，pp.448(1983)；Molecular Cloning 2nd Edt.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)；PCR A Practical Approach IRL Press pp.200(1991))或其它方法，将取代的、缺失的、插入的和/或添加的突变适当地导入到SEQ ID NO：2的多核苷酸中，由此本领域技术人员可以获得多核苷酸的同系物。

本发明的多核苷酸的同系物还包括能够在严格条件下与包含SEQ IDNO：2的核苷酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸，并且其编码具有上述物理化学性质(1)和(2)的蛋白质。术语“能够在严格条件下杂交的多核苷酸”是指：使用ECL直接核酸标记和检测系统(ECL direct nucleic acid labeling anddetection system)(GE Healthcare)，在说明书所描述的条件下(在42℃，在包含0.5x SSC的原始洗涤缓冲液中洗涤)，与一个或多个DNA探针杂交的多核苷酸，其中该DNA探针具有至少20个，优选至少30个，例如，40、60或100个SEQ ID NO：2的组成的核苷酸的任意序列。

本发明的多核苷酸的同系物包括编码蛋白质的多核苷酸，其中该蛋白质与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少70％的同一性，优选至少80％，更加优选90％或更高。可以按照下述方法来进行蛋白质同一性检索：例如，使用程序(例如BLAST和FASTA)，针对蛋白质氨基酸序列数据库(例如SWISS-PROT、PIR和DAD)；DNA序列数据库(例如DDBJ EMBL和GenBank)；和基于DNA序列预测的氨基酸序列的数据库，通过互连网来进行。

本发明还涉及包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的蛋白质。本发明还包括包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的蛋白质的同系物。本发明的“亚胺还原酶同系物”是指蛋白质，该蛋白质与包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的蛋白质是功能等效的，以及该蛋白质包含在SEQ ID NO：3的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列。本文中，短语“与包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的蛋白质功能等效”是指蛋白质具有上述物理化学性质(1)和(2)。利用定位突变(Nucleic Acid Res.10，pp.6487(1982)；Methods in Enzymol.100，pp.448(1983)；Molecular Cloning 2nd Edt.，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989)；PCR A Practical Approach IRL Press pp.200(1991))等，将取代的、缺失的、插入的和/或添加的突变适当地导入到SEQID NO：2的DNA中，由此本领域技术人员可以获得编码亚胺还原酶的同系物的多核苷酸。SEQ ID NO：3的亚胺还原酶的同系物可以如下获得：将编码亚胺还原酶的同系物的多核苷酸导入到宿主中，并在其中表达。

此外，本发明的亚胺还原酶的同系物是指与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少70％同一性的蛋白质，优选至少80％，更优选90％，更加优选90％或更高。可以按照下述方法来进行蛋白质同一性检索：例如，使用程序(例如BLAST和FASTA)，针对蛋白质氨基酸序列数据库(例如SWISS-PROT、PIR和DAD)；DNA序列数据库(例如DDBJ EMBL和GenBank)；和基于DNA序列预测的氨基酸序列的数据库，通过互连网来进行。

可以例如利用下述方法来分离编码本发明的亚胺还原酶的多核苷酸。

可以进行PCR，以获得本发明的DNA，使用基于SEQ ID NO：2的核苷酸序列设计的PCR引物，以及以来自于生产酶的菌株的染色体DNA或cDNA库作为模板。

另外，本发明的多核苷酸可以如下获得：用限制性内切酶消化染色体DNA(来自于酶生产菌株)，然后将这些片段插入到噬菌体、质粒等中；用构建的DNA转化大肠杆菌。可以使用上述获得的DNA片段作为探针，利用菌落杂交、噬菌斑杂交或类似的方法来筛选上述所得到的库或cDNA库。

或者，本发明的多核苷酸可以如下获得：分析通过PCR得到的DNA片段的核苷酸序列，然后基于所获得的序列设计用于序列延长的PCR引物。接下来，用合适的限制性内切酶消化酶生产菌株的染色体DNA，然后进行自环化(self-circle)，作为反向PCR的模板(Genetics 120，621-623(1988))，或者利用RACE(Rapid Amplification of cDNA End；“Experimental manual forPCR”p.25-33，HBJ Press)等。

除了利用上述方法克隆的基因组DNA和cDNA之外，本发明的多核苷酸还包括合成的DNA。

本发明还提供了亚胺还原酶的表达载体，其是通过将编码利用上述方法分离的本发明亚胺还原酶的多核苷酸插入到常规表达载体中而构建的。

通过培养用所述表达载体转化的重组体，本发明的亚胺还原酶可以由重组体获得。

对于待进行转化用来表达本发明的亚胺还原酶的微生物的类型没有限制，只要它能够用包含编码具有亚胺还原酶的多肽的多核苷酸的重组载体转化、并且能够表达亚胺还原酶活性即可。合适的微生物包括下述微生物：

宿主-载体系统可利用的细菌，例如，属于下述的那些：

埃希氏杆菌属(Escherichia)，

芽孢杆菌属，

假单胞菌属(Pseudomonas)，

沙雷氏菌属(Serratia)，

短杆菌属(Brevibacterium)，

棒状杆菌属(Corynebacterium)，

链球菌属(Streptococcus)，和

乳酸杆菌属(Lactobacillus)；

宿主-载体系统可利用的放线菌，例如，属于下述的那些：

红球菌属(Rhodococcus)，和

链霉菌属(Streptomyces)；

宿主-载体系统可利用的酵母，例如，属于下述的那些：

酵母菌属(Saccharomyces)，

克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，

裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，

接合酵母属(Zygosaccharomyces)，

耶氏酵母属(Yarrowia)，

毛孢子菌属(Trichosporon)，

红冬孢酵母属(Rhodosporidium)，

毕赤氏酵母属(Pichia)，和

假丝酵母属(Candida)；和

宿主-载体系统可利用的霉菌，例如，属于下述的那些：

脉孢菌属(Neurospora)，

曲霉属(Aspergillus)，

头孢霉菌属(Cephalosporium)，和

木霉属(Trichoderma)。

转化体的制备和对每个宿主相容的重组载体的构建可以使用分子生物学、生物工程学和遗传工程学的传统方法来实现(例如，Sambrook等人，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratories)。为了在微生物中表达本发明的用NADPH作为电子供体的亚胺还原酶，DNA应该首先被插入到在微生物中稳定的质粒或噬菌体载体中，并且允许遗传信息的转录和翻译。

为了实现这个目的，在本发明的DNA链的5′-端(上游)插入启动子(其是转录和翻译的调节单元)，且更优选在DNA的3′-端(下游)还插入终止子。这种启动子和终止子在宿主微生物中应该是功能性的。可以在多种微生物中使用的这样的载体、启动子、终止子等(在“FundamentalMicrobiology(Biseibutsugaku Kiso-kouza)8：Genetic Engineering，KYORITSUSHUPPAN CO.，LTD.”)中有详细描述，尤其是和酵母一起使用的那些在Adv.Biochem.Eng.43，75-102(1990)；Yeast 8，423-488(1992)等中有详细描述。

例如，对于属于埃希氏杆菌属的细菌菌种来说，特别是大肠杆菌(Escherichia coli)，pBR和pUC质粒作为质粒载体是合适的，并且合适的启动子包括那些lac(β-半乳糖苷酶)、trp(色氨酸操纵子)、tac、trc(lac和trp的融合物)和λ噬菌体PL与PR来源的启动子。合适的终止子包括trpA、噬菌体和rrnB核糖体RNA来源的终止子。合适载体包括pSE420D(描述在日本专利申请Kokai出版物No.(JP-A)2000-189170(未审查、公开的日本专利申请)中)，其具有商购pSE420(Invitrogen)的多克隆位点来源的经修饰的克隆位点。

对于属于芽孢杆菌属的细菌菌种来说，合适的载体包括pUB110质粒和pC194质粒。可以将质粒整合到染色体中。启动子和终止子可以从包括apr(碱性蛋白酶)，npr(中性蛋白酶)，amy(α-淀粉酶)的基因中获得。

之前已经形成了针对恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)及假单胞菌属来源的其它菌种的宿主-载体系统。宿主范围宽的载体(包含自主复制所需要的基因，来源于RSF1010等)，例如pKT240是合适的；这些载体由质粒TOL(其与甲苯和含甲苯的化合物的降解有关)构建。脂肪酶基因(JP-A(Kokai)H05-284973)可以提供启动子和终止子。

对于属于短杆菌属的细菌菌种来说，特别是乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)，合适的质粒载体包括pAJ43(Gene 39，281(1985))。这种菌种可以使用适合用于大肠杆菌的启动子和终止子，不用进行修饰。

对于属于棒状杆菌属的细菌菌种来说，特别是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，质粒载体例如pCS11(JP-A(Kokai)S57-183799)和pCB101(Mol.Gen.Genet.196，175(1984))是合适的。

对于属于链球菌属的细菌菌种来说，质粒载体例如pHV1301(FEMSMicrobiol.Lett.26，239(1985))和pGK1(Appl.Environ.Microbiol.50，94(1985))是合适的。

对于属于乳酸杆菌属的细菌菌种来说，质粒载体pAMβ1(J.Bacteriol.137，614(1979))是合适的；该质粒载体是针对属于链球菌属的细菌菌种而构建的，还可以使用适合于大肠杆菌的启动子。

对于属于红球菌属的细菌菌种来说，从紫红红球菌(Rhodococcusrhodochrous)(J.Gen.Microbiol.138，1003(1992))中分离的质粒载体是合适的。

对于属于链霉菌属的细菌菌种来说，可以利用Hopwood等人的方法构建的质粒，该方法描述在Genetic Manipulation of Streptomyces：A LaboratoryManual Cold Spring Harbor Laboratories(1985)中。特别是对于浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)来说，合适的质粒载体是pIJ486(Mol.Gen.Genet.203，468-478(1986))、pKC1064(Gene 103，97-99(1991))和pUWL-KS(Gene 165，149-150(1995))。此外，相同的质粒可以用于弗吉尼亚链霉菌(Streptomycesvirginiae)(Actinomycetol.11，46-53(1997))。

对于属于酵母菌属的真菌菌种，特别是对于酿酒酵母(Saccharomycescerevistae)，YRp质粒，YEp质粒，YCp质粒和YIp质粒是可以使用的。使用与染色体上的多拷贝核糖体DNA进行同源重组的整合载体(例如，EP537456)是非常有利的，这是由于可以使用载体将目标基因多拷贝地导入，并且整合的基因在宿主中是稳定的。合适的启动子和终止子来源于乙醇脱氢酶(ADH)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，酸性磷酸酶(PHO)，β-半乳糖苷酶(GAL)，磷酸甘油酸激酶(PGK)，烯醇化酶(ENO)等。

对于属于克鲁维酵母属的真菌菌种来说，特别是对于乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)，合适的质粒载体包括酿酒酵母来源的2μm质粒和pKD1质粒(J.Bacteriol.145，382-390(1981))；pGK11来源的质粒涉及放毒者活性(killer activity)；与属于克鲁维酵母属的真菌菌种的自主复制有关的基因来源的KARS质粒；以及能够与核糖体DNA进行同源重组而整合到染色体中的载体质粒(例如，EP 537456)。ADH、PGK及其它基因来源的启动子和终止子也是合适的。

对于属于裂殖酵母属的真菌菌种来说，合适的质粒载体是：粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)来源的ARS(涉及自主复制的基因)和酿酒酵母来源的包含补足营养缺陷性的选择标记的质粒载体(Mol.Cell.Biol.6，80(1986))。另外，ADH启动子和其它粟酒裂殖酵母来源的启动子是合适的(EMBO J.6，729(1987))。特别是，可以容易地使用商购的pAUR224(TakaraBio Inc.)。

对于属于接合酵母属的真菌菌种来说，来源于鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)来源的质粒pSB3的质粒载体(Nucleic Acids Res.13，4267(1985))等是合适的，并且合适的启动子包括酿酒酵母来源的PHO5启动子和鲁氏酵母来源的GAP-Zr(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)启动子(Agri.Biol.Chem.54，2521(1990))。

之前开发了针对属于毕赤氏酵母属的安格斯毕赤酵母(Pichiaangusta)(先前名称：汉逊酵母(Hansenula polymorpha))的宿主-载体系统。涉及自主复制的安格斯毕赤酵母来源的基因(HARS1和HARS2)可以用作载体。然而，这些基因相对不稳定，因此，更优选使用多拷贝整合到染色体中(Yeast 7，431-443(1991))。对于这种真菌菌种来说，可以使用能够用甲醇等诱导的AOX(醇氧化酶)启动子或FDH(甲酸脱氢酶)启动子。另外，对于巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)等来说，已经开发了使用毕赤氏酵母来源的、涉及自主复制的基因(PARS1和PARS2)的宿主-载体系统等(Mol.Cell.Biol.5，3376(1985))。由此，可以使用高效率启动子，例如AOX，其可用高密度培养物和甲醇诱导(Nucleic Acids Res.15，3859(1987))。

已经开发了针对麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)、白色假丝酵母(Candida albicans)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、产朊假丝酵母(Candidautilis)及其它属于假丝酵母属的菌种的宿主-载体系统。之前已经克隆了麦芽糖假丝酵母来源的ARS(Agri.Biol.Chem.51，51，1587(1987))，并由此针对麦芽糖假丝酵母开发了使用这种ARS的载体。另外，已经开发了针对产朊假丝酵母的带有高效率启动子的染色体整合载体(JP-A(Kokai)H08-173170)。

已经广泛地研究了属于曲霉属的真菌菌种黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)。质粒、染色体整合载体和胞外蛋白酶和淀粉酶来源的启动子对真菌菌种来说也是合适的(Trends in Biotechnology 7，283-287(1989))。

已经开发了针对属于木霉属的里氏木霉(Trichoderma reesei)的宿主-载体系统，并且胞外纤维素酶基因来源的启动子等是合适的(Biotechnology 7，596-603(1989))。

此外，除了微生物之外，已经开发了多种针对植物和动物物种的宿主-载体系统。已经开发了在昆虫(特别是蚕)(Nature 315，592-594(1985))和植物(例如菜籽，玉米和马铃薯)中用于表达外源蛋白质的大规模系统，并且适合于使用。

能够产生本发明的亚胺还原酶的微生物包括所有能够产生亚胺还原酶属于链霉菌属的菌株、及其突变体(mutant)和变体(variant)，以及通过遗传工程学技术能够获得生产本发明的酶的能力的经转化的菌株。

制备本发明的光学活性胺衍生物的方法包括下述步骤：使式(I)或(III)代表的底物化合物与具有亚胺还原酶活性的酶活性物质接触，亚胺还原酶活性是在通过该酶活性物质能够还原底物化合物的条件下，能够立体选择地还原底物化合物的活性。本文中，“酶活性物质”是指来源于具有立体选择地还原式(I)或(III)所代表的底物化合物的能力的微生物的物质，并且可以保持该能力的物质。具体来说，例如，只要保持亚胺还原酶活性，下述的组份就包括在本发明的酶活性物质中。

(i)能够立体选择地还原式(I)或(III)代表的底物化合物的微生物；

(ii)(i)中所描述微生物菌体的培养物；和

(iii)(i)中所描述微生物菌体的处理物。

本发明的微生物可以是培养物或微生物菌体。培养物涉及微生物与支持微生物的存活和生长的培养基一起存在的一种状态。例如，包含微生物的液体培养基是培养物。同时，本文使用的“微生物菌体”是指微生物本身的术语。微生物菌体是指从培养物中回收的微生物的细胞。例如，可以通过离心从液体培养基中回收微生物的微生物菌体。可以通过洗涤从培养物中回收的微生物菌体，从微生物菌体的表面除去培养基组份。

不用任何修饰，或进行固定之后，本发明的酶活性物质可以与底物化合物接触。有多种已知的固定微生物菌体或其处理物的方法。这种已知的固定微生物菌体或其处理物的方法包括，例如：

聚丙烯酰胺方法；

含硫的多糖方法(κ-卡拉胶法等)；

海藻酸凝胶法；

琼脂凝胶方法；和

离子交换树脂方法。

或者，可以在使用超滤膜的膜生物反应器等中使微生物、其处理物与底物化合物接触而进行反应。

可以通过下述步骤来利用本发明微生物对亚胺进行立体选择地来还原。在适于诱导酶的上述培养条件下培养微生物；将亚胺衍生物作为反应底物加入到制备的培养物、从培养物中回收的微生物菌体或其处理物中；并温育该混合物。或者，在上述微生物培养开始时，或在培养过程中，加入充当反应底物的亚胺衍生物。由此，在培养期间，发生立体选择性的亚胺还原。

对于本发明的微生物，立体选择地还原可以通过下述方法实现。在适于诱导酶的上述培养条件下培养微生物；并将反应底物添加到制备的培养物、从培养物中回收的微生物菌体或其处理物中。或者，该还原可以在与上述培养条件相同的pH值和温度范围下进行，同时培养1～7天。

这种反应条件包括，例如，如下所示的那些反应条件：

pH值：4.0～9.0，优选6.0～8.0；

温度：15～50℃，优选20～40℃；和

反应时间：接触4小时～7天。

通常，可以通过单独进行微生物的培养和反应，使反应系统的培养基中的杂质污染最小化。这在反应之后纯化产物时，可以是有利的。

此外，在存在糖或例如还原能源的条件下进行反应，可以预期更有效的酶催化还原反应。可以按照作为反应底物的亚胺衍生物的量，加入作为还原能源而添加的化合物。更具体来说，下述可以用作还原能源。

糖：葡萄糖，葡糖-6-磷酸，蔗糖等。

有机酸：苹果酸，柠檬酸，甲酸等。

氨基酸：丙氨酸，谷氨酸，赖氨酸等。

醇：乙醇，异丙醇等。

另外，在某些情况下，无机化合物(例如亚磷酸)可以用作还原能源。

本发明的还原反应在氢供体的存在下进行。相应地，在本发明中，能够还原底物化合物的条件是在氢供体的存在下、通过温育酶活性物质与底物化合物而实现的。可以使用任何氢供体，只要它支持本发明的还原反应即可。本发明优选的氢供体包括NADPH和NADH。NADPH优选与本发明人成功分离的链霉菌GF3546来源的亚胺还原酶、其同系物或其酶活性物质组合使用。

使用微生物的NADP⁺还原能力(糖酵解系统，甲基营养菌C1化合物的同化途径等)，可以实现由NADP⁺(其是由伴随上述还原反应的NADPH产生的)再生为NADPH。通过向反应系统中加入葡萄糖、乙醇等可以提高NADP⁺还原能力。或者，通过向反应系统中加入能够由NADP⁺产生NADPH的微生物、其处理物或其酶，可以实现这种再生。例如，可以使用含有葡糖脱氢酶、乙醇脱氢酶、氨基酸脱氢酶、有机酸脱氢酶(苹果酸脱氢酶等)等的微生物、其处理物或其纯化或部分纯化的酶，使NADPH再生。可以将构成NADPH再生所需要反应的这些组份加入到制备本发明的光学活性胺的反应系统中，固定之后加入，或通过NADPH-可交换的膜进行接触。

或者，在某些情况下，当在制备光学活性胺的上述方法中使用携带本发明DNA的重组载体转化的微生物的活微生物菌体时，可以不需要用于NADPH再生的额外反应系统。更具体来说，通过使用具有强NADPH再生活性的转化微生物，不用加入NADPH再生酶，就可以实现有效的还原。此外，通过共表达下述NADPH再生酶和亚胺还原酶，可以实现更有效的亚胺还原反应。可以将编码本发明亚胺还原酶的DNA与适合NADPH再生的基因(例如，编码葡糖脱氢酶、乙醇脱氢酶、氨基酸脱氢酶或有机酸脱氢酶(苹果酸脱氢酶等)的基因)一起导入到宿主中。当将两种或多种这样的基因导入到宿主中时，为了避免不相容性，将各个基因独立地插入到不同的重组载体中，这些重组载体的复制起点彼此不同，并且用这些载体转化宿主。或者，将两种基因插入到单一载体中，以及将两种或一种基因整合到染色体中。

当将多基因插入到单一载体中时，表达的调节区，例如启动子和终止子，可以与每个基因连接。或者，基因可以包含多个顺反子的操纵子，例如乳糖操纵子的形式表达。

例如，来源于属于枯草芽孢杆菌或嗜酸热原体(Thermoplasmaacidophilum)的菌种的葡糖脱氢酶可以用作NADPH再生酶。具体地说，优选的重组载体包括pSG-S2MP，其包含编码亚胺还原酶和葡糖脱氢酶(来源于枯草芽孢杆菌)的基因作为插入片段。

当与胺衍生物的降解有关的反应溶液的pH值有变化时，通过使用合适的酸或碱将pH值调节在某一范围之内可以继续该反应并且保持良好的反应性。

当在本发明中使用活微生物菌体时，在某些情况下，通过向反应混合物中加入表面活性剂，可以缩短反应周期。对用于这种目的的表面活性剂没有特别限制，只要它们提高活菌体的细胞壁的渗透性即可。这样的表面活性剂包括十六烷基溴化吡啶

，十六烷基三甲基溴化铵，Triton X-100，对异辛基苯基醚，Tween80和Span 60。在反应混合物中，优选使用约0.0001～1％的表面活性剂。

或者，在某些情况下，通过向反应溶液中加入有机溶剂，可以得到相同的效果。对用于这种目的的表面活性剂没有特别限制，只要它们提高活菌体的细胞壁的渗透性即可。这种有机溶剂包括甲苯和二甲苯。在反应溶液中，优选使用约0.0001～1％的有机溶剂。

或者，为了提高细胞壁的渗透性，可以在菌体收集之后，使用包含表面活性剂或有机溶剂的水或缓冲液预先处理的微生物菌体，来代替向反应溶液中加入表面活性剂或有机溶剂。

用作本发明反应底物的亚胺衍生物可以使用的浓度应该足以有效制备目标产物。在某些情况下，亚胺衍生物对微生物菌体或催化反应的酶是有毒性的。由此，值得注意的是，利用高浓度亚胺衍生物的反应可能不必然导致有效的制备。在反应混合物中，亚胺衍生物的浓度在例如0.05～50％w/v的范围，优选0.1～10％w/v。可以利用任何方法加入亚胺衍生物，例如，分批法，补料-分批法和补料法。或者，加入酮和胺(它们是亚胺的原料)来代替加入底物亚胺，从而在反应溶液中产生亚胺。产生的亚胺可以充当底物。

可以通过在不活性气体氛围中处理加入的亚胺衍生物来防止染色，从而改善产物质量。对于这种预期的效果，还可以在不活性气体氛围中将原料加入到反应混合物中。此外，通过在不活性气体氛围中进行酶反应，可以防止染色。本文使用的这种不活性气体包括，例如，氮气、氩气和氦气。特别是，氮气是便于获得的不活性气体。或者，氩气不容易扩散出来，这是因为它的比重高于空气的比重。由此，氩气在操作上是有利的，这是由于甚至在开放式操作中都可以保持不活性气体氛围。

本发明包括回收光学活性胺衍生物的步骤，这种光学活性胺衍生物是通过底物化合物与酶活性物质接触所获得的。具体来说，利用各种色谱、结晶等的组合使用，可以从反应溶液中分离通过亚胺衍生物的立体选择地还原所获得的光学活性胺衍生物。可以使用下述溶剂提取反应溶液中积累的光学活性胺衍生物，例如：

乙酸乙酯；

乙酸丁酯；

甲苯；

二甲苯；

己烷；

庚烷；

甲基异丁基酮；

甲基叔丁基醚；和

有机溶剂，例如卤素系溶剂。

可以利用下述的色谱对经提取的胺衍生物进行进一步纯化。在纯化之前例如，可以用酸或碱洗涤，以及用脱水剂脱水来进行处理，如果需要的话，可以组合使用。

离子交换色谱

吸附色谱

例如，通过离心从反应混合物中除去不能溶解的物质(例如微生物菌体)，然后在碱性条件下，使用溶剂进行提取。通过减压浓缩提取物，可以回收光学活性胺衍生物。

从溶液中除去不可溶的物质，例如微生物菌体，并将该溶液吸附到可以吸附胺衍生物的离子交换树脂等上。通过用碱(例如氨水，氢氧化钠水溶液，氢氧化钠的甲醇溶液或氢氧化钠的乙醇溶液)洗脱胺衍生物，可以容易地获得高浓度溶液。

或者，从溶液中除去不可溶的物质，例如微生物菌体，并将该溶液吸附到可以吸附胺衍生物的离子交换树脂等上。通过用碱(例如氨水，氢氧化钠水溶液，氢氧化钠的甲醇溶液或氢氧化钠的乙醇溶液)洗脱胺衍生物，可以容易地获得高浓度溶液。

或者，在溶剂提取之后，通过用盐酸对提取物进行处理，将其转变为盐酸盐，以便回收晶体形式的光学活性胺衍生物。为了提高产率，可以减压浓缩溶剂，或用适于结晶的溶剂替换。

此外，为了提高产率，可以减压浓缩溶剂，或用适于结晶的溶剂替换。

或者，在某些情况下，以与酸形成的结晶盐形式制备光学活性胺衍生物，可以提高其光学纯度。溶剂提取之后，通过用盐酸氯化，可以回收晶体形式的光学活性胺衍生物。纯化盐的这种酸包括无机酸，例如盐酸和硫酸，和有机酸，例如扁桃酸，柠檬酸和酒石酸。将利用上述方法获得的胺衍生物的盐溶解在强酸或强碱中，然后用合适碱或酸中和，以获得中和结晶。这种方法可以容易地使胺衍生物与其它杂质分离。例如，无机酸(例如盐酸和硫酸)可以用作溶解胺衍生物盐的强酸溶液。同时，NaOH水溶液和氨水可以用作强碱溶液。

另外，通过加热水溶液，然后冷却重结晶，可以容易地将胺衍生物与其它杂质分离。

在将所获得的晶体溶解之后，通过使用合适的展开剂、进行硅胶色谱，可以将胺衍生物进一步纯化至高纯度。用于硅胶色谱的这种展开剂包括，例如，丁醇，乙酸，其与水的混合溶剂。

将在本文中引用的所有现有技术文献并入本文作为参考。

实施例

在下文中，参考实施例对本发明进行具体地描述，但不能将实施例理解为限制性的。

在表中，菌株名称中的“GF”表示该菌株由国立大学法人岐阜大学保藏。

[实施例1]筛选

制备包含4g/l酵母抽提物，10g/l麦芽汁，4g/l葡萄糖，5mg/l硫酸铁七水合物和1g/l 2-甲基-1-吡咯啉的液体培养基(pH值调节至7.3)，并等分(4ml)到18mm直径的试管中。在高压灭菌器中，将上述试管在121℃加热15分钟，进行灭菌。用铂接种环(platinum loop)将示于下表1中的菌株各自接种到试管中。将试管在28℃振荡培养2～6天。

将得到的培养物离心，回收微生物菌体。将含10mM 2-甲基-1-吡咯啉的25mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)加入到菌体中。使菌体在25℃振荡反应24小时。反应之后，离心除去菌体。然后，使用硅胶(展开剂：1-丁醇/乙酸/水＝2/1/1)进行TLC分析，然后使用茚三酮喷雾剂进行检测。

对于在反应条件下的菌体，将50μl的2mg/ml三乙胺水溶液和100μl的8mg/ml 2，3，4，6-四-O-乙酰基吡喃葡糖基异硫氰酸酯(GITC)添加到50μl上清液中，并在40℃温育该混合物1小时从而用GITC进行衍生。通过液相色谱分析测定光学纯度。使用C18柱(来自于Wako Pure ChemicalIndustries(Wakosil II 5C18，4.6mm x 150mm))，以1ml/min的流速上样10mM磷酸盐缓冲液(pH2.5)/甲醇＝55/45的洗脱缓冲液。通过检测在254nm处的UV吸光度，来测定光学纯度。

分析结果示于表1中。结果证明产生了光学活性的2-甲基吡咯烷。

[表1]

[表2]

SIID5767-01

+：阳性，-：阴性W：弱响应

然后，用16S rDNA分析来鉴定GF3546。使用MicroSeq全基因16S rDNAPCR/测序试剂盒(ABI)，测定16S rDNA的核苷酸序列。按照试剂盒的说明书所描述的方法进行分析。测定的核苷酸序列示于SEQ ID NO：1中。针对APOLLON DB(产品名称，TechnoSuruga Laboratory)，用BLAST检索SEQ IDNO：1的核苷酸序列。结果表明，序列显示出与下述菌株的16S rDNA序列具有98.6％的同一性：

粉末链霉菌(Streptomyces pulveraceus)NBRC3855；

胶样链霉菌(Streptomyces gelaticus)NBRC12866；和

山南链霉菌(Streptomyces sannanensis)NBRC14239。

基于该结果构建分子系统树，并示于图1中。簇分析(cluster analysis)的结果可认为GF3546属于链霉菌。

[实施例3]通过GF3546合成(S)-2-甲基吡咯烷

将含20g/l酵母提取物、30g/l肉膏、10g/l NZ胺、20g/l葡萄糖、1mg/l硫酸铁七水合物、1mg/l氯化锰四水合物和1mg/l硫酸锌七水合物的液体培养基(pH值调节至7.3)等分(40ml)到振荡烧瓶中。在高压灭菌器中，将烧瓶在121℃加热15分钟，进行灭菌。用铂接种环将链霉菌GF3546接种到烧瓶中。将烧瓶在28℃振荡培养72小时。

将得到的培养基过滤，回收微生物菌体。将30mM 2-甲基-1-吡咯啉和100mM磷酸盐缓冲液(pH7.0，含有2％葡萄糖)添加到菌体中。使菌体在25℃振荡反应。

反应之后，根据实施例1适当地进行GITC衍生。然后，用HPLC对产物进行分析。结果示于图2中。该结果表明，反应72小时之后，产生最多27.5mM具有97％ee选择性的(S)-2-甲基吡咯烷。用下述方法测定光学纯度。

将下述组份添加到50μl反应溶液中，并将得到的混合物在40℃温育1小时。用GITC衍生产生的胺，然后用HPLC分离并定量。

50μl的2mg/ml三乙胺；和

100μl的8mg/ml 2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡糖基异硫氰酸酯(GITC)。

HPLC的条件如下：

-HPLC柱：Wakosil II 5C18(4.6mm x 150mm)，来自于Wako PureChemical Industries

-洗脱缓冲液：10mM磷酸盐缓冲液(pH2.5)/甲醇＝55/45

-流速：1ml/min

-检测：254nm处的UV吸光度

在上述条件下，在26.3分钟时洗脱出(R)-2-甲基吡咯烷，而在24.9分钟时洗脱出(S)-2-甲基吡咯烷。基于254nm的UV吸光度，测定每个洗脱的馏份的光学纯度。

[实施例4]GF3546来源的亚胺还原酶的纯化

按照实施例3所描述的方法培养菌株GF3546，并过滤收集微生物菌体。将得到的湿润的微生物菌体悬浮在含1mM二硫苏糖醇(DTT)和2mM苯甲基磺酰氟(PMSF)的100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中，并在珠磨式研磨仪(Biospec)中破碎。然后，离心除去菌体碎片，得到无细胞提取物。将硫酸鱼精蛋白添加到无细胞提取物中，离心，得到不含核酸的上清液。将硫酸铵添加到上清液中，直到饱和度达到30％。将得到的混合物上样到苯基琼脂糖凝胶HP 26/10(用含有1mM DTT和5％甘油的30％硫酸铵饱和的标准缓冲液(10mM磷酸钾缓冲液(pH7.0))平衡)上。用30％～0％饱和度的硫酸铵浓度梯度洗脱苯基琼脂糖凝胶HP 26/10。在部分梯度洗脱的馏份中检测到亚胺还原活性。回收洗脱的峰馏份，超滤浓缩。利用下述分析方法测定亚胺还原活性。

分析亚胺还原活性的标准方法

在30℃温育含有酶、100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)、0.2mM NADPH和10mM 2-甲基-1-吡咯啉的反应混合物。分析该反应混合物，以测定由于NADPH的降低而造成的吸光度的降低(在340nm处)。将每分钟催化减少1μmol NADPH的酶的量定义为1U。

用标准缓冲液对浓缩的酶溶液进行透析，然后上样到用相同缓冲液平衡的MonoQ 16/10上。用0～0.5M的氯化钠的梯度洗脱MonoQ 16/10。在洗脱的活性馏份当中，利用SDS-PAGE分析具有最高比活性的馏份。该馏份给出单一条带。经纯化的酶的比活性是120mU/mg。纯化方法总结在表3中。

[表3]菌株GF3546来源的亚胺还原酶的纯化

[实施例5]用亚胺还原酶合成(S)-2-甲基吡咯烷

将含100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)、40mMNADPH和20mM 2-甲基-1-吡咯啉和根据实施例4所述制备的酶的反应混合物在25℃温育过夜。根据实施例3测定所产生的2-甲基吡咯烷的量和光学纯度。结果表明，通过酶产生的2-甲基吡咯烷是92.7％ee的S异构体。反应产率是77.5％。

[实施例6]测定亚胺还原酶的分子量

利用SDS-PAGE分析根据实施例4所述制备的酶。结果表明，亚基分子量约为30500。此外，通过凝胶过滤法(使用Superdex200柱)测定的分子量约为81500。

[实施例7]亚胺还原酶的最适pH值

通过使用磷酸钾缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、甘氨酸/氯化钾/氢氧化钾缓冲液来改变pH值，检测根据实施例3所述制备的酶还原2-甲基-1-吡咯啉的活性和氧化(S)-2-甲基吡咯烷的活性。以100作为最大活性，相对活性示于图3和4中。针对还原的最适pH值是7.4～8.0，针对氧化的最适pH值是10.5。利用下述的标准测定法，通过单独改变pH值，测定氧化(S)-2-甲基吡咯烷的活性。

氧化(S)-2-甲基吡咯烷的活性的标准测定法

在30℃温育含100mM甘氨酸/氯化钾/氢氧化钾缓冲液10.5、2.5mMNADP⁺、10mM(S)-2-甲基吡咯烷和酶的反应混合物。分析该反应混合物，以测定由于NADPH的增加而造成的吸光度的升高(在340nm处)。将每分钟催化增加1μmol NADPH的酶的量定义为1U。

[实施例8]亚胺还原酶的最适温度

在亚胺还原的标准条件下，通过单独改变温度，检测根据实施例4所述制备的酶还原2-甲基-1-吡咯啉的活性。以100作为最大活性，相对活性示于图5中。在35～45℃的范围内，得到了最大活性的80％或更大。

[实施例9]亚胺还原酶的底物特异性

温育根据实施例4所述制备的酶与多种亚胺化合物。将还原2-甲基-1-吡咯啉的活性视为100，相对还原活性示于表4中。

[表4]亚胺还原酶的底物特异性

[实施例10]亚胺还原酶的部分氨基酸序列

使用蛋白质测序仪，分析根据实施例9所述制备的酶的N端氨基酸序列。氨基酸序列示于SEQ ID NO：4中。此外，从SDS-PAGE凝胶上切除包含亚胺还原酶的凝胶片段。洗涤两次之后，使用胰蛋白酶，在35℃进行过夜凝胶内消化。用反相HPLC(Tosho；TSK凝胶ODS-80-Ts，2.0mm x 250mm)分馏消化的肽。使用0.1％三氟乙酸(含有乙腈梯度)洗脱肽并回收肽。

将所回收肽中的一个的峰命名为T61。用蛋白质测序仪(Hewlett PackardG1005A蛋白质测序仪系统)分析肽的氨基酸序列。T61的氨基酸序列示于SEQ ID NO：5中。

[实施例11]链霉菌GF3546来源的染色体DNA的纯化

按照实施例3所描述方法培养GF3546并收集微生物菌体。按照J.DairySci.，75，1186-1191(1992)的参考文献中所描述的方法，从微生物菌体中纯化染色体DNA。

[实施例12]亚胺还原酶基因核心区域的克隆

基于N端和T61氨基酸序列，合成有义和反义引物。核苷酸序列示于SEQ ID NO：6和7中。

在GeneAmp PCR系统9700(Applied Biosystems)中，使用50μl反应混合物(含每种引物50pmol，10nmol dNTP，50ng链霉菌GF3546来源的染色体DNA，Ex-Taq缓冲液(Takara Bio)，5％DMSO和1U Ex-Taq(Takara Bio))进行PCR，进行30个变性(94℃，30秒钟)、退火(45℃，30秒钟)和延伸(70℃，1分零5秒钟)的循环。

用琼脂糖凝胶电泳分析部分PCR反应混合物。在约900bp处检测到可能的特异条带。然后，对该DNA片段的核苷酸序列进行测序。测定的核心区域的核苷酸序列示于SEQ ID NO：8中。

[实施例13基因的核心区域的核苷酸序列分析

用限制性内切酶SacI消化链霉菌GF3546来源的染色体DNA。在16℃，使用T4连接酶，通过进行过夜自身连接使每个片段环化。然后，在GeneAmpPCR系统9700(Applied Biosystems)中，使用50μl反应混合物(含SEQ IDNO：9和10所示的每个引物100pmol，25ng环化DNA，Ex-Taq缓冲液(TakaraBio)，5％DMSO和1U Ex-Taq(Takara Bio))进行PCR，进行30个变性(95℃，30秒钟)、退火(55℃，30秒钟)和延伸(72℃，7分钟)的循环。用琼脂糖凝胶电泳分析每个PCR混合物的一部分。检测到约2000bp的DNA片段。分析DNA片段的核苷酸序列，以测定亚胺还原酶基因的ORF序列。测定的DNA序列示于SEQ ID NO：2中，推测的氨基酸序列示于SEQ ID NO：3中。

[实施例14]亚胺还原酶基因的克隆

基于亚胺还原酶的结构基因序列，合成SEQ ID NO：11(SsSIR-ATG1)和SEQ ID NO：12(SsSIR-TAA1)所示的引物，以仅克隆ORF。在GeneAmp PCR系统9700(Applied Biosystems)中，使用50μl反应混合物(含每种引物50pmol，10nmol dNTP，50ng链霉菌GF3546来源的染色体DNA，PfuTurbo-DNA聚合酶缓冲液(STRATAGENE)，5％DMSO和1.9UPfuTurbo-DNA聚合酶(STRATAGENE))进行PCR，进行30个变性(98℃，30秒钟)、退火(60℃，1分钟)和延伸(72℃，1分零10秒钟)的循环。

使用GFX PCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒(GE Healthcare)，纯化并回收得到的DNA片段。用限制性内切酶BspHI和XbaI对DNA片段进行双重消化。琼脂糖凝胶电泳之后，切除含目标条带的部分，并使用GFX PCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒(GE Healthcare)来纯化DNA片段。

使用Takara连接试剂盒，将制备的DNA片段连接至用NcoI和XbaI双重消化的pSE420D(通过修饰质粒载体pSE420(来自于Invitrogen)的多克隆位点而构建的质粒；JP-A(Kokai)2000-189170)。用得到的载体转化大肠杆菌JM109菌株。

在含氨苄青霉素的LB培养基上培养转化体。从生长的转化体中提取质粒。将质粒命名为pSUS2MP1，确定其具有亚胺还原酶基因作为插入片段。质粒构建的过程示于图6中。

[实施例15]评价重组体亚胺还原酶的活性

在30℃，在含氨苄青霉素的液体LB培养基中过夜培养将已经用亚胺还原酶表达质粒pSUS2MP1转化的大肠杆菌JM109菌株。加入0.1mM IPTG之后，进一步培养4个小时。

离心收集微生物菌体，然后悬浮在含1mM DTT的100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中。在密封型超声波细胞粉碎机UCD-200TM(Cosmo Bio)中破碎微生物菌体。离心之后，回收上清液作为微生物菌体的提取物。同时，在LB培养基中过夜培养不包含上述基因的大肠杆菌JM109。加入0.1mM IPTG之后，进一步培养4个小时。使用相同的方法，将微生物菌体破碎，以制备微生物菌体的提取物。

检测每种微生物菌体的提取物对于2-甲基-1-吡咯啉的亚胺还原活性。结果示于表5中。该检测活性的方法与实施例4所述方法相同。

[表5]

[实施例16]共表达亚胺还原酶和芽孢杆菌来源的葡糖脱氢酶的质粒pSG-S2MP的构建

与实施例14类似地进行PCR。用BspHI和XbaI对含有亚胺还原酶的扩增的DNA片段进行双重消化。然后，用限制性内切酶NcoI和XbaI双重消化质粒pSE-BSG1(JP-A(Kokai)2000-189170)(其表达芽孢杆菌来源的葡糖脱氢酶基因)。使用Takara连接试剂盒，将含有亚胺还原酶基因的DNA片段连接至经消化的pSE-BSG1，以构建质粒pSG-S2MP，其可用于共表达亚胺还原酶和葡糖脱氢酶。质粒构建的过程示于图7中。

[实施例17]亚胺还原酶和葡糖脱氢酶在大肠杆菌中的共表达

在30℃，在含氨苄青霉素的液体LB培养基中过夜培养已经用pSG-S2MP转化的大肠杆菌JM109菌株。加入0.1mM IPTG之后，进一步培养4个小时。

离心收集微生物菌体，然后悬浮在含1mM DTT的100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中。在密封型超声波细胞粉碎机UCD-200TM(Cosmo Bio)中破碎微生物菌体。将微生物菌体溶胞产物离心，并回收上清液作为微生物菌体的提取物。检测该提取物对于2-甲基-1-吡咯啉的亚胺还原活性和它的葡糖脱氢酶活性。结果示于表5中。在30℃，使用含100mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)、2.5mM NADP⁺、100mM葡萄糖和微生物菌体的提取物的反应溶液，检测葡糖脱氢酶活性。将在上述条件下每分钟能够催化形成1μmol NADPH的酶的量定义为1U。

[实施例18]利用重组体大肠杆菌制备(S)-2-甲基吡咯烷

在30℃，在含氨苄青霉素的液体LB培养基(5ml)中过夜培养已经用pSG-S2MP转化的大肠杆菌JM109菌株。加入0.1mM IPTG之后，进一步培养4个小时。

离心收集微生物菌体，然后悬浮在含50mM 2-甲基-1-吡咯啉和100mM葡萄糖的1ml 100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中。使该悬浮液在25℃振荡反应过夜。反应之后，分析反应混合物，利用与实施例8所述方法相同的方法，测定所产生的2-甲基吡咯烷的光学纯度和2-甲基-1-吡咯啉和2-甲基吡咯烷在反应混合物中的浓度。产生的(S)-2-甲基吡咯烷的光学纯度是92.0％ee。

工业实用性

本发明提供了有效制备光学活性胺衍生物的方法，该方法利用微生物的还原能力、通过立体选择地还原来生产光学活性胺衍生物。由于可以预期高的立体选择性，因此本发明的方法在工业上是有利的。本发明制备的光学活性胺衍生物作为光学活性药物的原料是有用的。例如，(S)-2-甲基吡咯烷是作为药物原料的有用的化合物。

PCT

只用于受理局

只用于国际局