CN111575219A - 一株广谱溶藻放线菌lw9、分离方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一株广谱溶藻放线菌LW9、分离方法及应用，该放线菌属链霉菌属，分类命名为Streptomyces filipinensis LW9，保藏编号为CCTCC NO：M 2018138。本发明筛选分离出的广谱溶藻放线菌LW9产生的溶藻物质化学性质稳定，对酸碱、高温及紫外条件不敏感，可长时间发挥溶藻作用，且具有较好的杀藻广谱性。

Description

一株广谱溶藻放线菌LW9、分离方法及应用
技术领域
本发明涉及一株广谱溶藻放线菌LW9、分离方法及应用，属于微生物技术领域。
背景技术
蓝藻水华广泛存在于淡水生态系统中并产生一系列严重的水环境问题，对人类健康和生态系统造成严重危害，而微囊藻水华是世界范围内规模性和危害性最大的一类蓝藻水华。目前针对治理水体富营养化的物理化学方法具有治理成本高，易对环境产生二次污染等缺点；而微生物除藻主要是利用一些能够裂解藻的微生物抑杀引发水体富营养化现象的藻类，具有来源广泛、培养成本低、对环境安全友好等特征，发展应用前景广阔。
放线菌是一类具开发经济价值天然活性物质的重要微生物资源，溶藻放线菌为微生物控藻和研发新型生物控藻剂提供广阔前景。如姜红等从土壤中分离得到一株高效稳定的溶藻放线菌AN02菌株，其胞外代谢产物对铜绿微囊藻有强烈的抑制作用；又如唐晨通过喷雾干燥将AN02菌株发酵上清液制备成一种溶藻放线菌粉剂，此粉剂按0.01%质量比投加4d后对铜绿微囊藻的溶藻效率可达90%；还如崔妍等从江苏海洋滩涂土壤中筛选到一株具有溶藻活性的灰霉素链霉菌，可裂解包括微囊藻、鱼腥藻和集胞藻在内的多种藻类。
目前大部分的溶藻菌研究主要集中在微囊藻溶藻细菌的筛选及溶藻特性研究方面，而对束丝藻、鱼腥藻、颤藻等丝状蓝藻水华种类的溶藻菌发现相对较少；而且以往分离到的大多数溶藻菌仅对单细胞状态的微囊藻具有溶藻效果，而对自然环境水体下的群体微囊藻溶藻效果甚微。本研究通过从土壤中分离出一株具有高效广谱溶藻作用的放线菌LW9，对其进行了形态及分子生物学鉴定，并对其溶藻物质稳定性、产生时期以及对常见水华蓝藻种类的作用范围等溶藻特性进行了初步探究，并直接采集养殖水体微囊藻水华检验其溶藻效果与时效，以期评价该菌在研制控藻菌剂方面的潜力，从而为蓝藻水华防治提供新方法技术参考。
发明内容
为克服目前有关溶藻菌研究的局限性以及现有溶藻菌对自然水体水华溶藻效果甚微的问题，本发明的目的是提供一株广谱溶藻放线菌LW9、分离方法及应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
方案之一是提供一株广谱溶藻放线菌LW9，该放线菌属链霉菌
属，分类命名为Streptomyces filipinensis LW9，保藏编号为CCTCC NO：M 2018138，于2018年03月16日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国湖北省武汉市武汉大学。
所述广谱溶藻放线菌LW9生物学特征如下：（1）在高氏一号培养基上菌落呈黄色、直径5~6 mm、圆形、中央隆起状，菌落表面有小水珠，产黄色色素，菌苔的单个菌落之间有明显的缝隙，不产孢子；（2）在葡萄糖酵母膏培养基上菌落表面为白色、背面褐色，菌落直径7~8 mm、圆形、中央略微隆起、周边呈花瓣状褶皱，产褐色色素，菌苔连成一片，单个菌落之间没有缝隙，产白色孢子；（3）在葡萄糖天门冬素培养基上菌落呈淡黄色、直径4~5 mm、圆形、扁平、菌落边缘有匍匐状菌丝，菌苔的单个菌落之间有明显缝隙，产少量白色孢子；（4）在蔗糖察氏培养基上菌落呈淡黄色、直径4~5 mm、圆形、隆起、边界明显圆滑，菌苔的单个菌落之间有明显缝隙，产少量白色孢子。
方案之二是提供广谱溶藻放线菌LW9的分离方法，包括如下步骤：
（1）采样：采用随机五点采样法，取距离地表3-5 cm深的土壤，将其均匀混合后装入无菌袋中并带回实验室，自然风干后研成粉末，然后取10 g土壤样品，放入装有适量玻璃珠和无菌水的锥形瓶中，振荡20 min，使泥土与无菌水充分混合；
（2）恒温培养：采用梯度稀释平板涂布法将步骤（1）的土壤悬液涂布至固体高氏一号培养基上，然后置于恒温培养箱在28℃下培养8天；
（3）分离纯化：从经过步骤（2）恒温培养的培养基上挑取不同形态放线菌菌落，并以“Z”字划线法反复分离纯化3-4次；
（4）斜面培养：将经过步骤（3）分离纯化后的单菌落接种至高氏一号试管斜面上，于28℃下培养7天，然后保存于4℃冰箱备用；
（5）发酵培养：将经过步骤（4）处理得到的菌种接种至高氏一号液体培养基中，于28℃、180 r/min下摇床振荡培养7天；
（6）初筛：采用双层藻平板法，取对数生长期的铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）FACHB 905藻液以体积比为1：1加入到冷却至50℃、琼脂浓度2%的BG-11固体培养基中，混匀后倒入到底层为已凝固的、琼脂浓度为1%的BG-11固体培养基平板上，使其在上层迅速均匀铺平冷却，于25℃、25 µmol m-2s-1光照条件下培养5 天；然后使用1 ml的无菌枪头顶端在双层藻平板中央打圆形孔，向孔中加入经步骤（5）处理得到的放线菌发酵液100 µL，置于光照培养箱25℃、25 µmol m-2s-1条件下共培养5 天，观察是否产生溶藻圈；
（7）复筛：将初筛得到的放线菌发酵液以体积比为5%的比例加入到Ma. FACHB 905对数生长期的藻液中，空白对照组加入等体积无菌水，于25℃、25 µmol m-2s-1条件下培养3-5天，观察藻液是否产生黄化现象。
方案之三是提供广谱溶藻放线菌LW9在蓝藻水华消亡，尤其是微囊藻水华消亡中的应用。
进一步，广谱溶藻放线菌LW9在蓝藻水华消亡，尤其是微囊藻水华消亡中应用时，添加的是体积比为2.5%-5%的发酵9天的LW9发酵液。
本发明的有益效果是：
（1）本发明筛选分离出的广谱溶藻放线菌LW9产生的溶藻物质化学性质稳定，对酸碱、高温及紫外条件不敏感，可长时间发挥溶藻作用；
（2）本发明筛选分离出的广谱溶藻放线菌LW9产生的溶藻活性物质不仅能够溶解室内培养的单细胞微囊藻，对群体微囊藻及常见丝状水华蓝藻束丝藻、颤藻也均有溶藻作用，具有较好的杀藻广谱性；
（3）添加2.5%-5%LW9发酵液对养殖水体水华微囊藻有持续稳定的去除效果，溶藻效果保持稳定21天以上，具有研发成环境友好型生物控藻剂的潜力；
（4）本发明筛选分离出的广谱溶藻放线菌LW9为蓝藻水华防治方面提供了新的技术参考。
附图说明
图1为本发明放线菌菌株LW9的溶藻效果（其中：A.菌株LW9在双层藻平板上形成抑藻圈；B.菌株LW9溶解藻液：CK:对照组，T：处理组）；
图2为本发明放线菌菌株LW9在不同培养基上的形态特征（其中：A为高氏一号培养基培养的LW9菌落形态；B为高氏一号培养基培养的LW9菌苔特征；C为葡萄糖酵母膏培养基培养的LW9菌落形态；D为葡萄糖酵母膏培养基培养的LW9菌苔特征；E为葡萄糖天门冬素培养基培养的LW9菌落形态；F为葡萄糖天门冬素培养基培养的LW9菌苔特征；G为蔗糖察氏培养基培养的LW9菌落形态；H为蔗糖察氏培养基培养的LW9菌苔特征）
图3 为基于16S rRNA基因序列的菌株LW9系统发育树；
图4为不同处理条件下菌株LW9溶藻物质的稳定性测定结果（其中，CK.空白对照；A.未处理；B.pH 3.5酸处理；C.pH 9.5碱处理；D.热处理；E.紫外线照射处理）；
图5为菌株LW9在不同生长时期的溶藻效果；
图6为菌株LW9发酵上清液对5株水华蓝藻溶藻效果（其中A:溶藻宏观照片，CK为对照组，T为处理组；B为溶藻显微照片）；
图7为菌株LW9发酵上清液对铜绿微囊藻TH1701细胞内部结构影响 （A.对照组；B.实验组；a.细胞壁；b.胶被；c.伪空胞；d.类囊体）；
图8为添加不同比例LW9发酵液对养殖水体微囊藻水华的杀灭效果（A、B、C分别表示对照组、添加LW9发酵液5%实验组、添加LW9发酵液2.5%实验组，1、2、3分别表示培养第7、14、21天溶藻效果）；
图9为添加不同比例LW9发酵液对养殖水体水华微囊藻的溶藻效果显微观察（A、B、C分别表示对照组、添加LW9发酵液5%实验组、添加LW9发酵液2.5%实验组，1、2、3分别表示培养第7、14、21天观察结果）；
图10为添加不同比例LW9发酵液对养殖水体微囊藻水华的去除效果。
具体实施方式
现结合实施例及附图来对本发明作进一步的说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域的公知手段。且以下实施例仅为本发明的优选实施例之一，并非限制本发明的保护范围。
实施例一
（1）采样：土壤样品采自常德市市郊某肥沃菜园，采用随机五点采样法，取距离地表3-5cm深的土壤，并将其均匀混合后装入无菌袋中带回实验室，自然风干后研磨成粉末，然后取10g采集的土壤样品，放入装有适量玻璃珠和90ml无菌水的250ml锥形瓶中，振荡20min，使泥土与无菌水充分混合，制成土壤悬液；
（2）恒温培养：采样梯度稀释平板涂布法将步骤（1）的土壤悬液涂布至固体高氏一号培养基上，然后置于恒温培养箱在28℃下培养8天；其中固体高氏一号培养基是通过以下用量的成分进行制备的：可溶性淀粉20g、KNO3 1 g、K2HPO4 0.5g、MgSO4•7H2O 0.5g、NaCl 0.5g、FeSO4•7H2O 0.01g、蒸馏水1000mL，通过调pH为7.2，加入琼脂粉18 g，121℃灭菌20min而得；
（3）分离纯化：从经过步骤（2）恒温培养的培养基上挑取不同形态放线菌菌落，并以“Z”字划线法反复分离纯化3-4次；
（4）斜面培养：将经过步骤（3）分离纯化后的单菌落接种至高氏一号试管斜面上，于28℃下培养7天，然后保存于4℃冰箱备用，这里的高氏一号试管斜面所用培养基为步骤（2）中的固体高氏一号培养基；
（5）发酵培养：将经过步骤（4）处理得到的菌种接种至高氏一号液体培养基中，于28℃、180 r/min下摇床培养7天，其中高氏一号液体培养基是通过以下用量的成分制备而成：可溶性淀粉20g、KNO3 1 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4•7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、 FeSO4• 7H2O 0.01g、蒸馏水1000mL，调pH为7.2，121℃灭菌20 min，制得；
（6）初筛：采用双层藻平板法，取对数生长期的铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）FACHB 905藻液以体积比为1：1加入到冷却至50℃、琼脂浓度2%的BG-11固体培养基中，混匀后倒入到底层为已凝固的、琼脂浓度为1 %的BG-11固体培养基平板上，使其在上层迅速均匀铺平冷却，于25 ℃ 、25 µmol m-2s-1光照条件下培养5 天；然后使用1 ml的无菌枪头顶端在双层藻平板中央打圆形孔，向孔中加入经步骤（5）处理得到的放线菌发酵液100 µL，置于光照培养箱25℃、25 µmol m-2s-1条件下共培养5 天，观察是否产生溶藻圈；采用双层藻平板法对所分离的放线菌的溶藻效果进行检测筛选，获得1株溶藻放线菌LW9，其抑藻圈在5天后达50.0 mm（如图1A所示）；
（7）复筛：将初筛得到的放线菌发酵液以体积比为5%的比例加入到Ma. FACHB 905对数生长期的藻液中，空白对照组加入等体积无菌水，于25℃、25 µmol m-2s-1条件下培养3-5天，观察藻液是否产生黄化现象；复筛结果显示，添加菌株LW9发酵液3天后，藻细胞发生聚集下沉，并产生明显的黄化现象（如图1B所示）；该结果表明菌株LW9具有较强的溶藻活性；
（8）形态及分子生物学鉴定：
a、放线菌LW9的形态特征观察
将溶藻放线菌LW9分别接种到高氏一号培养平板（步骤（4）中的固体高氏一号培养基）、葡萄糖酵母膏培养平板（培养基由葡萄糖 10 g，酵母膏 10 g，蒸馏水 1000 mL，调 pH 值为 7.2，加入琼脂粉 18 g，121℃灭菌 20 min制得）、葡萄糖天门冬素培养平板（培养基由葡萄糖 10 g，K2HPO4 0.5 g，天门冬素 0.5 g，蒸馏水 1000 mL，调 pH值为 7.2，加入琼脂粉 18 g，121℃灭菌 20 min制得）以及蔗糖察氏培养平板（培养基由蔗糖 30 g，FeSO4•7H2O 0.01 g，NaNO3 3 g，K2HPO4 1 g，MgSO4•7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，蒸馏水 1000 mL， 调pH 为 7.2，加入琼脂粉 18 g，121℃灭菌 20 min制得）上，于28℃下恒温培养7天后，置于高级体式显微镜（Leica M205，Germany）下进行观察，拍摄并记录放线菌LW9菌丝、孢子以及菌落的特征（形状大小、菌苔颜色、色素的有无等）。结果显示：
①高氏一号培养基培养的LW9菌落呈黄色、直径5~6mm、圆形、中央隆起，菌落表面有小水珠，产黄色色素（图2A）；该培养基下的菌苔的单个菌落之间有明显的缝隙，不产孢子（图2B）；
②葡萄糖酵母膏培养基培养的LW9菌落表面白色、背面褐色、直径7~8mm、圆形、中央略微隆起、周边呈花瓣状褶皱，产褐色色素（图2C）；该培养基下的菌苔连成一片，单个菌落之间没有缝隙，产白色孢子（图2D）；
③葡萄糖天门冬素培养基培养的LW9菌落淡黄色、直径4~5mm、圆形、扁平、菌落边缘有匍匐状菌丝（图2E）；该培养基下的菌苔的单个菌落之间有明显的缝隙，产少量白色孢子（图2F）；
④蔗糖察氏培养基培养的LW9菌落淡黄色、直径4~5mm，圆形、隆起、边界圆滑（图2G），该培养基下的菌苔的单个菌落之间有明显的缝隙，产少量白色孢子（图2H）；
b、16S rDNA分子生物学鉴定
使用MP FastDNA SpinDown Kit（MP Biomedicals，LLC，France）提取溶藻放线菌LW9基因组DNA，操作流程参照试剂盒说明书。DNA的浓度和纯度使用超微分光光度计（NanoDrop8000，Thermo Fischer Inc.，USA）进行测定。采用细菌16S rDNA的通用扩增引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）对溶藻放线菌菌株LW9进行PCR 扩增；PCR条件为94 ℃预变性5 min；随后进行30个循环：94℃变性20 s，56℃退火20 s，72℃延伸1 min；最后72℃延伸5 min。PCR扩增纯化产物送往上海生物工程有限公司进行测序，所得16S rDNA序列在NCBI 数据库进行Blast比对分析。利用MEGA 7.0 软件，采用邻接法（Neighbour-joining）进行系统发育树构建。结果表明该菌为链霉菌属（Streptomyces）成员，与Streptomyces filipinesis strain NBRC 12860同源相似性达99.0 %，鉴定其为菲律宾链霉菌（如图3所示）；
（9）溶藻特性研究
第一，溶藻活性成分稳定性测试
取菌株LW9培养7天的发酵上清液经0.22μm滤膜（Millipore，USA）过滤，收集过滤后的无菌上清液样品分别进行以下处理：
a. 酸碱处理：用1.0 mol/L 的NaOH 和HCl 溶液，将样品pH 值分别调至3.5和9.5（原发酵上清液pH值为6.5），室温条件下放置1 h后再调回原始值；
b. 热处理：样品置于100℃水浴加热1 h后冷却到室温；
c. 紫外线处理：将样品置于超净工作台，365 nm紫外灯下照射1 h。
参照双层藻平板法，检测不同处理组样品中溶藻物质的活性，设置无菌水为空白对照，未处理样品为阳性对照，每组3个平行。置于光照培养箱25℃、25 µmol m-2s-1条件下培养7 天，观察记录各组抑藻圈的有无及直径大小。实验结果显示，不同处理条件下的LW9无菌发酵液样品均能够在双层藻平板上形成透明抑藻圈（如图4所示），其抑藻圈直径大小和未处理的阳性对照组相比无显著性差异（p＞0.05）（如表一所示），说明放线菌LW9产生的溶藻活性物质具有很好的酸碱稳定性、高温耐受性以及紫外线耐受性，这将有利于后续研究中对该活性物质进行提取、纯化，为在野外水体中长时间发挥溶藻效果提供可能性：
表一：不同处理条件下菌株LW9形成抑藻圈的直径大小
不同处理组 抑藻圈直径（mm）
CK（dH<sub>2</sub>O空白对照） 0
A（未处理） 52.5 ± 0.50
B（pH 3.5酸处理） 47.5 ± 0.34
C（pH 9.5碱处理） 52.0 ± 0.60
D（热处理） 49.0 ± 0.51
E（紫外线照射处理） 50.0 ± 0.23
第二 不同生长时期LW9发酵液的溶藻效果
为探究不同生长时期的LW9发酵液的溶藻活性，分别取菌株LW9 于28℃、180 r/min摇床培养延滞期（第3 天）、对数期（第5天）、稳定期（7天）和衰亡期（10天）的发酵液，6500 r/min离心10 min，保留上清液，再用0.22 μm滤膜（Millipore，USA）过滤，再以5%（v/v）的比例将无菌上清液加入到30 ml Ma. FACHB 905对数培养期藻液中，混匀，置于25℃、25 µmolm-2s-1光照培养箱中培养，每组3个平行，分别于第4天、7天取样，采用丙酮提取分光光度法测定藻液叶绿素a（chlorophyll a，chl a）含量，按公式（1）计算溶藻率；
溶藻率（%）= [(Cck-CT)/Cck] × 100% （1）
其中Cck表示对照组chl a浓度，CT表示处理组chl a浓度；
不同生长时期菌株LW9发酵上清液的溶藻效果如图5所示，菌株LW9在延滞期无明显溶藻活性，在对数期溶藻率为36.93%，说明在此阶段菌株LW9已开始分泌溶藻活性物质，溶藻率在稳定期（88.18%）和衰亡期（93.95%）明显上升，此阶段的菌株LW9已积累较多的溶藻活性物质，具有较强的溶藻效果。
第三 不同水华蓝藻种类溶藻效果
为探究菌株LW9对不同种水华蓝藻的溶藻效果，取菌株LW9无菌发酵上清液以5%（v/v）比例分别添加到单细胞铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）PCC7806、群体铜绿微囊藻TH1701、柔细束丝藻（Aphanizomenon gracile）FACHB1039、鱼腥藻（Anabaena sp.）PCC7120和颤藻（Oscillatoria sp.）PCC6505这五株藻液中，混匀，置于光照培养箱中培养，每组以添加无菌水为空白对照，观察记录各组藻液是否发生黄化并显微拍照观察藻细胞形态变化。菌株LW9对5株蓝藻的溶藻效果如图6 A和B所示。
LW9对单细胞铜绿微囊藻PCC7806、群体铜绿微囊藻TH1701、柔细束丝藻FACHB1039、颤藻PCC6505 均表现出明显的溶藻效果，而对鱼腥藻PCC7120无明显溶藻效果。对藻细胞外部形态影响具体描述如下：
a. 添加LW9无菌上清液3天后，单细胞铜绿微囊藻FACHB7806藻液即出现明显黄化，细胞下沉，5-7天后藻液变得澄清透明；显微观察PCC7806正常细胞呈蓝绿椭圆形，细胞壁边缘光滑完整，可见较多生长旺盛的二分裂状态细胞，而实验组视野中大部分藻细胞发生裂解，呈现较多灰黄色细胞碎片，少数未裂解细胞的细胞壁边缘皱缩；
b. 群体状态的铜绿微囊藻TH 1701在处理4天后可见明显黄化，显微观察正常TH 1701群体胶被细胞结构致密，呈鲜艳蓝绿色椭圆形，而实验组群体细胞呈灰黄色，群体细胞胶被结构明显松散，部分细胞形态发生改变；
c. 柔细束丝藻FACHB1039比铜绿微囊藻细胞对LW9溶藻物质更显敏感，实验组在培养约3天后，藻丝完全下沉，藻液澄清透明，显微观察可见藻丝断裂，伪空胞大量减少，藻丝体外围出现较多细菌；
d. 对照组颤藻PCC6506藻丝长，呈蓝绿色，喜贴壁生长，易形成藻丝团，实验组在培养7天后藻丝团体积明显变小；显微观察发现藻丝团内部藻丝结构完好，而外围藻丝明显黄化，藻丝发生断裂，大部分细胞结构被破坏，细胞内含物渗出，呈无色透明状；
e. 与以上四株藻现象不同，添加 LW9无菌上清液10天后都未观察到鱼腥藻PCC7120细胞发生黄化裂解现象，显微观察处理组藻丝细胞形态完好，未见明显藻丝断裂和细胞裂解现象。
第四 溶藻效果电镜观察
取适量经LW9无菌上清液处理4天的群体铜绿微囊藻TH1701藻细胞，6500 r/min离心10min，收集藻细胞，加入2.5%（v/v）的戊二醛于4℃下固定4 h，制备电镜切片样品，使用透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope，TEM）（HT-7700，Japan）对细胞内部结构形态进行观察。电镜结果显示，菌株LW9的溶藻物质能明显破坏微囊藻细胞的细胞壁及内部结构。正常铜绿微囊藻细胞（如图7 A所示）细胞壁（cell wall）结构完整，外围均匀围绕一层较薄的胶被（sheath），胞质内各种细胞器结构清晰可见，呈现蜂巢状（横面）或管状（纵面）结构为伪空胞（gas vacule），多层扁平膜状片层结构为类囊体（thylakoid），其上附着很多小色素颗粒，而处理组微囊藻细胞（如图7 B所示）的细胞壁及胶被层边缘模糊扩散，胞质内伪空胞、类囊体等细胞器结构模糊难以辨别。伪空胞的破坏与对不同水华蓝藻种类溶藻效果的结果中细胞大都发生下沉的现象相吻合，对其溶藻机制的阐明需要更多的实验数据支撑。
（10）对养殖水体微囊藻水华的溶藻效果与时效检验
用采水器从严重爆发微囊藻水华的池塘采集表层水样（富含群体微囊藻水华），分装至规格为50 ml无菌三角瓶，每瓶40 ml。分别按2.5%和5%（v/v）比例加入发酵9天的LW9发酵液，以不加发酵液水样为对照，每组设置三个重复，自然日光，室温放置（28-32℃），连续观察21天，记录各组藻液黄化现象并显微拍照观察藻细胞群体变化情况。分别于7天、14天、21天取样，采用phytoPAM 叶绿素荧光检测仪检测样品中叶绿素a含量，按公式（1）计算溶藻率，其结果如图8—图10所示：
图8显示，与对照组（图8A1-A3）相比，添加5% LW9发酵液实验组水样（图8B1-B3）颜色从第7天到21天接近透明，溶藻效果明显，且持续了21天。而添加2.5% LW9发酵液实验组水样（（图8C1-C3））第7-14天颜色逐渐由深变浅，第21天时出现轻微“返绿”的现象。
图9显示：对照组微囊藻（图9 A1-A3）细胞形态完整，细胞内大量颗粒状假空泡，在显微镜下呈明显的深绿色。藻细胞集中，呈现密集的藻细胞群体。而添加5% LW9发酵液实验组水样（图9 B1-B3），藻细胞群体胶被结构被破坏，群体与细胞逐渐崩解，视野内出现许多细胞残碎片，藻体颜色由鲜艳的深绿色变为灰暗的黄色，溶藻效果十分明显。添加2.5% LW9发酵液实验组水样（（图9C1-C3）），藻细胞相对分散，在细胞周围发现许多粘性物质，藻细胞群体变小，呈现浅黄绿色。这表明放线菌LW9的溶藻活性物质可以通过破坏藻细胞群体胶被及细胞膜的完整性，使细胞膜内物质流出导致藻细胞的裂解死亡。
由图10可知：添加5% LW9 发酵液，21天内其溶藻率始终保持在80%以上，比较稳定，第14天溶藻率最高，达到93%。添加2.5% LW9 发酵液，7天内表现轻微促进作用，但至14天其溶藻率也高达87%，至21天，其溶藻率虽有所下降，仍然保持在73%水平。
序列表
<110> 湖南文理学院
<120> 一株广谱溶藻放线菌LW9、分离方法及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1437
<212> DNA
<213> 菲律宾链霉菌LW9(Streptomyces filipinensis LW9)
<400> 1
gagggcggcc cgggctttac cactgcaact cgaacgattg aagcccttcg gggtggatta 60
gtggcgaacg ggtgagtaac acgtgggcaa tctgcccttc actctgggac aagccctgga 120
aacggggtct aataccggat acaaccactg accgcatggt cgggtggtgg aaagctccgg 180
cggtgaagga tgagcccgcg gcctatcagc ttgttggtga ggtaatggct caccaaggcg 240
acgacgggta gccggcctga gagggcgacc ggccacactg ggactgagac acggcccaga 300
ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt gcacaatggg cgaaagcctg atgcagcgac 360
gccgcgtgag ggatgacggc cttcgggttg taaacctctt tcagcaggga agaagcgaaa 420
gtgacggtac ctgcagaaga agcgccggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt 480
agggcgcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagagc tcgtaggcgg cttgtcacgt 540
cgattgtgaa agcccgaggc ttaacctcgg gtctgcagtc gatacgggct agctagagtg 600
tggtagggga gatcggaatt cctggtgtag cggtgaaatg cgcagatatc aggaggaaca 660
ccggtggcga aggcggatct ctgggccatt actgacgctg aggagcgaaa gcgtggggag 720
cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg gtgggaacta ggtgttggcg 780
acattccacg tcgtcggtgc cgcagctaac gcattaagtt ccccgcctgg ggagtacggc 840
cgcaaggcta aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggcgga gcatgtggct 900
taattcgacg caacgcgaag aaccttacca aggcttgaca tacaccggaa aaccctggag 960
acagggtccc ccttgtggtc ggtgtacagg tggtgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgtcgt 1020
gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttgt tctgtgttgc cagcatgccc 1080
ttcggggtga tggggactca caggagaccg ccggggtcaa ctcggaggaa ggtggggacg 1140
acgtcaagtc atcatgcccc ttatgtcttg ggctgcacac gtgctacaat ggccggtaca 1200
atgagctgcg ataccgtgag gtggagcgaa tctcaaaaag ccggtctcag ttcggattgg 1260
ggtctgcaac tcgaccccat gaagtcggag tcgctagtaa tcgcagatca gcattgctgc 1320
ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac gtcacgaaag tcggtaacac 1380
ccgaagccgg tggcccaacc ccttgtggga gggagctgtc gaagggggac cgggttg 1437

Claims (5)

1.一株广谱溶藻放线菌LW9，该放线菌属链霉菌
属，分类命名为Streptomyces filipinensis LW9，保藏编号为CCTCC NO：M 2018138，于2018年03月16日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国湖北省武汉市武汉大学。
2.根据权利要求1所述的一株广谱溶藻放线菌LW9，其特征在于，其生物学特征如下：（1）在高氏一号培养基上菌落呈黄色、直径5~6 mm、圆形、中央隆起状，菌落表面有小水珠，产黄色色素，菌苔的单个菌落之间有明显的缝隙，不产孢子；（2）在葡萄糖酵母膏培养基上菌落表面为白色、背面褐色，菌落直径7~8 mm、圆形、中央略微隆起、周边呈花瓣状褶皱，产褐色色素，菌苔连成一片，单个菌落之间没有缝隙，产白色孢子；（3）在葡萄糖天门冬素培养基上菌落呈淡黄色、直径4~5 mm、圆形、扁平、菌落边缘有匍匐状菌丝，菌苔的单个菌落之间有明显缝隙，产少量白色孢子；（4）在蔗糖察氏培养基上菌落呈淡黄色、直径4~5 mm、圆形、隆起、边界明显圆滑，菌苔的单个菌落之间有明显缝隙，产少量白色孢子。
3.根据权利要求1或2所述的一株广谱溶藻放线菌LW9的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）采样：采用随机五点采样法，取距离地表3-5 cm深的土壤，将其均匀混合后装入无菌袋中并带回实验室，自然风干后研成粉末，然后取10 g土壤样品，放入装有适量玻璃珠和无菌水的锥形瓶中，振荡20 min，使泥土与无菌水充分混合；
（2）恒温培养：采用梯度稀释平板涂布法将步骤（1）的土壤悬液涂布至固体高氏一号培养基上，然后置于恒温培养箱在28℃下培养8天；
（3）分离纯化：从经过步骤（2）恒温培养的培养基上挑取不同形态放线菌菌落，并以“Z”字划线法反复分离纯化3-4次；
（4）斜面培养：将经过步骤（3）分离纯化后的单菌落接种至高氏一号试管斜面上，于28℃下培养7天，然后保存于4℃冰箱备用；
（5）发酵培养：将经过步骤（4）处理得到的菌种接种至高氏一号液体培养基中，于28℃、180 r/min下摇床振荡培养7天；
（6）初筛：采用双层藻平板法，取对数生长期的铜绿微囊藻藻液以体积比为1：1加入到冷却至50℃、琼脂浓度2%的BG-11固体培养基中，混匀后倒入到底层为已凝固的、琼脂浓度为1%的BG-11固体培养基平板上，使其在上层迅速均匀铺平冷却，于25℃、25 µmol m-2s-1光照条件下培养5 天；然后使用1 ml的无菌枪头顶端在双层藻平板中央打圆形孔，向孔中加入经步骤（5）处理得到的放线菌发酵液100 µL，置于光照培养箱25℃、25 µmol m-2s-1条件下共培养5 天，观察是否产生溶藻圈；
（7）复筛：将初筛得到的放线菌发酵液以体积比为5%的比例加入到铜绿微囊藻对数生长期的藻液中，空白对照组加入等体积无菌水，于25℃、25 µmol m-2s-1条件下培养3-5 天，观察藻液是否产生黄化现象。
4.一株广谱溶藻放线菌LW9在蓝藻水华消亡，尤其是微囊藻水华消亡中的应用。
5.根据权利要求4所述的一株广谱溶藻放线菌LW9在蓝藻水华消亡，尤其是微囊藻水华消亡中的应用，其特征在于，应用时，添加的是体积比为2.5%-5%的发酵9天的LW9发酵液。
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Assignor: HUNAN University OF ARTS AND SCIENCE

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Denomination of invention: A broad-spectrum algal solubilizing actinomycete LW9, isolation method and application

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License type: Common License

Record date: 20230530

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