CN107435049B - 一种生产红景天苷的重组大肠杆菌及构建方法及应用 - Google Patents

一种生产红景天苷的重组大肠杆菌及构建方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107435049B
CN107435049B CN201610361309.2A CN201610361309A CN107435049B CN 107435049 B CN107435049 B CN 107435049B CN 201610361309 A CN201610361309 A CN 201610361309A CN 107435049 B CN107435049 B CN 107435049B
Authority
CN
China
Prior art keywords
escherichia coli
salidroside
strain
ugt73b6
genes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610361309.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107435049A (zh
Inventor
刘涛
毕慧萍
庄以彬
殷华
孙雪
马延和
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Original Assignee
Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS filed Critical Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority to CN201610361309.2A priority Critical patent/CN107435049B/zh
Publication of CN107435049A publication Critical patent/CN107435049A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107435049B publication Critical patent/CN107435049B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1247—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07006—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/0108—4-Hydroxyphenylpyruvate decarboxylase (4.1.1.80)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种生产红景天苷的重组大肠杆菌及构建方法及应用，构建方法为：(1)以大肠杆菌△A为出发菌株，通过基因敲除或基因沉默的方法使大肠杆菌△A染色体上的galE，galT和ugd基因不表达，得到大肠杆菌菌株BMGU；(2)向大肠杆菌菌株BMGU中导入ARO10，UGT73B6MK，pgm，galU和T7Polymerase基因，使ARO10，UGT73B6MK，pgm，galU和T7Polymerase基因过表达，异源合成红景天苷，得到一种生产红景天苷的重组大肠杆菌。本发明通过引入高效UDP葡萄糖基转移酶突变体UGT73B6MK，并对葡萄糖代谢途径进行优化，显著提高了红景天苷的产量。

Description

一种生产红景天苷的重组大肠杆菌及构建方法及应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体地，涉及一种生产红景天苷的重组大肠杆菌及构建方法及应用。
背景技术
红景天是生长在高寒无污染地带的珍稀野生植物，是我国藏族人民的习用药物，至今已有1000多年的应用历史，具有刺激神经系统、增加工作效率、消除疲劳和预防高山症等作用。除此之外，红景天还具有保护心脑血管，神经细胞以及抗肿瘤抗辐射等功能。红景天的主要药用活性成分是红景天苷及其苷元酪醇。近年来，以红景天苷作为主要原料生产的药剂、饮料、食品以及化妆品等产品种类越来越多，其苷元酪醇是一种具有重要工业价值的酚类化合物，酪醇及其衍生物是多种有机化合物的合成前体。人们对红景天苷及其苷元酪醇的关注程度不断提高。除红景天苷和酪醇外，红景天植物中还含有其它一些化学物质，例如，淫羊藿次苷D2。
红景天苷(Salidroside)具有以下特征：化学名称为2‐(4‐hydroxyphenyl)ethyl‐β‐D‐glucopyranoside，分子式为C14H20O7，分子量为300.304，CAS号为10338‐51‐9，结构式为
Figure BDA0001000902240000011
淫羊藿次苷D2(Icariside D2)具有以下特征：化学名称为p‐(2‐hydroxyethyl)‐phenol‐D‐pyranoglucoside，分子式为C14H20O7，分子量为300.31，CAS号为38954‐02‐8，结构式为
Figure BDA0001000902240000012
其苷元酪醇(Tyrosol)具有以下特征：化学名称为4‐(2‐Hydroxyethyl)phenol，分子式为C8H10O2，分子量为138.164，CAS号为501‐94‐0，结构式为
Figure BDA0001000902240000013
目前，红景天苷的生产主要是对红景天植株进行化学提取。野生红景天生长条件恶劣，植被资源稀有，而且红景天苷的量很低，如现在最常用的高山红景天和大花红景天，其植株中红景天苷的量只有0.5％‐0.8％。人工栽培的红景天成本高而有效成分量低，达不到市场要求的标准。因而植物提取正面临严峻的现实。除植物提取外，化学合成、微生物转化及组织培养生产红景天苷也是研究热点。
明海泉以酪醇和溴代四乙酰葡萄糖为原料，以Ag2CO3为催化剂，成功合成了红景天苷(明海泉，红景天苷合成及药理作用，药学通讯，1986,21(6):373)。
王梦亮等以D‐葡萄糖和酪醇为底物，探索出了一种借助于微生物合成红景天苷的方法(王梦亮，张芳，刘滇生，微生物催化D‐葡萄糖与酪醇葡糖基转移合成红景天苷的初步研究，催化学报，2006,27(3):233‐236)。
在采用组织培养方式进行红景天苷的生物合成方面，研究成果最为成熟的是Wu等用致密愈伤组织体系进行的红景天苷高产出率培养条件的研究。从高山红景天的根、茎、叶、子叶等分离体得到的相应的几种愈伤组织，并对其生长速度、红景天苷量和培养繁殖条件进行筛选，确定了生成高产出率红景天苷的最佳条件，红景天苷最高收获率可达到干重57.72mg/g，为野生植株的5～10倍(Wu S,Zu Y,Wu M High yield production ofsalidroside in the suspension culture of Rhodiola sachalinensis[J]JBiotechnol,2003,106(1):331)。
张罗红等采用硅胶柱色谱与制备型高效液相色谱，首次从红景天苷原料药中分离出了淫羊藿次苷D2，是酪醇酚羟基糖基化的产物(张罗红，彭艳，都述虎，红景天苷原料药中有关物质的分离与结构鉴定，中药与临床，2010,1(3):21‐23)。
但是化学合成工艺过程长不易操作控制，成本高，难以实现产业化；微生物转化效率较低，需要添加外源底物；植物组织培养反应周期长，效价较低。
本发明的发明人提交的名为“一种在大肠杆菌中生物合成酪醇的方法及应用”(申请号201310133238.7)的专利申请中，在大肠杆菌(Escherichia coli)中构建了一条新的不同于植物的酪醇生物合成通路，该途径利用大肠杆菌本身合成的4‐羟苯基丙酮酸，引入酵母菌的4‐羟苯基丙酮酸脱羧酶(ARO10)将其转化为4‐羟苯基乙醛(4HPAA)，4HPAA脱氢生成酪醇。本发明的发明人提交的专利申请号为：201410115011.4发明名称为：“一种高产酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2的大肠杆菌及其应用”的专利申请中，在大肠杆菌中构建了一条新的不同于植物的酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2生物合成通路，通过调控大肠杆菌酪氨酸代谢通路实现酪醇的高产：通过对aroG和tyrA基因进行点突变以分别获得tyrA*基因，aroG*基因；在敲除feaB基因基础上，进一步敲除tyrR，pykA，pykF，pheA基因；通过导入含有tyrA*，aroG*，ppsA，tktA，aroB，aroD和aroE基因的载体，使这些基因进行过表达；调控从葡萄糖到酪氨酸的代谢流，来增强酪醇的合成，构建高产红景天苷苷元酪醇的大肠杆菌表达菌株；然后通过在大肠杆菌表达菌株中表达UDP葡萄糖基转移酶UGT73B6，异源合成红景天苷及淫羊藿次苷D2，从而实现了红景天苷及淫羊藿次苷D2在大肠杆菌中的生物全合成。酪醇产量达到600mg/L，红景天苷的产量可达50mg/L，同时，该菌株还可以合成淫羊藿次苷D2，产量达40mg/L。本发明的发明人提交的专利申请号为：201510160496.3发明名称为：“催化天麻素或红景天苷合成的糖基转移酶及编码该酶的基因及应用”的专利申请中，提供了一种催化红景天苷合成的糖基转移酶UGT73B6及其突变体UGT73B6MK，能够显著提高红景天苷的产量。
上述发明已经在大肠杆菌中实现了从头合成红景天苷，但产量较低，因此，提高红景天苷的产量具有重要的科研价值及社会效益。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种能高效率地生产红景天苷的重组大肠杆菌。
本发明的第二个目的是提供一种生产红景天苷的重组大肠杆菌的构建方法。
本发明的第三个目的是提供一种生产红景天苷的重组大肠杆菌的应用。
本发明的技术方案概述如下：
一种生产红景天苷的重组大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)以大肠杆菌△A为出发菌株，通过基因敲除或基因沉默的方法使大肠杆菌△A染色体上的galE，galT和ugd基因不表达，得到大肠杆菌菌株BMGU；
(2)向大肠杆菌菌株BMGU中导入ARO10，UGT73B6MK，pgm，galU和T7Polymerase基因，使ARO10，UGT73B6MK，pgm，galU和T7Polymerase基因过表达，异源合成红景天苷，得到一种生产红景天苷的重组大肠杆菌BMGU‐1。
上述方法构建的生产红景天苷的重组大肠杆菌BMGU-1。
上述生产红景天苷的重组大肠杆菌在发酵生产酪醇、红景天苷和淫羊藿次苷D2的用途。
本发明通过引入高效UDP葡萄糖基转移酶突变体UGT73B6MK，并对葡萄糖代谢途径进行优化，显著提高了红景天苷的产量。
附图说明
图1为本发明的在大肠杆菌表达菌株中生物合成酪醇、红景天苷及淫羊藿次苷D2的途径示意图；
图2为菌株BMGU‐1(pETDuet‐ARO10‐UGT73B6MK&pBbA5c‐T7Pol‐lac pgm‐lacgalU)的摇瓶小摇发酵产物以及酪醇和红景天苷标准品的HPLC结果。其中，1是红景天苷和酪醇的标准品，2是菌株BMGU‐0(pETDuet1&pBbA5c‐T7Pol)发酵液，3是菌株BMGU‐1(pETDuet‐ARO10‐UGT73B6MK&pBbA5c‐T7Pol‐lac pgm‐lac galU)发酵液。
图3为菌株BMGU‐1(pETDuet‐ARO10‐UGT73B6MK&pBbA5c‐T7Pol‐lac pgm‐lacgalU)的发酵罐高密度发酵产物HPLC检测结果。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
以大肠杆菌△A(参照中国专利，专利申请号：201410115011.4.)为出发菌株，通过基因敲除或基因沉默的方法使大肠杆菌△A染色体上的galE(GenBank：U00096.3(791,039..792,055))，galT(GenBank：U00096.3(789,983..791,029))和ugd(GenBank：AAC75089.1)基因不表达，得到大肠杆菌菌株BMGU；
向大肠杆菌菌株BMGU中导入ARO10(GenBank：GeneID:851987)UGT73B6MK(SEQ IDNo：2)，pgm(Genbank：U00096.3(713,558..715,198))，galU(Genbank：U00096.3(1,291,457..1,292,365))和T7Polymerase(Genbank：M38308.1)基因，使ARO10，UGT73B6MK，pgm，galU和T7Polymerase基因过表达，异源合成红景天苷，得到一种生产红景天苷的大肠杆菌。
本发明中，
基因ARO10为由酪氨酸合成酪醇过程中的相关基因，可以来自酵母。
基因UGT73B6为由酪醇合成红景天苷及淫羊藿次苷D2过程中的相关基因，可以来自红景天植物。
优选地，ARO10和UGT73B6分别为来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的苯丙酮酸脱羧酶基因ScARO10(GenBank：GeneID:851987)和来自红景天(Rhodiolasachalinensis)的UDP‐葡萄糖基转移酶RsUGT73B6(GenBank：AY547304)。
优选的，为了提高UGT73B6的表达量，还可以其进行大肠杆菌密码子偏好性优化，优化后的UGT73B6基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。优选的，为了提高UGT73B6的催化效率，还可以对其进行定向进化，进化后的UGT73B6MK基因的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。
本发明中，需要说明的是，所述利用葡萄糖生产红景天苷的重组大肠杆菌表达菌株含有并能够表达ARO10，UGT73B6MK，pgm，galU和T7Polymerase基因，是指大肠杆菌在发酵培养时，上述ARO10，UGT73B6MK，pgm，galU和T7Polymerase基因能被翻译为相应的蛋白，并使相应蛋白发挥其作用。
本发明中，对基因敲除或基因沉默的方法没有特殊要求，可以为能够应用于大肠杆菌进敲除或基因沉默的各种方法。对表达载体的种类没有特殊要求，可以为能够在大肠杆菌中表达目的基因的本领域常用的各种表达载体，例如质粒等。本领域技术人员应该理解的是，表达载体的构建方法可以采用本领域常用的各种方法，如将目的基因经过酶切处理后连接至载体中，在此不再赘述。
以下实施例中，大肠杆菌菌株MG1655，BL21(DE3)和DH5α均可市售获得，大肠杆菌菌株MG1655用于本发明中所有基因的表达，BL21(DE3)用于T7Polymerase基因扩增，DH5α用于载体构建。
大肠杆菌表达载体pBbA5c-MCS为本发明人自行构建，构建过程参见参照中国专利，专利申请号：201410115011.4。大肠杆菌表达载体pETDuet-1，购自Novagen，大肠杆菌表达载体pET28a购自Invitrogen，基因敲除载体pKD46，pKD4和pCP20购自普如汀生物技术(北京)有限公司。
Phusion高保真DNA聚合酶购自Thermo公司。
LB培养基，M9培养基配方参见《分子克隆实验指南》。改良LB培养基配方如下：Yeast extract 20g/L，Tryptone 15g/L，Nacl 10g/L，甘油30g/L。M9Y培养基配方如下：M9基本培养基+0.025％yeast extract+微量元素30ml。
下列实施例中未注明具体条件的试验方法，按照常规条件进行，例如《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照相应生物学试剂的制造厂商所建议的条件。
实施例1
基因UGT73B6MK及大肠杆菌表达载体pET28a‐UGT73B6MK获得
参照中国专利(专利申请号201510160496.3)催化天麻素或红景天苷合成的糖基转移酶及编码该酶的基因及应用，对UGT73B6(SEQ ID No：1，该序列文献已报道，来源于植物库页红景天Rhodiola sachalinensis)，进行error‐PCR随机突变，将得到的片段酶切连接到商业化载体pET28a中，之后经定向进化筛选(Richard W.Gantt,Pauline Peltier‐Pain,Shanteri Singh,Maoquan Zhou,and Jon S.Thorson,Broadening the scope ofglycosyltransferase‐catalyzed sugar nucleotide synthesis,PNAS,2013,110(19):7648‐7653；Gavin J.Williams,Randal D.Goff,Changsheng Zhang,and Jon S.Thorson,Optimizing glycosyltransferase specificity via‘hot spot’saturationmutagenesis presents a new catalyst for novobiocin glycorandomization,ChemBiol.2008,15(4):393‐409)，获得含突变基因UGT73B6MK的大肠杆菌表达载体pET28a‐UGT73B6MK。具体的糖基转移酶UGT73B6MK第264位甲硫氨酸突变为赖氨酸，得到催化天麻素或红景天苷合成的糖基转移酶的核苷酸序列为SEQ ID No：2，相应的碱基由atg突变为aag(该序列的最后3个核苷酸为终止密码子)。
在上述步骤中，error‐PCR扩增反应的反应程序可以为常规的PCR扩增反应程序，例如可以为：95℃预变性5分钟；98℃变性20秒，56℃退火45秒，72℃延伸2分钟，30个循环；72℃延伸5分钟。
实施例2
大肠杆菌表达载体pETDuet‐ARO10‐UGT73B6MK&pBbA5c‐T7Pol‐lac pgm‐lac galU，该载体的制备方法优选包括以下步骤：
(a)参照中国专利(专利申请号：201410115011.4.)，毕慧萍，白艳芬等，一种高产酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2的大肠杆菌表达菌株及其应用，以引物aro‐5FPNco(SEQ ID No：3)/aro‐3RPSac(SEQ ID No：4)为引导，以酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)S288C的基因组DNA为模板进行PCR，扩增得到ARO10的ORF，扩增产物经NcoI和SacI酶切后连入经NcoI和SacI酶切的质粒pETDuet‐1中，构建得到质粒pETDuet‐ARO10。以及中国专利(专利申请号201510160496.3)催化天麻素或红景天苷合成的糖基转移酶及编码该酶的基因及应用，以质粒pET28a‐ugt73b6MK为模板，经NdeI和BamHI酶切后连入经NdeI和BglII酶切的质粒pETDuet‐ARO10中(BamHI和BglII为同尾酶)，得到大肠杆菌表达载体pETDuet‐ARO10‐UGT73B6MK。
(b)以大肠杆菌BL21(DE3)基因组DNA为模板，以引物T7Pol‐5FPEco(SEQ ID No：5)/T7Pol‐3RPPst(SEQ ID No：6)扩增T7Polymerase基因片段，EcoRI和PstI双酶切连接入经过EcoRI和PstI双酶切的表达载体pBbA5c‐MCS，得到载体pBbA5c‐T7Pol。表达载体pBbA5c‐MCS的构建参照中国专利(专利申请号：201410115011.4.)，毕慧萍，白艳芬等，一种高产酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2的大肠杆菌表达菌株及其应用。以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模板，以引物pgm‐5FPEco(SEQ ID No：7)/pgm‐3RPNot(SEQ ID No：8)扩增pgm基因片段，EcoRI和NotI双酶切连接入经过EcoRI和NotI双酶切的表达载体pBbA5c‐MCS，得到载体pBbA5c‐pgm。以引物lacpgm‐5FPPst(SEQ ID No：9)/pgm‐3RPNot(SEQ ID No：8)扩增得到lac pgm片段，PstI/NotI双切，将lac pgm片段连入PstI/NotI双切的pBbA5c‐T7Pol载体上，得到载体pBbA5c‐T7Pol‐lac pgm。以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模板，以引物galU‐5FPEco(SEQ ID No：10)/galU‐3RPPac(SEQ ID No：11)扩增galU基因片段，EcoRI和PacI双酶切连接入经过EcoRI和PacI双酶切的表达载体pBbA5c‐MCS，得到载体pBbA5c‐galU。以引物lacgalU‐5FPNot(SEQ ID No：12)/lacgalU‐3RPPac(SEQ ID No：11)为引物扩增得到lac galU片段，用NotI/PacI双切，将lac galU片段连入pBbA5c‐T7Pol‐pgm载体上，得到大肠杆菌表达载体pBbA5c‐T7Pol‐lac pgm‐lac galU。
实施例3
本实施例用于说明大肠杆菌菌株BMGU的构建
(1)根据本发明，使大肠杆菌染色体上的feaB，tyrR，pykA，pykF，pheA，galE，galT和ugd基因不表达的方法可以为本领域常规的方法，例如，可以通过基因敲除的方法进行，也可以通过基因沉默的方法进行。本发明优选通过基因敲除的方法进行。本发明中，对基因敲除的方法没有特殊要求，可以为能够在大肠杆菌中进行基因敲除的各种方法，如利用λRed基因敲除系统。参照中国专利(专利申请号：201410115011.4.)，毕慧萍，白艳芬等，一种高产酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2的大肠杆菌表达菌株及其应用，以大肠杆菌△A为出发菌株，质粒pKD46(温度敏感型，含有受阿拉伯糖启动子调控的exo、bet和gam基因，Ampr)、pKD4(含有两端带有FRT位点的卡那抗性基因，Kanr)、pCP20(温度敏感型，编码能够识别FRT位点的FLP重组酶，Ampr)均为市售。
(2)引物galE‐5FPL(SEQ ID No：13)/galT‐3RPL(SEQ ID No：14)用于扩增pKD4中Kan基因以替换galE和galT基因编码区；引物galEGD‐5FP(SEQ ID No：15)/galTGD‐3RP(SEQID No：16)为galE‐galT基因敲除后重组菌鉴定引物，两条引物各位于打靶序列区的左右两侧。PCR反应体系为：5×PCR buffer，10μL；dNTP(2mM each)，5μL；引物galE‐5FPL/galT‐3RPL(10μM)，各2μL；Phusion high‐fidelity DNA polymerase(5U/μL)，0.5μL；pKD4，50ng；ddH2O补足体系到50μL。反应程序为：初始变性98℃30sec；98℃8sec，55℃30sec，72℃30sec，30个循环；终延伸72℃10min。得到打靶分子DNA片段。
(3)将过夜培养12h的含有pKD46的大肠杆菌△A按1:100的量接种，振荡培养至OD600值约为0.2，加入终浓度为100mmol/L的阿拉伯糖继续培养至OD600为0.5‐0.6。制备电转感受态，取50μL感受态菌液与约200ng的打靶分子DNA片段进行电转化。电击后立即加入1mL LB液体培养液，37℃，振荡培养2h，涂布于LB平板(Kanr)筛选阳性克隆。随后第二轮体内重组过程中，将编码FLP位点特异性重组酶的质粒pCP20转入galE‐galT敲除菌株中，将Kan抗性基因剔除。然后37℃培养，丢掉pCP20。利用引物galEGD‐5FP/galTGD‐3RP进行PCR验证，得到galE‐galT基因敲除的大肠杆菌。
用同样的方法将ugd基因敲除掉，得到敲除基因feaB，tyrR，pykF，pykA，pheA，galE，galT和ugd的大肠杆菌菌株BMGU。用于敲除ugd的引物如SEQ ID No：17和SEQ ID No：18所示，验证引物如SEQ ID No：19和SEQ ID No：20所示。
实施例4
将实施例2中所述载体pETDuet‐ARO10‐UGT73B6MK和pBbA5c‐T7Pol‐lac pgm‐lacgalU用电转化的方法转化实施例3中大肠杆菌菌株BMGU，得到重组大肠杆菌菌株BMGU‐1(pETDuet‐ARO10‐UGT73B6MK&pBbA5c‐T7Pol‐lac pgm‐lac galU)；
(a)大肠杆菌菌株BMGU电转化感受态细胞的制备
挑取大肠杆菌菌株BMGU单克隆菌落，于4ml LB液体培养基中37℃220rpm过夜培养12‐14h，按照2％的接种率转接至50ml LB液体培养基中，37℃220rpm培养至OD600 0.4‐0.6。将菌液在冰上预冷30min。同时，开启离心机，预冷至4℃。将菌液转移到50ml预冷的离心管中，4℃，4000rpm离心min。弃上清，先用少量(如5‐10ml)灭菌的冰水轻轻重悬沉淀的细胞团，然后加水至50ml，轻轻并充分悬起细胞，4℃，4000rpm离心min。弃上清液，加少量灭菌水，重悬菌体，再加水至25ml充分悬起细胞，4℃，4000rpm离心min。重复上一步骤一次。弃上清，剩余1ml时充分悬起细胞，转移至1.5ml离心管中，12000rpm离心30s，弃上清，100ul冰水充分悬起细胞，为保持较高的转化率，电转感受态细胞最好现制现用。
(b)将1ul pETDuet‐ARO10‐UGT73B6MK以及2ul pBbA5c‐T7Pol‐lac pgm‐lac galU加至感受态细胞中，轻轻混匀，转移至2mm电击杯中，冰上放置2‐5min，2500V电压进行电击转化，转化后加入1ml LB液体培养基37℃220rpm复苏40min，然后将菌液涂布在25mg/L氯霉素和100mg/L氨苄青霉素的LB平板上。利用氯霉素和氨苄青霉素抗性筛选携带表达载体的转化菌株BMGU‐1(pETDuet‐ARO10‐UGT73B6MK&pBbA5c‐T7Pol‐lac pgm‐lac galU)，并通过提取质粒进行酶切验证，得到BMGU‐1(pETDuet‐ARO10‐UGT73B6MK&pBbA5c‐T7Pol‐lac pgm‐lacgalU)。
实施例5
菌株BMGU‐1(pETDuet‐ARO10‐UGT73B6MK&pBbA5c‐T7Pol‐lac pgm‐lac galU)的发酵培养
将菌株BMGU‐1(pETDuet‐ARO10‐UGT73B6MK&pBbA5c‐T7Pol‐lac pgm‐lac galU)在4mL加入有25mg/L氯霉素和100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养12小时，得到种子液。
然后将种子液按2％的转接量(1ml)分别转接入50mL加入有25mg/L氯霉素和100mg/L氨苄青霉素的改良LB液体培养基中，37℃，220rpm培养至OD600为0.6‐0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG(异丙基‐β‐D‐硫代吡喃半乳糖苷)，16℃诱导15h，16℃4000rm离心得到菌体，用50ml M9Y培养基重悬菌体，30℃继续培养60h。
摇瓶小摇发酵结果为酪醇1.1g/L，红景天苷331.8mg/L，淫羊藿次苷D2 357.6mg/L。
实施例6
菌株BMGU‐1(pETDuet‐ARO10‐UGT73B6MK&pBbA5c‐T7Pol‐lac pgm‐lac galU)的高密度发酵培养
挑取1个克隆，入含有50mL改良LB液体培养基的250mL三角瓶中(5瓶)，37℃，200rpm，过夜培养(12h)，测OD，收集到500mL三角瓶，作为种子液。
火焰接种入发酵罐，含有5L改良LB液体培养基，25mg/L氯霉素和100mg/L氨苄青霉素。温度控制37℃，溶氧控制在30％，与转速偶联，pH值控制7.0左右。
OD600＝6左右，进行降温，待温度降到16℃，OD估计8左右，添加0.1mM IPTG，进行蛋白低温诱导。诱导15-16h后，离心，菌体用4L改良M9培养基重悬，30℃继续培养，发酵产酸用5M氨水调节pH值，流加葡萄糖。发酵时间48-60h。
5L发酵罐发酵结果为酪醇2.2g/L，红景天苷0.7g/L，淫羊藿次苷D2 0.8g/L。
对比例1
本对比例大肠杆菌表达菌株BMGU‐0(pETDuet‐1&pBbA5c‐T7Pol)的发酵培养
将质粒pETDuet‐1&pBbA5c‐T7Pol共同电击转化大肠杆菌表达菌株BMGU，得到菌株BMGU‐0(pETDuet‐1&pBbA5c‐T7Pol)。将菌株BMGU‐0(pETDuet‐1&pBbA5c‐T7Pol)分别在4mL加入有25mg/L氯霉素和100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养12小时，得到种子液。
然后将种子液按2％的转接量(1ml)分别转接入50mL加入有25mg/L氯霉素和100mg/L氨苄青霉素的改良LB液体培养基中，37℃，220rpm培养至OD600为0.6‐0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，16℃诱导15h，16℃4000rm离心得到菌体，用50ml M9培养基重悬菌体，30℃继续培养60h。
测试例1
酪醇和红景天苷的检测
产物的HPLC检测：分别取实施例5，对比例1获得的发酵液各1mL，12000rpm离心10min后，取上清，进行HPLC分析检测。分析条件如下：仪器为：安捷伦液相色谱仪，测定条件包括：C18柱(4.6×250mm)；检测波长224nm；流动相A＝水(含0.1％体积甲酸)，B＝甲醇；流速＝1mL/min；梯度洗脱条件：0–35min 10％体积B；进样量50μL。
标准品及发酵液的HPLC检测结果见图2。其中，
1是红景天苷和酪醇的标准品，
2是菌株BMGU‐0(pETDuet1&pBbA5c‐T7Pol)发酵液，
3是菌株BMGU‐1(pETDuet‐ARO10‐UGT73B6MK&pBbA5c‐T7Pol‐lac pgm‐lac galU)发酵液。
如图所示，菌株BMGU‐1(pETDuet‐ARO10‐UGT73B6MK&pBbA5c‐T7Pol‐lac pgm‐lacgalU)的发酵液中在9min时均存在一个峰，与红景天苷标准品(峰Ⅰ)的出峰时间一致；红景天苷的产量为331.8mg/L，相比于中国专利(专利申请号：201410115011.4.)，毕慧萍，白艳芬等，“一种高产酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2的大肠杆菌表达菌株及其应用”中红景天苷的产量50mg/L提高了约5.6倍。
测试例2
酪醇和红景天苷的检测
产物的HPLC检测：取实施例6获得的发酵液1mL，12000rpm离心10min后，取上清，稀释1倍，进行HPLC分析检测。分析条件如下：仪器为：安捷伦液相色谱仪，测定条件包括：C18柱(4.6×250mm)；检测波长224nm；流动相A＝水(含0.1％体积甲酸)，B＝甲醇；流速＝1mL/min；梯度洗脱条件：0–35min 10％体积B；进样量10μL。发酵液的HPLC检测结果见图3。其中，红景天苷的产量为0.7g/L，淫羊藿次苷D2产量为0.8g/L，酪醇产量为2.2g/L。
Figure IDA0001000902320000011
Figure IDA0001000902320000021
Figure IDA0001000902320000031
Figure IDA0001000902320000041
Figure IDA0001000902320000051
Figure IDA0001000902320000061
Figure IDA0001000902320000071

Claims (3)

1.一种生产红景天苷的重组大肠杆菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：
(1)以大肠杆菌△A为出发菌株，通过基因敲除或基因沉默的方法使大肠杆菌△A染色体上的galE，galT和ugd基因不表达，得到大肠杆菌菌株BMGU；
(2)向大肠杆菌菌株BMGU中导入ARO10，UGT73B6MK，pgm，galU和T7Polymerase基因，使ARO10，UGT73B6MK，pgm，galU和T7Polymerase基因过表达，异源合成红景天苷，得到一种生产红景天苷的重组大肠杆菌；所述大肠杆菌△A是通过基因敲除或基因沉默使大肠杆菌菌株feaB，tyrR，pykA，pykF，pheA基因不表达获得；所述UGT73B6MK的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示；所述大肠杆菌△A的保藏编号为：CGMCC No.8897。
2.权利要求1的方法构建的生产红景天苷的重组大肠杆菌。
3.权利要求2的生产红景天苷的重组大肠杆菌在发酵生产酪醇、红景天苷和淫羊藿次苷D2的用途。
CN201610361309.2A 2016-05-26 2016-05-26 一种生产红景天苷的重组大肠杆菌及构建方法及应用 Active CN107435049B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610361309.2A CN107435049B (zh) 2016-05-26 2016-05-26 一种生产红景天苷的重组大肠杆菌及构建方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610361309.2A CN107435049B (zh) 2016-05-26 2016-05-26 一种生产红景天苷的重组大肠杆菌及构建方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107435049A CN107435049A (zh) 2017-12-05
CN107435049B true CN107435049B (zh) 2020-03-31

Family

ID=60453530

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610361309.2A Active CN107435049B (zh) 2016-05-26 2016-05-26 一种生产红景天苷的重组大肠杆菌及构建方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107435049B (zh)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109988722B (zh) * 2017-12-29 2020-11-24 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种重组酿酒酵母菌株及其应用和生产酪醇和/或红景天苷的方法
CN108998460B (zh) * 2018-07-10 2021-10-15 天津大学 一种红景天苷的生物生产方法
CN108998459B (zh) * 2018-07-10 2021-11-23 天津大学 一种淫羊藿次苷d2的生物生产方法
CN110452865B (zh) * 2019-08-15 2021-05-28 江南大学 一种产酪醇的重组大肠杆菌及其构建方法和应用
US11286475B2 (en) 2019-08-15 2022-03-29 Jiangnan University Tyrosol-producing recombinant Escherichia coli and construction method and application thereof
CN113025541B (zh) * 2019-12-24 2022-08-12 北京化工大学 合成水杨苷的工程菌及其构建方法和应用
CN111763663B (zh) * 2020-07-09 2022-04-15 昆明理工大学 一种天麻葡糖基转移酶基因及应用
CN112501194A (zh) * 2020-12-14 2021-03-16 重庆大学 生产羟基红景天苷的重组质粒和基因工程菌及其运用
CN114032222B (zh) * 2021-05-17 2022-06-28 中国科学院天津工业生物技术研究所 糖链延伸糖基转移酶突变体及其编码基因以及基因工程菌和它们的应用
CN114736918B (zh) * 2022-03-23 2023-08-25 江南大学 一种整合表达生产红景天苷的重组大肠杆菌及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104099379A (zh) * 2013-04-08 2014-10-15 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种在大肠杆菌中生物合成酪醇的方法及应用
CN104774815A (zh) * 2015-04-07 2015-07-15 中国科学院天津工业生物技术研究所 催化天麻素或红景天苷合成的糖基转移酶及编码该酶的基因及应用
CN104846000A (zh) * 2015-05-21 2015-08-19 中国科学院天津工业生物技术研究所 利用葡萄糖生产对羟基苄醇或天麻素的重组大肠杆菌及用途
CN104946575A (zh) * 2014-03-26 2015-09-30 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种高产酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷d2的大肠杆菌表达菌株及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104099379A (zh) * 2013-04-08 2014-10-15 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种在大肠杆菌中生物合成酪醇的方法及应用
CN104946575A (zh) * 2014-03-26 2015-09-30 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种高产酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷d2的大肠杆菌表达菌株及其应用
CN104774815A (zh) * 2015-04-07 2015-07-15 中国科学院天津工业生物技术研究所 催化天麻素或红景天苷合成的糖基转移酶及编码该酶的基因及应用
CN104846000A (zh) * 2015-05-21 2015-08-19 中国科学院天津工业生物技术研究所 利用葡萄糖生产对羟基苄醇或天麻素的重组大肠杆菌及用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Enhanced exopolysaccharide production by metabolic engineering of Streptococcus thermophilus;Levander 等;《Appl Environ Microbiol》;20020228(第2期);第784-790页 *
红景天苷的提取分离、生物合成与生物活性研究进展;魏平平 等;《时珍国医国药》;20080831;第19卷(第6期);第13201323页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107435049A (zh) 2017-12-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107435049B (zh) 一种生产红景天苷的重组大肠杆菌及构建方法及应用
CN111712570B (zh) 一种生产阿洛酮糖及其衍生物的工程菌株及其构建方法和应用
CN104946575B (zh) 一种高产酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷d2的大肠杆菌表达菌株及其应用
CN111575220B (zh) 合成2’-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及其构建方法与应用
EP3808836A1 (en) Yeast for producing tyrosol and hydroxytyrosol and construction method
JP6337013B2 (ja) テルペノイドを調製するための組換え微生物、及び組換え微生物の構築方法
CN109988722B (zh) 一种重组酿酒酵母菌株及其应用和生产酪醇和/或红景天苷的方法
CN104099379A (zh) 一种在大肠杆菌中生物合成酪醇的方法及应用
Xue et al. Functional expression of an Arabidopsis p450 enzyme, p-coumarate-3-hydroxylase, in the cyanobacterium Synechocystis PCC 6803 for the biosynthesis of caffeic acid
CN112813013B (zh) 一种生产羟基酪醇的重组大肠杆菌及其应用
CN107460203B (zh) 一种产红景天苷及其类似物的重组菌及构建方法及用途
CN114207108A (zh) 产生糖基化大麻素的基因修饰的宿主细胞
CN113755354A (zh) 利用葡萄糖生产天麻素的重组酿酒酵母及其用途
WO2023208146A1 (zh) 生物合成麦角硫因的方法及载体
CN110982720A (zh) 产达玛烯二醇和原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌及用途
CN109957555B (zh) 一种糖基转移酶突变体及其在催化天麻素生物合成中的应用
CN112592880A (zh) 一种产假尿苷工程菌及其应用
CN110117582B (zh) 融合蛋白、其编码基因及在生物合成上的应用
CN112375723B (zh) 生产马来酸的工程菌及其构建方法和应用
CN112080452B (zh) 一种高产苯乳酸地衣芽孢杆菌基因工程菌、生产苯乳酸的方法和应用
CN107460152B (zh) 产红景天苷及其类似物的重组菌、构建方法及用途
CN111943996B (zh) 络塞维类似物及生产该络塞维类似物的基因工程菌和其应用
CN110317765B (zh) 一种高产香叶醇葡萄糖苷的大肠杆菌表达菌株及其应用
CN114891707B (zh) 重组菌株及其全细胞催化生产胆红素的方法
CN116355820A (zh) 一种高产麦角硫因工程菌株及其生产麦角硫因的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant