CN104946575B

CN104946575B - 一种高产酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷d2的大肠杆菌表达菌株及其应用

Info

Publication number: CN104946575B
Application number: CN201410115011.4A
Authority: CN
Inventors: 毕慧萍; 白艳芬; 庄以彬; 刘涛; 马延和
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2014-03-26
Filing date: 2014-03-26
Publication date: 2017-11-14
Anticipated expiration: 2034-03-26
Also published as: CN104946575A

Abstract

本发明涉及一种高产酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2的大肠杆菌表达菌株及其应用，其中，该大肠杆菌表达菌株不表达feaB，tyrR，pykA，pykF，pheA基因，含有并能够表达如SEQ ID No：1所示的tyrA*基因，如SEQ ID No：2所示的aroG*基因，以及ppsA，tktA，aroB，aroD，aroE和ARO10基因。本发明的在大肠杆菌表达菌株中生物合成酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2的方法，酪醇的产量可达600mg/L，红景天苷的产量可达50mg/L，淫羊藿次苷D2的产量可达40mg/L，是一种高产酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2的新的生物合成途径，为酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2的大规模工业生产奠定了基础，具有重要的经济价值和社会效益。

Description

一种高产酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2的大肠杆菌表达菌株及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地，涉及一种高产酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2的大肠杆菌表达菌株，以及所述大肠杆表达菌中生物合成酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2中的应用。

背景技术

红景天是生长在高寒无污染地带的珍稀野生植物，是我国藏族人民的习用药物，至今已有1000多年的应用历史，具有刺激神经系统、增加工作效率、消除疲劳和预防高山症等作用。除此之外，红景天还具有保护心脑血管，神经细胞以及抗肿瘤抗辐射等功能。红景天的主要药用活性成分是红景天苷及其苷元酪醇。近年来，以红景天苷作为主要原料生产的药剂、饮料、食品以及化妆品等产品种类越来越多，其苷元酪醇是一种具有重要工业价值的酚类化合物，酪醇及其衍生物是多种有机化合物的合成前体。人们对红景天苷及其苷元酪醇的关注程度不断提高。除红景天苷和酪醇外，红景天植物中还含有其它一些化学物质，例如，淫羊藿次苷D2。

红景天苷（Salidroside）具有以下特征：化学名称为2-(4-hydroxyphenyl)ethyl-β-D-glucopyranoside，分子式为C₁₄H₂₀O₇，分子量为300.304，CAS号为10338-51-9，结构式为淫羊藿次苷D2（Icariside D2）具有以下特征：化学名称为p-(2-hydroxyethyl)-phenol-D-pyranoglucoside，分子式为C₁₄H₂₀O₇，分子量为300.31，CAS号为38954-02-8，结构式为其苷元酪醇（Tyrosol）具有以下特征：化学名称为4-(2-Hydroxyethyl)phenol，分子式为C₈H₁₀O₂，分子量为138.164，CAS号为501-94-0，结构式为

目前，红景天苷的生产主要是对红景天植株进行化学提取。野生红景天生长条件恶劣，植被资源稀有，而且红景天苷的量很低，如现在最常用的高山红景天和大花红景天，其植株中红景天苷的量只有0.5%-0.8%。人工栽培的红景天成本高而有效成分量低，达不到市场要求的标准。因而化学提取正面临严峻的现实。除化学提取外，化学合成、微生物转化及组织培养生产红景天苷也是研究热点。

明海泉以酪醇和溴代四乙酰葡萄糖为原料，以Ag₂CO₃为催化剂，成功合成了红景天甙（明海泉，红景天甙合成及药理作用，药学通讯，1986,21(6):373）。

本发明的发明人提交的名为“一种在大肠杆菌中生物合成酪醇的方法及应用”（申请号201310133238.7）的专利申请中，在大肠杆菌（Escherichia coli）中构建了一条新的不同于植物的酪醇生物合成通路，该途径利用大肠杆菌本身合成的4-羟苯基丙酮酸，引入酵母菌的4-羟苯基丙酮酸脱羧酶（ARO10）将其转化为4-羟苯基乙醛（4HPAA)，4HPAA脱氢生成酪醇。

王梦亮等以D-葡萄糖和酪醇为底物，探索出了一种借助于微生物合成红景天甙的方法（王梦亮，张芳，刘滇生，微生物催化D-葡萄糖与酪醇葡糖基转移合成红景天甙的初步研究，催化学报，2006,27(3):233-236）。

在采用组织培养方式进行红景天苷的生物合成方面，研究成果最为成熟的是Wu等用致密愈伤组织体系进行的红景天苷高产出率培养条件的研究。从高山红景天的根、茎、叶、子叶等分离体得到的相应的几种愈伤组织，并对其生长速度、红景天苷量和培养繁殖条件进行筛选，确定了生成高产出率红景天苷的最佳条件，红景天苷最高收获率可达到干重57.72mg/g，为野生植株的5～10倍（Wu S,Zu Y,Wu M High yield production ofsalidroside in the suspension culture of Rhodiola sachalinensis[J]JBiotechnol,2003,106(1):331）。

张罗红等采用硅胶柱色谱与制备型高效液相色谱，首次从红景天苷原料药中分离出了淫羊藿次苷D2，是酪醇酚羟基糖基化的产物（张罗红，彭艳，都述虎，红景天苷原料药中有关物质的分离与结构鉴定，中药与临床，2010,1(3):21-23）。

但是化学合成工艺过程长不易操作控制，成本高，难以实现产业化；微生物转化效率较低，需要添加外源底物；植物组织培养反应周期长，效价较低。至今还没有红景天苷微生物从头合成的相关报道。淫羊藿次苷D2在红景天中含量较红景天苷更低，至今也没有任何生物合成的报道。因此，实现红景天苷及淫羊藿次苷D2的微生物体内生物全合成途径具有重要的科研价值及社会效益。

发明内容

本发明的目的是为了克服上述缺陷，提供一种高产酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2的大肠杆菌及其应用。

本发明的发明人在研究中发现，可以通过调控大肠杆菌酪氨酸代谢通路实现酪醇的高产：通过对aroG和tyrA基因进行点突变以分别获得如SEQ ID No：1所示的tyrA*基因，如SEQ ID No：2所示的aroG*基因；在敲除feaB基因基础上，进一步敲除tyrR，pykA，pykF，pheA基因；通过导入含有tyrA*，aroG*，ppsA，tktA，aroB，aroD和aroE基因的载体，使这些基因进行过表达；调控从葡萄糖到酪氨酸的代谢流，来增强酪醇的合成，构建高产红景天苷苷元酪醇的大肠杆菌表达菌株；然后通过在大肠杆菌表达菌株中表达UDP葡萄糖基转移酶UGT73B6，异源合成红景天苷及淫羊藿次苷D2，从而实现红景天苷及淫羊藿次苷D2在大肠杆菌中的生物全合成。

基于此，一方面，本发明提供了一种大肠杆菌表达菌株，其中，所述大肠杆菌表达菌株不表达feaB，tyrR，pykA，pykF，pheA基因，含有并能够表达如SEQ ID No：1所示的tyrA*基因，如SEQ ID No：2所示的aroG*基因，以及ppsA，tktA，aroB，aroD，aroE和ARO10基因。

优选地，所述大肠杆菌表达菌株还含有并能够表达UGT73B6基因，保藏编号为CGMCC No.8897，。

另一方面，本发明还提供了如上所述的大肠杆菌表达菌株在生物合成酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2，和/或在制备含有酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2的产品中的应用。

再一方面，本发明还提供了一种在大肠杆菌中生物合成酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2的方法，其中，该方法包括：将如上所述的大肠杆菌表达菌株进行发酵培养，使其生物合成酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2。

大肠杆菌作为最简单的模式生物，其背景清晰，生长快速，易于规模化发酵培养，成本低廉；而且本发明通过构建新的酪醇合成通路，调控从葡萄糖到酪氨酸的代谢流，得到高产红景天苷苷元酪醇的大肠杆菌，酪醇产量达到600mg/L；进一步引入UDP葡萄糖基转移酶，将红景天苷与酪醇的生物合成途径有机地结合在一起，能够显著提高红景天苷的产量，可达50mg/L，同时，该菌株还可以合成淫羊藿次苷D2，产量达40mg/L。本发明提供了一种高效高产酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2的新的生产途径，也为酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2的大规模工业生产奠定了基础，具有重要的经济价值和社会效益。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

生物保藏

本发明的大肠杆菌表达菌株△A(ARO10和UGT73B6)，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，于2014年03月05日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.8897。

附图说明

图1为本发明的在大肠杆菌表达菌株中生物合成酪醇、红景天苷及淫羊藿次苷D2的途径示意图；

图2为菌株△A（ARO10）和△A（ARO10和UGT73B6）的发酵产物以及酪醇和红景天苷标准品的HPLC结果，其中，1是酪醇和红景天苷的标准品混合样，2是△A（ARO10）的发酵产物，3是△A（ARO10和UGT73B6）的发酵产物，峰Ⅰ为酪醇峰，峰Ⅱ为红景天苷峰，峰Ⅲ为淫羊藿次苷D2峰。

图3为菌株△A（ARO10和UGT73B6）发酵产物的HPLC红景天苷峰（峰Ⅱ）及淫羊藿次苷D2峰（峰Ⅲ）的MS图谱。

图4为菌株△A（ARO10和UGT73B6）发酵产物的红景天苷峰（峰Ⅱ）（图4-1）及淫羊藿次苷D2峰（峰Ⅲ）（图4-2）的NMR-H图谱。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

一方面，本发明提供了一种大肠杆菌表达菌株，其中，所述大肠杆菌表达菌株不表达feaB，tyrR，pykA，pykF，pheA基因，含有并能够表达如SEQ ID No：1所示的tyrA*基因，如SEQ ID No：2所示的aroG*基因，以及ppsA，tktA，aroB，aroD，aroE和ARO10基因。

根据本发明，当本发明的大肠杆菌菌株还含有并能够表达UGT73B6基因的情况下，能够有效地进行红景天苷及淫羊藿次苷D2的表达，因此，优选地，本发明的大肠杆菌表达菌株还含有并能够表达UGT73B6基因，保藏编号为CGMCC No.8897。

本发明中，基因feaB，tyrR，pykA，pykF，pheA，以及aroG，tyrA，ppsA，tktA，aroB，aroD，aroE为酪氨酸代谢途径的相关基因，分别为苯乙醛脱氢酶基因feaB（GenBank:U00096.3(1,447,519..1,449,018)）、酪氨酸调节蛋白基因tyrR（GenBank:U00096.3(1,386,720..1,388,261)）、丙酮酸激酶基因A pykA（GenBank:U00096.3(1,386,720..1,388,261)）、丙酮酸激酶基因F pykF（GenBank:U00096.3(1,755,698..1,757,110)）、分支酸变位酶及预苯酸脱水酶基因pheA（GenBank:U00096.3(2,737,745..2,738,905)）、分支酸变位酶T及预苯酸脱氢酶双功能酶基因tyrA（GenBank：U00096.3(2,738,948..2,740,069)）、3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate（DAHP）合酶基因aroG（GenBank：U00096.3(1,386,720..1,388,261)）、磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因ppsA（GenBank：U00096.3(1,784,734..1,787,112)）、转酮醇酶A基因tktA（GenBank：U00096.3(3,079,644..3,081,635)）、3-脱氢奎尼酸合成酶基因aroB（GenBank：U00096.3(3,517,398..3,518,486)）、3-脱氢奎尼酸脱水酶基因aroD（GenBank：U00096.3(1,774,686..1,775,444)）及脱氢莽草酸还原酶aroE（GenBank：U00096.3(3,430,020..3,430,838)）。其中，如SEQ ID No：1所示的tyrA*基因由tyrA基因进行定点突变获得，如SEQ ID No：2所示的aroG*基因由aroG基因进行定点突变获得。进行点突变的方法为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。

本发明中，基因ARO10为由酪氨酸合成酪醇过程中的相关基因，可以来自酵母，基因UGT73B6为由酪醇合成红景天苷及淫羊藿次苷D2过程中的相关基因，可以来自红景天植物。优选地，ARO10和UGT73B6分别为来自酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的苯丙酮酸脱羧酶基因ScARO10（GenBank：GeneID:851987）和来自红景天（Rhodiolasachalinensis）的UDP-葡萄糖基转移酶RsUGT73B6（GenBank：AY547304）。优选的，为了提高UGT73B6的表达量，还可以其进行大肠杆菌密码子偏好性优化，优化后的UGT73B6基因的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示。

本发明中，需要说明的是，所述大肠杆菌表达菌株不表达feaB，tyrR，pykA，pykF，pheA基因，含有并能够表达tyrA*，aroG*，ppsA，tktA，aroB，aroD，aroE，ARO10，或者含有并能够表达tyrA*，aroG*，ppsA，tktA，aroB，aroD，aroE，ARO10和UGT73B6，是指使大肠杆菌染色体上的feaB，tyrR，pykA，pykF，pheA基因不表达；同时，在发酵培养时，上述tyrA*，aroG*，ppsA，tktA，aroB，aroD，aroE，ARO10和UGT73B6等基因能被翻译为相应的蛋白，并使相应蛋白发挥其作用。

根据本发明，使大肠杆菌染色体上的feaB，tyrR，pykA，pykF，pheA基因不表达的方法可以为本领域常规的方法，例如，可以通过基因敲除的方法进行，也可以通过基因沉默的方法进行。本发明优选通过基因敲除的方法进行。

本发明中，对基因敲除的方法没有特殊要求，可以为能够在大肠杆菌中进行基因敲除的各种方法，如利用λRed基因敲除系统对feaB，tyrR，pykA，pykF，pheA基因进行敲除，得到大肠杆菌菌株△A，并用含有基因tyrA*，aroG*，ppsA，tktA，aroB，aroD，aroE和ARO10，优选含有基因tyrA*，aroG*，ppsA，tktA，aroB，aroD，aroE，ARO10和UGT73B6的表达载体对大肠杆菌菌株△A进行转化得到所述大肠杆菌表达菌体。

本发明中，对表达载体的种类没有特殊要求，可以为能够在大肠杆菌中表达目的基因的本领域常用的各种表达载体，例如质粒等。本领域技术人员应该理解的是，表达载体的构建方法可以采用本领域常用的各种方法，如将目的基因经过酶切处理后连接至载体中，在此不再赘述。

本发明中的表达载体优选为大肠杆菌表达载体V1和大肠杆菌表达载体V2，大肠杆菌表达载体V1优选含有基因tyrA*，aroG*，ppsA，tktA，aroB，aroD和aroE，大肠杆菌表达载体V2优选含有基因ARO10，更优选含有基因ARO10和UGT73B6。

本发明中，对上述导入大肠杆菌中的基因的排列顺序没有特别的限制，只要能够进行有效地表达即可。优选的，大肠杆菌表达载体V1为pBbA5c-tyrA*-aroG*-ppsA-tktA-aroE-aroD-aroB，该载体的制备方法优选包括以下步骤：

（a）以引物MCS-5FPBgl/MCS-3RPNhe为引导，以质粒pACYCDuet-1为模板进行PCR扩增反应，得到带有BglⅡ，PstI，NotI，AflⅡ，PacI和NheI多克隆位点的基因片段，扩增产物经BglⅡ和NheI酶切后连入经BglⅡ和NheI酶切的质粒pBbA5c-MevT(CO)-MBIS中，得到质粒pBbA5c-MCS；

（b）以引物Ptet-tyrA-5FPPst/tyrA-3RPPst为引导，以核苷酸序列SEQ ID No：1所示带有点突变的tyrA*基因为模板进行PCR扩增反应，得到带有tet启动子的tyrA*基因片段，扩增产物经PstI酶切后连入经PstI酶切的质粒pBbA5c-MCS中，得到质粒pBbA5c-tyrA*；

（c）以引物aroG-5FPPst/aroG-3RPNot为引导，以核苷酸序列SEQ ID No：2所示带有点突变的aroG*基因为模板进行PCR扩增反应，扩增产物经PstI和NotI酶切后连入经PstI和NotI酶切的质粒pBbA5c-tyrA*中，构建得到质粒pBbA5c-tyrA*-aroG*；

（d）以引物ppsA-5FPNot/ppsA-3RPAfl为引导，以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，得到ppsA基因，经NotI和AflⅡ酶切后连入经NotI和AflⅡ酶切的质粒pBbA5c-tyrA*-aroG*中，构建得到质粒pBbA5c-tyrA*-aroG*-ppsA；

（e）以引物tktA-5FPBgl/tktA-3RPPac为引导，以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，得到tktA基因，经BglⅡ和PacI酶切后连入经BglⅡ和PacI酶切的质粒pBbA5c-MCS中，构建得到质粒pBbA5c-tktA；再以该质粒为模板，以引物Plac-tktA-5FPAfl/tktA-3RPPac为引导，扩增得到带有启动子PlacUV5的tktA基因片段Plac-tktA，经AflⅡ和PacI酶切后连入经AflⅡ和PacI酶切的质粒pBbA5c-tyrA*-aroG*-ppsA中，得到质粒pBbA5c-tyrA*-aroG*-ppsA-tktA；

（f）以引物aroE-5FPPac/aroE-3RPNhe为引导，以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，得到aroE基因，经PacI和NheI酶切后连入经PacI和NheI酶切的质粒pBbA5c-tyrA*-aroG*-ppsA-tktA中，得到质粒pBbA5c-tyrA*-aroG*-ppsA-tktA-aroE；

（g）以引物aroD-5FPBam/aroD-3RPPst为引导，以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，得到aroD基因，经BamHI和PstI酶切后连入经BglⅡ和PstI酶切的质粒pBbA5c-MCS中，构建得到质粒pBbA5c-aroD；以引物aroB-5FPPst/aroB-3RPNhe为引导，以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，得到aroB基因，经PstI和NheI酶切后连入经PstI和NheI酶切的质粒pBbA5c-aroD中，构建得到质粒pBbA5c-aroD-aroB；再以该质粒为模板，以引物Plac-5FPNhe/aroD-3RPNhe为引导，扩增得到带有启动子PlacUV5的aroD-aroB基因片段Plac-aroD-aroB，经NheI酶切后连入经NheI酶切的质粒pBbA5c-tyrA*-aroG*-ppsA-tktA-aroE中，得到大肠杆菌表达载体pBbA5c-tyrA*-aroG*-ppsA-tktA-aroE-aroD-aroB。

本发明中，大肠杆菌表达载体V2优选为pTrc-ARO10基因，更优选含pTrc-ARO10-UGT73B6。制备方法优选包括以下步骤：

（a）以引物aro-5FPNco/aro-3RPSac为引导，以酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）S288C的基因组DNA为模板进行PCR，扩增得到ARO10的ORF，扩增产物经NcoI和SacI酶切后连入经NcoI和SacI酶切的质粒pTrcHisB中，构建得到质粒pTrc-ARO10；

（b）在优选的情况下，以引物UGT-5FPNco/UGT-3RPBam为引导，优选以经密码子优选的UGT73B6基因为模板进行PCR扩增反应，扩增片段经NcoI和BamHI酶切后连入经NcoI和BamHI酶切的质粒pTrcHisB中，构建得到质粒pTrc-UGT73B6；再以该质粒为模板，以引物TrcUGT-5FPBgl/UGT-3RPBam为引导，扩增得到带有启动子Ptrc的UGT73B6基因片段Ptrc-UGT73B6，经BglⅡ和BamHI酶切后连入经BglⅡ酶切的质粒pTrc-ARO10中，得到质粒pTrc-ARO10-UGT73B6。

在以上载体的制备中使用的引物的序列如表1所示。

将所述载体pBbA5c-tyrA*-aroG*-ppsA-tktA-aroE-aroD-aroB和pTrc-ARO10转化大肠杆菌菌株△A，得到高产酪醇的大肠杆菌表达菌株△A（ARO10）；将所述载体pBbA5c-tyrA*-aroG*-ppsA-tktA-aroE-aroD-aroB和pTrc-ARO10-UGT73B6转化大肠杆菌菌株△A，得到高产红景天苷的大肠杆菌表达菌株△A（ARO10和UGT73B6）。大肠杆菌表达菌株△A（ARO10和UGT73B6）通过调控从葡萄糖到酪氨酸的代谢流，进行酪醇的高量表达，然后表达经过密码子优化的来自红景天的糖基转移酶UGT73B6，异源合成红景天苷及淫羊藿次苷D2（如图1所示）。

优选地，本发明中，所述大肠杆菌表达菌株优选为△A（ARO10）和△A（ARO10和UGT73B6）。

本领域技术人员应该理解的是，大肠杆菌与植物等在表达蛋白质时，都表现有不同程度的密码子偏爱性。将来自植物红景天的糖基转移酶基因进行密码子优化，可以使目标蛋白在大肠杆菌表达系统中更有效地表达。所述密码子优化的方法为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。

本发明中，在上述步骤中，PCR扩增反应的反应体系可以为常规的PCR扩增反应体系，优选为：5×phusion HF缓冲液10μl，2.5mM dNTP2.5μl，50μM正向引物0.5μl，50μM反向引物0.5μl，模板0.5μl，Phusion DNA聚合酶0.5μl，水35.5μl。

本发明中，在上述步骤中，PCR扩增反应的反应程序可以为常规的PCR扩增反应程序，例如可以为：94-95℃预变性4-5分钟；96-98℃变性20-30秒，55-60℃退火30-60秒，72℃延伸30-120秒，28-32个循环；72℃延伸8-10分钟。优选为：95℃预变性5分钟；98℃变性20秒，56℃退火45秒，72℃延伸2分钟，30个循环；72℃延伸10分钟。

本发明中，对用于构建大肠杆菌表达菌株的大肠杆菌的种类没有特殊要求，可以为能够表达目的基因的本领域常用的各种大肠杆菌，例如，所述大肠杆菌可以为MG1655或BL21(DE3)。为了使目的基因能够得到更好的表达，所述大肠杆菌优选为MG1655。

另一方面，本发明提供了如上所述的大肠杆菌表达菌株在生物合成酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2，和/或在制备含有酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2的产品中的应用。

其中，△A（ARO10）可用于合成酪醇，△A（ARO10和UGT73B6）可用于合成酪醇和红景天苷以及淫羊藿次苷D2。

本发明中，所述发酵培养的方法可以包括以下步骤：

（1）将如上所述的构建的大肠杆菌表达菌株接种至含有作为筛选标记用抗生素的LB液体培养基中，并在35-38℃下培养10-16小时，得到大肠杆菌种子液；

（2）将步骤（1）中得到的大肠杆菌种子液接种至含有所述作为筛选标记用抗生素的M9Y（M9基本培养基+0.025%yeast extract）液体培养基中，并在35-38℃下培养，当OD600达到0.4-0.6时加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），28-30℃下诱导培养36-72小时。

本领域技术人员应该理解的是，在发酵培养时，LB液体培养基和M9Y液体培养基中加入的抗生素为大肠杆菌表达菌株中含有的表达载体上的作为筛选标记用的抗生素，例如，氯霉素和氨苄青霉素；所述抗生素的浓度为本领域的常规选择，例如，所述氯霉素的加入量使其终浓度为20-50mg/mL；所述氨苄青霉素的加入量使其终浓度为100-150mg/mL。

另外，所述大肠杆菌种子液的接种量也可以为本领域常规的选择，例如，接种量为1-2体积%，也即，每100ml的M9Y液体培养基中加入1-2ml所述大肠杆菌种子液。

此外，本发明对异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的浓度也没有特别的限制，优选地，其加入量可以使其在M9Y液体培养基中的终浓度为0.5-1.0mM。

根据本发明，能够理解的是，当需要生产酪醇时，可以对△A（ARO10）进行发酵培养；当需要生产酪醇、红景天苷及淫羊藿次苷D2时，可以对△A（ARO10和UGT73B6）进行发酵培养。

实施例

以下的实施例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。

以下实施例中，大肠菌株MG1655和大肠杆菌DH5α均可市售获得，大肠菌株MG1655用于本发明中所有基因的表达，大肠杆菌DH5α用于本发明中所有基因的克隆。

大肠杆菌表达载体pBbA5c-MevT-MBIS购自Addgene，货号35151，由Taek_Soon Lee和Jay Keasling提供(参见Peralta-Yahya P.P.,Ouellet M.,Chan R.,Mukhopadhyay A.,Keasling J.D.,Lee T.S.,Identification and microbial production of a terpene-based advanced biofuel.Nature communication,2:483,doi:10.1038/ncomms1494)，本发明中将该质粒进行了改造，舍去了其用于在大肠杆菌中过表达的基因，保留了质粒骨架，得到质粒 pBbA5c-MCS。用作模板的大肠杆菌载体pACYCDuet-1，购自Novagen，货号71147-3。大肠杆菌表达载体pTrcHisB购自Invitrogen，货号V360-20。

Phusion高保真DNA聚合酶购自Thermo公司。

所用引物均由深圳华大基因科技有限公司合成，引物序列见表1，其中下划线部分表示酶切位点。

表1

下列实施例中未注明具体条件的试验方法，按照常规条件进行，例如《分子克隆：实验室手册》中所述的条件，或按照相应生物学试剂的制造厂商所建议的条件。

实施例1

本实施例用于说明大肠杆菌菌株△A的构建

（1）大肠杆菌MG1655，质粒pKD46（温度敏感型，含有受阿拉伯糖启动子调控的exo、bet和gam基因，Amp^r)、pKD4（含有两端带有FRT位点的卡那抗性基因，Kan^r)、pCP20（温度敏感型，编码能够识别FRT位点的FLP重组酶，Amp^r）均由本实验室保存。

（2）引物feaB-5FPL/feaB-3RPL用于扩增pKD4中Kan基因以替换feaB基因编码区；引物1655GD-5FP/1655GD-3RP为feaB基因敲除后重组菌鉴定引物，两条引物各位于打靶序列区的左右两侧。PCR反应体系为：5×PCR buffer，10μL；dNTP(2mM each)，5μL；引物feaB-5FPL和feaB-3RPL(10μM)，各2μL；Phusion high-fidelity DNA polymerase(5U/μL)，0.5μL；pKD4，50ng；ddH₂O补足体系到50μL。反应程序为：初始变性98℃30sec；98℃8sec，55℃30sec，72℃30sec，30个循环；终延伸72℃10min。得到打靶分子DNA片段。

（3）将过夜培养12h的含有pKD46的大肠杆菌MG1655按1:100的量接种，振荡培养至OD600值约为0.2，加入终浓度为100mmol/L的阿拉伯糖继续培养至OD600为0.5-0.6。制备电转感受态，取50μL感受态菌液与约200ng的打靶分子DNA片段进行电转化。电击后立即加入1mL LB液体培养液，37℃，振荡培养2h，涂布于LB平板（Kan^r）筛选阳性克隆。随后第二轮体内重组过程中，将编码FLP位点特异性重组酶的质粒pCP20转入feaB敲除菌株中，将Kan抗性基因剔除。然后37℃培养，丢掉pCP20。利用引物1655GD-5FP/1655GD-3RP进行PCR验证，得到feaB基因敲除的大肠杆菌。

用同样的方法将tyrR，pykF，pykA和pheA基因敲除掉，得到敲除基因feaB，tyrR，pykF，pykA和pheA的大肠杆菌菌株△A。相应的用于敲除的基因及验证的基因见表1，其中，用于敲除tyrR的引物如SEQ ID No：32和SEQ ID No：33所示，验证引物如SEQ ID No：34和SEQ ID No：35所示；用于敲除pykF的引物如SEQ ID No：36和SEQ ID No： 37所示，验证引物如SEQ ID No：38和SEQ ID No：39所示；用于敲除pykA的引物如SEQ ID No：40和SEQ ID No：41所示，验证引物如SEQ ID No：42和SEQ ID No：43所示；用于敲除pheA的引物如SEQ IDNo：44和SEQ ID No：45所示，验证引物如SEQ ID No：46和SEQ ID No：47所示。

实施例2

本实施例用于说明酪醇及红景天苷及淫羊藿次苷D2生物合成途径在大肠杆菌中的重构

将质粒pBbA5c-tyrA*-aroG*-ppsA-tktA-aroE-aroD-aroB和pTrc-ARO10或者pTrc-ARO10-UGT73B6用化学转化的方法转入大肠杆菌菌株△A，所述转化方法具体为：取100μl感受态大肠杆菌菌株△A细胞于冰上，10分钟后加入2μl质粒pBbA5c-tyrA*-aroG*-ppsA-tktA-aroE-aroD-aroB和1μl质粒pTrc-ARO10或者pTrc-ARO10-UGT73B6，轻轻混匀，冰上放置30分钟后，42℃热激90秒，取出立即于冰上放置2分钟，加入600μl LB液体培养基，37℃，150rpm摇床复苏培养30分钟，然后将菌液涂布在含氯霉素和氨苄青霉素的LB平板上。利用氯霉素和氨苄青霉素抗性筛选同时携带两种表达载体的转化菌株△A（ARO10）和（ARO10和UGT73B6），并通过提取质粒进行酶切验证，得到酪醇高产途径的大肠杆菌表达菌株△A（ARO10），以及红景天苷及淫羊藿次苷D2生物合成途径的大肠杆菌表达菌株△A（ARO10和UGT73B6）（保藏编号为CGMCC No.8897）。

实施例3

本实施例大肠杆菌表达菌株△A（ARO10）和△A（ARO10和UGT73B6）的发酵培养

将菌株△A（ARO10）和△A（ARO10和UGT73B6）分别在2mL加入有25mg/L氯霉素和100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养12小时，得到种子液。

然后将种子液将1体积%的转接量（0.5mL）分别转接入50mL加入有25mg/L氯霉素和100mg/L氨苄青霉素的M9Y液体培养基中，37℃培养，当OD600约为0.6时加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，30℃继续培养48个小时。分别得到表达有酪醇的发酵液1，和表达有红景天苷及淫羊藿次苷D2的发酵液2。

对比例1

本对比例用于说明现有技术的使用微生物生物合成酪醇

按照申请号201310133238.7的专利申请中的方法构建大肠杆菌表达菌株，并使用实施例3中的条件进行发酵，得到发酵液D1。

对比例2

本对比例用于说明参比的使用微生物生物合成酪醇及红景天苷及淫羊藿次苷D2

按照实施例1-3中的方法分别进行合成合成酪醇或者酪醇和红景天苷及淫羊藿次苷D2的大肠杆菌表达菌株的构建，不同的是，tyrA*替换为tyrA，aroG*替换为aroG。得到发酵液D2和D3。

测试例

酪醇和红景天苷及淫羊藿次苷D2的检测

（1）产物的HPLC检测：分别取实施例3中的发酵液1和2，对比例1中的发酵液D1，以及对比例2中的发酵液D2和D3各1mL12000rpm离心5min后，取上清，进行HPLC分析检测。分析条件如下：仪器为：安捷伦液相色谱仪，测定条件包括：C18柱（4.6×250mm）；检测波长224nm；流动相A=水(含0.1%体积甲酸)，B=甲醇；流速=1mL/min；梯度洗脱条件：0–20min20%体积B；21–45min20%体积B到100%体积B（21–45min内B的浓度均匀增加）；进样量50μL。

发酵液1和发酵液2的结果见图2。箭头1，2，3分别表示酪醇和红景天苷混合标准品（1mg酪醇标品与1mg红景天苷标品混溶于1mL甲醇，进样量5μL），发酵液1（菌株△A（ARO10））和发酵液2（菌株△A（ARO10和UGT73B6））。如图所示，菌株△A（ARO10）的发酵产物在11min时出现了一个新峰，与酪醇标准品（峰Ⅰ）的出峰时间一致；菌株△A（ARO10和UGT73B6）的发酵产物除了前述酪醇峰，在8min时还出现了另一个新峰，与红景天苷标准品（峰Ⅱ）的出峰时间一致，此外，在5min时还出现另一个新峰（峰Ⅲ）。发酵液D1和D2的出峰时间与发酵液1一致，发酵液D3的出峰时间与发酵液2一致。

（2）产物的LC-MS、¹H-NMR分析：对步骤（1）中各发酵液中看到的新峰进行LC-MS分析，其中，进行LC-MS分析的条件包括：C18柱（4.6×250mm）；检测波长201nm；流动相A=水(含0.1体积%乙酸铵)，B=甲醇；流速=1ml/min；梯度洗脱条件：0–5min5%体积B，6–45min5%体积B到100体积%B（6–45min内B的浓度均匀增加）；进样量50μl；ESI正离子源，分子量扫描范围50–1200。发酵液2的扫描结果见图3。峰Ⅱ的MS图谱上有红景天苷的MS特征峰318.15，峰Ⅲ的MS图谱上有淫羊藿次苷D2的MS特征峰318.29。通过进一步的¹H-NMR可以确定△A(ARO10-UGT73B6)菌株产红景天苷[¹H-NMR(500MHz,DMSO-d₆)数据:9.15(s,1H);7.02(d,J=10.0,H-C(10,14));6.64(d,J=10.0,H-C(11,13));4.95(s,OH);4.92(s,OH);4.88(s,OH);4.47(t,J=5.0,OH);4.15(d,J=10.0,H-C(1));3.85(dt,J=5.0,10.0,Ha-C(7));3.64(dd,J=5.0,10.0,Ha-C(6));3.54(dt,J=5.0,10.0,H_b-C(7));3.40(m,H_b-C(6));3.09(m,H-C(3));3.05(m,H-C(5));3.02(m,H-C(4));2.94(m,H-C(2));2.71(m,CH₂(8))]；以及淫羊藿次苷D2[¹H-NMR(500MHz, DMSO-d₆)数据[¹H-NMR(600MHz,DMSO-d₆)数据:7.11(d,J=12.0,H-C(9,11));6.92(d,J=12.0,H-C(8,12));5.25(d,J=6.0,2-OH);5.05(d,J=6.0,3-OH);4.99(d,J=6.0,4-OH);4.59(t,J=6.0,6-OH);4.53(t,J=6.0,14-OH);4.78(d,J=6.0,H-C(1));3.23(m,H-C(2);3.25(m,H-C(3);3.15(m,H-C(4);3.30(m,H-C(5);3.68(m,H_a-C(6));3.45(m,H_b-C(6));3.55(t,J=6.0,H-C(14));2.65(t,J=6.0,H-C(13))]，结果如图4所示。

且经测定，酪醇高产菌株△A（ARO10）发酵液1中酪醇的产量为600mg/L，菌株△A（ARO10和UGT73B6）发酵液中的酪醇产量为500mg/L，红景天苷的产量为50mg/L，淫羊藿次苷D2的产量为40mg/L。发酵液D1中的酪醇产量为200mg/L，发酵液D2中的酪醇产量为250mg/L，发酵液D3中的酪醇的产量为200mg/L，红景天苷的产量为20mg/L，淫羊藿次苷D2的产量为15mg/L。

本发明的高产酪醇大肠杆菌中酪醇产量可达600mg/L，在此基础上进一步实现了红景天苷及淫羊藿次苷D2的生物合成，红景天苷的产量可达50mg/L，淫羊藿次苷D2的产量可达40mg/L，显著的高于对比例中的酪醇或红景天苷及淫羊藿次苷D2的产量。因此，本发明提供了一种高产酪醇及红景天苷的新的生物合成途径，为酪醇及红景天苷的大规模工业生产奠定了基础，具有重要的经济价值和社会效益。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims

1.一种大肠杆菌表达菌株，其特征在于，所述大肠杆菌表达菌株不表达feaB，tyrR，pykA，pykF，pheA基因，含有并能够表达如SEQ ID No：1所示的tyrA*基因，如SEQ ID No：2所示的aroG*基因，以及ppsA，tktA，aroB，aroD，aroE和ARO10基因。

2.根据权利要求1所述的大肠杆菌表达菌株，其中，所述大肠杆菌表达菌株的保藏编号为CGMCC No.8897，所述大肠杆菌表达菌株还含有并能够表达UGT73B6基因。

3.根据权利要求1所述的大肠杆菌表达菌株，其中，所述大肠杆菌表达菌株通过如下方法进行制备：

(1)通过基因敲除或基因沉默使大肠杆菌菌株的feaB，tyrR，pykA，pykF，pheA基因不表达，得到大肠杆菌菌株△A；

(2)用含有aroG*，tyrA*，ppsA，tktA，aroB，aroD，aroE和ARO10基因的表达载体对步骤(1)得到的大肠杆菌菌株△A进行转化，得到所述大肠杆菌表达菌株。

4.根据权利要求1所述的大肠杆菌表达菌株，其中，所述大肠杆菌表达菌株通过如下方法进行制备：

(2)用含有aroG*，tyrA*，ppsA，tktA，aroB，aroD，aroE，ARO10和UGT73B6基因的表达载体对步骤(1)得到的大肠杆菌菌株△A进行转化，得到所述大肠杆菌表达菌株。

5.根据权利要求3所述的大肠杆菌表达菌株，其中，

所述表达载体包括大肠杆菌表达载体V1和大肠杆菌表达载体V2；

所述大肠杆菌表达载体V1含有aroG*，tyrA*，ppsA，tktA，aroB，aroD和aroE基因；所述大肠杆菌表达载体V2含有ARO10基因。

6.根据权利要求4所述的大肠杆菌表达菌株，其中，

所述大肠杆菌表达载体V1含有aroG*，tyrA*，ppsA，tktA，aroB，aroD和aroE基因；所述大肠杆菌表达载体V2含有ARO10和UGT73B6基因。

7.根据权利要求5所述的大肠杆菌表达菌株，其中，

所述大肠杆菌表达载体V1为pBbA5c-tyrA*-aroG*-ppsA-tktA-aroE-aroD-aroB；

所述大肠杆菌表达载体V2为pTrc-ARO10。

8.根据权利要求6所述的大肠杆菌表达菌株，其中，

所述大肠杆菌表达载体V2为pTrc-ARO10-UGT73B6。

9.根据权利要求3-6中任意一项所述的大肠杆菌表达菌株，其中，所述大肠杆菌菌株为MG1655或BL21(DE3)。

10.权利要求1-9中任意一项所述的大肠杆菌表达菌株在生物合成酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2，和/或在制备含有酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2的产品中的应用。

11.一种在大肠杆菌中生物合成酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2的方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求1-9中任意一项所述的大肠杆菌表达菌株进行发酵培养，使其生物合成酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述发酵培养的方法包括：

(1)将权利要求1-9中任意一项所述的大肠杆菌表达菌株接种至含有作为筛选标记用抗生素的LB液体培养基中，并在35-38℃下培养10-16小时，得到大肠杆菌种子液；

(2)将步骤(1)中得到的大肠杆菌种子液接种至含有所述作为筛选标记用抗生素的M9Y液体培养基中，并在35-38℃下进行发酵培养；当OD600达到0.4-0.6时加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，28-30℃下诱导培养36-72小时。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，

所述作为筛选标记用抗生素为氯霉素和氨苄青霉素；

以所述M9Y液体培养基的体积为基准，所述大肠杆菌种子液的接种量为1-2体积％；

异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的加入量使其终浓度为0.5-1.0mM。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述氯霉素的加入量使其终浓度为20-50mg/mL；所述氨苄青霉素的加入量使其终浓度为100-150mg/mL。