CN116463239B - 一种奇异链霉菌bd2233、油悬浮剂及其应用 - Google Patents
一种奇异链霉菌bd2233、油悬浮剂及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种奇异链霉菌BD2233、油悬浮剂及其应用，该菌分离自四川省仁寿县华宁村竹林地的根际土壤中，该菌已于2022年9月2日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.25634。该奇异链霉菌BD2233在燕麦片培养基上生长最好，菌落圆形规则，白色，气生菌丝和孢子丝丰富。该奇异链霉菌BD2233对束梗镰刀菌具有显著的抑制作用，对束梗镰刀菌导致的箭竹腐烂病显示出优良的控制能力，可应用在盆栽和田间的箭竹腐烂病感染防治中。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种奇异链霉菌BD2233、油悬浮剂及其应用。
背景技术
利用有益微生物杀灭或压低病原菌的密度以控制植物病害的发生发展，其实就是利用微生物间的抗生、竟争、重寄生、溶菌作用，或者是代谢产物来诱导植物抗病性等，从而达到防治效果。拮抗菌可以在植物的根际、体表和体内快速繁殖和定殖，占据定殖位点，从而阻止病原微生物的进一步侵染和定殖。生物防治是未来植物病害防治的重要方向，生防菌在减少和替代化学杀菌剂的使用方面有着较大的潜力。
近年来，化学农药的广泛应用，造成了环境污染、农药残留、破坏生态平衡及病菌产生抗药性等问题，为此开发对人类以及环境友好的、防治效果良好的、新的植物病虫害生物防治方法一直是各国科学家研究的热门领域。链霉菌(Streptomyces)是高等放线菌，可产生多种抗生素、植物激素等活性物质，对提高植物的抗病、抗逆性能具有重要的作用，具有开发生物农药的潜力。链霉菌的生防机制研究表明，链霉菌主要通过拮抗作用、竞争作用、重寄生作用、诱导作用和抗生作用等抗病机制来防治植物病害、土传病害，且链霉菌不仅仅通过一种方式单独发挥生防作用，通常都是几种方式联合作用的共同效果，不同的生防机制间也存在协同作用。由于链霉菌防治植物病害时存在防治效果难以稳定、持久等缺点，寻找提高链霉菌防治植物病害效果的途径显得十分重要。诱变育种、固定化技术和改良发酵工艺等是提高链霉菌防治植物病害效果的有效途径，其目标是为了提高目标产物的产量和纯度，减少副产物，改变生物合成途径，以获得高产的新产品。
箭竹(Fargesia)隶属于禾本科竹亚科(Poaceae,Bambusoideae)北美箭竹族(tribe arundinariinae)或木本竹类温带分支，主要分布于从秦岭南坡的佛坪经四川盆地北界的南枰、平武、北川、宝兴最后到川南的雷波呈一弧形分布于四川盆地西缘山地，包括甘肃南部、陕西、云南，湖北、江西。大多数箭竹生长在温暖湿润，箭竹年平均气温13～19摄氏度，年降水量约为1000mm，空气相对湿度较大的环境里，不需要大量水便可以很好的成长；没有一种竹子能忍受寒冷和干燥的气候条件，但箭竹却是高山地区抗风沙的有利植被。箭竹不仅是我国国宝—大熊猫的主食竹，也是亚高山针叶林下层最重要的优势种群，在亚高山生态系统中的水源涵养、水土保持、养分平衡等生态功能发挥中具有重要的作用。近年来箭竹的生长受病害为害日趋严重，特别是真菌性病害，致使箭竹生长受限，品质和产量下降。
由病原菌束梗镰刀菌(Fusarium stilboides Wollenw.)造成的箭竹腐烂病主要发生在竹竿基部上。病健交界处分界明显，发病初期竹竿基部出现红褐色的小病斑，病部组织松软，水渍状，腐烂，韧皮部和木质部分离，输导组织受到破坏，导致养分和水分无法运输，竹冠部分得不到充分的养分，叶子逐渐变黄，然后干枯，直至整株枯死。因此，找到一种有效防治箭竹腐烂病的生物控制方法是非常有意义的。
油悬浮剂是水基化、颗粒化绿色制剂的一个很好的补充，具有以下优势：1)可以适用于在水中稳定性差、制粒较难的农药；2)由于以植物油作载体，对靶标有良好的亲合性，可更好地发挥药效；3)生产工艺相对简单，基本与水悬浮剂相同；4)应用时，不像水基化制剂对助剂要求那么高，基本不需加入增效剂；5)特别适用于多种喷雾制剂，如低容量喷雾制剂、超低容量喷雾制剂等。因此，希望找到一种有效防治箭竹腐烂病的油悬浮剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种奇异链霉菌(Streptomyces mirabilis)BD2233、油悬浮剂及其应用，该菌对束梗镰刀菌具有显著的抑制作用，用该菌制备的油悬浮剂对箭竹腐烂病显示出优良的控制能力，可应用在箭竹腐烂病感染防治中。
为了达到上述目的，本发明提供了一种奇异链霉菌BD2233，该菌已于2022年9月2日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.25634，该奇异链霉菌BD2233的拉丁文名称为Streptomyces mirabilis。
本发明提供的奇异链霉菌BD2233对束梗镰刀菌有抑制作用，可用于束梗镰刀菌的防治中。
本发明还提供了一种由上述奇异链霉菌BD2233制备的油悬浮剂。
优选地，本发明提供的油悬浮剂的乳化剂为十二烷基苯磺酸钠，增稠剂为黄原胶，分散剂为二水磷酸氢二钠，该油悬浮剂还包含孢子浓度为1×1012cfu/mL奇异链霉菌BD2233。
本发明提供的油悬浮剂可被应用于箭竹腐烂病的防治中。
本发明的奇异链霉菌BD2233，显著抑制束梗镰刀菌，用该菌制备的油悬浮剂解决了箭竹腐烂病的防治问题，具有以下优点：
本发明提供的奇异链霉菌BD2233对箭竹腐烂病菌有抑制作用，具备防治该病害的能力，应用性强。
本发明提供的由奇异链霉菌BD2233制备的油悬浮剂，无粉尘危害，对操作者和环境安全；吸附能力强、抗雨水冲刷，与竹表面高度亲和，有助于药效的稳定发挥。
附图说明
图1为本发明中奇异链霉菌BD2233对病原菌的平板对抗抑制结果。
图2为本发明中奇异链霉菌BD2233在不同培养基上菌落生长情况。
图3为本发明中奇异链霉菌BD2233的显微形态图。
图4为本发明中采用6对引物对奇异链霉菌BD2233的扩增电泳结果。
图5为本发明基于gyrB、trpB、rpoB、recA和atpD基因序列构建的多基因联合系统发育树。
图6为本发明中奇异链霉菌BD2233的发酵条件优化结果。
图7为本发明中油悬浮剂的不同助剂筛选结果。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
说明：本发明所用到的试剂若无特殊说明的均为常规试剂，所用到的方法均为常规方法。
实验例1菌株的分离鉴定与平板抑制效果
1.菌株的分离
于2021年7月1日在四川省仁寿县华宁村撑×绿杂交竹健康林地进行样品采集，采用五点取样法采集根际土。除去土壤表层的枯枝落叶后，在以竹竿为中心，直径0.5m的圆形范围内，收集0～20cm土层深度的带土的根系，先轻轻抖落大块不含根系的土壤，然后用毛刷刷下黏附在根系周围的土壤(距离0～5mm)，作为根际土，放入无菌自封袋中保存于冰盒中迅速带回实验室，保存于4℃冰箱。
取健康植株根际土10g于装有90mL无菌水的250mL锥形瓶中，摇匀，制成10-1稀释液，将土样溶液分别用无菌水稀释至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，从10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀释液中分别吸取100μL至牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(NA培养基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂20g、1000mL蒸馏水，进行121℃高压灭菌30min)平板上，用灭菌三角棒培养基平板上涂布均匀，倒置放入37℃培养箱中恒温培养24h，每个处理3次重复。用无菌接种环挑取菌落形态差异明显的单菌落，在NA培养基上重新进行划线培养，共得到纯化后的14种菌株(分别命名为BD2230、BD2231、BD2232、BD2233、BD2234、BD2235、BD2236、BD2237、BD2238、BD2239、BD2240、BD2241、BD2242、BD2243)，将纯化后的菌株转接NA斜面于4℃保藏。
2.平板抑制效果
按琼脂打孔法，用无菌接种针将6mm的病原菌菌饼置于常规的PDA培养基平板一侧，在距离病原菌菌饼3cm处用6mm的无菌打孔器打孔，并接种100μL经28℃、180r/min摇床振荡培养24h的1×105cfu/mL各纯菌株培养液。空白对照在圆心处接种直径6mm的病原真菌菌饼，25℃恒温培养7d，每个处理3个平行，各筛选菌对束梗镰刀菌(Fusarium stilboidesWollenw.)的抑制率如下表1所示。
表1为各筛选菌对束梗镰刀菌的抑制率
注：抑制率(％)＝(对照组病原菌直径-处理组病原菌直径)/(对照组病原菌直径-菌饼直径)×100；数据为平均值±标准误，数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
根据各筛选菌对束梗镰刀病原菌的抑制率结果，筛选出效果最佳的菌株为BD2233，该菌株具备一定的生防能力。菌株BD2233对病原菌的平板抑制效果如图1所示，其中，平板中的左侧为病原菌，右侧为筛选的菌株BD2233。
3、生防细菌的鉴定
(1)形态学鉴定
将筛选的菌株BD2233分别在无机盐淀粉、高氏一号、酵母膏-麦芽浸汁、察氏、燕麦和马铃薯浸汁培养基(不同培养基配方见下表2)上28℃培养7d，各培养基上的菌落生长情况如图2所示，其中，图中的A的培养基为可溶性无机盐淀粉培养基；B的培养基为高氏一号培养基；C的培养基为酵母膏-麦芽浸汁琼脂培养基；D的培养基为察氏培养基；E的培养基为燕麦片培养基；F的培养基为马铃薯浸汁琼脂培养基。由结果可知，菌株BD2233在燕麦片培养基上生长最好，菌落圆形规则，白色，气生菌丝丰富；菌株在察氏培养基上生长最差，菌落圆形，灰白色，气生菌丝很少，基生菌丝丰富；菌株在马铃薯浸汁和酵母膏-麦芽浸汁琼脂培养基生长好，在无机盐淀粉和高氏一号培养基上生长良好，该菌在各培养基上生长的形态描述见下表3。其中，该菌株BD2233在高氏一号培养基培养12d的显微形态如图3所示，其中，图中的A为菌丝形态，B为紧螺旋孢子丝形态，该图右下角的标尺均为10μm。可知，该菌株BD2233的孢子形态为杆状，没有运动性，为典型的奇异链霉菌形态特征之一。
其中，表2中的微量盐为将0.1g的FeSO4·7H2O、0.1g的MnCl2·4H2O、0.1g的ZnSO4·7H2O溶于100mL蒸馏水制备所得。
表2不同培养基配方
表3BD2233菌株在不同培养基上的形态及培养特征
(2)分子生物学鉴定
利用TIANGENDNAKIT细菌DNA提取试剂盒提取菌株BD2233基因组DNA，产物进行PCR检测：用2×EasyTaqPCRSuperMix(+dye)酶对从获得的基因组DNA中扩增16srRNA、gyrB、rpoB、trpB、recA和atpD基因，使用的引物如下表4所示，反应体系和扩增程序分别如下表5所示。
表4扩增的引物序列
表5 PCR反应体系与反应程序
将得到的PCR产物用1％的琼脂糖凝胶，以110V恒压电泳25min进行电泳检测PCR产物。将PCR产物送往成都擎科生物技术有限公司测序，所得各个基因序列测序结果在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库进行对比，根据比对结果确定建树所用序列，采用邻接法(M-E)构建多基因联合系统发育树，确定拮抗菌株的系统进化地位。
如图4所示，为6种分别对菌株BD2233的16srRNA、gyrB、rpoB、trpB、recA和atpD基因进行扩增得到的产物的电泳条带(各目标基因扩增两个重复)，图中的M为DL2000的marker。结合测序可知，扩增后分别对应得到长度为1129bp、462bp、810bp、723bp、818bp和903bp的DNA片段。将BD2233菌株的各扩增DNA序列递交GenBank数据库获得登录号(16SOP236556；gyrB OP413833；trpB OP413834；rpoB OP390164；recA OP390163；atpDOP390162)。
在NCBI数据库中进行BLAST对比分析，选取与之同源性最高的菌株的不同DNA序列，采用PhyloSuite进行多基因联合建树，基于PhyloSuite菌株BD2233的gyrB、rpoB、trpB、recA和atpD基因序列构建的多基因联合系统发育树如图5所示。由发育树可知，BD2233与Streptomyces mirabilis NRRL ISP-5553以较高的自展值支持聚为1个分支，亲缘关系最近，与其他链霉菌株关系较远。基于以上特征，将菌株BD2233分类命名为奇异链霉菌(Streptomyces mirabilis)BD2233，并将该菌于2022年9月2日保藏在中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.25634。
实验例2油悬浮剂的制备
1.发酵条件的优化
以1mol/L的NaOH和1mol/L的醋酸调整生防菌株的发酵液pH值分别为4、5、6、7、8、9、10，以原始pH值的发酵液为对照组，分别检测各个pH下发酵液的OD600值并计算抑菌率，每种处理重复3次，筛选出最佳pH值。结果如图6中的A所示，当pH＝6时，抑菌率(35.87％)和OD600(1.87)达到最大值然后随着pH值的增大抑菌率和OD600均逐渐下降，可知，该菌的最佳pH值为6。
将菌株BD2233的发酵液分别于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃水浴30min，检测其OD600值并计算抑菌率，以未经过处理的发酵液为对照，每种处理重复3次，筛选最佳发酵温度。结果如图6中的B所示，当发酵温度为20～30℃时，抑菌率和OD600逐渐增大，在30℃达到最大值(抑菌率为44.99％、OD600为0.89)，30℃后随着温度上升抑菌率和OD600值逐渐降低，可知，该菌的最佳发酵温度为30℃。
将该生防菌株BD2233接种于NB培养基，于30℃、170r/min振荡培养72h，制成生防菌的孢子悬浮液。将孢子悬浮液的浓度定到1×1012cfu/mL。从所得的孢子悬浮液中分别以体积分数为5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％的添加量接种于培养基中，在28℃，170r/min的摇床中培养24h，分别检测其OD600值并计算抑菌率，每次处理重复3次，筛选出最佳添加量。结果如图6中的C所示，当生防菌孢子悬浮液的添加量为5％～20％时，随着添加量的增加，抑菌率和OD600均逐渐上升，在添加量为20％时达到稳定值(抑菌率为36.49％、OD600为1.27)，在添加量为20％～50％时，随着添加量的增加，抑菌率和OD600较为稳定，可知该菌株的最佳添加接种量为20％。
以体积分数为20％的添加量接种于燕麦片琼脂培养基中，在30℃，170r/min的摇床中培养，从开始阶段每隔6h抽取发酵液至72h的时间段，分别检测其OD600值并计算抑菌率，每次处理重复3次，筛选出最佳发酵时间。结果如图6中的D所示，在发酵时间为18～48h时，随着发酵时间的增加抑菌率和OD600均逐渐上升，在48h后达到最大值(抑菌率37.90％、OD600为2.61)，发酵时间为48～72h的抑菌率和OD600保持稳定，可知，该菌株的最佳发酵时间为48h。
其中，图6中的不同小写字母表示0.05水平的显著差异；误差条表示测量值的不确定度。
用实验例1中筛选出来的最优培养基成分和上述筛选出的最优培养条件对菌株BD2233进行发酵培养，以原始发酵条件为对照，对比抗菌活性物质对病菌的抑菌圈大小。
将所得的发酵孢子液置于4℃冷库中，静置60h后，用注射器取出并弃除3/5的上清液，保留余下的200mL浓缩沉降液备用。
2.助剂筛选
(1)乳化剂的筛选
将十二烷基苯磺酸纳、十二烷基硫酸钠、月桂酰基谷氨酸钠、烷基酚聚氧乙烯醚、吐温80以及二苄基联苯酚聚氧乙烯醚6种乳化剂以质量分数为2％的含量进行相容性检测，筛选出与生防菌相容性最好的乳化剂。
相容性检测：将选择的试剂分别加入NB培养基中，121℃灭菌30min，冷却至后倒入培养皿，用不含任何助剂的NB培养基作为空白对照。将生防菌发酵液以5％的接种量分别接种到上述培养基中，每个处理有3个平行，摇瓶发酵24h后，用平板菌落计数法(ZaidAhmedPirzada.2014)测量其菌落数并按以下公式计算抑制率。
生长抑制率(％)＝(空白对照菌落直径-加有助剂的菌落直径)/空白对照菌落的直径×100％
将筛选出与生防菌相容性最好的乳化剂分别按照质量分数为2％、3％、4％、5％、6％与溶剂混匀，取混合液0.5mL，放入盛有250mL标准硬水的具塞量筒中，观察其分散性；摇匀后，观察乳化性，然后再放入30℃恒温槽中保温1h，取出继续观察其乳化分散稳定性，选出最优乳化剂以及最适含量。
不同乳化剂与生防菌的相容性检测的结果如图7中的A所示，十二烷基苯磺酸钠的抑菌率(34.69％)及菌含量(34.7×107)最高，除十二烷基硫酸钠的抑菌率与十二烷基苯磺酸钠差异不显著外，其他的乳化剂的抑菌率及菌含量都显著低于十二烷基苯磺酸钠，可知，油悬浮剂的最佳乳化剂为十二烷基苯磺酸钠。
根据筛选出的最佳乳化剂的结果，将不同浓度的十二烷基苯磺酸钠加入油悬浮剂测试其效果。当十二烷基苯磺酸钠的质量分数为3％～8％时，常温情况下，乳化性较差，但搅拌后乳化液呈不透明乳状液，30℃保温1h后，仍有明显浮油。乳化剂含量为9％时乳液变为白色。当乳化剂含量为10％时常温下乳液乳化分散呈丝状，略搅动乳化体系呈乳白色不透明乳化液，30℃保温1h后，乳液白色无浮油。当乳化剂含量达到12％后，在常温和30℃保温1h情况下，乳化效果均为最佳，乳液呈白色并无浮油。当乳化剂含量再增加，对其乳化效果影响不大。因此，乳化剂十二烷基苯磺酸钠的最适含量为12％。
(2)增稠剂的筛选
将选择的有机膨润土、改性膨润土、硅酸镁铝、羧甲基纤维素、黄原胶5种增稠剂以质量分数为1％的含量检测其相容性，筛选出与生防菌相容性最好的增稠剂。将选取的增稠剂分别按质量分数为1％、2％、3％、4％、5％的量加入油悬浮液，使用高速分散均制机乳化分散40min，静置48h后进行倾倒性实验，悬浮率检测等，选出最优增稠剂及最佳含量。
不同增稠剂与生防菌的相容性检测结果如图7中的B所示，黄原胶的抑菌率(18.83％)及菌含量(57.6×107)最高，且与其他增稠剂差异显著，可知，油悬浮剂的最佳增稠剂为黄原胶。
根据筛选出的最佳增稠剂的结果，将不同浓度的黄原胶加入油悬浮剂测试其效果。当增稠剂的质量分数为0.1％～0.4％时，试剂无沉淀且流动性较好，但有油珠析出。当增稠剂的质量分数为为0.5％～0.6％时，试剂无沉淀无油珠且流动性较好。当增稠剂的质量分数为达到0.7％后，试剂开始出现沉淀，且静置后出现分层现象。根据以上结果并结合经济情况考虑，增稠剂黄原胶的最适含量为0.5％的质量分数。
(3)分散剂的筛选
将羧丙基纤维、羧甲基纤维素钠、木质素磺酸钠、三聚磷酸钠、二水磷酸氢二钠5种分散剂以质量分数为1％的含量检测其相容性，筛选出与生防菌相容性最好的分散剂。将溶剂分别和质量分数为0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％的量选择出的分散剂混匀，取混合液0.5mL，放入盛有250mL标准硬水的具塞量筒中，观察其分散性，筛选最优分散剂以及最适含量。
不同分散剂与生防菌的相容性结果如图7中的C所示，二水磷酸氢二钠的抑菌率(34.47％)及菌含量(39.1×107)显著高于其他分散剂，可知，油悬浮剂的最佳分散剂为二水磷酸氢二钠。
根据筛选出的最佳分散剂的结果，将不同浓度的二水磷酸氢二钠加入油悬浮剂测试其效果。当分散剂的质量分数为0.5～4.5％时，常温状态和30℃保温1h情况下，试剂的自动分散性均较差，且有浮油。当分散剂的质量分数为5％时，常温状况下试剂的自动分散性较好，但仍有少量浮油析出，30℃保温1h后，有大量浮油析出。当分散剂的质量分数为6％时，常温状态和30℃保温1h情况下，试剂的自动分散性均良好且无浮油析出。因此，分散剂二水磷酸氢二钠的最适含量为为6％(质量分数)。
其中，图7中的不同小写字母表示0.05水平的显著差异；误差条表示测量值的不确定度。
综述可知，本发明提供的油悬浮剂为12％十二烷基苯磺酸钠、0.5％黄原胶和6％二水磷酸氢二钠与优化发酵后的生防菌孢子浓度为1×1012cfu/mL的浓缩沉降液混合制成，上述三种助剂的分数均为质量分数。
3.油悬浮剂产品质量检测
将筛选出的最佳乳化剂、增稠剂和分散剂与溶剂以最适含量混合后，加入上述优化发酵后的生防菌孢子浓度为1×1012cfu/mL的浓缩沉降液制成油悬浮剂，将其封入瓶中，放置0℃以及在54±2℃恒温箱中贮存14d，分析在贮存前后分析有效成分的含量，分析误差为±l％，观察其外观是否有分层，流动性以及分散性。检测结果如下表6所示，结果表明，奇异链霉菌BD2233油悬浮剂活菌率超过94％、悬浮率超过95％，均高于国家标准；在制备完成及高温与低温储藏后，持久起泡性(2.35～12.57)、倾倒性(1.36％～3.28％)、pH(5.5～6.5)均控制在较稳定的水平，起泡性远优于国家标准。由于竹表面蜡质层较厚，一般的制剂无法附着，导致病害防治难度大，本发明提供的油悬浮剂具有很强的粘附力，有助于防治效果的稳定。
表6油悬浮剂质量检测
实验例3生防菌对箭竹腐烂病的盆栽防效和田间防效测定
1.盆栽防治试验
在四川农业大学温室大棚内进行，准备病原菌孢子悬浮液(1×106cfu/mL)，试验组为将上述油悬浮剂稀释至50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、2000倍的油悬浮剂；以市售的50％多菌灵500倍液为对照药剂，无菌水处理为空白对照。选取一年生健康的箭竹幼苗630株，分成先接病原菌、先接生防菌和同时接种3组，每组10株，每组处理重复3次，分别做如下处理：1)先采用针刺法在枝干接种病原菌液，每株100mL，15d后在原处采用喷洒法分别接种不同稀释倍数的油悬浮剂。2)先接种不同稀释倍数的油悬浮剂，15d后接种病原菌悬液。3)同时接种病原菌和不同稀释倍数的油悬浮剂。30d后观察发病情况，计算发病率、病情指数、防治效果，具体计算公式如下：
发病率(％)＝发病株数/总接种株数×100％；
病情指数＝∑(病级株数×代表数值)/(总株数×发病最重级的代表数值)×100％；
防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100％。
试验结果见下表7所示，可知，生防菌对病原菌的抑制能力随着稀释倍数的增加而降低。50倍稀释液对箭竹腐烂病控制最有效，观察到的最高控制量为95.2％。从病害防治角度来看，奇异链霉菌BD2233油悬浮剂50倍、100倍、200倍、500倍和1000倍稀释液的防治效果均大于50％多菌灵。因此，选择浓度为1000倍的稀释浓度，即孢子浓度为1×109cfu/mL，能在控制成本的同时对病害进行有效的控制。
表7奇异链霉菌BD2233对箭竹腐烂病的盆栽实验
注：同一列中不同小写字母表明差异性显著，P<0.05；CK1为无菌水；CK2为50％多菌灵；处理表示稀释倍数。
2.田间防效试验
(1)供试地点：试验于2022年在四川省都江堰市箭竹栽培区进行。
(2)供试植株：4年生箭竹(Fargesiaspp.)。
(3)试验设计：试验共设5组处理，包括喷洒的油悬浮剂剂量为1×109cfu的400mL/hm2、600mL/hm2、800mL/hm2的奇异链霉菌BD2233可分散油悬浮剂1000倍液，无菌水为空白对照和800mL/hm250％多菌灵500倍液的药剂对照，每处理3次重复，共设15个小区。每个小区面积约100m2，各小区随机排列。田间自然发病前开始喷药，共施药3次，施药时间分别为2022年5月5日、5月12日、5月19日，施药时均无降雨，整个试验期间无恶劣天气影响。
(4)调查方法
最后一次施药后30d和60d后调查发病情况。使用对角线5点采样法采样，每点调查10株，共50株，记录病株数和各病级株数，计算相应的病情指数和防治效果，具体计算公式如下所示：
病情指数＝100×∑(各级病叶数×各级代表值)/(调查总叶数×最高级代表值)；
防治效果(％)＝(空白对照区施药后病情指数-药剂处理区施药后病情指数)×100/空白对照区施药后病情指数。
田间防治效果见下表8所示，可知，施药后30d，箭竹腐烂病发病率明显降低，且600和800mL/hm2剂量的奇异链霉菌BD2233可分散油悬浮剂对箭竹腐烂病的防治效果显著高于对照药剂多菌灵。施药后60d，三个剂量的奇异链霉菌BD2233可分散油悬浮剂对箭竹腐烂病的防治效果仍显著高于对照药剂多菌灵。从30～60d观察期看，施用奇异链霉菌BD2233可分散油悬浮剂能使病情指数不再显著升高，且防治效果较50％多菌灵稳定。整个田间试验过程，未产生药害症状，说明奇异链霉菌BD2233可分散油悬浮剂在400mL/hm2～800mL/hm2的剂量下，对箭竹安全。
表8奇异链霉菌BD2233对箭竹腐烂病的田间防效
注：同一列中不同小写字母表明差异性显著，P<0.05。
综上结果表明，本发明筛选的奇异链霉菌BD2233对束梗镰刀菌具有显著的抑制作用，对束梗镰刀菌导致的箭竹腐烂病显示出优良的控制能力，可应用在盆栽和田间的箭竹腐烂病感染。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
Claims (4)
1.一种奇异链霉菌(Streptomyces mirabilis)BD2233，其特征在于，该菌已于2022年9月2日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.25634，该奇异链霉菌BD2233的拉丁文名称为Streptomyces mirabilis，该菌对束梗镰刀菌(Fusarium stilboides)有抑制作用。
2.一种由权利要求1所述奇异链霉菌BD2233制备的油悬浮剂。
3.根据权利要求2所述的油悬浮剂，其特征在于，所述油悬浮剂的乳化剂为十二烷基苯磺酸钠，增稠剂为黄原胶，分散剂为二水磷酸氢二钠，所述的油悬浮剂还包含孢子浓度为1×1012cfu/mL的奇异链霉菌BD2233。
4.如权利要求2或3中所述的油悬浮剂在箭竹腐烂病中的应用。
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