JP2012065591A - エルゴチオナーゼ、およびエルゴチオネインの定量方法 - Google Patents
エルゴチオナーゼ、およびエルゴチオネインの定量方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2012065591A JP2012065591A JP2010213226A JP2010213226A JP2012065591A JP 2012065591 A JP2012065591 A JP 2012065591A JP 2010213226 A JP2010213226 A JP 2010213226A JP 2010213226 A JP2010213226 A JP 2010213226A JP 2012065591 A JP2012065591 A JP 2012065591A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ergothionase
- ergothioneine
- activity
- protein
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- SSISHJJTAXXQAX-ZETCQYMHSA-N L-ergothioneine Chemical compound C[N+](C)(C)[C@H](C([O-])=O)CC1=CNC(=S)N1 SSISHJJTAXXQAX-ZETCQYMHSA-N 0.000 title claims abstract description 96
- 229940093497 ergothioneine Drugs 0.000 title claims abstract description 82
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 57
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 88
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 82
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 82
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 17
- 241001508395 Burkholderia sp. Species 0.000 claims abstract description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 72
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 72
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 60
- ZBKFFCZXHBPGFK-OWOJBTEDSA-N Thiourocanic acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C1=CNC(=S)N1 ZBKFFCZXHBPGFK-OWOJBTEDSA-N 0.000 claims description 43
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 42
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 42
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 42
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 25
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 25
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims description 21
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 20
- 241001453380 Burkholderia Species 0.000 claims description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 19
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 15
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 14
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 10
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 9
- SSISHJJTAXXQAX-UHFFFAOYSA-N 5-[2-carboxy-2-(trimethylazaniumyl)ethyl]-1h-imidazole-2-thiolate Chemical compound C[N+](C)(C)C(C([O-])=O)CC1=CNC(=S)N1 SSISHJJTAXXQAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 8
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 8
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 6
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims description 5
- NBCQBGBECVUZMK-UHFFFAOYSA-N (4-carboxyphenyl)mercury;hydrate Chemical compound O.OC(=O)C1=CC=C([Hg])C=C1 NBCQBGBECVUZMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N Histidine Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 claims description 4
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 claims description 4
- 241000589774 Pseudomonas sp. Species 0.000 claims description 4
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 claims description 4
- ZBKFFCZXHBPGFK-UHFFFAOYSA-N 3-(2-sulfanylidene-1,3-dihydroimidazol-4-yl)prop-2-enoic acid Chemical compound OC(=O)C=CC1=CNC(=S)N1 ZBKFFCZXHBPGFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 abstract description 5
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 abstract description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 75
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 66
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 51
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 37
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 36
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 26
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 25
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 24
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 23
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 15
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 15
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 15
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 15
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 14
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 13
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 11
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 11
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 8
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 8
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 7
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 6
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- -1 thiol compounds Chemical class 0.000 description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 4
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000901842 Escherichia coli W Species 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 108020001027 Ribosomal DNA Proteins 0.000 description 4
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 3
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 3
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 3
- 241000222128 Candida maltosa Species 0.000 description 3
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 3
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 3
- 102000011755 Phosphoglycerate Kinase Human genes 0.000 description 3
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 3
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 3
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 3
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 2-oxoglutaric acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)C(O)=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- NGSWKAQJJWESNS-UHFFFAOYSA-N 4-coumaric acid Chemical compound OC(=O)C=CC1=CC=C(O)C=C1 NGSWKAQJJWESNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588813 Alcaligenes faecalis Species 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 2
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 2
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 2
- 235000005956 Cosmos caudatus Nutrition 0.000 description 2
- 241000235646 Cyberlindnera jadinii Species 0.000 description 2
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N D-gluconic acid Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 2
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 2
- 108090000698 Formate Dehydrogenases Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 2
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 2
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 description 2
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 241000235017 Zygosaccharomyces Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229940005347 alcaligenes faecalis Drugs 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 2
- 239000000306 component Substances 0.000 description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007845 reactive nitrogen species Substances 0.000 description 2
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-M .beta-Phenylacrylic acid Natural products [O-]C(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-M 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AEOBEOJCBAYXBA-UHFFFAOYSA-N A2P5P Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1OP(O)(O)=O AEOBEOJCBAYXBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 1
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 1
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 241000283590 Burkholderia arboris Species 0.000 description 1
- 241000589513 Burkholderia cepacia Species 0.000 description 1
- 241000371422 Burkholderia stabilis Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 241000222178 Candida tropicalis Species 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- 241001619326 Cephalosporium Species 0.000 description 1
- 241000588919 Citrobacter freundii Species 0.000 description 1
- 241000221751 Claviceps purpurea Species 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N D-gluconic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MNQZXJOMYWMBOU-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde Chemical compound OC[C@@H](O)C=O MNQZXJOMYWMBOU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229940124186 Dehydrogenase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102100031004 Histidine-tRNA ligase, cytoplasmic Human genes 0.000 description 1
- 102100029015 Histidine-tRNA ligase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 101000838688 Homo sapiens D-aminoacyl-tRNA deacylase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000843187 Homo sapiens Histidine-tRNA ligase, cytoplasmic Proteins 0.000 description 1
- 101000696493 Homo sapiens Histidine-tRNA ligase, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101000695548 Homo sapiens Probable proline-tRNA ligase, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 241000588915 Klebsiella aerogenes Species 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 241000192041 Micrococcus Species 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 1
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 description 1
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091006764 Organic cation transporters Proteins 0.000 description 1
- 101150012394 PHO5 gene Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000194105 Paenibacillus polymyxa Species 0.000 description 1
- 235000019482 Palm oil Nutrition 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100028531 Probable proline-tRNA ligase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 241000588767 Proteus vulgaris Species 0.000 description 1
- 101710130181 Protochlorophyllide reductase A, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 description 1
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 1
- 208000025747 Rheumatic disease Diseases 0.000 description 1
- 241000187693 Rhodococcus rhodochrous Species 0.000 description 1
- 241000223252 Rhodotorula Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 241000187398 Streptomyces lividans Species 0.000 description 1
- 241000187180 Streptomyces sp. Species 0.000 description 1
- 241000187122 Streptomyces virginiae Species 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001228709 Suruga Species 0.000 description 1
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 description 1
- 241000223230 Trichosporon Species 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 241000235013 Yarrowia Species 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000235033 Zygosaccharomyces rouxii Species 0.000 description 1
- ZNOZWUKQPJXOIG-XSBHQQIPSA-L [(2r,3s,4r,5r,6s)-6-[[(1r,3s,4r,5r,8s)-3,4-dihydroxy-2,6-dioxabicyclo[3.2.1]octan-8-yl]oxy]-4-[[(1r,3r,4r,5r,8s)-8-[(2s,3r,4r,5r,6r)-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-5-sulfonatooxyoxan-2-yl]oxy-4-hydroxy-2,6-dioxabicyclo[3.2.1]octan-3-yl]oxy]-5-hydroxy-2-( Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](OS([O-])(=O)=O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H]2OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]3[C@@H]4OC[C@H]3O[C@H](O)[C@@H]4O)[C@@H]1O)OS([O-])(=O)=O)[C@@H]2O ZNOZWUKQPJXOIG-XSBHQQIPSA-L 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N aldrithiol Chemical compound C=1C=CC=NC=1SSC1=CC=CC=N1 HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- HWXBTNAVRSUOJR-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxyglutaric acid Natural products OC(=O)C(O)CCC(O)=O HWXBTNAVRSUOJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940009533 alpha-ketoglutaric acid Drugs 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000003712 anti-aging effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LFYJSSARVMHQJB-QIXNEVBVSA-N bakuchiol Chemical compound CC(C)=CCC[C@@](C)(C=C)\C=C\C1=CC=C(O)C=C1 LFYJSSARVMHQJB-QIXNEVBVSA-N 0.000 description 1
- 230000003796 beauty Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960004106 citric acid Drugs 0.000 description 1
- 238000007621 cluster analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000000174 gluconic acid Substances 0.000 description 1
- 235000012208 gluconic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229950006191 gluconic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 1
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 235000013402 health food Nutrition 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000031942 natural killer cell mediated cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 229910017464 nitrogen compound Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000002897 organic nitrogen compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002540 palm oil Substances 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 101150079312 pgk1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 229940007042 proteus vulgaris Drugs 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000000552 rheumatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- CIJQGPVMMRXSQW-UHFFFAOYSA-M sodium;2-aminoacetic acid;hydroxide Chemical compound O.[Na+].NCC([O-])=O CIJQGPVMMRXSQW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 150000003613 toluenes Chemical class 0.000 description 1
- WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-N trans-cinnamic acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-N 0.000 description 1
- LOIYMIARKYCTBW-OWOJBTEDSA-N trans-urocanic acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C1=CNC=N1 LOIYMIARKYCTBW-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- LOIYMIARKYCTBW-UHFFFAOYSA-N trans-urocanic acid Natural products OC(=O)C=CC1=CNC=N1 LOIYMIARKYCTBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 101150019416 trpA gene Proteins 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
【解決手段】エルゴチオナーゼ生産能を有するバークホルデリア・スピーシーズHME13株を見出し、当該株より、エルゴチオナーゼを精製した結果、L-エルゴチオネインに特異的に作用することが明らかになった。また本酵素をコードする遺伝子をクローニングし、大腸菌により高発現させ、本酵素を容易にかつ大量調製することが可能となった。さらに、本酵素を用いて特異的かつ簡便にL-エルゴチオネインを定量可能なことが明らかになった。
【選択図】なし
Description
〔1〕 次の(1)〜(2)に示す理化学的性状を有するエルゴチオナーゼ;
(1)作用:L-エルゴチオネインに作用し、チオウロカン酸(3-(2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾール-4-イル)プロペン酸)およびトリメチルアミンを生成する、および
(2)基質特異性:L-エルゴチオネインに作用し、D-, L-ヒスチジン、D-, L-チロシン、D-, L-フェニルアラニンに作用しない。
〔2〕 さらに付加的に、次の(3)〜(8)に示す理化学的性状を有する〔1〕に記載のエルゴチオナーゼ;
(3)至適pH:7.0〜9.5、
(4)至適温度:50〜65℃、
(5)分子量:ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が45,000〜55,000、ゲルろ過による分子量が200,000〜260,000。
(6)熱安定性: 60℃、30分で90%以上の活性を保持、
(7)pH安定性: pH 6.5〜11.0、30分で80%以上の活性を保持、および
(8)阻害剤: p-ヒドロキシ水銀安息香酸(p-hydroxymercuribenzoate)、ヨード酢酸(iodoacetate)、および/またはL-システイン(L-cysteine)存在下において80%以上の活性を保持。
〔3〕 バークホルデリア属、もしくはシュードモナス属に属する微生物に由来する、〔1〕または〔2〕に記載のエルゴチオナーゼ。
〔4〕 前記バークホルデリア属、もしくはシュードモナス属に属する微生物が、下記の群から選択されるいずれかの微生物であることを特徴とする〔3〕に記載のエルゴチオナーゼ;
バークホルデリア・エスピー NITE P-861(Burkholderia sp. NITE P-861)、および
シュードモナス・エスピー (Pseudomonas sp.)。
〔5〕 下記(a)〜(e)のいずれかに記載のエルゴチオナーゼ活性を有するタンパク質;
(a)配列番号:3に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
(b)配列番号:4に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、
(c)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を含むタンパク質、
(d)配列番号:4に記載された塩基配列からなるDNAと高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、または
(e)配列番号:3に記載のアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
〔6〕 〔5〕に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔7〕 〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載のエルゴチオナーゼをコードするポリヌクレオチドまたは〔6〕に記載のポリヌクレオチドを保持したベクター。
〔8〕 〔7〕に記載のベクターにより形質転換された形質転換体。
〔9〕 前記宿主が大腸菌である〔8〕に記載の形質転換体。
〔10〕 バークホルデリア属、もしくはシュードモナス属に属し、エルゴチオナーゼ活性を有する微生物、もしくは〔8〕または〔9〕に記載の形質転換体を培養する工程と、培養物よりエルゴチオナーゼを回収する工程を含むエルゴチオナーゼの製造方法。
〔11〕 エルゴチオネインに作用してチオウロカン酸を生成する能力を有する酵素活性物質を、被検対象に接触させる工程を含む、エルゴチオネインの定量方法。
〔12〕 前記酵素活性物質が、〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載のエルゴチオナーゼ、〔5〕に記載のエルゴチオナーゼ活性を有するタンパク質、当該エルゴチオナーゼまたはエルゴチオナーゼ活性を有するタンパク質を生産する微生物、およびその処理物からなる群から選択される、〔11〕に記載のエルゴチオネインの定量方法。
〔13〕 エルゴチオナーゼおよび/または酵素活性物質を含むことを特徴とするエルゴチオネイン定量試薬、およびキット。
〔14〕 チオウロカン酸およびトリメチルアミンにエルゴチオナーゼおよび/または酵素活性物質を作用させることを特徴とする、エルゴチオネインの製造方法。
(1)作用:L-エルゴチオネインに作用し、チオウロカン酸およびトリメチルアミンを生成する、および
(2)基質特異性:L-エルゴチオネインに作用し、D-, L-ヒスチジン、D-, L-チロシン、D-, L-フェニルアラニンに作用しない。
(3)至適pH:7.0〜9.5、
(4)至適温度:50〜65℃、
(5)分子量:ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(以下、SDS-PAGEと略す)による分子量が45,000〜55,000、ゲルろ過による分子量が200,000〜260,000、
(6)熱安定性: 60℃、30分で90%以上の活性を保持、
(7)pH安定性: pH 6.5〜11.0、30分で80%以上の活性を保持、および
(8)阻害剤: p-ヒドロキシ水銀安息香酸(p-hydroxymercuribenzoate)、ヨード酢酸(iodoacetate、グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤)、L-システイン(L-cysteine)存在下において80%以上の活性を保持。
本発明におけるエルゴチオネインは好ましくは、L-エルゴチオネインである。
バークホルデリア・エスピー HME 13(Burkholderia sp. HME 13)
(1)寄託機関の名称・あて名:
名称:独立行政法人製品評価技術基盤機構
あて名:日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8(郵便番号292−0818)
(2)受託日(寄託日):2010年1月20日
(3)受託番号:
バークホルデリア・エスピー HME 13 (Burkholderia sp. HME 13) ;受託番号 NITE P-861
シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)
バークホルデリア・エスピー NITE P-861(Burkholderia sp. NITE P-861)、および
シュードモナス・エスピー (Pseudomonas sp.)。
0.25 mM エルゴチオネイン、10 mM ピロリン酸ナトリウム緩衝液(pH 9.0)およびび酵素活性物質を含む 1 mLの反応液を用いて30℃で反応し、チオウロカン酸生成に由来する311 nmの吸光度の増加を測定する。1 Uは、上記条件下で1分間に1μmolのチオウロカン酸生成を触媒する酵素量とし、チオウロカン酸の分子吸光係数(ε=18,000)より計算する。
寄託された微生物は、例えば次のような寄託機関から分譲を受けることができる;
生物遺伝資源センター(NBRC)、
理化学研究所(JCM)、
東京農業大学菌株保存室(IAM)、
American Type Culture Collection(ATCC)、および
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen(DSM)。
糖類:グルコース、フルクトース、マルトース、スクロース、ラクトースなど
デンプン、
デンプン加水分解物、
廃糖蜜、
アルコール:グリセロール、メタノール、エタノールなど
糖アルコール、
有機酸:酢酸、グルコン酸、ピルビン酸、α-ケトグルタル酸、クエン酸など
脂肪類:パーム油、大豆油、オリーブオイルなど
炭化水素類:ノルマルパラフィンなど
有機窒素化合物:例えば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆加水分解物、ミルクカゼイン、カザミノ酸、廃糖蜜、アスパラギン、グルタミン、あるいはグルタミン酸などのアミノ酸類やコーンスティープリカー、NZアミンなど
無機窒素化合物:アンモニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウムなど、尿素、硝酸塩など
また、エルゴチオナーゼの誘導を目的として、エルゴチオネインを単一の窒素源として使用することができる。
振とう培養(shaking culture)
通気攪拌培養(aeration-agitation culture)
連続培養(continuous culture)
流加培養(feeding culture, fed batch culture)
培養開始時のpHを4から10、好ましくは6から8に調節
15から70℃、好ましくは20から40℃の温度条件下で培養
培養時間はエルゴチオナーゼ活性を有する菌体を得ることができれば特に制限されない。通常は1日から14日、好ましくは1日から7日培養する。
すなわち本発明は、本発明によって提供されたエルゴチオナーゼ活性を有する微生物の菌体から精製することができるエルゴチオナーゼに関する。
硫安、アセトンなどを用いた溶解度による分割、
イオン交換クロマトグラフィー、
疎水クロマトグラフィー、
2',5'-ADP セファロースやブルーもしくはレッドセファロースなどを用いたアフィニティクロマトグラフィー、あるいは
ゲルろ過。
超音波による菌体の破砕と無細胞抽出液の調製、
硫安分画によるタンパク画分の分離、
DEAE-トヨパールを用いたイオン交換クロマトグラフィー、および
ブチル-トヨパールを用いた疎水クロマトグラフィーによるエルゴチオナーゼ活性分画の単離。
0.25 mM エルゴチオネイン
10 mM ピロリン酸ナトリウム緩衝液 (pH 9.0) および
酵素
1 Uは、上記条件下で1分間に1μmol のチオウロカン酸生成を触媒する酵素量とし、チオウロカン酸の分子吸光係数(ε=18,000)より計算する。
(a)配列番号:3に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
(b)配列番号:4に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、
(c)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を含むタンパク質、
(d)配列番号:4に記載された塩基配列からなるDNAと高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、
(e)配列番号:3に記載のアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
本発明のエルゴチオナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば配列番号:4に示す塩基配列を含む。配列番号:4に示す塩基配列は、配列番号:3に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしており、このアミノ酸配列を含むタンパク質は、本発明によるエルゴチオナーゼの好ましい態様を構成する。
また、本発明におけるポリヌクレオチドには、配列番号:4に記載の塩基配列にシグナル配列を含めた配列番号:2に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドも含まれる。
なお本発明のポリヌクレオチドには、以上のような方法によってクローニングされたゲノムDNA、あるいはcDNAの他、合成によって得られたDNAが含まれる。
エシェリヒア(Escherichia)属
バチルス(Bacillus)属
シュードモナス(Pseudomonas)属
セラチア(Serratia)属
ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属
コリネバクテリイウム(Corynebacterium)属
ストレプトコッカス(Streptococcus)属
ラクトバチルス(Lactobacillus)属など宿主ベクター系の開発されている細菌
ロドコッカス(Rhodococcus)属
ストレプトマイセス(Streptomyces)属など宿主ベクター系の開発されている放線菌
サッカロマイセス(Saccharomyces)属
クライベロマイセス(Kluyveromyces)属
シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属
チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属
ヤロウイア(Yarrowia)属
トリコスポロン(Trichosporon)属
ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属
ピキア(Pichia)属
キャンディダ(Candida)属などの宿主ベクター系の開発されている酵母
ノイロスポラ(Neurospora)属
アスペルギルス(Aspergillus)属
セファロスポリウム(Cephalosporium)属
トリコデルマ(Trichoderma)属などの宿主ベクター系の開発されているカビ
本発明のエルゴチオネインの定量方法は、エルゴチオナーゼ活性を有する酵素活性物質を、この酵素活性物質によってエルゴチオネインからチオウロカン酸を生成することが可能な条件下で、被検対象に接触させる工程を含む。
(1)被験者(クローン病患者を含む)および臨床検体等から単離されたあらゆる生体由来物質(組織、臓器、体液、血液、細胞等)、および
(2)エルゴチオネイン、エルゴチオネイン含有物質、またはその原料や処理物(例えば、一般食品、健康食品、美容食品等の食品、化粧品、生体材料、カビ類、キノコ類、マイコバクテリア等)。
i) エルゴチオネインに作用し、チオウロカン酸およびトリメチルアミンを生成する能力を有する微生物
ii) i)の微生物の菌体、菌体培養物、菌体もしくは菌体培養物の処理物(菌体もしくは菌体培養物の乾燥物や濃縮物、菌体培養液から菌体を除去した上清、菌体自体の乾燥物や濃縮物等)
iii) i)またはii)から単離された物質
なお本発明における酵素活性物質は、精製された標品である必要はない。
ポリアクリルアミド法、
含硫多糖ゲル法(κ-カラギーナンゲル法など)、
アルギン酸ゲル法、
寒天ゲル法、
イオン交換樹脂法
あるいは、限外ろ過膜等を用いたメンブレンバイオリアクター中で、微生物、その処理物、あるいは酵素を基質化合物と接触させて反応させることもできる。
pH 5.0から11.0、好ましくはpH 7.0から9.5、
温度25から80℃、好ましくは25から60℃
(1) エルゴチオネインに作用してチオウロカン酸およびトリメチルアミンを生成する能力を有する酵素活性物質(enzymatic active materials)を、被検対象に接触させる工程、および
(2) 生成されたチオウロカン酸またはトリメチルアミンを定量する工程。
非特許文献4(J. Biol. Chem., 237, 874-881 (1962))に記載の培地を用い、大腸菌W株を0.02% 硫酸マグネシウム・7水和物、0.2% クエン酸、1% K2HPO4、0.5% グルコース及び5 mM エルゴチオネインを含有する培地(以下、エルゴチオネイン培地, pH 7.2)で37℃、5日間培養したが菌の生育は見られなかった。
0.25 mM エルゴチオネイン、10 mM ピロリン酸ナトリウム緩衝液(pH 9.0)および酵素を含む1 mLの反応液を用いて30℃で反応し、チオウロカン酸生成に由来する311 nmの吸光度の増加を測定した。1 U は、上記条件下で1分間に1μmolのチオウロカン酸生成を触媒する酵素量とし、チオウロカン酸の分子吸光係数(ε=18,000)より計算した。
エルゴチオネイン培地(5 mM エルゴチオネイン、0.02% 硫酸マグネシウム・7水和物、0.2% クエン酸、1% 無水リン酸水素二カリウム、pH7.2)を1 mLずつ分注し、オートクレーブにより加熱滅菌した。ここに高知県立のいち動物公園(高知県香南市野市町)から採取した土壌試料を小スパチュラで1サジ加え、30℃、4日間、振盪培養した。この培養液5μLを、0.1 mg/L シクロヘキシミドを含むエルゴチオネイン培地に植菌し、30℃、2日間、振盪培養した。この培養液を100倍希釈し、20μLを0.1 mg/Lシクロヘキシミドを含むエルゴチオネイン平板培地に塗布し、30℃で静置培養後、コロニーを単離した。その結果、エルゴチオネイン資化性細菌が単離された。
単離された資化性細菌(菌株)のうちHME13の微生物学的特徴は、表1にまとめたとおりである。
得られた塩基配列を配列番号:5に示した。配列番号:5の塩基配列を元に、アポロンDB-BA4.0(テクノスルガ・ラボ)を用いて、Blast検索を行った結果、次の菌株の16S-rDNA配列にそれぞれ99.4%の相同性を示した。
Burkholderia arboris R-24201
B. stabilis LMG14294
実施例1に記載のエルゴチオネイン培地で一晩振盪培養し、遠心分離にて得られた菌体を10 mM Sodium pyrophosphate (pH9.0), 1mM PMSFに懸濁し、超音波破砕した。破砕液を遠心分離し、未破砕菌体および菌体の残渣を除いた粗酵素液を得た。0.25 mM エルゴチオネインを含む10 mM Sodium pyrophosphate (pH 9.0)に本粗酵素液20μLを加え、30℃で保持しながら311 nmの吸光度を測定してチオウロカン酸の増加を追跡することで、酵素活性を測定した。また、タンパク質濃度をProtein assay CBB solution(ナカライテスク)にて定量した。エルゴチオナーゼ1Uは、1分間に1μmolのチオウロカン酸を生成する酵素量とした。結果を表2に示した。
エルゴチオネイン培地1 mLにBurkholderia sp. HME13を植菌し、30℃、一晩振盪培養し、得られた前培養液100μLを500 mLのエルゴチオネイン培地に植菌し、30℃、45時間振盪培養した。培養液を遠心分離し、得られた菌体を1 mM PMSF を含む10 mM ピロリン酸ナトリウム緩衝液 (pH 7.2) に懸濁し、超音波により菌体を破砕した。菌体破砕液を35-65% 硫安分画を行い、得られた酵素を10 mM ピロリン酸ナトリウム緩衝液 (pH 7.2) で2回透析した後、20 mM Tris-HCl (pH 7.2)で平衡化したDEAE-トヨパールカラム (250 mL-Resin)にアプライし、塩化ナトリウムにより段階的に溶出した。活性画分を回収し、濃縮後、35% 飽和硫安を含む10 mM ピロリン酸ナトリウム緩衝液 (pH 7.2) で透析し、35% 飽和硫安を含む10 mM ピロリン酸ナトリウム緩衝液 (pH 7.2) で平衡化したButyl-トヨパールカラム (200 mL-Resin)にアプライし、硫安濃度を段階的に下げて酵素を溶出した。精製の要約を表3(HME13からのエルゴチオナーゼの精製)に示した。
HME13から精製されたエルゴチオナーゼの至適温度を検討した。0.25 mMエルゴチオネイン、10 mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2)、23 ng 精製酵素を含む全量1.0 mlの溶液を反応液とし、25℃〜80℃まで5℃間隔でインキュベートし、反応液中に生成するチオウロカン酸の吸収(311 nm)の増加を測定した。結果を図2に示す。この結果から、HME13から精製されたエルゴチオナーゼの至適温度は65℃であることが確認された。また50-65℃で最大活性の80%以上が維持された。
次に、HME13から精製されたエルゴチオナーゼの熱安定性について検討した。0.1 mg /ml 精製酵素溶液を4,20,30,40,50,60,65,70,80℃で30分間加温した。その後、0.25 mM エルゴチオネイン,10 mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2),各温度で処理された精製酵素47 ngを含む全量1.0 mlの溶液を反応液とし、30℃で反応液中に生成するチオウロカン酸の吸収(311 nm)の増加を測定した。結果を図3に示す。この結果から、HME13から精製されたエルゴチオナーゼは60℃まで約90%の活性を維持し、70℃以上の温度では急速に活性を失うことが確認された。
さらに、HME13から精製されたエルゴチオナーゼの至適pHについて検討した。緩衝液を変えた他は(1)と同じ組成の反応液にエルゴチオナーゼ(47 ng/mL)を加えて反応を開始し、30℃で活性を測定した。実験に使用した緩衝液と、そのpHは次のとおりである。
100 mM酢酸ナトリウム緩衝液:pH5.0−6.5
100 mMリン酸ナトリウム緩衝液:pH6.5−7.5
100 mM Tris塩酸緩衝液:pH7.5−8.5
100 mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液:pH8.5−11.0
次に、HME13から精製されたエルゴチオナーゼの安定性に与えるpHの影響について検討した。各緩衝液に溶解したエルゴチオナーゼ(0.1mg/mL)を30℃で30分間プレインキュベーションした。次いで各pHで処理されたエルゴチオナーゼ47 ngを(1)と同じ組成の反応液に加えて反応を開始し、30℃で生成するチオウロカン酸の吸収(311 nm)を測定した。結果を図5に示す。この結果から、HME13から精製されたエルゴチオナーゼはpH 6.5-11.0で30℃, 30分間処理後に活性の80%以上を維持することが確認された。
HME13から精製されたエルゴチオナーゼの基質特異性について検討した。基質を変えた他は(1)と同じ組成の反応液にエルゴチオナーゼ(47 ng/mL)を加えて反応を開始し、30℃で活性を測定した。実験に使用した基質は表5のとおりである。エルゴチオネインを基質とした場合には生成するチオウロカン酸の吸収(311 nm)を測定した。ヒスチジンを基質とした場合には生成するウロカニン酸の吸収(277 nm)を測定した。チロシンを基質とした場合には生成するp-ヒドロキシケイ皮酸の吸収(315 nm)を測定した。フェニルアラニンを基質とした場合には生成するトランス-ケイ皮酸の吸収(290 nm)を測定した。この結果、エルゴチオナーゼはエルゴチオネイン以外のいずれのアミノ酸にも作用しなかった(表4)。
HME13から精製されたエルゴチオナーゼの阻害剤の影響について検討した。各阻害剤を加えた他は(1)と同じ組成の反応液にエルゴチオナーゼ(47 ng/mL)を加えて反応を開始し、30℃で生成するチオウロカン酸の吸収(311 nm)を測定した。但し、p-ヒドロキシ水銀安息香酸については、エルゴチオネインを除く反応液を30℃で20分間加温後、エルゴチオネインを加えて反応を開始した。実験に使用した阻害剤は表5のとおりである。この結果、エルゴチオナーゼは検討した各阻害剤によりほとんど影響を受けず、特にp-ヒドロキシ水銀安息香酸(p-hydroxymercuribenzoate)、ヨード酢酸(iodoacetate)、L-システイン(L-cysteine)存在下で80%以上の活性を保持していた点において、非特許文献4に記載の大腸菌W株由来エルゴチオナーゼと異なっていた(表5)。
実施例4で得られた酵素を用いて、プロテインシーケンサー(HT492 アプライドバイオシステムズ社)によりN末端アミノ酸配列を解析した。アミノ酸配列を配列番号:6に示した。
N末端アミノ酸配列を元にBLAST検索した結果、完全に一致するアミノ酸配列が得られた。得られた配列は次のとおりである。
Burkholderia sp.383 由来 Bcep18194_B3018 タンパク質のアミノ酸配列の一部
Burkholderia pseudomarei 1106a 由来 BURPS1106A_2045 タンパク質のアミノ酸配列の一部
Burkholderia pseudomarei 1710b 由来 BURPS1710b_2187 タンパク質のアミノ酸配列の一部
Burkholderia pseudomarei K96243 由来 BPSL1676 タンパク質のアミノ酸配列の一部
配列番号:7:CGACGTGCACACGCTCGCCGCGCT
配列番号:8:CCCGACGCGAGCTGCACGAGATGCTT
エルゴチオナーゼの構造遺伝子配列を基にORFのみをクローニングするためのプライマー(配列番号:10、11)を合成した。プライマーを各10 pmol、dNTP 10 nmol、Burkholderia sp. HME13由来染色体DNA 144 ng、Ex-Taq用緩衝液(タカラバイオ製)、Ex-Taq 1.25 U(タカラバイオ製)を含む50μLの反応液を用い、94℃、1分の後、98℃、10秒、68℃、1分を25サイクル、最後に72℃、10分、GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ製)を用いて行った。
配列番号:10:GGAATTCCATATGCAACGCTTCCTCATGCGGAGC
配列番号:11:GGGAAGCTTTCAGTCGTGATACGCGCGCAGCAG
エルゴチオナーゼを発現するプラスミドpET21a(+)/ERTaseで形質転換された大腸菌Rosetta 2 (DE3) 株をアンピシリンとクロラムフェニコールを含む液体LB培地で終夜30℃培養し、0.1 mM IPTGを加え、さらに3時間培養を行った。
エルゴチオナーゼを発現するプラスミドで形質転換された大腸菌Rosetta2 (DE3) 株を、1 mM PMSFを含む10 mM ピロリン酸ナトリウム緩衝液 (pH 7.2) に懸濁し、超音波により菌体を破砕した。菌体破砕液を30-50% 硫安分画を行い、得られた酵素を10 mM ピロリン酸ナトリウム緩衝液 (pH 7.2) で2回透析した後、20mM Tris-HCl (pH 7.2)で平衡化したDEAE-トヨパールカラムにアプライし、塩化ナトリウムにより段階的に溶出した。活性画分を回収し、濃縮後、30% 飽和硫安を含む10 mM ピロリン酸ナトリウム緩衝液 (pH 7.2) で透析し、30% 飽和硫安を含む10 mM ピロリン酸ナトリウム緩衝液 (pH 7.2) で平衡化したButyl-トヨパールカラム (200mL-Resin)にアプライし、硫安濃度を段階的に下げて酵素を溶出した。精製の要約を表7(組換えエルゴチオナーゼの精製)に示した。
配列番号:12:DVTLDGRSVTPESIARI
エルゴチオナーゼのシグナル配列を除いたORFのみをクローニングするためのプライマー(配列番号:13、14)を合成した。プライマーを各15 pmol、dNTP 20 nmol、pET21a(+)/ERTase plasmid、KOD FX用緩衝液(TOYOBO製)、KOD FX 1U(TOYOBO製)を含む50μLの反応液を用い、94℃、2分の後、98℃、10秒、74℃、1分30秒を5サイクル、98℃、10秒、72℃、1分30秒を20サイクル、最後に68℃、7分、GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ製)を用いて行った。
配列番号:13:GGAATTCCATATGGACGTCACGCTCGACGGCCGGT
配列番号:14:GGGAAGCTTTCAGTCGTGATACGCGCGCAGCAG
0〜500μg/mLエルゴチオネイン、10mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2)、1.9 mg/mL精製酵素を含む全量1.0 mLの溶液を反応液とし、30℃で1時間インキュベートし、2N HClを50μL加えて反応を停止し、反応液中に生成するチオウロカン酸の吸収(311 nm)の増加を測定した。結果を図6に示す。この結果から、HME13から精製されたエルゴチオナーゼを用いて0-500μg/mLの範囲でエルゴチオネインを定量可能であることが確認された。
Claims (14)
- 次の(1)〜(2)に示す理化学的性状を有するエルゴチオナーゼ;
(1)作用:L-エルゴチオネインに作用し、チオウロカン酸(3-(2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-1H-イミダゾール-4-イル)プロペン酸)およびトリメチルアミンを生成する、および
(2)基質特異性:L-エルゴチオネインに作用し、D-, L-ヒスチジン、D-, L-チロシン、D-, L-フェニルアラニンに作用しない。 - さらに付加的に、次の(3)〜(8)に示す理化学的性状を有する請求項1に記載のエルゴチオナーゼ;
(3)至適pH:7.0〜9.5、
(4)至適温度:50〜65℃、
(5)分子量:ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が45,000〜55,000、ゲルろ過による分子量が200,000〜260,000。
(6)熱安定性: 60℃、30分で90%以上の活性を保持、
(7)pH安定性: pH 6.5〜11.0、30分で80%以上の活性を保持、および
(8)阻害剤: p-ヒドロキシ水銀安息香酸(p-hydroxymercuribenzoate)、ヨード酢酸(iodoacetate)、および/またはL-システイン(L-cysteine)存在下において80%以上の活性を保持。 - バークホルデリア属、もしくはシュードモナス属に属する微生物に由来する、請求項1または2に記載のエルゴチオナーゼ。
- 前記バークホルデリア属、もしくはシュードモナス属に属する微生物が、下記の群から選択されるいずれかの微生物であることを特徴とする請求項3に記載のエルゴチオナーゼ;
バークホルデリア・エスピー NITE P-861(Burkholderia sp. NITE P-861)、および
シュードモナス・エスピー (Pseudomonas sp.)。 - 下記(a)〜(e)のいずれかに記載のエルゴチオナーゼ活性を有するタンパク質;
(a)配列番号:3に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
(b)配列番号:4に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、
(c)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を含むタンパク質、
(d)配列番号:4に記載された塩基配列からなるDNAと高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、または
(e)配列番号:3に記載のアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。 - 請求項5に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のエルゴチオナーゼをコードするポリヌクレオチドまたは請求項6に記載のポリヌクレオチドを保持したベクター。
- 請求項7に記載のベクターにより形質転換された形質転換体。
- 前記宿主が大腸菌である請求項8に記載の形質転換体。
- バークホルデリア属、もしくはシュードモナス属に属し、エルゴチオナーゼ活性を有する微生物、もしくは請求項8または9に記載の形質転換体を培養する工程と、培養物よりエルゴチオナーゼを回収する工程を含むエルゴチオナーゼの製造方法。
- エルゴチオネインに作用してチオウロカン酸を生成する能力を有する酵素活性物質を、被検対象に接触させる工程を含む、エルゴチオネインの定量方法。
- 前記酵素活性物質が、請求項1〜4のいずれかに記載のエルゴチオナーゼ、請求項5に記載のエルゴチオナーゼ活性を有するタンパク質、当該エルゴチオナーゼまたはエルゴチオナーゼ活性を有するタンパク質を生産する微生物、およびその処理物からなる群から選択される、請求項11に記載のエルゴチオネインの定量方法。
- エルゴチオナーゼおよび/または酵素活性物質を含むことを特徴とするエルゴチオネイン定量試薬、およびキット。
- チオウロカン酸およびトリメチルアミンにエルゴチオナーゼおよび/または酵素活性物質を作用させることを特徴とする、エルゴチオネインの製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010213226A JP5735772B2 (ja) | 2010-09-24 | 2010-09-24 | エルゴチオナーゼ、およびエルゴチオネインの定量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010213226A JP5735772B2 (ja) | 2010-09-24 | 2010-09-24 | エルゴチオナーゼ、およびエルゴチオネインの定量方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2012065591A true JP2012065591A (ja) | 2012-04-05 |
JP5735772B2 JP5735772B2 (ja) | 2015-06-17 |
Family
ID=46163638
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010213226A Active JP5735772B2 (ja) | 2010-09-24 | 2010-09-24 | エルゴチオナーゼ、およびエルゴチオネインの定量方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5735772B2 (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110358719A (zh) * | 2019-07-23 | 2019-10-22 | 江南大学 | 一种发酵合成麦角硫因的工程菌株及其构建方法 |
CN114085782A (zh) * | 2021-11-23 | 2022-02-25 | 深圳中科欣扬生物科技有限公司 | 一种来源于曲卓木天然热泉的麦角硫因合成基因及其开发应用 |
CN114107326A (zh) * | 2020-09-01 | 2022-03-01 | 中国科学院微生物研究所 | 两个麦角硫因合成蛋白质及其在麦角硫因合成中的应用 |
-
2010
- 2010-09-24 JP JP2010213226A patent/JP5735772B2/ja active Active
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JPN6014040074; Phenylalanine/histidine ammonia-lyase. , 20061031 * |
JPN6014040075; J. Biol. Chem. vol.237, no.3, 1962, pp.874-881 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110358719A (zh) * | 2019-07-23 | 2019-10-22 | 江南大学 | 一种发酵合成麦角硫因的工程菌株及其构建方法 |
CN110358719B (zh) * | 2019-07-23 | 2021-05-04 | 江南大学 | 一种发酵合成麦角硫因的工程菌株及其构建方法 |
CN114107326A (zh) * | 2020-09-01 | 2022-03-01 | 中国科学院微生物研究所 | 两个麦角硫因合成蛋白质及其在麦角硫因合成中的应用 |
CN114085782A (zh) * | 2021-11-23 | 2022-02-25 | 深圳中科欣扬生物科技有限公司 | 一种来源于曲卓木天然热泉的麦角硫因合成基因及其开发应用 |
CN114085782B (zh) * | 2021-11-23 | 2023-10-24 | 深圳中科欣扬生物科技有限公司 | 一种来源于曲卓木天然热泉的麦角硫因合成基因及其开发应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP5735772B2 (ja) | 2015-06-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
WO2010024445A1 (ja) | 光学活性なアミン誘導体を製造するための方法 | |
US20040197773A1 (en) | Novel carbonyl reductase, method for producing said enzyme, DNA encoding said enzyme, and method for producing alcohol using said enzyme | |
JP7221350B2 (ja) | ヒドロキシ-l-ピペコリン酸の製造方法 | |
WO2010024444A1 (ja) | 光学活性なアミン誘導体の製造方法 | |
US8518669B2 (en) | Recombinant expression plasmid vector and recombinant strain to be used in producing oxalate decarboxylase, and method of producing recombinant oxalate decarboxylase | |
Thongchuang et al. | Design of a recombinant Escherichia coli for producing L-phenylalanine from glycerol | |
US11549130B2 (en) | Random interesterification lipase | |
JP5735772B2 (ja) | エルゴチオナーゼ、およびエルゴチオネインの定量方法 | |
JP4294382B2 (ja) | (2s,3s)−2,3−ブタンジオール脱水素酵素 | |
US7250278B2 (en) | α-keto acid reductase, method for producing the same, and method for producing optically active α-hydroxy acids using the same | |
Oikawa et al. | Expression of alr gene from Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 in Escherichia coli and molecular characterization of the recombinant alanine racemase | |
JP4272312B2 (ja) | 新規ニトリラーゼ、および2−ヒドロキシ−4−メチルチオ酪酸の製造方法 | |
JP2010187658A (ja) | D−フェニルセリンデアミナーゼ及びその利用 | |
JP4295531B2 (ja) | 新規カルボニル還元酵素及びこれをコードするdna、ならびにこれらを利用した光学活性アルコールの製造方法 | |
US6780619B2 (en) | D-aminoacylase and gene encoding the same | |
Tork et al. | New tannase-producing Lactobacillus Sp. Nrc10: Gene cloning, enzyme purification, and characterization | |
JP4587348B2 (ja) | 新規な(r)−2,3−ブタンジオール脱水素酵素 | |
JP2011177029A (ja) | 光学活性なアミン誘導体の製造方法 | |
JP4397088B2 (ja) | 還元酵素をコードする遺伝子 | |
EP1178114A2 (en) | Heat-stable d-aminoacylase | |
JP5354710B2 (ja) | 高活性カタラーゼ産生微生物及びその使用 | |
JP4415247B2 (ja) | 新規なグリセロールキナーゼ、該遺伝子及び該遺伝子を用いたグリセロールキナーゼの製造法 | |
JP2009261261A (ja) | D−マンデル酸脱水素酵素−iiの製造方法 | |
Bae et al. | Molecular cloning and characterization of a novel cold-active lipase from Pichia lynferdii NRRL Y-7723 | |
WO2011118831A1 (ja) | 5-(アミノメチル)-2-クロロチアゾールの製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20130405 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20130405 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20140827 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140918 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20141017 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150226 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150306 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20150316 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150413 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20150417 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5735772 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |