CN107686492A - 一种使用大孔吸附树脂提取纯化发酵液中红景天苷的方法 - Google Patents

一种使用大孔吸附树脂提取纯化发酵液中红景天苷的方法 Download PDF

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庄以彬
何庆林
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Abstract

本发明公开了一种使用大孔吸附树脂提取纯化发酵液中红景天苷的方法，包括以下步骤：(1)将产红景天苷的大肠杆菌发酵液，离心，得到上清液为上样液；(2)将上样液加入到大孔吸附树脂柱中；(3)向大孔吸附树脂柱中加入水，去除大孔吸附树脂柱中残留的上清液及极性杂质；(4)向大孔吸附树脂柱中加入体积浓度为10％～20％的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇水溶液体积的20％‑80％的洗脱液；(5)将洗脱液浓缩，干燥，得到红景天苷粗品；(6)将红景天苷粗品用90％的乙醇水溶液溶解，结晶；(7)重复步骤(6)，得到纯度98％及以上的红景天苷。本发明从产红景天苷的大肠杆菌发酵液中提取纯化获得红景天苷，具有操作简单、收率高、环境友好等优点。获得的红景天苷纯度高，适合工业化生产。

Description

一种使用大孔吸附树脂提取纯化发酵液中红景天苷的方法
技术领域
本本发明涉及发酵产物的提取纯化，特别涉及一种使用大孔吸附树脂提取纯化发酵液中红景天苷的方法。
背景技术
红景天是生长在高寒无污染地带的珍稀野生植物，是我国藏族人民的习用药物，至今已有1000多年的应用历史，具有刺激神经系统、增加工作效率、消除疲劳和预防高山症等作用。除此之外，红景天还具有保护心脑血管，神经细胞以及抗肿瘤抗辐射等功能。红景天的主要药用活性成分是红景天苷及其苷元酪醇。近年来，以红景天苷作为主要原料生产的药剂、饮料、食品以及化妆品等产品种类越来越多，其苷元酪醇是一种具有重要工业价值的酚类化合物，酪醇及其衍生物是多种有机化合物的合成前体。人们对红景天苷及其苷元酪醇的关注程度不断提高。红景天苷(Salidroside)具有以下特征：化学名称为2-(4-hydroxyphenyl)ethyl-β-D-glucopyranoside，分子式为C14H20O7，分子量为300.304，CAS号为10338-51-9。其苷元酪醇(Tyrosol)具有以下特征：化学名称为4-(2-Hydroxyethyl)phenol，分子式为C8H10O2，分子量为138.164，CAS号为501-94-0。
目前，红景天苷的生产主要是对红景天植株进行化学提取。野生红景天生长条件恶劣，植被资源稀有，而且红景天苷的量很低，如现在最常用的高山红景天和大花红景天，其植株中红景天苷的量只有0.5％-0.8％。人工栽培的红景天成本高而有效成分量低，达不到市场要求的标准，因而植物提取正面临严峻的现实。除植物提取外，化学合成、微生物转化及组织培养生产红景天苷也是研究热点。
明海泉以酪醇和溴代四乙酰葡萄糖为原料，以Ag2CO3为催化剂，成功合成了红景天甙(明海泉，红景天甙合成及药理作用，药学通讯，1986，21(6):373)。王梦亮等以D-葡萄糖和酪醇为底物，探索出了一种借助于微生物合成红景天甙的方法(王梦亮，张芳，刘滇生，微生物催化D-葡萄糖与酪醇葡糖基转移合成红景天甙的初步研究，催化学报，2006，27(3):233-236)。
在采用组织培养方式进行红景天苷的生物合成方面，研究成果最为成熟的是Wu等用致密愈伤组织体系进行的红景天苷高产出率培养条件的研究。从高山红景天的根、茎、叶、子叶等分离体得到的相应的几种愈伤组织，并对其生长速度、红景天苷量和培养繁殖条件进行筛选，确定了生成高产出率红景天苷的最佳条件，红景天苷最高收获率可达到干重57.72mg/g，为野生植株的5～10倍(Wu S,Zu Y,Wu M High yield production ofsalidroside in the suspension culture of Rhodiola sachalinensis.J Biotechnol,2003,106(1):331)。
化学合成红景天苷工艺过程长不易操作控制，成本高，难以实现产业化；微生物转化天麻素、红景天苷效率较低，需要添加外源底物；植物组织培养反应周期长，效价较低。因此，红景天苷的微生物体内生物全合成途径具有重要的科研价值及社会效益。本实验室构建了合成红景天苷的工程大肠杆菌，实现了红景天苷的微生物发酵生产，并申请了中国专利，专利名称为一种高产酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2的大肠杆菌表达菌株及其应用，公开号为CN 104946575 A。目前从大肠杆菌发酵液中分离纯化红景天苷的方法尚未见报道。
大孔吸附树脂是20世纪60年代发展起来的一种新型非离子型高分子聚合物，兼有吸附性和筛选性，是以吸附作用和筛选作用相结合的分离材料。大孔吸附树脂理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂,对有机物选择性好,不受无机盐等离子和低分子化合物的影响。目前,大孔吸附树脂主要应用于环保、医药工业、化学工业、分析化学、临床鉴定等多个领域，特别是在抗生素，皂苷，生物碱等天然产物的提取纯化过程中应用越来越广泛(郭丽冰，王蕾，常用大孔吸附树脂的主要参数和应用情况，中国现代中药，2006，8(4):26-32)。
目前，使用大孔吸附树脂提取纯化微生物发酵液中红景天苷的方法尚未报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种使用大孔吸附树脂提取纯化发酵液中红景天苷的方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种使用大孔吸附树脂提取纯化发酵液中红景天苷的方法，包括以下步骤：
(1)将产红景天苷的大肠杆菌发酵液，离心，得到上清液为上样液；
(2)以上样流速为1～3BV/h将上样液加入到大孔吸附树脂柱中；上样液和大孔吸附树脂的体积比例为3～5:1；
(3)向大孔吸附树脂柱中加入水，以0.5～2BV/h的流速通过大孔吸附树脂柱洗脱，去除大孔吸附树脂柱中残留的上清液及极性杂质；
(4)以0.5～2BV/h的流速，向大孔吸附树脂柱中加入体积浓度为10％～20％的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇水溶液体积的20％-80％的洗脱液；所述乙醇水溶液与大孔吸附树脂的体积比为2～4:1；
(5)将洗脱液浓缩，干燥，得到红景天苷粗品；
(6)将红景天苷粗品用40-50℃的体积浓度为90％的乙醇水溶液溶解，置于4℃-25℃下结晶；
(7)重复步骤(6)，得到纯度98％及以上的红景天苷。
步骤(2)中的上样流速优选为2BV/h。
步骤(2)上样液和大孔吸附树脂的体积比例优选为5:1。
步骤(4)中乙醇水溶液的体积浓度优选为20％。
步骤(4)中所述乙醇水溶液与大孔吸附树脂的体积比优选为3:1。
所述步骤(4)中流速优选为1BV/h。
大孔吸附树脂的型号优选为SPB825L、AB-8或HPD-100C。
本发明的优点：从产红景天苷的大肠杆菌发酵液中提取纯化获得红景天苷，具有操作简单、收率高、环境友好等优点。获得的红景天苷纯度高，适合工业化生产。
附图说明
图1为大肠杆菌发酵产物HPLC检测。
图2本发明的方法获得的红景天苷HPLC谱图。
具体实施方式
本发明各实施例所用的“产红景天苷的大肠杆菌发酵得到的发酵液”中的“大肠埃氏希菌”是以保藏编号CGMCC No.8897的大肠杆菌为例。
本发明所涉及的大肠杆菌，建议的分类命名为大肠埃氏希菌Escherichia coli,现于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.8897，保藏时间为2014年3月5日，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。
保藏编号CGMCC No.8897的大肠杆菌发酵方法见中国专利CN104946575 A“一种高产酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2的大肠杆菌表达菌株及其应用”，通过该方法获得发酵液。
需要说明的是，本发明是以CGMCC No.8897大肠杆菌为例，是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制，本领域技术人员能够理解，其它的能够产红景天苷的大肠杆菌也属于本发明的保护范围。
大孔吸附树脂的型号优选为SPB825L、AB-8或HPD-100C。(市售)
大孔吸附树脂预处理方法:
量取大孔吸附树脂用两倍体积的体积浓度为95％的乙醇水溶液浸泡两小时，用水浸泡洗涤两小时至无乙醇残留。
准确量取大孔吸附树脂500mL，湿法装柱(46*457mm,带砂芯)。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
一种使用大孔吸附树脂提取纯化发酵液中红景天苷的方法，包括以下步骤：
(1)将产红景天苷的大肠杆菌发酵液，离心，得到上清液为上样液；
(2)以上样流速为2BV/h将2.5L上样液加入到型号为SPB825L大孔吸附树脂柱中；
(3)向大孔吸附树脂柱中加入1L水，以1BV/h的流速通过大孔吸附树脂柱洗脱，去除大孔吸附树脂柱中残留的上清液及极性杂质；
(4)以1BV/h的流速，向大孔吸附树脂柱中加入1500mL体积浓度为20％的乙醇水溶液洗脱，收集300～1200mL这一段洗脱液；
(5)将洗脱液浓缩，干燥，得到红景天苷粗品；
(6)将红景天苷粗品用45℃的体积浓度为90％的乙醇水溶液溶解，置于15℃下结晶；
(7)重复步骤(6)3次，得到纯度98.0％的红景天苷。收率86％。
测试例1
(1)大肠杆菌发酵产物HPLC检测：分别样品各1mL，12000rpm离心10min后，取上清，进行HPLC分析检测。分析条件如下：岛津液相色谱仪，测定条件包括：C18柱(4.6×250mm)；检测波长224nm；流动相A＝水(含0.1％体积甲酸)，B＝甲醇；流速＝1mL/min；梯度洗脱条件：0–20min 20％体积B；进样量20μL。
HPLC检测结果见图1。其中，
1是大肠杆菌发酵液，离心，得到上清液；
2是大肠杆菌发酵液经实施例1步骤(1)(2)后获得的液体；
3是大肠杆菌发酵液经实施例1步骤(1)(2)(3)后，以1BV/h的流速，向大孔吸附树脂柱中加入1500mL体积浓度为20％的乙醇水溶液洗脱的前300mL的洗脱液；(将淫羊藿次苷D2分离)。
4大肠杆菌发酵液经实施例1步骤(1)(2)(3)后，以1BV/h的流速，向大孔吸附树脂柱中加入1500mL体积浓度为20％的乙醇水溶液洗脱的300～1200mL的洗脱液；(分离得到酪醇粗品溶液)。
5大肠杆菌发酵液经实施例1步骤(1)(2)(3)后，以1BV/h的流速，向大孔吸附树脂柱中加入1500mL体积浓度为20％的乙醇水溶液洗脱的1200～1500mL的洗脱液；(分离得到酪醇粗品溶液)。
如图所示，保留时间6.5分钟的化合物是淫羊藿次苷D2，保留时间10.2分钟的化合物是红景天苷，保留时间为12.1分钟的化合物是酪醇。
结论：从图1中可知大孔吸附树脂不仅可从发酵液中的提取富集红景天苷，还能将其与其他物质很好分离开来，起到分离纯化的作用。
实施例1的方法获得的红景天苷HPLC检测：将得到的晶体配置成1mg/mL的甲醇溶液，进样量10μL，其它色谱条件同上。结果见图2。
实施例2
一种使用大孔吸附树脂提取纯化发酵液中红景天苷的方法，包括以下步骤：
(1)将产红景天苷的大肠杆菌发酵液，离心，得到上清液为上样液；
(2)以上样流速为1BV/h将1.5L上样液加入到型号为AB-8大孔吸附树脂柱中；
(3)向大孔吸附树脂柱中加入1L水，以0.5BV/h的流速通过大孔吸附树脂柱洗脱，去除大孔吸附树脂柱中残留的上清液及极性杂质；
(4)以0.5BV/h的流速，向大孔吸附树脂柱中加入2000mL体积浓度为10％的乙醇水溶液洗脱，收集500～1600mL这一段洗脱液；
(5)将洗脱液浓缩，干燥，得到红景天苷粗品；
(6)将红景天苷粗品用50℃的体积浓度为90％的乙醇水溶液溶解，置于25℃下结晶；
(7)重复步骤(6)3次，得到纯度98％的红景天苷。收率70％
实施例3
一种使用大孔吸附树脂提取纯化发酵液中红景天苷的方法，包括以下步骤：
(1)将产红景天苷的大肠杆菌发酵液，离心，得到上清液为上样液；
(2)以上样流速为3BV/h将2L上样液加入到型号为HPD-100C大孔吸附树脂柱中；
(3)向大孔吸附树脂柱中加入1L水，以2BV/h的流速通过大孔吸附树脂柱洗脱，去除大孔吸附树脂柱中残留的上清液及极性杂质；
(4)以2BV/h的流速，向大孔吸附树脂柱中加入2000mL体积浓度为15％的乙醇水溶液洗脱，收集400～1300mL这一段洗脱液；
(5)将洗脱液浓缩，干燥，得到红景天苷粗品；
(6)将红景天苷粗品用40℃的体积浓度为90％的乙醇水溶液溶解，置于4℃下结晶；
(7)重复步骤(6)3次，得到纯度98％的红景天苷。收率78％。

Claims (7)

1.一种使用大孔吸附树脂提取纯化发酵液中红景天苷的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将产红景天苷的大肠杆菌发酵液，离心，得到上清液为上样液；
(2)以上样流速为1～3BV/h将上样液加入到大孔吸附树脂柱中；上样液和大孔吸附树脂的体积比例为3～5:1；
(3)向大孔吸附树脂柱中加入水，以0.5～2BV/h的流速通过大孔吸附树脂柱洗脱，去除大孔吸附树脂柱中残留的上清液及极性杂质；
(4)以0.5～2BV/h的流速，向大孔吸附树脂柱中加入体积浓度为10％～20％的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇水溶液体积的20％-80％的洗脱液；所述乙醇水溶液与大孔吸附树脂的体积比为2～4:1；
(5)将洗脱液浓缩，干燥，得到红景天苷粗品；
(6)将红景天苷粗品用40-50℃的体积浓度为90％的乙醇水溶液溶解，置于4℃-25℃下结晶；
(7)重复步骤(6)，得到纯度98％及以上的红景天苷。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中的上样流速为2BV/h。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)上样液和大孔吸附树脂的体积比例为5:1。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(4)中乙醇水溶液的体积浓度为20％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(4)中所述乙醇水溶液与大孔吸附树脂的体积比为3:1。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(4)中流速为1BV/h。
7.根据权利要求1、3或5所述的方法，其特征在于所述大孔吸附树脂的型号为SPB825L、AB-8或HPD-100C。
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