CN112011464A - 一种用于生产麦角硫因的里氏木霉 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株里氏木霉，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17667。本发明的里氏木霉CGMCC No.17667能够通过发酵生产麦角硫因，具有工业化开发和应用前景。

Description

一种用于生产麦角硫因的里氏木霉

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种里氏木霉及其用于生产麦角硫因的用途。

背景技术

麦角硫因(L-ergothionine，EGT)，化学名为2-巯基组氨酸三甲基内盐，结构式如下：

麦角硫因是至今唯一为人们所知的天然2-硫代咪唑氨基酸。麦角硫因具有抗氧化、抗炎症、延长细胞生存周期或抗细胞衰老活性，改善神经细胞生成等多种生理功效。同时在多种疾病模型中包括阿兹海默、糖尿病等的并发症中，具有较好的保护细胞和抗击损伤的功效。具有较好的市场应用前景。

目前，麦角硫因可以经化学合成，食用真菌提取和微生物发酵生产获得。其中，已有多种微生物被证实具有麦角硫因的合成能力，包括分枝杆菌、链霉菌、霉菌和酵母等多类微生物。以食用蕈菌菌丝体深层发酵技术生物合成制备麦角硫因，是低成本规模化生产麦角硫因的主流方向。

但是蕈菌发酵存在两个重要缺陷，一是蕈菌菌丝体生长较为缓慢，导致发酵周期较长，一般为7-10天；二是蕈菌发酵合成的麦角硫因绝大部分积累于菌丝体内，需要进行菌丝体破碎提取的繁琐后处理工序，导致生产成本相对较高。

发明内容

为了探索能够微生物快速发酵法来生产麦角硫因的工业化途径，发明人进行了大量的微生物筛选，得到了两种具有工业化应用前景的麦角硫因生产菌株，经鉴定分别为米根霉(Rhizopus oryzae)和里氏木霉(Trichoderma reesei)，它们生长速度较快、且产生的麦角硫因能够大量分泌到菌体外的发酵液中。

因此，本发明的第一个目的在于提供一种用于生产麦角硫因的里氏木霉，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17667。本公司命名为SH445。

本发明的第二个目的在于提供所述里氏木霉CGMCC No.17667用于生产麦角硫因的应用。

上述发酵分为种子培养阶段和发酵阶段。

在一种实施方式中，种子培养基组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，pH7.0。

优选地，发酵培养基组成为：葡萄糖60g/L，蛋白胨10g/L，玉米浆粉10g/L，硫酸亚铁10mg/L，pH6.5。

上述发酵温度是25-35℃、优选28-32℃、更优选30℃。

本发明筛选出的里氏木霉CGMCC No.17667是无致病性的安全微生物，生长速度较快，无产物抑制性，产生的麦角硫因能够大量分泌到菌体外的发酵液中，后处理工序简单，具有工业化开发和应用前景。

本发明筛选的的拉丁学名是Trichoderma reesei，中文名称是里氏木霉，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期是2019年05月15日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.17667。

附图说明

图1为里氏木霉CGMCC No.17667的平板培养状态照片。

图2为里氏木霉CGMCC No.17667的细胞显微形态特征照片。

具体实施方式

在微生物筛选策略中，考虑到麦角硫因最初在一种真菌麦角菌(Claviepspurpurea)中被发现，且产麦角硫因的微生物主要是丝状真菌，因此在从自然界中筛选时，将微生物类型选定为丝状真菌，将细菌和酵母排除在外，以便提高成功率。在实施方式中，用于初步筛选的培养基选用适合于丝状真菌生长的培养基，并添加用于抑制细菌生长的抗生素比如青霉素、卡那霉素和/或氯霉素。

考虑到发明的目标是能够通过发酵生产高浓度代谢产物麦角硫因，该微生物必须具有高产物浓度耐受性，即没有代谢产物抑制性，因此初步筛选是在压力条件下进行。作为一种实施方式，在用于初步筛选的培养基中添加一定浓度比如0.1-2wt％的麦角硫因作为压力条件。

经过大量的平板初步筛选、摇甁筛选、优选菌的发酵罐验证，最终得到了两种霉菌，经鉴定分别为米根霉(Rhizopus oryzae)和里氏木霉(Trichoderma reesei)。在发酵后，发现麦角硫因大部分存在于发酵液中，少部分存在于菌丝体中，使得提取麦角硫因的后处理工序简单化，这在经济上是有利的。更有利的是，这两种霉菌都是生物安全性高的微生物，无致病性，为将来的工业化生产排除了生物安全性隐患。

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

实施例

材料和方法

麦角硫因标准品，购自中国医药(集团)上海化学试剂公司。

使用HPLC检测麦角硫因，检测条件为：安捷伦高效液相色谱仪1260infinity II，依利特ODS-BP色谱柱，柱温40℃，流动相：A，磷酸二氢铵(配置方法，称取1.1503g磷酸二氢铵+400mL纯化水，氨水调pH至5.0，再加100mL纯化水)；B：乙腈。A:B＝99:1，流速1mg/min，进样量10μl，检测波长258nm。

实施例1：耐麦角硫因的丝状真菌筛选

采集浙江省湖州市30个区域的餐厨垃圾样本，分别使用无菌水重悬，无菌脱脂棉过滤后，将悬液涂布含青霉素、卡那霉素、氯霉素和麦角硫因的固体培养基(葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，青霉素(100μg/ml)，卡那霉素(50μg/ml)，氯霉素(25μg/ml)，麦角硫因1g/L，琼脂20g/L，pH7.0)，于28-30℃培养4-5天。挑取生长旺盛的丝状微生物，分别转接到新的固体平板，进行纯培养。历时两个多月，共获得600多株形态各异的微生物，绝大部分为霉菌，用于下一步的摇瓶发酵筛选。

实施例2：产麦角硫因的微生物筛选

将实施例1中获得的600多株微生物分别接种于液体培养基(葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，pH7.0)试管，每个菌株接种3个装液量为4ml的试管。30℃，230rpm摇床培养72h。

培养结束后，合并每个菌株的3个试管培养液，离心分离取上清，用HPLC检测麦角硫因含量。有19株微生物的发酵液中可以检测出麦角硫因的产生。其中两株微生物中的麦角硫因含量相对较高，分别命名为SH444、SH445。

实施例3：菌株鉴定

将实施例2中获得的菌株SH444和SH445送交中国科学院微生物研究所进行菌种鉴定，根据培养、即细胞显微形态特征、生理生化特征和rRNA基因序列等数据，确定SH444为米根霉；确定SH445为里氏木霉。具体为

3.1菌株SH444

菌落稀疏蓬松，菌丝白色，假根略发黑褐色，匍匐枝爬行，假根发达，化能异养，好氧。菌株置于显微镜下观察，形态成长条状，无色透明。

3.2菌株SH445

菌落呈广铺的棉絮状，起初为白色致密的平坦菌丝，中部稍凸起，湿润时粘，而后边缘出现浅黄的产孢子丛束区，反面无色。化能异样，好氧。菌株置于显微镜下观察，形态成长条状，呈现泛黄色，透明。如图1和图2所示。

其rRNA基因序列为：

TCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCCAATGTGAACGTTACCAATCTGTTGCCTCGGCGGGATTCTCTGCCCCGGGCGCGTCGCAGCCCCGGATCCCATGGCGCCCGCCGGAGGACCAACTCAAACTCTTTTTTCTCTCCGACGCGGCTTCCGTCGCGGCTCTGTTTTACCTTTGCTCTGAGCCTTTCTCGGCGACCCTAGCGGGCGTCTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCCTCACCGGGCCGCCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACACTCGCACCGGGAAGCGCGGCGCGGCCACAGCCGTAAAACACCCCAAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGAGAGAATACCCGCTGAACTTAA(SEQ ID NO:1)。

实施例4：里氏木霉SH445的摇瓶发酵

将SH445菌种进行平板活化，使用接种环，取一部分菌丝体接种子培养基(葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，pH7.0)试管，4ml装液量，30℃，230rpm培养过夜；按5％的接种量，接种到摇瓶发酵培养基(葡萄糖30g/L，蛋白胨10g/L，玉米浆粉10g/L，硫酸亚铁10mg/L，pH6.5)，250ml三角瓶装液25ml，30℃，230rpm摇床培养发酵，96h后，进行发酵液和菌体取样检测麦角硫因含量。

胞外产物检测：发酵菌液进行10000rpm，4min离心，取上清，用2μm过滤器进行过滤处理后，样品进行HPLC检测。

胞内产物检测：发酵菌液进行10000rpm，4min离心，收集菌体，称取100mg湿菌体，转移至干净的1.5ml离心管中，加1ml无菌水，涡旋，重悬菌体，然后于90℃进行温浴30min，温浴结束，12000rpm，10min离心，取上清，用2μm过滤器进行过滤处理后，样品进行HPLC检测。

麦角硫因产量检测结果为：胞外308mg/L，胞内264mg/L，总量达到572mg/L。

根据摇瓶发酵结果，确认里氏木霉菌株SH445具有较强的产麦角硫因能力。将其提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行微生物保藏，保藏编号为CGMCCNo.17667。

实施例5：里氏木霉SH445的5L发酵罐发酵

从SH445活化平板上，使用接种环取一部分菌丝体接种子培养基(葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，pH7.0)试管，4ml装液量，30℃，230rpm培养过夜；按5％的接种量，接种到种子培养基摇瓶，250ml三角瓶装液50ml，30℃，230rpm摇床培养，过夜，准备种子。将种子液，按10％的接种比例，转接发酵罐培养基(葡萄糖60g/L，蛋白胨10g/L，玉米浆粉10g/L，硫酸亚铁10mg/L，pH6.5)。

发酵罐搅拌转速为400～800rpm，溶氧偶联，溶氧控制40％，温度为30℃，空气流量3L/min，补加氨水，控制pH6.5，发酵可以一直持续到110h。其间，在12-24h，以20ml/h的速率流加500g/L的葡萄糖溶液；24h-72h，以10ml/h的速率流加500g/L的葡萄糖溶液；72h-96h，以3-5ml/h的速率流加500g/L的葡萄糖溶液；24-96h，以5-8ml/h的速率流加100g/L的玉米浆溶液。产物在110h左右达到峰值，麦角硫因总产量可达1.08g/L，胞内产量436mg/L，胞外产量644mg/L。

上述实验证明，里氏木霉菌株CGMCC No.17667通过发酵能够大量产生麦角硫因、并且分泌到菌丝体外的发酵液中，采用分批补料培养可以使发酵持续进行110小时，具有工业化开发和应用前景。

序列表

<110> 浙江华睿生物技术有限公司

<120> 一种用于生产麦角硫因的里氏木霉

<130> SHPI1910278

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 618

<212> DNA

<213> Trichoderma reesei

<400> 1

tctccgttgg tgaaccagcg gagggatcat taccgagttt acaactccca aaccccaatg 60

tgaacgttac caatctgttg cctcggcggg attctctgcc ccgggcgcgt cgcagccccg 120

gatcccatgg cgcccgccgg aggaccaact caaactcttt tttctctccg acgcggcttc 180

cgtcgcggct ctgttttacc tttgctctga gcctttctcg gcgaccctag cgggcgtctc 240

gaaaatgaat caaaactttc aacaacggat ctcttggttc tggcatcgat gaagaacgca 300

gcgaaatgcg ataagtaatg tgaattgcag aattcagtga atcatcgaat ctttgaacgc 360

acattgcgcc cgccagtatt ctggcgggca tgcctgtccg agcgtcattt caaccctcga 420

acccctccgg ggggtcggcg ttggggatcg gcccctcacc gggccgcccc cgaaatacag 480

tggcggtctc gccgcagcct ctcctgcgca gtagtttgca cactcgcacc gggaagcgcg 540

gcgcggccac agccgtaaaa caccccaaac ttctgaaatg ttgacctcgg atcaggagag 600

aatacccgct gaacttaa 618

Claims (6)

1.一种用于生产麦角硫因的里氏木霉，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17667。

2.如权利要求1所述里氏木霉用于生产麦角硫因的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，通过发酵生产麦角硫因。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵分为种子培养阶段和发酵阶段。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，种子培养基组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，pH7.0。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，发酵培养基组成为：葡萄糖60g/L，蛋白胨10g/L，玉米浆粉10g/L，硫酸亚铁10mg/L，pH6.5。

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