CN107460152B - 产红景天苷及其类似物的重组菌、构建方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种产红景天苷及其类似物的重组菌、构建方法及用途，构建方法为：人工全合成酮基脱羧酶基因synkdc和糖基转移酶基因synyjic，将synkdc基因通过酶切，连接到表达载体pRSFDuet‑1的第一个启动子下游，筛选阳性克隆得到重组载体pSynkdc1；将synyjic基因连接到pSynkdc1的第二个启动子下游，筛选阳性克隆得到重组载体pSynkdc1‑yjic，并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组菌；该重组菌以酪氨酸或葡萄糖为碳源，利用游离诱导表达和整合表达两种方法进行发酵生产红景天苷及其类似物。本发明可解决红景天苷及其类似物的来源问题，降低了成本，有利于工业化生产。

Description

产红景天苷及其类似物的重组菌、构建方法及用途
技术领域
本发明所属生物医药技术领域，涉及一种产红景天苷及其类似物的重组菌及构建方法。
背景技术
红景天苷(salidroside)是景天科(Crassulaceae)红景天属植物红景天(Rhodiola rosea)的主要有效成分，具有良好的抗氧化、抗辐射、抗疲劳、免疫调节、抗高原低氧等多种药理活性。其分子式为C14H20O7，分子量为300.30，类白色或浅黄色粉末。近年来，研究发现红景天苷可用于癌症、神经系统疾病、细胞衰老、脑与心脏等器官缺氧与缺血、认知障碍、皮肤斑哺、代谢调节等多方面的治疗，因此使得红景天苷在药品、保健品、化妆品等工业生产中有广泛使用。
目前为止，红景天苷的主要来源依然是野生红景天，野生红景天中红景天苷的量很低,而且天然红景天苷的提取需要复杂的工艺，现在最常用的高山红景天和大花红景天，其植株中红景天苷的量只有0.5％-0.8％。而人工栽培的红景天成本颇高而有效成分量低。近几年，在化学合成、生物催化(酶催化)合成红景天苷等方面，相关理论和实践都取得了重要进步。尽管化学合成红景天苷及其类似物技术已日趋成熟，但大多都需要进行选择性保护、活化或使用昂贵的金属催化剂。因此以上方法均不利于工业生产。
植物中红景天苷的生物合成分为4个阶段：第一阶段是初生代谢产物磷酸烯醇式丙酮酸和赤藓糖-4-磷酸经莽草酸途径形成莽草酸；第二阶段是由莽草酸再经几步酶促反应形成阿罗酸；第三阶段是由阿罗酸到酪醇的合成；第四阶段是由葡萄糖和酪醇结合形成红景天苷。在这4个阶段中，第l阶段是许多高等植物所共有的代谢步骤，是十分明确的，第2阶段和第4阶段的反应机制也已经被探索清楚；关于第3阶段，从阿罗酸到酪醇的生物合成途径，已经提出了3条可能的途径，即苯丙烷类代谢途径、酪氨酸脱羧代谢途径和酪氨酸转氨代谢途径。
近年来也已有研究证实酪氨酸可以经过脱羧、还原等步骤直接转化成酪醇。而红景天苷生物合成最后一步反应机制也已经明确，植物体内的尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶以尿苷二磷酸葡萄糖和酪醇为底物催化合成红景天苷。因此，通过使用合成生物学技术，在工程微生物中构建全新的生物合成通路，有望实现红景天苷及其类似物的从头合成。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供产红景天苷及其类似物的重组菌。
本发明的第二个目的是提供产红景天苷及其类似物的重组菌的构建方法。
本发明的第三个目的是提供产红景天苷及其类似物的重组菌发酵制备红景天苷及其类似物的方法。
本发明的技术方案概述如下：
产红景天苷及其类似物的重组菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)人工全合成酮基脱羧酶基因synkdc，所述酮基脱羧酶基因synkdc的核苷酸序列如SEQ ID No.03所示；人工全合成糖基转移酶基因synyjic，所述糖基转移酶基因synyjic的核苷酸序列如SEQ ID No.04所示；
(2)按下述三种方式之一种进行：
方式一：
①将synkdc基因通过酶切，连接到表达载体pRSFDuet-1的第一个启动子下游，筛选阳性克隆得到重组载体pSynkdc1；
②将synyjic基因连接到pSynkdc1的第二个启动子下游，筛选阳性克隆得到重组载体pSynkdc1-yjic；
③将重组载体pSynkdc1-yjic转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到SyBE-218001菌株；
方式二：
①将synkdc基因通过酶切，连接到表达载体pCDFDuet-1的第一个启动子下游，筛选阳性克隆得到重组载体pSynkdc2；
②将synyjic基因连接到pSynkdc2的第二个启动子下游，筛选阳性克隆得到重组载体pSynkdc2-yjic；
③将重组载体pSynkdc2-yjic转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到SyBE-218002菌株；
方式三：
①将synkdc基因，通过λRed同源重组技术整合到大肠杆菌BL21(DE3)中，同时敲除基因feaB，得到SyBE-218003菌株；
②将synyjic基因，通过λRed同源重组技术整合到大肠杆菌SyBE-218003菌株中，同时敲除基因ushA，得到SyBE-218004菌株。
上述方法构建的产红景天苷及其类似物的重组菌SyBE-218001菌株、SyBE-218002菌株或SyBE-218004菌株。
产红景天苷及其类似物的重组菌制备红景天苷及其类似物的方法，包括如下步骤：
将重组菌SyBE-218001、SyBE-218002或SyBE-218004接种在LB培养基中，37℃，220rpm，震荡培养2-4h，在OD600到0.8-1.0之间时，加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷使终浓度为0.1-1mM，30℃，200-250rpm诱导3-4h，然后转接到含有葡萄糖的M9培养基中发酵，饲喂酪氨酸或者4-羟基苯丙酮酸使终浓度为500mg/L，发酵培养；或用酶水解的红景天植物原料进行发酵培养；高效液相色谱(HPLC)检测，得到红景天苷及其类似物。
本发明的优点：
红景天苷可用于癌症、神经系统疾病、细胞衰老等多方面的治疗，因此使得红景天苷在化妆品、食品、保健品、药品等工业生产中被广泛使用。本发明使用工程大肠杆菌，以酪氨酸或葡萄糖为碳源，利用游离诱导表达和整合表达两种方法进行发酵生产红景天苷及其类似物。本发明可解决红景天苷及其类似物的来源问题，同时最大限度的降低了生产成本，有利于工业化生产。
附图说明
图1为红景天苷及其类似物(苯乙醇-β-D-吡喃葡萄糖苷)的合成路线。
图2为红景天苷及其类似物验证的HPLC图谱。(a)为重组菌SyBE-218001的发酵液检测图谱，(b)为重组菌SyBE-218002的发酵液检测图谱，(c)为重组菌SyBE-218004的发酵液检测图谱。
具体实施方式
利用毕赤酵母菌(Pichia pastoris GS115)中酮基脱羧酶基因kdc以及地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中的糖基转移酶基因yjic，在工程大肠杆菌中实现了以葡萄糖为生物质碳源合成红景天苷及其类似物，使生产成本最低化。
本发明所用表达载体pRSFDuet-1和pCDFDuet-1购买自Novagen公司。
本发明所用大肠杆菌菌株E.coli BL21(DE3)购买自北京全式金生物技术有限公司。
本发明所用pKD46质粒和pCP20质粒购买自普如汀生物技术(北京)有限公司。
LB培养基组成为：10g/L NaCl、10g/L蛋白胨和5g/L酵母粉，余量为水，0.1Mpa压力121℃下灭菌20min。
含有葡萄糖的M9培养基组成为：0.5g/L NaCl、1.0g/L NH4Cl、3.0g/L KH2PO4、17.1g/L Na2HPO4·12H2O、0.025％酵母粉，余量为水，培养基在0.1Mpa压力121℃下灭菌20min。灭菌完后加入过膜的终浓度为5mM MgSO4、0.1mM CaCl2以及灭菌的5g/L葡萄糖。
含有红景天苷植物原料酶水解物的培养基：红景天植物粉碎成粉末，粉末：水＝1：15，加入纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶水解，0.1％KH2PO4、0.1％Na2HPO4·12H2O和0.1％NH4Cl，培养基在0.1Mpa压力121℃下灭菌20min。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
本发明设计的红景天苷的生物合成途径属于莽草酸途径，详细的合成途径如图1所示：以葡萄糖为碳源，经过莽草酸途径合成对羟基苯丙酮酸。对羟基苯丙酮酸在酮基脱羧酶(synkdc)的催化作用下合成4-羟基苯乙醛，4-羟基苯乙醛在大肠杆菌內源乙醇脱氢酶(adh)催化下生成4-羟基苯乙醇(酪醇)，在糖基转移酶(synyjic)的催化下，酪醇与UDP-葡萄糖供体结合合成红景天苷及其类似物(苯乙醇-β-D-吡喃葡萄糖苷)。
实施例1酮基脱羧酶基因synkdc和糖基转移酶基因synyjic设计
优选毕赤酵母GS115酮基脱羧酶，地衣芽孢杆菌糖基转移酶，其氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID No.01和SEQ ID No.02所示。使用JCAT在线密码子优化软件(http：//www.jcat.de)结合OPTIMIZER在线密码子优化工具(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)，以大肠杆菌对密码子的偏好性进行优化，设计全长synkdc基因和synyjic基因，分别如序列表SEQ ID No.03和SEQ ID No.04所示。
实施例2重组表达载体pSynkdc1-yjic的构建
将通过化学全合成得到的synkdc基因片段，通过PCR方法在片段两端分别加上位于表达载体pRSFDuet-1的第一个启动子下游的EcoRI和PstI酶切位点后，使用FastDigest内切酶EcoRI和PstI进行酶切，反应体系为：5μL 10*FD buffer，2.5μL EcoRI、2.5μL PstI、30μL synkdc基因片段和10μL超纯水。反应条件为：37℃，2h。使用PCR纯化试剂盒，将50μL酶切产物中，加入250μL Bingding Buffer溶液，混匀后加入吸附柱中，静置一分钟，10，000g离心1分钟，弃出流出液。加入650μL Wash Buffer,10，000g离心1分钟，弃出流出液。10，000g离心2分钟，去除残留的Wash Buffer。将吸附柱置于一个干净的离心管中，在柱的中央加入30μL Elution Buffer(Elution Buffer提前在65℃水浴锅中预热)，室温静置1分钟，10，000g离心1分钟，洗脱酶切后的synkdc基因片段。同样将pRSFDuet-1质粒用FastDigest内切酶EcoRI和PstI进行酶切，PCR纯化试剂盒纯化回收。将酶切后的synkdc基因片段和pRSFDuet-1质粒进行连接反应。反应体系为：1μL 10*T4DNA Ligase Buffer,1μL T4DNALigase,6μL酶切后的synkdc基因片段和2μL酶切后的pRSF-Duet1质粒。反应条件为：22℃，0.5h。酶切连接后转化感受态细胞E.coli DH5α，菌落PCR筛选阳性克隆提质粒，测序验证，得到synkdc基因连接到表达载体pRSFDuet-1的第一个启动子下游的质粒pSynkdc1。
将通过化学全合成得到的synyjic基因片段，通过PCR方法在片段两端分别加上位于表达载体pRSFDuet-1的第二个启动子下游的XhoI和BglII酶切位点后，使用FastDigest内切酶XhoI和BglII分别将synyjic基因片段和pSynkdc1质粒进行双酶切，然后通过DNA连接酶将synyjic基因连接到pSynkdc1载体第二个启动子下游，酶切连接反应体系及反应条件按照pSynkdc1载体构建方法。酶切连接后转化感受态细胞E.coli DH5α，菌落PCR筛选阳性克隆，获得重组载体pSynkdc1-yjic，测序验证。
实施例3重组表达载体pSynkdc2-yjic的构建
将通过化学全合成得到的synkdc基因片段，通过PCR方法在片段两端分别加上位于表达载体pCDFDuet-1的第一个启动子下游的EcoRI和PstI酶切位点后，使用FastDigest内切酶EcoRI和PstI将两端加入EcoRI和PstI酶切位点的synkdc基因片段以及pCDF-Duet1质粒进行双酶切，然后通过DNA连接酶将synkdc基因连接到pCDF-Duet1载体第一个启动子下游，酶切连接反应体系及反应条件按照实施例2中的pSynkdc1载体构建方法，酶切连接后转化感受态细胞E.coli DH5α，菌落PCR筛选阳性克隆提质粒，测序验证，得到将synkdc基因连接到表达载体pCDFDuet-1的第一个启动子下游的质粒pSynkdc2。
将通过化学全合成得到的synyjic基因片段，通过PCR方法在片段两端分别加上位于表达载体pCDFDuet-1的第二个启动子下游的XhoI和BglII酶切位点后，使用FastDigest内切酶XhoI和BglII分别将synyjic基因片段和pSynkdc2质粒进行双酶切，然后通过DNA连接酶将synyjic基因连接到pSynkdc2载体第二个启动子下游，酶切连接反应体系及反应条件按照实施例2中pSynkdc1-yjic载体构建方法。酶切连接后转化感受态细胞E.coli DH5α，菌落PCR筛选阳性克隆，获得重组载体pSynkdc2-yjic，测序验证。
实施例4重组载体pSynkdc1-yjic和pSynkdc2-yjic分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)
重组载体pSynkdc1-yjic和pSynkdc2-yjic分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)中的详细构建步骤如下：
1、将活化的大肠杆菌菌株BL21(DE3)100μL，接种于10ml LB培养基中，37℃，220rpm，培养至OD600为0.8-1.0时，转入10ml离心管中，在预冷的4℃离心机中，4500rpm/min，离心5min，去上清，收集菌体；
2、用5ml预冷的灭过菌的10％甘油洗涤菌体，在预冷的4℃离心机中，4500rpm/min，离心5min，去上清，收集菌体，重复洗涤三次；
3、尽量倒尽上清，加入200μL10％甘油重悬菌体，制成BL21(DE3)感受态细胞，分装两管；
4、将实施例2中构建的pSynkdc1-yjic质粒2.5μL以及实施例3中构建的pSynkdc2-yjic质粒2.5μL，分别加入到100μL电转感受态细胞中，轻轻旋转混匀。将混合物分别加入2mm的冰预冷电击杯中，2.5KV电击4-6ms。迅速分别加入1mL LB培养基，37℃复苏2h后涂布对应抗性的平板，过夜培养；
5、挑选菌落PCR验证的阳性转化子到5ml LB培养基中过夜培养，分别得到重组菌株SyBE-218001和SyBE-218002，保存菌株；
实施例5λ-red同源重组方法敲除feaB基因同时整合synkdc基因到大肠杆菌BL21(DE3)染色体上。
敲除feaB基因同时整合synkdc基因到大肠杆菌BL21(DE3)染色体上的底盘菌株构建过程详细步骤如下：
1、引物FeaB-KdcF和Kdc R,Kan F和FeaB-Kan R序列分别如序列表SEQ ID NO.05、SEQ ID NO.06、SEQ ID NO.07、SEQ ID NO.08，重叠延伸PCR制备具有kan抗性的FeaB-Kdc-Kan片段。
2、把pKD46质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中，获得BL21(DE3)/pKD46，将活化的菌种BL21(DE3)/pKD46，接种于10ml LB液体培养基中，30℃，200rpm，培养至OD600为0.4-0.6。加入终浓度为10mM L-阿拉伯糖，继续培养3-4h。4℃下4000rpm离心8min，收集细胞。弃上清，加入冰预冷的10％甘油洗涤细胞2次，制备成电转感受态细胞。取7.5μL抗性片段FeaB-Kdc-Kan，加入到100μL电转感受态细胞中，轻轻旋转混匀。将混合物加入2mm的冰预冷电击杯中，2.5KV电击4-6ms。然后加入1mL LB培养基，37℃复苏2h后涂布对应抗性的平板，42℃过夜培养。
3、挑取PCR验证正确单菌落，在42℃下卡那霉素抗性平板传代3次，氨苄卡那霉素抗性平板验证pKD46缺失，37℃培养保存，获得敲除feaB基因同时将synkdc基因整合到大肠杆菌BL21(DE3)染色体上的菌株。
4、利用步骤3中得到的重组菌，制备感受态细胞，同样方法电转化质粒pCP20，30℃过夜培养。挑取单菌落，无抗性平板划线，42℃传代3次，筛选卡那霉素和氨苄青霉素抗性缺失的菌株，37℃培养保存，得到成功无痕整合的优化底盘菌株SyBE-218003。
实施例6λ-red同源重组方法敲除ushA基因同时整合synyjic基因到大肠杆菌底盘菌株SyBE-218003染色体上
敲除ushA基因同时整合synyjic基因到大肠杆菌底盘菌株SyBE-218003染色体上的菌株构建过程详细步骤如下：
1、引物YjicF和YjicR，Yjic-Kan F和Yjic-Kan R序列分别如序列表SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12，重叠延伸PCR制备具有kan抗性的Yjic-Kan片段。
2、把pKD46质粒导入大肠杆菌SyBE-218003中，获得SyBE-218003/pKD46。将活化的菌种SyBE-218003/pKD46，接种于10ml LB液体培养基中，30℃，200rpm，培养至OD600为0.4-0.6。加入终浓度为10mM L-阿拉伯糖，继续培养3h。4℃下4000rpm离心8min，收集细胞。弃上清，加入冰预冷的10％甘油洗涤细胞2次，制备成电转感受态细胞。取Yjic-Kan抗性片段7.5μL，加入到100μL电转感受态细胞中，轻轻旋转混匀。将混合物加入2mm的冰预冷电击杯中，2.5KV电击4-6ms。然后加入1mL LB培养基，37℃复苏2h后涂布对应抗性的平板，42℃过夜培养。
3、挑取PCR验证正确单菌落，在42℃下卡那霉素抗性平板传代3次，氨苄卡那霉素抗性平板验证pKD46缺失，37℃培养保存，获得整合yjic基因到底盘菌株SyBE-218003染色体上的菌株。
4、利用步骤3中得到的重组菌，制备感受态细胞，同样方法电转化质粒pCP20，30℃过夜培养。挑取单菌落，无抗性平板划线，42℃传代3次，筛选卡那霉素和氨苄青霉素抗性缺失的菌株，37℃培养保存，得到成功无痕整合的底盘菌株SyBE-218004。
实施例7重组菌SyBE-218001、SyBE-218002和SyBE-218004发酵检测
将重组菌SyBE-218001、SyBE-218002和SyBE-218004菌株分别接种到5ml LB培养基中过夜培养。
将过夜培养的菌液转接进入含有50ml LB培养基的250ml摇瓶中，初始OD600约为0.1，37℃，220rpm培养3h，在OD600到达0.8时，加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷使终浓度为1mM，30℃，200rpm诱导4h，然后转接到含有葡萄糖的M9培养基中发酵，饲喂终浓度为500mg/L的底物酪氨酸，30℃，200rpm发酵培养48h。
在发酵过程中不同时间点，取发酵液1ml，然后12000r/min离心10分钟，取上清，用0.22μm的微孔滤膜过滤后进行高效液相色谱(HPLC)系统检测。色谱条件如下：C18(4.6×250mm)色谱柱；流动相为20％甲醇-80％超纯水溶液-0.1％甲酸；流速1mL/min；进样量20μL；柱温室温；紫外检测器，检测波长280nm。
如图2所示分别是SyBE-218001、SyBE-218002和SyBE-218004发酵液样品中产物验证的HPLC图谱。
发酵48h，SyBE-218001菌株生成红景天苷和苯乙醇-β-D-吡喃葡萄糖苷；SyBE-218002菌株生成红景天苷和苯乙醇-β-D-吡喃葡萄糖苷；SyBE-218004菌株生成红景天苷和苯乙醇-β-D-吡喃葡萄糖苷。
实施例8重组菌SyBE-218001、SyBE-218002和SyBE-218004发酵检测
将重组菌SyBE-218001、SyBE-218002和SyBE-218004菌株分别接种到5ml LB培养基中过夜培养。
将过夜培养的菌液转接进入含有50ml LB培养基的250ml摇瓶中，初始OD600约为0.1，37℃，220rpm培养2h，在OD600到达0.9时，加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷使终浓度为0.1mM，30℃，250rpm诱导4h，然后转接到含有葡萄糖的M9培养基中发酵，饲喂终浓度为500mg/L的底物酪氨酸，30℃，200rpm发酵培养48h。
检测结果与实施例7的结果相似。
实施例9重组菌SyBE-218001、SyBE-218002和SyBE-218004发酵检测
将重组菌SyBE-218001、SyBE-218002和SyBE-218004菌株分别接种到5ml LB培养基中过夜培养。
将过夜培养的菌液转接进入含有50ml LB培养基的250ml摇瓶中，初始OD600约为0.1，37℃，220rpm培养4h，在OD600到达1.0时，加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷使终浓度为0.5mM，30℃，220rpm诱导3h，然后转接到含有葡萄糖的M9培养基中发酵，饲喂终浓度为500mg/L的底物4-羟基苯丙酮酸，30℃，200rpm发酵培养48h。
检测结果与实施例7的结果相似。
实施例10重组菌SyBE-218001、SyBE-218002和SyBE-218004发酵检测
将重组菌SyBE-218001、SyBE-218002和SyBE-218004菌株分别接种到5ml LB培养基中过夜培养。
将过夜培养的菌液转接进入含有50ml LB培养基的250ml摇瓶中，初始OD600约为0.1，37℃，220rpm培养4h，在OD600到达1.0时，加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷使终浓度为0.5mM，30℃，220rpm诱导3h，然后转接到含有红景天苷植物原料酶水解的培养基中，进行发酵。
检测结果与实施例7的结果相似。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。
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Claims (3)

1.一种产红景天苷及其类似物的重组菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：
人工全合成酮基脱羧酶基因synkdc，所述酮基脱羧酶基因synkdc的核苷酸序列如SEQID No.03所示；人工全合成糖基转移酶基因synyjic，所述糖基转移酶基因synyjic的核苷酸序列如SEQ ID No.04所示；
将synkdc基因，通过λRed同源重组技术整合到大肠杆菌BL21(DE3)中，同时敲除基因feaB，得到SyBE-218003菌株；将synyjic基因，通过λRed同源重组技术整合到大肠杆菌SyBE-218003菌株中，同时敲除基因ushA，得到SyBE-218004菌株；
红景天苷类似物为苯乙醇-β-D-吡喃葡萄糖苷。
2.权利要求1的方法构建的产红景天苷及其类似物的重组菌SyBE-218004菌株。
3.产红景天苷及其类似物的重组菌制备红景天苷及其类似物的方法，其特征是包括如下步骤：
将权利要求2的重组菌SyBE-218004接种在LB培养基中，37℃，220rpm，震荡培养2-4h，在OD600到0.8-1.0之间时，加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷使终浓度为0.1-1mM，30℃，200-250rpm诱导3-4h，然后转接到含有葡萄糖的M9培养基中发酵，饲喂酪氨酸或者4-羟基苯丙酮酸使终浓度为500mg/L，发酵培养；或用酶水解的红景天植物原料发酵；高效液相色谱检测，得到红景天苷及其类似物。
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