CN114085782B

CN114085782B - 一种来源于曲卓木天然热泉的麦角硫因合成基因及其开发应用

Info

Publication number: CN114085782B
Application number: CN202111393552.XA
Authority: CN
Inventors: 张山; 丁利平
Original assignee: Shenzhen Upfo Biotech Co ltd
Current assignee: Shenzhen Upfo Biotech Co ltd
Priority date: 2021-11-23
Filing date: 2021-11-23
Publication date: 2023-10-24
Anticipated expiration: 2041-11-23
Also published as: CN114085782A

Abstract

本发明公开了一种来源于曲卓木天然热泉的麦角硫因合成基因及其开发应用，属于基因工程领域。本发明提供了一株重组里氏木霉，所述重组里氏木霉是以里氏木霉TU‑6为宿主，插入表达盒pyr4‑Pcbh1‑tegt1‑Tcbh2后得到的，所述表达盒插入到里氏木霉TU‑6的scaffold_33:120008‑120031位点。本发明中里氏木霉tegt1过表达菌株在纤维素诱导条件下，麦角硫因的合成提高量至5.316mg/g(d.w.)，相比于原始菌株TU‑6的0.239mg/g(d.w.)，麦角硫因产量提高了22.24倍，本发明实现了在里氏木霉中通过基因工程提高麦角硫因的合成。

Description

一种来源于曲卓木天然热泉的麦角硫因合成基因及其开发应用

技术领域

本发明涉及一种来源于曲卓木天然热泉的麦角硫因合成基因及其开发应用，属于基因工程领域。

背景技术

麦角硫因(Ergothioneine，ERG)是一种由组氨酸衍生而来的天然含巯基小分子化合物，最早是从寄生在黑麦上的一种真菌——麦角菌(Claviceps purpurea)中分离得到，是一种功能强大的抗氧化剂，具备清除活性氧(ROS)如羟基自由基、次氯酸、过氧亚硝酸盐和单重态氧的能力，以及调节由细胞过氧化氢、肿瘤坏死因子α或棕榈酸治疗引起的炎症反应的能力；此外麦角硫因还能保护DNA免受损伤、螯合二价金属离子，且麦角硫因螯合后产生的化合物性质稳定，并不会再次分解产生自由基。因此，麦角硫因有望广泛应用于食品、医药、化妆品等诸多领域。

目前市面上的麦角硫因产品主要由化学合成得到，但合成过程中涉及一些酚类化合物的使用，后期纯化及去除困难，安全性难以得到保障，且合成的试剂昂贵，并不适用于大量工业化生产。近年来随着麦角硫因的细菌真菌及厌氧合成路径的解析，麦角硫因的生物合成逐渐兴起，诸如大型食用真菌菌丝发酵，利用基因工程改造大肠杆菌、酿酒酵母等。

但尚未有报道通过基因工程技术手段改造里氏木霉菌株来合成麦角硫因。

里氏木霉(Trichoderma reesei)作为一种美国FDA认证的食品级安全菌株，同时还具有强大的酶蛋白表达系统，在各种内源和外源蛋白的表达生产中担当着不可或缺的角色，是表达各种同源和异源蛋白的理想宿主。

藏南地区唐古拉山以南的曲卓木乡蕴藏着无数天然热泉，与周边零下温度形成剧烈反差；4800米海拔带来的强辐射，干旱冻结的土地，使这里的环境恶劣。发明人团队前期研究发现，从曲卓木天然热泉旁的土壤中分离到一株木霉菌THS-1。深入研究表明，是这株木霉菌内高效合成的麦角硫因给了它强大抗氧化、抗逆的能力，使其顽强的存活在高原之上。

然而，天然里氏木霉菌株的麦角硫因合成效率和产量较低。因此，需要利用基因工程手段对天然菌株改造，以提高其麦角硫因产量。

发明内容

本发明的首要目的是提供一株通过基因工程技术改造提高麦角硫因合成的里氏木霉菌株，该菌株利用强诱导型启动子过表达了麦角硫因合成通路中的关键基因tegt1，相比于原始菌株具有显著提高。

本发明提供了一株重组里氏木霉(Trichoderma reesei)，所述重组里氏木霉是以里氏木霉TU-6为宿主，插入过表达盒pyr4-Pcbh1-tegt1-Tcbh2后得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述表达盒插入到里氏木霉TU-6的scaffold_33:120008-120031位点。

在本发明的一种实施方式中，所述表达盒中pyr4的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述表达盒中tegt1基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述表达盒中pyr4的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，编码所述表达盒中Pcbh1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码所述表达盒中tegt1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码所述表达盒中Tcbh2的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。

本发明还提供了一种构建可生产麦角硫因的重组里氏木霉的方法，所述方法为：

(1)从里氏木霉QM9414(ATCC 26921)中扩增出核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的pyr4片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的Pcbh1片段，从本公司于西藏热泉附近筛选出的木霉菌(Trichoderma spp.)THS-1中扩增出核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的tegt1片段，从里氏木霉QM9414(ATCC 26921)中扩增出核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的Tcbh2片段；

(2)分别将步骤(1)制备得到的pyr4片段、Pcbh1片段、tegt1片段、Tcbh2片段依次连接在质粒pEASY-blunt simple上，制备得到重组质粒pEASY-pyr4-Pcbh1-tegt1-Tcbh2，再从质粒中通过PCR扩增得到片段pyr4-Pcbh1-tegt1-Tcbh2；

(3)制备里氏木霉TU-6原生质体；

(4)将步骤(2)制备得到的片段pyr4-Pcbh1-tegt1-Tcbh2导入里氏木霉原生质体的scaffold_33:120008-120031位点中，制备得到重组里氏木霉tegt1。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中的里氏木霉为TU-6。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中的原生质体的制备方法为：

(1)将里氏木霉TU-6接种至PDA培养基平皿中，在28～30℃条件下培养7～10d，用0.9～1.2mol/L浓度的山梨醇进行冲洗孢子，制备得到孢子悬液；

(2)将步骤(1)制备得到的孢子悬液均接种到50mL含有5mmol/L尿嘧啶的种子培养基中，在30℃，200rpm条件下培养14～18h，制备得到菌丝悬液；

(3)将步骤(2)得到的菌丝悬液用200目筛子过滤，收集菌体，并用无菌水冲洗，在用1.2mol/L的MgSO₄缓冲液润洗，制备得到菌丝体；

(4)将步骤(3)得到的菌丝体悬浮于20mL裂解液中，在30℃，70～80rpm条件下孵育2～3h后，加入20mL 0.6mol/L山梨醇溶液制备得到原生质体悬液；

(5)将步骤(4)得到的原生质体悬液用双层200目筛子过滤，收集滤过液，2800～3500rpm离心10～15min，弃上清，制备得到原生质体沉淀；

(6)将步骤(5)得到的原生质体沉淀用1.0mol/L山梨醇缓冲液洗2～3次后，悬浮于1mL浓度为1.0mol/L山梨醇缓冲液中，即制备得到原生质体。

在本发明的一种实施方式中，MM+2％葡萄糖培养基：(NH₄)₂SO₄ 5g，KH₂PO₄ 15g，MgSO₄ 0.6g，CaCl₂ 0.6g，FeSO₄·7H₂O 0.005g，MnSO₄·H₂O 0.0016g，ZnSO₄·7H₂O 0.0014g，CoCl₂ 0.002g，葡萄糖20g，蒸馏水定容至1L，pH自然。

在本发明的一种实施方式中，所述1.2mol/L的MgSO₄缓冲液成分包括：MgSO₄·7H₂O29.52g，0.2M磷酸盐缓冲液5mL，蒸馏水定容至100mL；

所述0.2M磷酸盐缓冲液配制方法为：81mL 0.2mol/L Na₂HPO₄与19mL 0.2mol/LNaH₂PO₄混合。

在本发明的一种实施方式中，所述裂解液成分包括：裂解酶(sigma，L-1412)200mg，纤维素酶(YAKULT，AOV0105)20mg，MgSO₄·7H₂O 29.52g，蒸馏水定容至100mL。

在本发明的一种实施方式中，所述1.0mol/L山梨醇缓冲液成分包括：山梨醇18.217g，0.1mol/L CaCl₂ 10mL，1mol/L pH7.5 Tris-HCl 1mL，蒸馏水定容至100mL。

本发明还提供了一种制备麦角硫因的方法，所述方法为，采用上述重组里氏木霉发酵制备得到。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为：

(1)将重组里氏木霉接种至PDA培养基平皿中，在28～30℃条件下培养7d，采用2mL0.9～1.2mol/L浓度的山梨醇进行冲洗孢子，制备得到孢子悬液；

(2)将步骤(1)制备得到的孢子悬液按1～5％(v/v)的接种量接种至MM+2％葡萄糖培养基中，在30℃200rpm预培养40～52h，制备得到菌丝体；

(3)将步骤(2)制备得到的菌丝体采用无菌水冲洗后，取2～6％的菌丝体接种至MM+1％纤维素培养基中，发酵条件为：在28～30℃200rpm发酵6～7d，制备得到菌丝体；

(4)提取麦角硫因：将上述发酵后的菌丝收集后，通过液氮研磨破碎菌体，加入少量蒸馏水，10000～13000rpm离心5min。

在本发明的一种实施方式中，MM+1％纤维素培养基：(NH₄)₂SO₄ 5g，KH₂PO₄ 15g，MgSO₄ 0.6g，CaCl₂ 0.6g，FeSO₄·7H₂O 0.005g，MnSO₄·H₂O 0.0016g，ZnSO₄·7H₂O 0.0014g，CoCl₂ 0.002g，微晶纤维素10g，蒸馏水定容至1L，KOH调pH至5.3。

本发明还提供了上述重组里氏木霉在制备含有麦角硫因产品中的应用。

有益效果

(1)里氏木霉是一种美国FDA认证的食品级安全菌株，该菌株作为生产菌株不会产生类似大肠杆菌生成的内毒素；相比于酿酒酵母发酵，里氏木霉的发酵过程不会大量产热，降低降温设备投入成本；相比于大型真菌，里氏木霉发酵周期较短，且作为一种纤维素酶酶系发达的模式菌株，该菌可以直接利用纤维素，使得将麸皮、玉米芯等转化合成麦角硫因成为可能。

(2)本发明中里氏木霉tegt1过表达菌株在纤维素诱导条件下，麦角硫因的合成提高量至5.316mg/g(d.w.)，相比于原始菌株TU-6的0.239mg/g(d.w.)，麦角硫因产量提高了22.24倍，目前尚未有报道改造里氏木霉提高麦角硫因的合成。

附图说明

图1：过表达tegt1重组载体pEASY-pyr4-Pcbh1-tegt1-Tcbh2图谱。

图2：里氏木霉tegt1过表达菌株发酵合成麦角硫因的HPLC检测结果。

图3：出发菌株TU-6与重组里氏木霉菌株tegt1发酵7d麦角硫因的合成量。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所使用引物序列均在北京生工生物工程股份有限公司直接合成获得；下述实施例中所涉及的里氏木霉QM9414(ATCC 26921)和TU-6(ATCC MYA-256)购自ATCC；下述实施例中所涉及的pEASY-blunt simple、感受态大肠杆菌细胞Trans1-T1购自北京全式金生物。下述实施例中所涉及的裂解酶(lysing enzymes，sigma)和纤维素酶(cellulase“ONOZUKA”R-10，日本YAKULT)分别购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司和北京拜尔迪生物技术有限公司。

木霉菌(Trichoderma spp.)THS-1由本公司研发团队与西藏热泉附近的土壤中分离得到，由本公司保藏。

下述实施例中所涉及的培养基如下：

LB固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，蒸馏水定容至1L，pH自然。

PDA固体培养基：葡萄糖20g，马铃薯200g，琼脂粉20g，蒸馏水定容至1L，pH自然。

MM(Minimal Methanol)培养基：(NH₄)₂SO₄ 5g，KH₂PO₄ 15g，MgSO₄.7H₂O 1.23g，CaCl₂.2H₂O 0.8g，FeSO₄·7H₂O 5mg，MnSO₄·H₂O 1.6mg，ZnSO₄·7H₂O 1.4mg，CoCl₂ 2mg，去离子水定容至1L，KOH调pH至5.3。

上层筛选培养基：1L MM液体培养基中加入葡萄糖10g，山梨醇200g，琼脂粉8g。

下层筛选培养基：1L MM液体培养基中加入葡萄糖10g，山梨醇200g，琼脂粉30g。

MM+2％葡萄糖培养基：(NH₄)₂SO₄ 5g，KH₂PO₄ 15g，MgSO₄ 0.6g，CaCl₂ 0.6g，FeSO₄·7H₂O 0.005g，MnSO₄·H₂O 0.0016g，ZnSO₄·7H₂O 0.0014g，CoCl₂ 0.002g，葡萄糖20g，蒸馏水定容至1L，pH自然。

MM+1％纤维素培养基：(NH₄)₂SO₄ 5g，KH₂PO₄ 15g，MgSO₄ 0.6g，CaCl₂ 0.6g，FeSO₄·7H₂O 0.005g，MnSO₄·H₂O 0.0016g，ZnSO₄·7H₂O 0.0014g，CoCl₂ 0.002g，微晶纤维素10g，蒸馏水定容至1L，KOH调pH至5.3。

下述实施例中所涉及的溶液如下：

1.2M MgSO₄溶液的配制：MgSO₄·7H₂O 29.52g，0.2M磷酸盐缓冲液5mL，蒸馏水定容至100mL。

0.6M山梨醇溶液的配制：山梨醇10.9302g，1M Tris-HCl 10mL，蒸馏水定容至100mL。

1.0M山梨醇溶液的配制：山梨醇18.217g，0.1M CaCl₂ 10mL，1M Tris-HCl 1mL，蒸馏水定容至100mL。

50％PEG4000缓冲液的配制：PEG 4000 25g，1M Tris-HCl 500μL，CaCl₂·2H₂O0.37g，蒸馏水定容至50mL，0.22μm滤器滤灭。

下述实施例中所涉及的麦角硫因的含量的检测如下：

按照上清液:去离子水:乙腈体积比1:2:7制备，用0.22μm的有机微孔滤膜过滤后HPLC检测麦角硫因浓度；对照组与上述操作相同。标准品麦角硫因(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)用70％(体积百分比)乙腈水溶液溶解至10mg/L。

HPLC检测仪为Agilent 1260Infinity LC,检测柱为Agilent ZOBAX-NH2氨基柱，紫外检测波长为254nm，流动相70％(V/V)乙腈水溶液,流速1.0mL/min,进样量10μL，采用外标法按峰面积定量。

下述实施例中所涉及的引物序列如表1所示：

表1引物序列

实施例1：重组载体pyr4-Pcbh1-tegt1-Tcbh2的构建

具体步骤如下：

(1)各个片段的获得：

提取里氏木霉QM9414(ATCC 26921)的基因组DNA，并以此为模板，利用引物Fpyr4和Rpyr4(表1)进行PCR扩增，所获得的扩增产物记为pyr4片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，2389bp)；

以里氏木霉QM9414基因组DNA为模板，利用引物Fpcbh1和Rpcbh1(表1)进行PCR扩增，所获得的扩增产物记为Pcbh1片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，1512bp)；

以木霉菌THS-1基因组DNA为模板，利用引物Ftegt1和Rtegt1进行PCR扩增，所获得的扩增产物记为tegt1片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，3290bp)；

以里氏木霉QM9414基因组DNA为模板，利用引物Ftcbh2和Rtcbh2进行PCR扩增，所获得的扩增产物记为Tcbh2片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，1048bp)；

以pEASY-blunt simple载体为模板，利用引物Fvec和Rvec进行PCR扩增，所获得的扩增产物记为vec片段(3856bp)。

(2)利用无缝拼接试剂盒(Clone MultiS One Step Cloning Kit，诺唯赞)将上述所得到的pyr4，Pcbh1，tegt1，Tcbh2和vec五个片段进行连接，连接产物通过氯化钙转化法转入到感受态大肠杆菌细胞Trans1-T1中，制备得到转化子，将转化子涂布在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，挑取阳性克隆，提质粒测序，最终得到重组质粒被记为pEASY-pyr4-Pcbh1-tegt1-Tcbh2，质粒图谱见图1所示。

(3)以得到的重组质pEASY-pyr4-Pcbh1-tegt1-Tcbh2为模板，利用引物Fpyr4和Rtcbh2进行PCR扩增，所获得的扩增产物记为pyr4-Pcbh1-tegt1-Tcbh2(8159bp)。

实施例2：里氏木霉原生质体的制备

具体步骤如下：

(1)将里氏木霉TU-6菌株接种于PDA固体培养基中，30℃恒温培养箱培养7d后，用1.1M山梨醇洗下孢子，制备得到孢子悬液；

(2)将孢子悬液按1％(v/v)的接种量接种于MM+2％葡萄糖培养基中，在30℃200rpm条件下孵育16h，制备得到菌丝体；

(3)将制备得到的菌丝体用200目筛子过滤，并采用1.2M MgSO₄溶液润洗后，收集菌丝并将其悬浮于含有终浓度为10g/L裂解酶(lysing enzymes，sigma)和终浓度为1g/L纤维素酶(cellulase“ONOZUKA”R-10，日本YAKULT)的1.2M MgSO₄溶液中，在30℃，80rpm条件下孵育2h后，加入等体积的0.6M山梨醇溶液，双层200目筛子过滤，收集下层原生质体液，室温3000rpm离心10分钟，收集原生质体沉淀，用1.0M山梨醇溶液洗2-3次后，弃上清，将原生质体悬浮于1mL 1.0M山梨醇溶液中。

实施例3：里氏木霉的转化

具体步骤如下：

(1)将20μg实施例1制备得到的片段pyr4-Pcbh1-tegt1-Tcbh2加入到200μL实施例2制备得到的里氏木霉TU-6原生质体溶液中，混匀后，加入50μL 50％PEG4000缓冲液，混匀，冰上保温30min，得到混合液；

(2)向上述混合液中加入1mL 50％PEG4000缓冲液，摇匀后，在室温下放置20min；加入1mL 1.0M山梨醇溶液，混匀后，与冷却至58℃以下的上层筛选培养基混和，立即铺于下层筛选培养基平皿上，30℃恒温培养箱培养4天。

(3)挑取筛选培养基中的单个菌落(即转化子)，接种到PDA固体培养基平皿中产孢，30℃恒温培养箱培养3-4d；刮取少量转化子孢子，利用UniversAll组织DNA萃取缓冲液(yeastern)粗提基因组DNA，并利用引物F-JD和R-JD进行PCR扩增(表1)，将能成功扩增出大小约为3777bp条带的PCR产物送至北京擎科生物科技有限公司测序，测序结果表明，获得了成功插入过表达盒pyr4-Pcbh1-tegt1-Tcbh2的菌株重组里氏木霉，命名为重组里氏木霉tegt1。

实施例4：重组里氏木霉tegt1插入位点的鉴定

具体步骤如下：

(1)重组里氏木霉tegt1接种至PDA培养基平皿上，30℃培养7d后，采用1.1M的山梨醇进行冲洗孢子，制备得到孢子悬液；

(2)分别将步骤(1)制备得到的孢子悬液按1％(v/v)接种量接种至MM+2％葡萄糖培养基中，30℃200rpm培养48h，制备得到菌丝体；

(3)取少量步骤(2)制备得到的菌丝体，利用CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒(Aidlab)抽提得到重组里氏木霉tegt1的基因组DNA；

(4)将步骤(3)制备得到的基因组DNA稀释至50ng/μL，按照表2所示第一轮PCR扩增体系加入各组分，其中Taq酶购于TaKaRa；扩增程序如表3中第一轮PCR扩增反应所示，制备得到第一轮扩增产物；

表2第一轮PCR扩增体系

成分	体积
		基因组DNA	1μL
10×Taq Buffer	2μL
		dNTP(2.5mmol/L)	1μL
LAD1/2(10μmol/L)	2μL
		LAD3/4(10μmol/L)	2μL
SP0(10μmol/L)	1μL
		Taq酶(5U/μL)	0.5μL
ddH₂O	13.5μL
		总体积	20μL

表3hiTAIL-PCR扩增程序

(5)将步骤(4)制备得到的第一轮扩增产物稀释40倍后作为模板，进行第二轮hiTAIL-PCR，扩增体系如表4所示，扩增程序如表3中第二轮PCR扩增反应所示，制备得到第二轮扩增产物；

表4第二轮PCR扩增体系

成分	体积
		第一轮扩增产物稀释40倍	1μL
10×Taq Buffer	5μL
		dNTP(2.5mmol/L)	4μL
AC1(10μmol/L)	2μL
		SP1(10μmol/L)	2μL
Taq酶(5U/μL)	1μL
		ddH₂O	35μL
总体积	50μL

(6)将步骤(5)制备得到的第二轮扩增产物稀释10倍后作为模板，进行第三轮hiTAIL-PCR，扩增体系如表5所示，扩增程序如表3中第三轮PCR扩增反应所示，制备得到第三轮扩增产物；

表5第三轮PCR扩增体系

(7)将步骤(6)制备得到的第三轮PCR扩增产物胶回收后与pMD19-T Vector(TaKaRa)通过T4 DNA连接酶(全式金)进行连接，连接产物通过氯化钙转化法转入到感受态大肠杆菌细胞Trans1-T1中，制备得到转化子，将转化子涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上，挑取阳性克隆，提质粒测序，测序结果在JGI的里氏木霉数据库中比对，结果显示，第三轮PCR扩增产物为一个207bp的片段，其中包含插入片段的pyr4上游76bp，以及里氏木霉基因组中的131bp(scaffold_33:119877-120008)，即得到插入位点的起始位置：scaffold_33:120008。

(8)以步骤(3)制备得到的基因组DNA为模板，利用引物F-AD和R-AD进行普通PCR扩增，得到的片段送测序，测序结果在JGI的里氏木霉数据库中比对，结果显示，该片段长度为897bp，包含Tcbh2下游的126bp，以及里氏木霉基因组中771bp(scaffold_33:120031-120794)，即得到插入位点的终止位置：scaffold_33:120031。

(9)根据步骤(7)和步骤(8)所得结果，确定过表达盒pyr4-Pcbh1-tegt1-Tcbh2在里氏木霉TU-6的插入位点为scaffold_33:120008-120031。

实施例5：麦角硫因标准曲线的绘制

具体步骤如下：

(1)称取4mg麦角硫因标品，用4mL 70％乙腈水溶液溶解，配制得到1g/L的麦角硫因标品母液；

(2)用70％的乙腈水溶液将步骤(1)得到的母液进行梯度稀释，分别得到5，10，25，50，100，250，500mg/L的麦角硫因溶液；

(3)将步骤(2)得到的不同浓度麦角硫因溶液用0.22μm的有机微孔滤膜过滤，通过HPLC检测，检测结果如表6所示。

表6不同浓度麦角硫因的峰面积

(4)将步骤(3)所得数据拟合标准曲线：y＝37.854x+39.353，R²＝1，得到麦角硫因浓度与峰面积的计算公式：麦角硫因浓度(mg/L)＝(峰面积-39.353)/37.854。

实施例6：重组里氏木霉tegt1发酵合成麦角硫因

具体步骤如下：

(1)分别将重组里氏木霉tegt1及对照菌株里氏木霉TU-6接种至PDA培养基和含有5mM尿嘧啶的PDA培养基中，在30℃条件下培养7d，采用1.1M的山梨醇进行冲洗孢子，分别制备得到孢子悬液；

(2)分别将步骤(1)制备得到的孢子悬液按1％(v/v)接种量接种至MM+2％葡萄糖培养基中，30℃200rpm预培养48h，分别制备得到菌丝体悬液；

(3)分别将制备得到的菌丝体悬液，用双层纱布过滤，无菌水冲洗后，称取2g菌丝接种于MM+1％纤维素培养基中，30℃200rpm发酵7d；分别制备得到菌丝体；

(4)提取麦角硫因：将上述发酵后的菌丝收集起来，分别取一部分菌丝进行称湿重，然后放到65℃烘箱中烘干后称干重，计算湿/干重比，结果如表7所示。

表7里氏木霉TU-6与tegt1菌丝的干湿重

	TU-6-A	TU-6-B	TU-6-C	tegt1-A	tegt1-B	tegt1-C
							湿重/g	3.1	2.99	4.41	2.73	6.05	5.57
干重/g	0.23	0.18	0.26	0.19	0.38	0.35
							湿/干重比	13.48	16.61	16.96	14.37	15.92	15.91

分别将剩余菌丝通过液氮研磨破碎菌体，取少量研磨后的菌体称量(称量结果如表8所示)，加入250μL蒸馏水充分混匀后，13000rpm离心3min，吸取上清，按照上清液：去离子水：乙腈体积比为1：2：7制备，用0.22μm的有机微孔滤膜过滤后HPLC检测麦角硫因，检测所得峰面积如表8及图2所示；利用实施例5得到的标准曲线以及步骤(4)得到的湿/干重比计算菌丝中麦角硫因的含量，计算公式为：菌丝中麦角硫因含量(mg/g)＝湿干比*(峰面积-39.353)/(15141.6*菌体取样量)；麦角硫因含量结果如表8及图3所示。

表8里氏木霉TU-6与tegt1菌体取样量以及HPLC检测结果

	TU-6-A	TU-6-B	TU-6-C	tegt1-A	tegt1-B	tegt1-C
							菌体取样量/g	0.258	0.15	0.212	0.219	0.194	0.25
峰面积	123.99	69.8	77.8	1288.7	1178.3	1493.1

结果显示，本发明的菌株重组里氏木霉tegt1在纤维素诱导的条件下发酵7d，胞内能合成5.316mg/g(d.w.)麦角硫因，相比于对照组TU-6菌株的0.239mg/g(d.w.)，其合成量提高了22.24倍。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳中科欣扬生物科技有限公司

<120> 一种来源于曲卓木天然热泉的麦角硫因合成基因及其开发应用

<130> BAA211077A

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 381

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ala Pro His Pro Thr Leu Lys Ala Thr Phe Ala Ala Arg Ser Glu

1 5 10 15

Thr Ala Thr His Pro Leu Thr Ala Tyr Leu Phe Lys Leu Met Asp Leu

20 25 30

Lys Ala Ser Asn Leu Cys Leu Ser Ala Asp Val Pro Thr Ala Arg Glu

35 40 45

Leu Leu Tyr Leu Ala Asp Lys Ile Gly Pro Ser Ile Val Val Leu Lys

50 55 60

Thr His Tyr Asp Met Val Ser Gly Trp Thr Ser His Pro Glu Thr Gly

65 70 75 80

Thr Gly Ala Gln Leu Ala Ser Leu Ala Arg Lys His Gly Phe Leu Ile

85 90 95

Phe Glu Asp Arg Lys Phe Gly Asp Ile Gly His Thr Val Glu Leu Gln

100 105 110

Tyr Thr Gly Gly Ser Ala Arg Ile Ile Asp Trp Ala His Ile Val Asn

115 120 125

Val Asn Met Val Pro Gly Lys Ala Ser Val Ala Ser Leu Ala Gln Gly

130 135 140

Ala Lys Arg Trp Leu Glu Arg Tyr Pro Cys Glu Val Lys Thr Ser Val

145 150 155 160

Thr Val Gly Thr Pro Thr Met Asp Ser Phe Asp Asp Asp Ala Asp Ser

165 170 175

Arg Asp Ala Glu Pro Ala Gly Ala Val Asn Gly Met Gly Ser Ile Gly

180 185 190

Val Leu Asp Lys Pro Ile Tyr Ser Asn Arg Ser Gly Asp Gly Arg Lys

195 200 205

Gly Ser Ile Val Ser Ile Thr Thr Val Thr Gln Gln Tyr Glu Ser Val

210 215 220

Ser Ser Pro Arg Leu Thr Lys Ala Ile Ala Glu Gly Asp Glu Ser Leu

225 230 235 240

Phe Pro Gly Ile Glu Glu Ala Pro Leu Ser Arg Gly Leu Leu Ile Leu

245 250 255

Ala Gln Met Ser Ser Gln Gly Asn Phe Met Asn Lys Glu Tyr Thr Gln

260 265 270

Ala Ser Val Glu Ala Ala Arg Glu His Lys Asp Phe Val Met Gly Phe

275 280 285

Ile Ser Gln Glu Thr Leu Asn Thr Glu Pro Asp Asp Ala Phe Ile His

290 295 300

Met Thr Pro Gly Cys Gln Leu Pro Pro Glu Asp Glu Asp Gln Gln Thr

305 310 315 320

Asn Gly Ser Val Gly Gly Asp Gly Gln Gly Gln Gln Tyr Asn Thr Pro

325 330 335

His Lys Leu Ile Gly Ile Ala Gly Ser Asp Ile Ala Ile Val Gly Arg

340 345 350

Gly Ile Leu Lys Ala Ser Asp Pro Val Glu Glu Ala Glu Arg Tyr Arg

355 360 365

Ser Ala Ala Trp Lys Ala Tyr Thr Glu Arg Leu Leu Arg

370 375 380

<210> 2

<211> 833

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Pro Ala Val Lys Ala Lys Lys Glu Cys Thr Thr Gln Thr Leu Asn

1 5 10 15

Leu Asp Ile Ile Asp Ile Arg His Ala Arg Ile Asp Ile Asn Leu Lys

20 25 30

Asp Glu Ile Leu Met Gln Met Phe Pro Glu Gln Gly Pro Arg Thr Leu

35 40 45

Pro Thr Leu Leu Leu Tyr Asp Glu Arg Gly Leu Gln Leu Phe Glu Asp

50 55 60

Ile Thr Tyr Leu Asp Glu Tyr Tyr Leu Met Asn Tyr Glu Ile Glu Leu

65 70 75 80

Leu Lys Lys Ser Ala Ala Glu Met Ala Ser Lys Ile Pro Ser Gly Ala

85 90 95

Ile Val Val Glu Leu Gly Ser Gly Asn Leu Arg Lys Val Ser Leu Leu

100 105 110

Leu Gln Ala Tyr Ser Cys Ala Lys Lys Lys Ile Asp Tyr Phe Ala Leu

115 120 125

Asp Leu Ser Glu Arg Glu Leu Glu Arg Thr Leu Ala Gln Ala Pro Cys

130 135 140

Gly Leu Tyr Val Ser Cys Arg Gly Leu Arg Gly Thr Tyr Asp Asp Gly

145 150 155 160

Cys Glu Trp Leu Lys Gly Asn Lys Asn Cys Cys His Val Lys Cys Ile

165 170 175

Leu His Leu Gly Ser Ser Ile Gly Asn Phe Asn Arg Asp Glu Ala Ala

180 185 190

Asp Phe Leu Arg Ser Phe Ala Glu Ile Leu Gln Pro Thr Asp Leu Met

195 200 205

Ile Val Gly Val Asp Ser Cys Gln Asn Pro Asp Lys Val Tyr His Ala

210 215 220

Tyr Asn Asp Val Asp Gly Ile Met His Thr Phe Val Leu Asn Gly Leu

225 230 235 240

Thr Ala Ala Asn Glu Ile Leu Gly Asp Glu Met Phe Tyr Asp His Ile

245 250 255

Trp Glu Tyr Val Gly Glu Tyr Val Tyr Asp Val Asp Gly Gly Arg His

260 265 270

Gln Ala Phe Val Ser Pro Asp Leu Glu Trp Ser Val Leu Gly His Ile

275 280 285

Ile Lys Pro His Glu Arg Ile Lys Ile Glu Gln Ser Phe Lys Tyr Ser

290 295 300

Asp Val Gly Ser Glu Lys Leu Trp Lys Thr Ala Gly Leu Glu Glu Val

305 310 315 320

Met Arg Trp Arg Ala Asp Gly Glu Tyr Gly Leu His Met Leu Lys Lys

325 330 335

Ala Lys Met Pro Phe Cys Val Thr Leu Glu Leu Tyr Ala Ser Asp Thr

340 345 350

Leu Pro Thr Trp Ala Asp Trp Glu Asn Leu Trp Ala Ala Trp Asp Met

355 360 365

Val Thr Arg Lys Met Leu Pro Pro Ser Glu Leu Asn Glu Lys Pro Ile

370 375 380

Lys Leu Arg Asn Ala Cys Ile Phe Tyr Leu Gly His Ile Pro Ala Phe

385 390 395 400

Leu Asp Ile Gln Leu Lys Lys Thr Thr Lys Asn Asn Trp Gly Glu Pro

405 410 415

Val Tyr Phe His Ser Ile Phe Glu Arg Gly Ile Asp Pro Asp Val Asp

420 425 430

Asn Pro Glu Leu Cys His Asp His Ser Glu Ile Pro Asp Glu Trp Pro

435 440 445

Pro Leu Glu Asp Ile Leu Ala Tyr Gln His Val Val Arg Glu Arg Leu

450 455 460

Gln Lys Leu Tyr Ala Asn Arg Val Asn Asp Pro Glu Trp Val Arg Arg

465 470 475 480

Ala Val Trp Ile Gly Phe Glu His Glu Val Leu His Leu Glu Met Leu

485 490 495

Leu Tyr Met Leu Leu Gln Ser Asp Lys Thr Leu Pro Pro Pro Pro Thr

500 505 510

Gly Arg Pro Asp Phe Pro Lys Met Ala Ala Lys Ala Tyr Ala Gln Arg

515 520 525

Val Ala Asn Gln Trp Phe Glu Ile Pro Glu Gln Thr Ile Met Ile Gly

530 535 540

Met Asp Asp Asp Glu Asp Glu His Asp Pro Lys Arg His Phe Gly Trp

545 550 555 560

Asp Asn Glu Lys Pro Ala Arg Gln Ala Lys Val His Ala Phe Glu Ala

565 570 575

Lys Gly Arg Pro Ile Thr Asn Glu Glu Tyr Ala Glu Tyr Leu Ile Ser

580 585 590

Ser His Ile Glu Ala Leu Pro Ala Ser Trp Ser Ile Val Pro Pro Glu

595 600 605

Tyr His His Asn Thr Asn Ser Val Ser Gly His Glu Arg Arg Asp Val

610 615 620

Pro Leu Pro Glu Ser Phe Ile His Asp Lys Ala Val Arg Thr Val Tyr

625 630 635 640

Gly Leu Val Pro Leu Arg Tyr Ala Leu Asp Trp Pro Val Phe Ala Ser

645 650 655

Tyr Asp Glu Leu Ala Gly Cys Ala Ala Tyr Met Gly Gly Arg Ile Pro

660 665 670

Met Met Glu Glu Ala Lys Ser Ile Tyr Ala Tyr His His His Leu Lys

675 680 685

Asp Ile Ala Lys Gln Ser Lys Leu Ser Asn Lys Val Pro Ala Val Asn

690 695 700

Ala His Leu Val Asn Asp Gly Val Gln Glu Thr Pro Pro Ser Asn Asn

705 710 715 720

Ser Pro Ser Ser Leu Phe Ala Asp Leu Ser Asn Thr Asn Thr Gly Phe

725 730 735

Leu His Trp His Pro Ala Pro Val Met Pro Asn Gly Gly Ser Leu Ala

740 745 750

Gly Gln Gly Glu Leu Gly Gly Val Trp Glu Trp Thr Ser Thr Val Leu

755 760 765

Arg Pro His Glu Gly Phe Arg Pro Met Ser Ile Tyr Pro Gly Tyr Thr

770 775 780

Ala Asp Phe Phe Asp Glu Lys His Asn Val Val Leu Gly Gly His Met

785 790 795 800

Ala Met His Pro Arg Val Ala Gly Arg Lys Ser Phe Val Asn Trp Tyr

805 810 815

Gln Arg Asn Tyr Leu Tyr Ala Trp Val Gly Ala Arg Leu Val Arg Asp

820 825 830

Leu

<210> 3

<211> 2389

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctggcagact tgtgtgtatc attcacccta tttctgcttc atagtacatg tactgtacct 60

gaacggctca accgctattt acgactctta tttttttgtg gcgttggtca cgtttgccag 120

ctgttgtccg tctttctagg gctcctcaaa cttgacctga ccgagctccc tttctggacc 180

cggtgggctt cacttccagc tgctgagcga cctgagccga acatcctcag tccttgtcca 240

gcgcaattca ttttctttcc ttttcttttt ttttattcct ttctttactt ttattctctc 300

tttttctcct cttcctcttc ttcttctttc tcctcctcct ccatatcctc actctcgtct 360

ccctcattac taccctctcg gctcctcagg tccaccaacc ctcccgcacc caaacctctg 420

ccgctgaaac ccattcggtg gtcgccgttt tttttttttt ttttttctca cccccaaagt 480

cgcaatatcg ggtatcgccg ccggcattga atcgccttct ccgctagcat cgactactgc 540

tgctctgctc tcgttgccag cgctgctccc tagaattttg accaggggac gagcccgaca 600

ttaaagcaac tccctcgcct cgagacgact cggatcgcac gaaattctcc caatcgccga 660

cagttcctac tcctcttcct cccgcacggc tgtcgcgctt ccaacgtcat tcgcacagca 720

gaattgtgcc atctctctct tttttttccc cccctctaaa ccgccacaac ggcaccctaa 780

gggttaaact atccaaccag ccgcagcctc agcctctctc agcctcatca gccatggcac 840

cacacccgac gctcaaggcc accttcgcgg ccaggagcga gacggcgacg cacccgctga 900

cggcttacct gttcaagctc atggacctca aggcgtccaa cctgtgcctg agcgccgacg 960

tgccgacagc gcgcgagctg ctgtacctgg ccgacaagat tggcccgtcg attgtcgtgc 1020

tcaagacgca ctacgacatg gtctcgggct gggacttcca cccggagacg ggcacgggag 1080

cccagctggc gtcgctggcg cgcaagcacg gcttcctcat cttcgaggac cgcaagtttg 1140

gcgacattgg ccacaccgtc gagctgcagt acacgggcgg gtcggcgcgc atcatcgact 1200

gggcgcacat tgtcaacgtc aacatggtgc ccggcaaggc gtcggtggcc tcgctggccc 1260

agggcgccaa gcgctggctc gagcgctacc cctgcgaggt caagacgtcc gtcaccgtcg 1320

gcacgcccac catggactcg tttgacgacg acgccgactc cagggacgcc gagcccgccg 1380

gcgccgtcaa cggcatgggc tccattggcg tcctggacaa gcccatctac tcgaaccggt 1440

ccggcgacgg ccgcaagggc agcatcgtct ccatcaccac cgtcacccag cagtacgagt 1500

ccgtctcctc gccccggtta acaaaggcca tcgccgaggg cgacgagtcg ctcttcccgg 1560

gcatcgagga ggcgccgctg agccgcggcc tcctgatcct cgcccaaatg tccagccagg 1620

gcaacttcat gaacaaggag tacacgcagg cctgcgtcga ggccgcccgg gagcacaagg 1680

actttgtcat gggcttcatc tcgcaggaga cgctcaacac cgagcccgac gatgccttta 1740

tccacatgac gcccggctgc cagctgcccc ccgaagacga ggaccagcag accaacggat 1800

cggtcggtgg agacggccag ggccagcagt acaacacgcc gcacaagctg attggcatcg 1860

ccggcagcga cattgccatt gtgggccggg gcatcctcaa ggcctcagac cccgtagagg 1920

aggcagagcg gtaccgatca gcagcgtgga aagcctacac cgagaggctg ctgcgatagg 1980

ggagggaagg gaagaaagaa gtaaagaaag gcatttagca agaaggggga aaagggaggg 2040

aggacaaacg gagctgagaa agagctcttg tccaaagccc ggcatcatag aatgcagctg 2100

tatttaggcg acctcttttt ccatcttgtc gatttttgtt atgacgtacc agttgggatg 2160

atggatgatt gtaccccagc tgcgattgat gtgtatcttt gcatgcaaca acacgcgatg 2220

gcggaggcga actgcacatt ggaaggttca tatatggtcc tgacatatct ggtggatctg 2280

gaagcatgga attgtatttt tgatttggca tttgcttttg cgcgtggagg gaacatatca 2340

ccctcgggca tttttcattt ggtaggatgg tttggatgca gttgtcgac 2389

<210> 4

<211> 1492

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gttgtgaagt cggtaatccc gctgtatagt aatacgagtc gcatctaaat actccgaagc 60

tgctgcgaac ccggagaatc gagatgtgct ggaaagcttc tagcgagcgg ctaaattagc 120

atgaaaggct atgagaaatt ctggagacgg cttgttgaat catggcgttc cattcttcga 180

caagcaaagc gttccgtcgc agtagcaggc actcattccc gaaaaaactc ggagattcct 240

aagtagcgat ggaaccggaa taatataata ggcaatacat tgagttgcct cgacggttgc 300

aatgcagggg tactgagctt ggacataact gttccgtacc ccacctcttc tcaacctttg 360

gcgtttccct gattcagcgt acccgtacaa gtcgtaatca ctattaaccc agactgaccg 420

gacgtgtttt gcccttcatt tggagaaata atgtcattgc gatgtgtaat ttgcctgctt 480

gaccgactgg ggctgttcga agcccgaatg taggattgtt atccgaactc tgctcgtaga 540

ggcatgttgt gaatctgtgt cgggcaggac acgcctcgaa ggttcacggc aagggaaacc 600

accgatagca gtgtctagta gcaacctgta aagccgcaat gcagcatcac tggaaaatac 660

aaaccaatgg ctaaaagtac ataagttaat gcctaaagaa gtcatatacc agcggctaat 720

aattgtacaa tcaagtggct aaacgtaccg taatttgcca acggcttgtg gggttgcaga 780

agcaacggca aagccccact tccccacgtt tgtttcttca ctcagtccaa tctcagctgg 840

tgatccccca attgggtcgc ttgtttgttc cggtgaagtg aaagaagaca gaggtaagaa 900

tgtctgactc ggagcgtttt gcatacaacc aagggcagtg atggaagaca gtgaaatgtt 960

gacattcaag gagtatttag ccagggatgc ttgagtgtat cgtgtaagga ggtttgtctg 1020

ccgatacgac gaatactgta tagtcacttc tgatgaagtg gtccatattg aaatgtaagt 1080

cggcactgaa caggcaaaag attgagttga aactgcctaa gatctcgggc cctcgggcct 1140

tcggcctttg ggtgtacatg tttgtgctcc gggcaaatgc aaagtgtggt aggatcgaac 1200

acactgctgc ctttaccaag cagctgaggg tatgtgatag gcaaatgttc aggggccact 1260

gcatggtttc gaatagaaag agaagcttag ccaagaacaa tagccgataa agatagcctc 1320

attaaacgga atgagctagt aggcaaagtc agcgaatgtg tatatataaa ggttcgaggt 1380

ccgtgcctcc ctcatgctct ccccatctac tcatcaactc agatcctcca ggagacttgt 1440

acaccatctt ttgaggcaca gaaacccaat agtcaaccgc ggactgcgca tc 1492

<210> 5

<211> 3250

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgcctgctg ttaaagccaa gaaagaatgt actacccaaa cattaaattt ggatattatc 60

gacatacgtc atgcacgcat tgatatcaac cttaaggacg agatactcat gcagatgttt 120

cccgaacaag gtccacgaac tctaccgacc ctgttattgt atgatgagcg gggccttcag 180

ctcttcgaag acgtaagtct gcgagagccc attgatccta atccatccct ccctgccccg 240

tagctgtttg tgcagaagtg tgtaaccgga gtatggattt tgctgccaga ttacatacct 300

agatgagtat tacctgatga attatgaaat cgagttattg aaaaagtctg cggctgaaat 360

ggcctccaaa ataccttcag gagcaattgt cgtagagctt gggtcggggt tagttttctt 420

tctggcctgc tttgattccc aatcccgccc cccctgtccc ccttcttcgt cttgttgctg 480

tttgttccta acgtttgagg tgctttcttt gcttttttcc tgttggtgaa gtaacctcag 540

aaaggtgagt ctactgttac aagcgtacag ctgcgctaaa aagaaaatcg actattttgc 600

cttggatctt tctgaaaggg agctcgaacg tactctagca caggcgccct gtggcctgta 660

cgtttcctgc cgcggattac gagggaccta tgacgatggt tgtgagtggt tgaagggcaa 720

taaaaactgc tgtcacgtca agtgcatact tcatctcgga tcatcgattg gtatgaatgg 780

attctgtgac ttgatgagat ctgtcgatat tgttcgattt ggctaatgct gctgtttttt 840

agggaatttc aaccgggacg aagctgccga ttttctaaga agtttcgcag agatcctgca 900

accaacagac ttaatgatag taggtgtgga tagctgtcag aatccggaca aagtttagtg 960

agtgcacata agtgacatgc agttacaata cccgctgacc aagtttgata cctagccacg 1020

cgtataacgg tgcgtactct atcagatggc tgtttcattg acaagaaaat ggatctcgct 1080

gacagcagct cagatgtcga cggcattatg catacgtaag atgatatatc cacacatcac 1140

ttatactggg ctcatcaact aacgctacgg gcagttttgt attgaatgga cttaccgctg 1200

ccaacgaaat cctcggggat gagatgttct acgaccacat atgggaatat gtgggtgagt 1260

acgtttatga tgtcgacggc ggaaggcatc aagcatttgt atctcctgat ctagaatggt 1320

ccgtgctggg gcacattatc aagccccatg agcgtataaa aattgaacag tcattcaagt 1380

actcggacgt tggtagtgag aaattatgga agacagcggg cttggaagag gtcatgcgct 1440

ggcgagctga tggagaatat ggtacgtcct cgcagtcgtt tccccccccc ccctcccccc 1500

ctttccatac gaagccaatt gttgatatct gacatatcat gccattccag ggcttcacat 1560

gctcaaaaag gccaaaatgc cattttgcgt aactctagag ctgtacgcaa gcgacacctt 1620

accgacatgg gcggattggg aaaatttgtg ggctgcctgg gacatggtga ctcggaagat 1680

gcttcctccc tctgagctca acgaaaaacc aatcaagcta agaaatgcat gtatattcta 1740

tctgggtcat attccggcgt ttttagatat ccaattgaaa aagaccacaa aaaacaattg 1800

gggcgagcct gtttacttcc actccatatt tgaaagggga attgaccccg atgtcgacaa 1860

cccagagctt tgccatgatc actcagaaat cccggacgag tggcctcccc tcgaagatat 1920

actagcttat cagcatgtag tgcgtgagcg cctgcaaaag ttatacgcca atcgagttaa 1980

cgacccagaa tgggtccgga gagcagtatg gattgggttc gagcacgaag tgttgcatct 2040

tgagatgctc ctatatatgc tgttacagtc ggataaaact ttgccgcctc ccccaaccgg 2100

taggccggac tttcctaaga tggcggctaa agcctacgca caacgtgttg cgaatcagtg 2160

gttcgaaatc cccgagcaaa caataatgat tggcatggat gacgatgaag acgagcacga 2220

tccaaagcgc cattttggat ggtgagagat gttctgtaaa catgctggaa acttttgcac 2280

ttacacagag ggatagggac aacgaaaaac cggctcgaca ggccaaggtc cacgcattcg 2340

aggcgaaagg gcggcctatc actaatgaag aggtaagcca atgtttgcca ttggatgcat 2400

ccaacaatca actgactctc gtccagtatg ctgaatacct tataagtagc catattgagg 2460

ccctccccgc atcttggtcc atcgtaccac cggaatatca ccataacacc aattcagtgt 2520

cgggtcacga gagaagggat gttcctctac ccgaaagttt tatacatgac aaggcggtcc 2580

gtacagtata cggcctggtg ccattacgct atgctttgga ttggccggtt ttcgccagct 2640

acgacgagct tgcaggatgt gcggcttata tggggggtcg aattcctatg atggaagagg 2700

ccaaatctat ctacgcatat caccatcacc tcaaggatat agcgaaacaa tccaagctat 2760

caaacaaagt tccagccgtc aacgggtgag tccactcaaa cacgttcatc aacatcgctc 2820

acctcgagca gaaggaagag aagaggtccc cgctgtaaat gcccatctgg tgaacgacgg 2880

cgttcaggaa actccaccgt cgaataacag tcctagctct ttatttgcag atttgtccaa 2940

taccaacaca ggattccttc actggcatcc cgcgccagtc atgccgaatg ggggttcact 3000

cgctggccaa ggagagctag ggggtgtatg ggaatggact tcgaccgtgc tgcggcctca 3060

cgagggcttt agacccatga gtatttaccc aggatataca gccgacttct ttgatgaaaa 3120

gcataacgtt gtcttagggg gtcacatggc aatgcatccg agggtagcgg gccgtaaaag 3180

cttcgtgaat tggtaccagc gcaactattt gtacgcttgg gttggagccc gacttgtccg 3240

ggacttataa 3250

<210> 6

<211> 1028

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggctttcgtg accgggcttc aaacaatgat gtgcgatggt gtggttcccg gttggcggag 60

tctttgtcta ctttggttgt ctgtcgcagg tcggtagacc gcaaatgagc aactgatgga 120

ttgttgccag cgatactata attcacatgg atggtctttg tcgatcagta gctagtgaga 180

gagagagaac atctatccac aatgtcgagt gtctattaga catactccga gaataaagtc 240

aactgtgtct gtgatctaaa gatcgattcg gcagtcgagt agcgtataac aactccgagt 300

accagcaaaa gcacgtcgtg acaggagcag ggctttgcca actgcgcaac cttgcttgaa 360

tgaggataca cggggtgcaa catggctgta ctgatccatc gcaaccaaaa tttctgttta 420

tagatcaagc tggtagattc caattactcc acctcttgcg cttctccatg acatgtaagt 480

gcacgtggaa accataccca aattgcctac agctgcggag catgagccta tggcgatcag 540

tctggtcatg ttaaccagcc tgtgctctga cgttaatgca gaatagaaag ccgcggttgc 600

aatgcaaatg atgatgcctt tgcagaaatg gcttgctcgc tgactgatac cagtaacaac 660

tttgcttggc cgtctagcgc tgttgattgt attcatcaca acctcgtctc cctcctttgg 720

gttgagctct ttggatggct ttccaaacgt taatagcgcg tttttctcca caaagtattc 780

gtatggacgc gcttttgcgt gtattgcgtg agctaccagc agcccaattg gcgaagtctt 840

gagccgcatc gcatagaata attgattgcg catttgatgc gatttttgag cggctgtttc 900

aggcgacatt tcgcccgccc ttatttgctc cattatatca tcgacggcat gtccaatagc 960

ccggtgatag tcttgtcgaa tatggctgtc gtggataacc catcggcagc agatgataat 1020

gattccgc 1028

Claims

1.一株重组里氏木霉，其特征在于，所述重组里氏木霉是以里氏木霉（Trichoderma reesei）TU-6为宿主，插入表达盒pyr4- Pcbh1- tegt1- Tcbh2后得到的；所述表达盒中的pyr4的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述表达盒中的tegt1基因的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，编码所述表达盒中的Pcbh1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码所述表达盒中的Tcbh2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.如权利要求1所述的重组里氏木霉，其特征在于，所述表达盒插入到里氏木霉TU-6的scaffold_33: 120008-120031位点。

3.如权利要求2所述的重组里氏木霉，其特征在于，编码所述表达盒中的pyr4的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码所述表达盒中的tegt1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

4.一种构建权利要求1~3任一所述重组里氏木霉的方法，其特征在于，所述方法为：

（1）从里氏木霉中扩增出核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的pyr4片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的Pcbh1片段，从木霉菌（Trichoderma spp.）中扩增出核苷酸序列如SEQID NO.5所示的tegt1片段，从里氏木霉中扩增出核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的Tcbh2片段；

（2）分别将步骤（1）制备得到的pyr4片段、Pcbh1片段、tegt1片段、Tcbh2片段依次连接在质粒pEASY-blunt simple上，制备得到重组质粒pEASY- pyr4- Pcbh1- tegt1- Tcbh2，再从质粒中通过PCR扩增得到片段pyr4- Pcbh1- tegt1- Tcbh2；

（3）制备里氏木霉TU-6原生质体；

（4）将步骤（2）制备得到的片段pyr4- Pcbh1- tegt1- Tcbh2导入里氏木霉原生质体的scaffold_33: 120008-120031位点中，制备得到重组里氏木霉tegt1。

5.一种制备麦角硫因的方法，其特征在于，所述方法为，采用权利要求1~3任一所述的重组里氏木霉发酵制备得到。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法为：

（1）将重组里氏木霉接种至种子培养基中，制备得到孢子悬液；

（2）将步骤（1）制备得到的孢子悬液按1~5%（v/v）的接种量接种至培养基中，制备得到菌丝体；

（3）将步骤（2）制备得到的菌丝体采用无菌水冲洗后，取2~6%的菌丝体接种至培养基中进行发酵，制备得到菌丝体；

（4）提取麦角硫因：将发酵后的菌丝体收集后，提取制备得到麦角硫因。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（2）中的发酵条件为：30℃，200 rpm发酵40~52 h。

8.一种提高里氏木霉TU-6发酵制备麦角硫因的产量的方法，其特征在于，所述方法为，将过表达盒pyr4- Pcbh1- tegt1- Tcbh2插入到里氏木霉TU-6的 scaffold_33: 120008-120031位点；所述表达盒中的pyr4的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述表达盒中的tegt1基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码所述表达盒中的Pcbh1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码所述表达盒中的Tcbh2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

9.权利要求1~3任一所述的重组里氏木霉在制备含有麦角硫因产品中的应用。