CN112280726B - 一种高产四氢嘧啶工程菌株的构建方法与应用 - Google Patents

一种高产四氢嘧啶工程菌株的构建方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112280726B
CN112280726B CN202011191374.8A CN202011191374A CN112280726B CN 112280726 B CN112280726 B CN 112280726B CN 202011191374 A CN202011191374 A CN 202011191374A CN 112280726 B CN112280726 B CN 112280726B
Authority
CN
China
Prior art keywords
coli
gene
tetrahydropyrimidine
micc
recombinant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011191374.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112280726A (zh
Inventor
康振
陈坚
堵国成
戴跃锋
何广文
颜少尉
魏伟伟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Syoung Cosmetics Manufacturing Co Ltd
Original Assignee
Jiangnan University
Syoung Cosmetics Manufacturing Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University, Syoung Cosmetics Manufacturing Co Ltd filed Critical Jiangnan University
Priority to CN202011191374.8A priority Critical patent/CN112280726B/zh
Publication of CN112280726A publication Critical patent/CN112280726A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112280726B publication Critical patent/CN112280726B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1217—Phosphotransferases with a carboxyl group as acceptor (2.7.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01178—Diaminobutyrate acetyltransferase (2.3.1.178)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y206/00—Transferases transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C12Y206/01—Transaminases (2.6.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/02—Phosphotransferases with a carboxy group as acceptor (2.7.2)
    • C12Y207/02004—Aspartate kinase (2.7.2.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01108—Ectoine synthase (4.2.1.108)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种高产四氢嘧啶工程菌株的构建方法与应用，属于生物工程技术领域。本发明提供了能够在低盐条件下生产四氢嘧啶的E.coli BL21(DE3)重组菌，该菌包含由T7启动子控制的、具有特定RBS序列的外源基因ectA，ectB和ectC，并使用sRNA技术对ptsG，pta，thrA和lysA基因进行了转录后水平抑制。本发明构建的重组大肠杆菌以葡萄糖为底物，发酵72h后，四氢嘧啶产量可达30g/L。

Description

一种高产四氢嘧啶工程菌株的构建方法与应用
技术领域
本发明涉及一种高产四氢嘧啶工程菌株的构建方法与应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
四氢嘧啶(Ectoine)是一种极性、易溶、生理pH范围内不带电荷的小分子有机物，属于相容性溶质。研究表明，四氢嘧啶是好氧中度嗜盐细菌中最常见的渗透压调控物；对蛋白质的构象和活性有积极的影响；对细菌细胞处于极端环境(干旱、冷冻、高盐碱、高温、射线等)中的核酸、蛋白质、酶等起到保护作用；广泛应用于医药，化妆品，酶工业等领域。
四氢嘧啶的合成主要有两种方法：化学合成法和生物合成法。其中，生物合成法主要采用酶催化法和发酵法。化学合成法存在着很多问题，包括生产过程复杂，合成产率低，副产物多且与目标产物的化学性质相似，下游分离纯化难度很高等。酶催化法，诱导表达并提取酶的过程操作复杂，成本较高。传统发酵法常采用的是一种叫做“细菌挤奶”的方法，通过循环控制培养环境中盐浓度的增加与降低来分别实现嗜盐或耐盐菌中四氢嘧啶的合成与分泌，该方法存在高盐的发酵废液对生产设备腐蚀严重，对环境压力大等缺点。此外，谢希贤等(201510410080.2)公布了一种产生四氢嘧啶的大肠杆菌工程菌及其构建方法与应用，该基因工程菌为具有特定基因型的大肠杆菌，包含来源于伸长盐单胞菌ectABC基因簇；lysA，thrA，iclR三个基因缺陷型；具有lac启动子控制的谷氨酸棒状杆菌lysC基因；trc启动子控制的ppc基因；发酵20-28h后，四氢嘧啶产量达到了12-18g/L。但是，该菌未对异源基因簇ectABC做改造，在一定程度上限制了四氢嘧啶产量的进一步提高；同时该菌为氨基酸缺陷型菌，一定程度上会抑制菌体生长，给菌体造成一定的压力，进而影响四氢嘧啶的生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生产四氢嘧啶的大肠杆菌工程菌的构建方法和应用，用于制备四氢嘧啶。
本发明的第一个目的是提供一种生产四氢嘧啶的大肠杆菌工程菌，表达了伸长盐单胞菌来源的EctABC基因簇，或伸长盐单胞菌来源的二氨基丁酸转乙酰基酶(EctA)、二氨基丁酸转氨酶(EctB)和四氢嘧啶合成酶(EctC)，以及谷氨酸棒杆菌来源的天冬氨酸激酶，并替换了异源基因ectA,ectB,ectC的RBS序列。
在一种实施方式中，所述EctABC基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在一种实施方式中，所述二氨基丁酸转乙酰基酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第1～579bp所示。
在一种实施方式中，所述二氨基丁酸转氨酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第662～1927bp所示。
在一种实施方式中，所述四氢嘧啶合成酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第2020～2433bp所示。
在一种实施方式中，所述二氨基丁酸转乙酰基酶基因的RBS替换为SEQ ID NO.7第287～300bp所示序列、二氨基丁酸转氨酶基因和和四氢嘧啶合成酶基因的RBS均替换为SEQID NO.8所示序列。
在一种实施方式中，所述天冬氨酸激酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在一种实施方式中，所述EctABC基因簇以载体pRSFDuet-1表达。
在一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主。
在一种实施方式中，所述大肠杆菌为E.coli BL21、E.coli BL21(DE3)、E.coliJM109、E.coli DH5α或E.coli TOP10。
在一种实施方式中，所述基因工程菌还抑制了pta，ptsG，thrA和lysA中至少一个基因的表达，其中pta核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，ptsG核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，thrA核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，lysA核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明的第二个目的是提供构建所述基因工程菌的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)以线性化的质粒pRSFDuet-1表达EctABC基因簇，获得重组质粒pR-ABC，并转化至E.coli BL21(DE3)感受态得到重组菌株E/pR-ABC；
(2)分别替换pR-ABC上ectA，ectB和ectC基因的RBS序列，获得RBS优化的重组质粒R-AB，转化至E.coli BL21(DE3)感受态得到重组菌株ECT-AB；
(3)将天冬氨酸激酶基因连接至表达载体R-AB的第二个T7启动子表达框处并进行定点突变C932T，得到重组质粒R-AB-L，转化至E.coli BL21(DE3)感受态得到重组菌株ECT-AB-L。
在一种实施方式中，所述方法在步骤(3)后，设计以micC为骨架靶向基因ptsG，pta，thrA或lysA的sRNA序列，合成并插入到质粒R-AB-L中，得到重组质粒R-AB-L-micC，转化至E.coli BL21(DE3)感受态获得基因抑制的重组菌株ECT-AB-L-micC。
本发明的第三个目的是提供所述基因工程菌在制备四氢嘧啶中的应用。
在一种实施方式中，所述应用是将所述基因工程菌在含酵母提取物、蛋白胨、KH2PO4、Na2HPO4、(NH4)2SO4、FeSO4、葡萄糖的培养基中发酵。
在一种实施方式中，所述发酵培养基组成为(g/L)：酵母提取物8.0，蛋白胨12.0，KH2PO45.0，Na2HPO4·12H2O 5.0，(NH4)2SO4 25.0，FeSO4·7H2O 0.05，d-葡萄糖20.0，调节pH为7.0-7.2。
在一种实施方式中，所述发酵条件为：30℃条件下培养，通过控制搅拌桨转速来使溶解氧维持在25-35％，通过补加氨水来控制pH维持在7.0-7.2，流加60％的葡萄糖使发酵持续进行。
有益效果：
本发明首次使用双T7启动子表达系统同时进行了异源基因簇ectABC和异源基因lysCfbr的表达；首次使用RBS序列优化策略，对大肠杆菌中的异源基因簇ectABC进行了改造；并首次使用sRNA技术对四氢嘧啶生产途径的支路途径基因进行了转录后水平抑制，取得了如下效果：
(1)本发明的四氢嘧啶合成基因工程菌首次在大肠杆菌中实现了对异源基因ectA,ectB,ectC进行了改造，并取得了可观的效果，使四氢嘧啶量产量达1563.6mg/L，与对照E/pR-ABC相比提高了72.6％。
(2)本发明的四氢嘧啶合成基因工程菌采用了sRNA抑制手段来实现对宿主基因的调控，避免了基因敲除对菌体生长带来的压力，同时实现了在非高盐浓度条件下四氢嘧啶的高产，节省了成本。
附图说明
图1是菌株代谢示意图；
图2是ectABC替换RBS策略图；
图3是四氢嘧啶标准样品高效液相色谱图；
图4是四氢嘧啶发酵液高效液相色谱图；
图5是四氢嘧啶标准样品LC-MS图；
图6是四氢嘧啶发酵液LC-MS图。
具体实施方式
本发明利用合成生物学技术和基因工程手段，以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为出发菌株，在菌体内异源表达了四氢嘧啶合成途径相关基因簇ectABC；对异源基因ectA,ectB,ectC进行了RBS序列的替换；过表达了谷氨酸棒杆菌来源的天冬氨酸激酶基因lysC，并对第932位氨基酸进行了定点突变，将半胱氨酸突变为苏氨酸，得到突变体C932T；进一步地，使用sRNA抑制技术对四氢嘧啶合成途径的支路基因pta、ptsG、thrA、lysA进行抑制。通过前面所述一系列表达载体的构建得到四氢嘧啶生产菌株。
材料：
1.大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为商业化的常用宿主。
2.伸长盐单胞菌(Halomonas elongata)ATCC 33173购自中国海洋微生物菌种保藏管理中心。
3.PrimeSTAR DNA聚合酶、磷酸化酶、DNA Marker、Solution I、AvrII等酶类试剂购自TaKaRa(大连)。
4.ClonExpress一步法定向克隆试剂盒购自Vazyme Biotech(南京)。
5.胶回收试剂盒购自Thermo fisher Scientific公司。
6.质粒抽提试剂盒购自生物工程(上海)有限公司。
7.各种分析纯试剂购自国药集团。
8.四氢嘧啶标准样品购自Sigma-Aldrich公司(上海)。
9.LB固体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10，琼脂粉20。
10.LB液体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10。
11.发酵培养基(g/L)：酵母提取物8.0，蛋白胨12.0，KH2PO4 5.0，Na2HPO4·12H2O5.0，(NH4)2SO4 25.0，FeSO4·7H2O 0.05，D-葡萄糖20.0，调节pH为7.0-7.2。
实施例1：构建重组质粒pRSFDuet-1-ectABC
(1)提取伸长盐单胞菌(Halomonas elongata)基因组，设计引物ectABC-F/ectABC-R(ectABC-F：ggccggccgatatccaattgagatctgccgctacagcgaaccacgacaatgaac；ectABC-R：gcggtttctttaccagactcgagggtaccgttacagcggcttctggtcgtcggcttcg)，以伸长盐单胞菌基因组为模板，使用引物进行PCR，扩增获得带有原始RBS序列的目的基因片段ectABC(SEQ ID NO.1所示)；
(2)提取质粒pRSFDuet-1，其核苷酸序列为SEQ ID NO.7，设计引物pRSFDuet-1-F1/pRSFDuet-1-R1(pRSFDuet-1-F1：cggtaccctcgagtctggtaaagaaaccgctgctgcgaaatttgaac；pRSFDuet-1-R1：ggccggccgatatccaattgagatctgccatatgtatatctcc)，以质粒pRSFDuet-1为模板，进行PCR扩增，获得在第一个T7启动子表达框处实现线性化的载体pRSFDuet-1；
(3)利用一步克隆酶将步骤(1)和(2)获得的片段进行连接，构建成重组质粒pR-ABC。
实施例2：重组菌株E/pR-ABC的构建及摇瓶水平培养
(1)配制CaCl2溶液：
(2)从LB平板上挑取E.coli BL21(DE3)单菌落，接种于5ml LB液体培养基中，37℃，220rpm过夜培养；
(3)将菌液按2％转接至含50ml LB液体培养基的250mL摇瓶中，37℃，220rpm培养至OD600＝0.4-0.6；
(4)冰上放置15min，然后4000rpm，4℃，离心10min收集菌体；
(5)将菌体重悬至冰浴后的CaCl2溶液，静置30min后4000rpm，4℃，离心10min；
(6)弃上清，重新加入1-2mL CaCl2溶液，混匀，每管50-100μL分装至1.5ml灭菌离心管中，置于-80℃保存或进行转化；
(7)实施例1获得的重组质粒pR-ABC与步骤(6)获得的感受态细胞混匀后于冰中放置30min；
(8)将上述冰浴后的混合体系迅速热击(42℃，90s)然后迅速置于冰上，静置2min，然后无菌室加入900μL不加抗生素的LB液体培养基，恢复培养(40-60min，37℃，220rpm)；
(9)培养液离心(4000-5000rpm，2min)，弃800μL上清，混匀浓缩至200μL，涂布卡那抗性平板，37℃恒温培养12-16h，挑选阳性克隆进行菌落PCR验证，并测序正确后即为重组菌株E/pR-ABC。
(9)待活化菌取自-80℃保存的甘油管，使用无菌接种环划线至具有相应抗性或无抗的LB固体培养基上，密封倒置于37℃恒温培养12-16h至长出单菌落。
(10)从活化的LB平板上挑取单菌落接种至50mL的离心管中(装液量为5mL)，37℃，220r/min培养8-10h。
(11)将培养好的种子液按2％(v/v)的接种量，转接到250mL锥形瓶中(装样量为30mL)，发酵温度为30℃，转速为220r/min。转接的同时加入0.25mmol/L的IPTG，诱导菌体产四氢嘧啶，培养48h后经检测四氢嘧啶产量为912.6mg/L。
实施例3：构建重组质粒R-A，R-B和R-C
设计引物EctA-F/EctA-R(EctA-F：gtataagaaggagatatacataatgaacgcaaccacagagccctttacaccc；EctA-R：ctctgtggttgcgttcattatgtatatctccttcttatacttaactaatatac),EctB-F/EctB-R(EctB-F：aaggaggaaaatatccacaggaggtcgcaatgca；EctB-R：gtggatattttcctccttcgtcccggctcagatctggtc),EctC-F/EctC-R(EctC-F：aaggaggaaaatatcgacatgatcgttcgcaatctcg；EctC-R：gtcgatattttcctcctttcagctaaaggcctgcttggtg)，以重组载体pR-ABC为模板进行环化PCR，对基因ectA，ectB和ectC分别进行RBS序列替换，获得单基因RBS序列替换的重组载体R-A，R-B和R-C，其中ectA的RBS序列替换为载体pRSFDuet-1上T7启动子后的RBS序列(如SEQID NO.7的287～300bp所示)，命名为R-A；ectB和ectC的RBS序列均替换为SEQ ID NO.11所示核苷酸序列，所得重组质粒分别命名为R-B和R-C。
实施例4：构重组菌株建ECT-A，ECT-B，和ECT-C
按实施例2所述制备E.coli BL21(DE3)感受态细胞，将实施例3中获得的重组载体R-A，R-B和R-C按实施例2的转化方式转化，用卡那抗性平板筛选，阳性克隆子进行菌落PCR验证，并测序正确后即为ECT-A，ECT-B，和ECT-C重组菌株，其中ECT-A的四氢嘧啶生产能力提高最多，培养48h，最高产量为1350.3mg/L，与E/pR-ABC相比提高了47.9％。
实施例5：构建重组载体R-AB，R-AC和R-BC
使用引物EctA-F/EctA-R(EctA-F：gtataagaaggagatatacataatgaacgcaaccacagagccctttacaccc；EctA-R：ctctgtggttgcgttcattatgtatatctccttcttatacttaactaatatac)，EctB-F/EctB-R(EctB-F：aaggaggaaaatatccacaggaggtcgcaatgca；EctB-R：gtggatattttcctccttcgtcccggctcagatctggtc),EctC-F/EctC-R(EctC-F：aaggaggaaaatatcgacatgatcgttcgcaatctcg；EctC-R：gtcgatattttcctcctttcagctaaaggcctgcttggtg)，分别以重组载体R-B，R-C和R-A为模板进行环化PCR，以及对基因ectA，ectB和ectC分别进行RBS序列替换，获得双基因RBS序列替换的重组载体R-AB，R-AC和R-BC；其中，R-AB中ectA的RBS序列替换为载体pRSFDuet-1上T7启动子后的RBS序列(如SEQ ID NO.7的287～300bp所示)，且ectB的RBS序列替换为SEQ ID NO.8所示核苷酸序列；R-AC中ectA的RBS序列替换为载体pRSFDuet-1上T7启动子后的RBS序列(如SEQ ID NO.7的287～300bp所示)，且ectC的RBS序列替换为SEQ IDNO.8所示核苷酸序列；R-BC中ectB的RBS序列和ectC的RBS序列均替换为SEQ ID NO.8所示核苷酸序列。
实施例6：构建ECT-AB，ECT-AC和ECT-BC菌株
按实施例2所述制备E.coli BL21(DE3)感受态细胞，将实施例5中获得的重组载体R-AB，R-AC和R-BC按实施例2的转化方式转化至E.coli BL21(DE3)，用卡那抗性平板筛选，阳性克隆子进行菌落PCR验证，并测序正确后即为ECT-AB，ECT-AC和ECT-BC重组菌株，其中ECT-AB培养48h，产四氢嘧啶量最高为1563.6mg/L，与对照E/pR-ABC相比提高了72.6％。
实施例7：构建R-ABC重组载体
设计引物EctA-F/EctA-R(EctA-F：gtataagaaggagatatacataatgaacgcaaccacagagccctttacaccc；EctA-R：ctctgtggttgcgttcattatgtatatctccttcttatacttaactaatatac)，以实施例5构建的重组载体R-BC为模板进行环化PCR，对基因ectA进行RBS序列替换，获得三基因RBS序列替换的重组载体R-ABC，使ectA的RBS序列替换为载体pRSFDuet-1上T7启动子后的RBS序列(如SEQ ID NO.7的287～300bp所示)，且ectB的RBS序列和ectC的RBS序列均替换为SEQ ID NO.8所示核苷酸序列。
实施例8：构建ECT-ABC菌株
按实施例2所述制备E.coli BL21(DE3)感受态细胞，将实施例7中获得的重组载体R-ABC按实施例2的转化方式转化至E.coli BL21(DE3)，用卡那抗性平板筛选，阳性克隆子进行菌落PCR验证，并测序正确后即为ECT-ABC重组菌株，该菌株培养48h，其四氢嘧啶产量为1538.7mg/L，与E/pR-ABC相比提高了69.9％。
实施例9：构建R-AB-lysC(G1A)质粒
(1)提取谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组，设计引物lysC-F1/lysC-R1(lysC-F1：acagccaggatccgaattcatggccctggtcgtacagaaatatgg；lysC-R1：attatgcggccgcaagcttttagcgtccggtgcctgcataaac)，以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，使用引物lysC-F1/lysC-R1通过PCR扩增基因，获得含有定点突变的目的基因片段lysC(G1A)；
(2)提取质粒R-AB，设计引物pRSFDuet-1-F2/pRSFDuet-1-R2(pRSFDuet-1-F2：aagcttgcggccgcataatgcttaag；pRSFDuet-1-R2：gaattcggatcctggctgtggtgatgat)，以质粒R-AB为模板，通过PCR扩增，获得在第二个T7启动子表达框处实现线性化的载体；
(3)利用一步克隆酶将步骤(1)和(2)获得的片段连接，构建重组质粒R-AB-lysC(G1A)。
实施例10：构建ECT-AB-lysC(G1A)菌株
按实施例2所述制备E.coli BL21(DE3)感受态细胞，将实施例9中获得的重组载体R-AB-lysC(G1A)按实施例2的转化方式转化至E.coli BL21(DE3)，用卡那抗性平板筛选，阳性克隆子进行菌落PCR验证，并测序正确后即为ECT-AB-lysC(G1A)重组菌株。
实施例11：构建R-AB-L质粒
提取质粒R-AB-lysC(G1A)，设计引物lysC-F2/lysC-R2(lysC-F2：cgacatcatcttcacctgccctcgttccgacgg；lysC-R2：aacgagggcaggtgaagatgatgtcggtggtg)，以质粒R-AB-lysC(G1A)为模板进行PCR扩增，获得重组质粒R-AB-L；
实施例12：构建ECT-AB-L菌株
按实施例2所述制备E.coli BL21(DE3)感受态细胞，将实施例11中获得的重组载体R-AB-L按实施例2的转化方式转化至E.coli BL21(DE3)，用卡那抗性平板筛选，阳性克隆子进行菌落PCR验证，并测序正确后即为ECT-AB-L重组菌株，培养48h，经检测四氢嘧啶产量最高为1653.6mg/L，比ECT-AB提高了5.7％。
实施例13：构建单基因抑制质粒
(1)设计以micC为骨架，分别靶向ptsG，pta，thrA、lysA基因N16、N20以及N24的sRNA序列，交由金唯智公司合成，合成序列如下。
micC-ptsG1：
taatacgactcactataggttagcaaatgcattcttaaacattttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgag；
micC-ptsG2：
taatacgactcactataggcaaatgcattcttaaacattttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgag；
micC-ptsG3：
taatacgactcactatagatgcattcttaaacattttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgag；
micC-pta1：
taatacgactcactataggatcagcataataatacgggacactttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgag；
micC-pta2：
taatacgactcactatagagcataataatacgggacactttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgag；
micC-pta3：
taatacgactcactatagtaataatacgggacactttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgag；
micC-thrA1：
taatacgactcactatagaccgccgaacttcaacactcgcattttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgag；
micC-thrA2：
taatacgactcactatagccgaacttcaacactcgcattttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgag；
micC-thrA3：
taatacgactcactatagacttcaacactcgcattttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgag；
micC-lysA1：
taatacgactcactatagggtgctgaacagtgaatgtggcattttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgag；
micC-lysA2：
taatacgactcactatagctgaacagtgaatgtggcattttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgag；
micC-lysA3：
taatacgactcactatagacagtgaatgtggcattttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgag；
(2)设计引物micC-F/micC-R(micC-F：ctatagtgagtcgtattatcgtcagcttgtcgtcggtt；micC-R：agtcgtccgggctttttttctcgagccgggtctccgcaagtggcac)，以实施例11中构建的质粒R-AB-L为模板进行PCR，获得线性化载体
(3)利用一步克隆酶将步骤(1)合成片段与步骤(2)线性化载体连接，获得R-AB-L-micC质粒，获得的重组载体按实施例2的转化方式转化，用卡那抗性平板筛选，阳性克隆子进行菌落PCR验证，测序正确后即为含有不同micC的单基因抑制质粒，分别为R-AB-L-micC(ptsG1)，R-AB-L-micC(ptsG2)，R-AB-L-micC(ptsG3)，R-AB-L-micC(pta1)，R-AB-L-micC(pta2)，R-AB-L-micC(pta3)，R-AB-L-micC(thrA1)，R-AB-L-micC(thrA2)，R-AB-L-micC(thrA3)，R-AB-L-micC(lysA1)，R-AB-L-micC(lysA2)，R-AB-L-micC(lysA3)。
实施例14：制备抑制单基因的四氢嘧啶工程菌
按实施例2所述制备E.coli BL21(DE3)感受态细胞，将实施例13中测序正确的质粒按实施例2的转化方式转化，用卡那霉素抗性平板筛选，阳性克隆子即为抑制单基因的四氢嘧啶工程菌：ECT-AB-L-ptsG1，ECT-AB-L-ptsG2，ECT-AB-L-ptsG3，ECT-AB-L-pta1，ECT-AB-L-pta2，ECT-AB-L-pta3，ECT-AB-L-thrA1，ECT-AB-L-thrA2，ECT-AB-L-thrA3，ECT-AB-L-lysA1，ECT-AB-L-lysA2，ECT-AB-L-lysA3，将上述菌株分别在发酵培养基中培养48h，其中ECT-AB-L-thrA3四氢嘧啶产量提高最多为3366.6mg/L，比ECT-AB-L提高了106.3％。
实施例15：构建多基因抑制质粒
(1)设计以micC为骨架靶向抑制ptsG，pta，thrA、lysA中两个基因的sRNA序列，交由金唯智公司合成，合成序列如下。
micC-pGpa：
taatacgactcactatagatgcattcttaaacattttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgagaagcttagatctattaccctgttatccctactaatacgactcactataggatcagcataataatacgggacactttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgag
micC-pat：
taatacgactcactatagacttcaacactcgcattttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgagaagcttagatctattaccctgttatccctactaatacgactcactataggatcagcataataatacgggacactttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgag
micC-pal：
taatacgactcactatagctgaacagtgaatgtggcattttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgagtcgagttcatgtgcagctccataagctaatacgactcactataggatcagcataataatacgggacactttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgag
micC-pGt：
taatacgactcactatagatgcattcttaaacattttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgagaagcttagatctattaccctgttatccctactaatacgactcactatagacttcaacactcgcattttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgag
micC-pGl：
taatacgactcactatagatgcattcttaaacattttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgagaagcttagatctattaccctgttatccctactaatacgactcactatagctgaacagtgaatgtggcattttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgag
micC-tl：
taatacgactcactatagacttcaacactcgcattttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgagaagcttagatctattaccctgttatccctactaatacgactcactatagctgaacagtgaatgtggcattttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgag
(2)设计以micC为骨架靶向抑制ptsG，pta，thrA、lysA中三个基因的sRNA序列，交由金唯智公司合成，合成序列如下：
micC-pGpat：
taatacgactcactatagatgcattcttaaacattttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgagaagcttagatctattaccctgttatccctactaatacgactcactatagacttcaacactcgcattttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgagaagcttagatctattaccctgttatccctactaatacgactcactataggatcagcataataatacgggacactttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgaga
micC-pGpal：
taatacgactcactatagatgcattcttaaacattttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgagaagcttagatctattaccctgttatccctactaatacgactcactatagctgaacagtgaatgtggcattttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgagtcgagttcatgtgcagctccataagctaatacgactcactataggatcagcataataatacgggacactttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgag
micC-pGtl：
taatacgactcactatagatgcattcttaaacattttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgagaagcttagatctattaccctgttatccctactaatacgactcactatagacttcaacactcgcattttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgagaagcttagatctattaccctgttatccctactaatacgactcactatagctgaacagtgaatgtggcattttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgag
micC-patl：
taatacgactcactatagacttcaacactcgcattttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgagaagcttagatctattaccctgttatccctactaatacgactcactatagctgaacagtgaatgtggcattttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgagtcgagttcatgtgcagctccataagctaatacgactcactataggatcagcataataatacgggacactttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgag
(3)设计以micC为骨架，同时靶向抑制ptsG，pta，thrA、lysA四个基因的sRNA序列，交由金唯智公司合成，合成序列如下。
micC-pGpatl：
taatacgactcactatagatgcattcttaaacattttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgagaagcttagatctattaccctgttatccctactaatacgactcactatagacttcaacactcgcattttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgagaagcttagatctattaccctgttatccctactaatacgactcactatagctgaacagtgaatgtggcattttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgagtcgagttcatgtgcagctccataagctaatacgactcactataggatcagcataataatacgggacactttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgag
(4)按照实施例13中方法，利用一步克隆酶将合成的片段与环P质粒R-AB-L所获得的线性化载体连接，筛选得到重组质粒R-AB-L-micC(pGpa)，R-AB-L-micC(pat)，R-AB-L-micC(pal)，R-AB-L-micC(pGt)，R-AB-L-micC(pGl)，R-AB-L-micC(tl)，R-AB-L-micC(pGpat)，R-AB-L-micC(pGpal)，R-AB-L-micC(pGtl)，R-AB-L-micC(patl)和R-AB-L-micC(pGpatl)。
实施例16：构建抑制多基因的四氢嘧啶工程菌株
将实施例15中获得的质粒R-AB-L-micC(pGpa)，R-AB-L-micC(pat)，R-AB-L-micC(pal)，R-AB-L-micC(pGt)，R-AB-L-micC(pGl)，R-AB-L-micC(tl)，R-AB-L-micC(pGpat)，R-AB-L-micC(pGpal)，R-AB-L-micC(pGtl)，R-AB-L-micC(patl)和R-AB-L-micC(pGpatl)按实施例2的方式转化，用卡那和壮观霉素双抗性平板筛选，阳性克隆子即为抑制多基因的四氢嘧啶工程菌：ECT-AB-L-pGpa，ECT-AB-L-pat，ECT-AB-L-pal，ECT-AB-L-pGt，ECT-AB-L-pGl，ECT-AB-L-tl，ECT-AB-L-pGpat，ECT-AB-L-pGpal，ECT-AB-L-pGtl，ECT-AB-L-patl和ECT-AB-L-pGpatl，将上述菌株分别在发酵培养基中培养48h，经检测ECT-AB-L-pGt四氢嘧啶产量最高为6500.7mg/L，与ECT-AB-L相比提高了286.1％。
实施例17：四氢嘧啶生产工程菌ECT-AB-L-pGt的发酵培养
(1)种子培养，将ECT-AB-L-pGt基因工程菌进行平板活化，挑取单菌落接入装有5mL的LB液体培养基的50mL离心管中，在37℃、摇床转速为220rpm/min条件下培养8-10h，得到重组菌菌液；
(2)250mL摇瓶培养，按照2％的接种量将步骤(1)获得的重组菌菌液接入含有50mL发酵培养基的250mL摇瓶中，在37℃、摇床转速为220rpm/min条件下培养72h。
(3)3L发酵罐培养，按照2％的接种量将步骤(2)获得的重组菌菌液接入含有1.5L发酵培养基的3L发酵罐中，在30℃条件下培养，通过控制搅拌桨转速来使溶解氧维持在25-35％，通过补加氨水来控制pH维持在7.0-7.2，流加60％的葡萄糖使发酵持续进行。
(4)检测样品制备，取1mL发酵液离心(13000rpm，2min)，将获得的上清使用超纯水稀释适当倍数，再经0.22m的水系微孔滤膜过滤后打入液相瓶中。
(5)HPLC检测，使用Agilent 1260高效液相色谱仪测定四氢嘧啶。设置进样量为5μl，色谱柱为ODS-2C18色谱柱，柱温30℃，流动相为2％乙腈，流速0.6mL/min，紫外检测波长210nm，图3所示为150mg/L四氢嘧啶标样液相色谱检测结果。
(6)LC-MS检测，使用岛津离子阱飞行时间质谱仪LCMS-IT-TOF在正电离模式(ESI+)下鉴定四氢嘧啶。色谱分离采用ZORBAXSB-AQ(100mm×2.1mm，3.5μm，Agilent，美国)色谱柱，温度设置为30℃。流动相为95％甲醇和5％水(含0.1％甲酸)(v/v)的混合物，等度梯度洗脱，流速为0.2mL/min。LC-MS分析的质量扫描范围为m/z 80-400。在LC-MS/MS分析中，以17V的碰撞能量对m/z 143进行了产物离子扫描。破碎电压为110V，毛细管电压和雾化气体压力分别为4.0kV和35psi。干燥气体流速为12ml/min，溶剂去除温度为350℃。使用氮气作为碰撞气体。
(7)经检测，如图5所示发酵72h后发酵液上清稀释30倍的液相色谱检测结果，四氢嘧啶含量可达30g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
湖南御家化妆品制造有限公司
<120> 一种高产四氢嘧啶工程菌株的构建方法与应用
<130> BAA200606A
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2433
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgaacgcaa ccacagagcc ctttacaccc tccgccgacc tggccaagcc cagcgtggcc 60
gatgccgtgg tcggccatga ggcctcaccg ctcttcatcc gcaagccaag ccccgatgac 120
ggctggggca tctacgagct ggtcaagtcc tgtccgcctc tcgacgtcaa ttccgcctac 180
gcctatctgt tgctggccac ccagttccgc gatagctgcg ccgtggcgac caacgaagag 240
ggcgagatcg tcggcttcgt ttccggctac gtgaagagca acgcccccga tacctatttc 300
ctctggcagg ttgccgtggg cgagaaggca cgtggcaccg gcctggcccg tcgtctggtg 360
gaagccgtga tgacacgccc ggaaatggcc gaggtccacc atctcgagac cactatcacg 420
cccgacaacc aggcgtcctg gggcttgttc cgccgtctcg ccgatcgctg gcaggcgccg 480
ttgaacagcc gcgaatactt ctccaccgat caactcggcg gtgagcatga cccggaaaac 540
ctcgttcgca tcggcccgtt ccagaccgac cagatctgag ccgggacgcc gcctggccgg 600
cccggtacgg gccggcaacc cgtcttttcg ttttatcact ttccccccac aggaggtcgc 660
aatgcagacc cagattctcg aacgcatgga gtccgacgtt cggacctact cccgctcctt 720
cccggtcgtc ttcaccaagg cgcgcaatgc ccgcctgacc gacgaggaag ggcgcgagta 780
catcgacttc ctggccggtg ccggcaccct gaactacggc cacaacaacc cgcacctcaa 840
gcaggcgctg ctcgactata tcgacagcga cggcatcgtc cacggcctgg acttctggac 900
tgcggccaag cgcgactatc tggaaaccct ggaagaggtg atcctcaagc cgcgcggtct 960
cgactacaag gtgcatctgc ccggaccgac tggcaccaac gccgtcgagg cggccattcg 1020
cctggcccgg gtcgccaagg ggcgccacaa tatcgtctcc ttcaccaacg gctttcatgg 1080
cgtcaccatg ggcgcgctgg cgaccaccgg taaccgcaag ttccgcgagg ccaccggtgg 1140
cgtgccgacc caggctgctt ccttcatgcc gttcgatggc tacctcggca gcagcaccga 1200
caccctcgac tacttcgaga agctgctcgg cgacaagtcc ggcggcctgg acgtgcccgc 1260
ggcggtgatc gtcgagacag tgcagggcga gggcggtatc aatgtcgccg gcctggagtg 1320
gctcaagcgc ctcgagagca tctgccgcgc caatgacatc ctgctgatca tcgacgacat 1380
ccaggcgggc tgcggccgga ccggcaagtt cttcagcttc gagcatgccg gcatcacgcc 1440
ggatatcgtg accaactcca agtcgctgtc cggttacggc ctgccgttcg ctcacgtcct 1500
gatgcgcccc gagctcgaca agtggaagcc cggtcagtac aacggcacct tccgcggctt 1560
caacctggct ttcgccactg ctgctgccgc catgcgcaag tactggagcg acgacacctt 1620
cgagcgtgac gtgcagcgca aggctcgcat cgtcgaggaa cgcttcggca agatcgccgc 1680
ctggctgagc gagaacggca tcgaggcctc cgagcgcggc cgcgggctga tgcggggcat 1740
cgacgtgggt tccggcgata tcgccgacaa gatcacccac caagccttcg agaacgggtt 1800
gatcatcgaa accagcggtc aggacggcga agtggtcaag tgcctgtgcc cgctgaccat 1860
tcccgacgaa gacctggtcg agggactcga catcctcgag accagcacca agcaggcctt 1920
tagctgatcg cctgaggtgc gccatcgggc ctgtccatgg catcctgtat cggtcggccg 1980
tgcgcggccg gccagtcatt gattcactgg agaatcgaca tgatcgttcg caatctcgaa 2040
gaagcgcgcc agaccgaccg tctggtcacc gccgaaaacg gcaactggga cagcacccgc 2100
ctgtcgctgg ccgaagatgg tggcaactgc tccttccaca tcacccgcat cttcgagggt 2160
accgagaccc acatccacta taagcatcac ttcgaggctg tttattgcat cgaaggcgag 2220
ggcgaagtgg aaaccctggc cgatggcaag atctggccca tcaagccggg tgacatctac 2280
atcctcgacc agcacgacga gcacctgctg cgcgccagca agaccatgca cctggcctgc 2340
gtgttcacgc cgggcctgac cggcaacgaa gtgcaccgcg aagacggttc ctacgcacct 2400
gccgacgaag ccgacgacca gaagccgctg taa 2433
<210> 2
<211> 1266
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atggccctgg tcgtacagaa atatggcggt tcctcgcttg agagtgcgga acgcattaga 60
aacgtcgctg aacggatcgt tgccaccaag aaggctggaa atgatgtcgt ggttgtctgc 120
tccgcaatgg gagacaccac ggatgaactt ctagaacttg cagcggcagt gaatcccgtt 180
ccgccagctc gtgaaatgga tatgctcctg actgctggtg agcgtatttc taacgctctc 240
gtcgccatgg ctattgagtc ccttggcgca gaagcccaat ctttcacggg ctctcaggct 300
ggtgtgctca ccaccgagcg ccacggaaac gcacgcattg ttgatgtcac tccaggtcgt 360
gtgcgtgaag cactcgatga gggcaagatc tgcattgttg ctggtttcca gggtgttaat 420
aaagaaaccc gcgatgtcac cacgttgggt cgtggtggtt ctgacaccac tgcagttgcg 480
ttggcagctg ctttgaacgc tgatgtgtgt gagatttact cggacgttga cggtgtgtat 540
accgctgacc cgcgcatcgt tcctaatgca cagaagctgg aaaagctcag cttcgaagaa 600
atgctggaac ttgctgctgt tggctccaag attttggtgc tgcgcagtgt tgaatacgct 660
cgtgcattca atgtgccact tcgcgtacgc tcgtcttata gtaatgatcc cggcactttg 720
attgccggct ctatggagga tattcctgtg gaagaagcag tccttaccgg tgtcgcaacc 780
gacaagtccg aagccaaagt aaccgttctg ggtatttccg ataagccagg cgaggctgcg 840
aaggttttcc gtgcgttggc tgatgcagaa atcaacattg acatggttct gcagaacgtc 900
tcttctgtag aagacggcac caccgacatc accttcacct gccctcgttc cgacggccgc 960
cgcgcgatgg agatcttgaa gaagcttcag gttcagggca actggaccaa tgtgctttac 1020
gacgaccagg tcggcaaagt ctccctcgtg ggtgctggca tgaagtctca cccaggtgtt 1080
accgcagagt tcatggaagc tctgcgcgat gtcaacgtga acatcgaatt gatttccacc 1140
tctgagattc gtatttccgt gctgatccgt gaagatgatc tggatgctgc tgcacgtgca 1200
ttgcatgagc agttccagct gggcggcgaa gacgaagccg tcgtttatgc aggcaccgga 1260
cgctaa 1266
<210> 3
<211> 2145
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gtgtcccgta ttattatgct gatccctacc ggaaccagcg tcggtctgac cagcgtcagc 60
cttggcgtga tccgtgcaat ggaacgcaaa ggcgttcgtc tgagcgtttt caaacctatc 120
gctcagccgc gtaccggtgg cgatgcgccc gatcagacta cgactatcgt gcgtgcgaac 180
tcttccacca cgacggccgc tgaaccgctg aaaatgagct acgttgaagg tctgctttcc 240
agcaatcaga aagatgtgct gatggaagag atcgtcgcaa actaccacgc taacaccaaa 300
gacgctgaag tcgttctggt tgaaggtctg gtcccgacac gtaagcacca gtttgcccag 360
tctctgaact acgaaatcgc taaaacgctg aatgcggaaa tcgtcttcgt tatgtctcag 420
ggcactgaca ccccggaaca gctgaaagag cgtatcgaac tgacccgcaa cagcttcggc 480
ggtgccaaaa acaccaacat caccggcgtt atcgttaaca aactgaacgc accggttgat 540
gaacagggtc gtactcgccc ggatctgtcc gagattttcg acgactcttc caaagctaaa 600
gtaaacaatg ttgatccggc gaagctgcaa gaatccagcc cgctgccggt tctcggcgct 660
gtgccgtgga gctttgacct gatcgcgact cgtgcgatcg atatggctcg ccacctgaat 720
gcgaccatca tcaacgaagg cgacatcaat actcgccgcg ttaaatccgt cactttctgc 780
gcacgcagca ttccgcacat gctggagcac ttccgtgccg gttctctgct ggtgacttcc 840
gcagaccgtc ctgacgtgct ggtggccgct tgcctggcag ccatgaacgg cgtagaaatc 900
ggtgccctgc tgctgactgg cggctacgaa atggacgcgc gcatttctaa actgtgcgaa 960
cgtgctttcg ctaccggcct gccggtattt atggtgaaca ccaacacctg gcagacctct 1020
ctgagcctgc agagcttcaa cctggaagtt ccggttgacg atcacgaacg tatcgagaaa 1080
gttcaggaat acgttgctaa ctacatcaac gctgactgga tcgaatctct gactgccact 1140
tctgagcgca gccgtcgtct gtctccgcct gcgttccgtt atcagctgac tgaacttgcg 1200
cgcaaagcgg gcaaacgtat cgtactgccg gaaggtgacg aaccgcgtac cgttaaagca 1260
gccgctatct gtgctgaacg tggtatcgca acttgcgtac tgctgggtaa tccggcagag 1320
atcaaccgtg ttgcagcgtc tcagggtgta gaactgggtg cagggattga aatcgttgat 1380
ccagaagtgg ttcgcgaaag ctatgttggt cgtctggtcg aactgcgtaa gaacaaaggc 1440
atgaccgaaa ccgttgcccg cgaacagctg gaagacaacg tggtgctcgg tacgctgatg 1500
ctggaacagg atgaagttga tggtctggtt tccggtgctg ttcacactac cgcaaacacc 1560
atccgtccgc cgctgcagct gatcaaaact gcaccgggca gctccctggt atcttccgtg 1620
ttcttcatgc tgctgccgga acaggtttac gtttacggtg actgtgcgat caacccggat 1680
ccgaccgctg aacagctggc agaaatcgcg attcagtccg ctgattccgc tgcggccttc 1740
ggtatcgaac cgcgcgttgc tatgctctcc tactccaccg gtacttctgg tgcaggtagc 1800
gacgtagaaa aagttcgcga agcaactcgt ctggcgcagg aaaaacgtcc tgacctgatg 1860
atcgacggtc cgctgcagta cgacgctgcg gtaatggctg acgttgcgaa atccaaagcg 1920
ccgaactctc cggttgcagg tcgcgctacc gtgttcatct tcccggatct gaacaccggt 1980
aacaccacct acaaagcggt acagcgttct gccgacctga tctccatcgg gccgatgctg 2040
cagggtatgc gcaagccggt taacgacctg tcccgtggcg cactggttga cgatatcgtc 2100
tacaccatcg cgctgactgc gattcagtct gcacagcagc agtaa 2145
<210> 4
<211> 1434
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgtttaaga atgcatttgc taacctgcaa aaggtcggta aatcgctgat gctgccggta 60
tccgtactgc ctatcgcagg tattctgctg ggcgtcggtt ccgcgaattt cagctggctg 120
cccgccgttg tatcgcatgt tatggcagaa gcaggcggtt ccgtctttgc aaacatgcca 180
ctgatttttg cgatcggtgt cgccctcggc tttaccaata acgatggcgt atccgcgctg 240
gccgcagttg ttgcctatgg catcatggtt aaaaccatgg ccgtggttgc gccactggta 300
ctgcatttac ctgctgaaga aatcgcctct aaacacctgg cggatactgg cgtactcgga 360
gggattatct ccggtgcgat cgcagcgtac atgtttaacc gtttctaccg tattaagctg 420
cctgagtatc ttggcttctt tgccggtaaa cgctttgtgc cgatcatttc tggcctggct 480
gccatcttta ctggcgttgt gctgtccttc atttggccgc cgattggttc tgcaatccag 540
accttctctc agtgggctgc ttaccagaac ccggtagttg cgtttggcat ttacggtttc 600
atcgaacgtt gcctggtacc gtttggtctg caccacatct ggaacgtacc tttccagatg 660
cagattggtg aatacaccaa cgcagcaggt caggttttcc acggcgacat tccgcgttat 720
atggcgggtg acccgactgc gggtaaactg tctggtggct tcctgttcaa aatgtacggt 780
ctgccagctg ccgcaattgc tatctggcac tctgctaaac cagaaaaccg cgcgaaagtg 840
ggcggtatta tgatctccgc ggcgctgacc tcgttcctga ccggtatcac cgagccgatc 900
gagttctcct tcatgttcgt tgcgccgatc ctgtacatca tccacgcgat tctggcaggc 960
ctggcattcc caatctgtat tcttctgggg atgcgtgacg gtacgtcgtt ctcgcacggt 1020
ctgatcgact tcatcgttct gtctggtaac agcagcaaac tgtggctgtt cccgatcgtc 1080
ggtatcggtt atgcgattgt ttactacacc atcttccgcg tgctgattaa agcactggat 1140
ctgaaaacgc cgggtcgtga agacgcgact gaagatgcaa aagcgacagg taccagcgaa 1200
atggcaccgg ctctggttgc tgcatttggt ggtaaagaaa acattactaa cctcgacgca 1260
tgtattaccc gtctgcgcgt cagcgttgct gatgtgtcta aagtggatca ggccggcctg 1320
aagaaactgg gcgcagcggg cgtagtggtt gctggttctg gtgttcaggc gattttcggt 1380
actaaatccg acaacctgaa aaccgagatg gatgagtaca tccgtaacca ctaa 1434
<210> 5
<211> 2463
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atgcgagtgt tgaagttcgg cggtacatca gtggcaaatg cagaacgttt tctgcgggtt 60
gccgatattc tggaaagcaa tgccaggcag gggcaggtgg ccaccgtcct ctctgccccc 120
gccaaaatca ccaaccacct ggtggcgatg attgaaaaaa ccattagcgg ccaggatgct 180
ttacccaata tcagcgatgc cgaacgtatt tttgccgaac ttttgacggg actcgccgcc 240
gcccagccgg gattcccgct ggcgcaattg aaaactttcg tcgatcagga atttgcccaa 300
ataaaacatg tcctgcatgg cattagtttg ttggggcagt gcccggatag catcaacgct 360
gcgctgattt gccgtggcga gaaaatgtcg atcgccatta tggccggcgt attagaagcg 420
cgcggtcaca acgttaccgt tatcgatccg gtcgaaaaac tgctggcagt ggggcattac 480
ctcgaatcta ccgtcgatat tgctgagtcc acccgccgta ttgcggcaag tcgcattccg 540
gctgatcaca tggtgctgat ggcaggtttc accgccggta atgaaaaagg cgaactggtg 600
gtacttggac gcaacggttc cgactactcc gcggcggtgc tggctgcctg tttacgcgcc 660
gattgttgcg agatttggac ggacgttgac ggggtctata cctgcgaccc gcgtcaggtg 720
cccgatgcga ggttgttgaa gtcgatgtcc taccaggaag cgatggagct ttcctacttc 780
ggcgctaaag ttcttcaccc ccgcaccatt acccccatcg cccagttcca gatcccttgc 840
ctgattaaaa ataccggaaa tcctcaagct ccaggtacgc tcattggtgc cagccgtgat 900
gaagacgaat taccggtcaa gggcatttcc aatctgaata atatggcaat gttcagcgtt 960
tccggcccgg ggatgaaagg gatggttggc atggcggcgc gcgtgtttgc agcgatgtca 1020
cgcgcccgta tttccgtggt gctgattacg caatcatctt ccgaatacag tatcagtttc 1080
tgcgttccgc aaagcgactg tgtgcgagct gaacgggcaa tgcaggaaga gttctacctg 1140
gaactgaaag aaggcttact ggagccgctg gcggtgacgg aacggctggc cattatctcg 1200
gtggtaggtg atggtatgcg caccttgcgt gggatctcgg cgaaattctt tgccgcgctg 1260
gcccgcgcca atatcaacat tgtcgccatt gctcagggat cttctgaacg ctcaatctct 1320
gtcgtggtaa ataacgatga tgcgaccact ggcgtgcgcg ttactcatca gatgctgttc 1380
aataccgatc aggttatcga agtgtttgtg attggcgtcg gtggcgttgg cggtgcgctg 1440
ctggagcaac tgaagcgtca acaaagctgg ctgaagaata aacatatcga cttacgtgtc 1500
tgcggtgttg ccaactcgaa ggcactgctc accaatgtgc atggcctaaa tctggaaaac 1560
tggcaggaag aactggcgca agccaaagag ccgtttaatc tcgggcgctt aattcgcctc 1620
gtgaaagaat atcatctgct gaacccggtc attgttgact gcacttccag ccaggcagtg 1680
gcggatcaat atgccgactt cttgcgcgaa ggtttccacg ttgtcacgcc gaacaaaaag 1740
gccaacacct cgtcgatgga ttactaccat ctgttgcgtc atgcggcgga aaaatcgcgg 1800
cgtaaattcc tctatgacac caacgttggg gctggattac cggttattga gaacctgcaa 1860
aatctgctca atgctggtga tgaattgatg aagttctccg gcattctttc aggttcgctt 1920
tcttatatct tcggcaagtt agacgaaggc atgagtttct ccgaggcgac tactctggcg 1980
cgggaaatgg gttataccga accggatccg cgagatgatc tttctggtat ggatgtagcg 2040
cgtaagctat tgattctcgc tcgtgaaacg ggacgtgaac tggagctggc ggatattgaa 2100
attgaacctg tgctgcccgc agagtttaac gctgagggtg atgttgccgc ttttatggcg 2160
aatctgtcac agctcgacga tctctttgcc gcgcgcgtgg cgaaggcccg tgatgaagga 2220
aaagttttgc gctatgttgg caatattgat gaagatggtg cctgccgcgt gaagattgcc 2280
gaagtggatg gtaatgatcc gctgttcaaa gtgaaaaatg gcgaaaacgc cctggccttt 2340
tatagccact attatcagcc gctgccgttg gtgctgcgcg gatatggtgc gggcaatgac 2400
gttacagctg ccggtgtctt tgccgatctg ctacgtaccc tctcatggaa gttaggagtc 2460
tga 2463
<210> 6
<211> 1263
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ttaaagcaat tccagcgcca gtaattcttc gatggtctgg cgacggcgaa tcaaccgcgc 60
ctgaccatta tcaaacagaa cttctggtaa cagcggacgg ctattgtagt tggatgacat 120
tgatgcgcca tatgcccctg tatcatgcag taccagataa tcacctgcct tcacttccgg 180
caaggcgcgg gtttcaacat ttcccccttc ctgctgggta aagacatcgc ccgattcaca 240
taacggtccg gcgacgacgg tttccaccgt tggcgcgtgt tccagagaac gaccatcagc 300
tgccagggca ctgatatggt ggtaactacc gtacattgcc gggcgcatca gatcgttgaa 360
cccggcatca accagcacaa agtggcggct ccccatttgt ttgacgctcc gcacctgagt 420
aattaatacg ccagactgcg ctaccaggaa gcgacccggt tcaatttcca gtttcacagg 480
gtggcccaaa tggcgggcga tttgctcacg cgcggcattc cacagaccat aataatgttc 540
ggtatcaacc gcctcttcac cctgttgata aggaacagaa agcccaccgc ccgcagaaat 600
agcctgtaaa tcctgaccga attcgatgac ctgacgcacc atagcaccac acacctgttc 660
cagatgggca taatcaacgc cagaaccaat gtgcatgtga atgccgacca gctgcagatg 720
atgacgttgt atcacgtcca gtgcggcggg cagatcggtg taccagatac cgtgcttgct 780
gttttcgcca ccggtattgg ttttttggct atgtccgtga ccaaaccccg gattaacgcg 840
cagccatacc cgatgccctg gcgaaacctg gcccagttgg tcgagcatat caacagaacc 900
cgcattcacc ggaatttgca attcactgac gcgttcaagc gtcgcctgat cgataacatc 960
tgccgtaaaa acaatatcat cggggtgcgt ttgcggattg taacccgccg ccaacgcacg 1020
ctctatttcg cctaacgaga cggaatccac tttcacgccc tgctcacgca ttaagcgcaa 1080
aatatgaata ttggaacagg ctttctgtgc aaagcgcacc acatcaaact gtttcagcgc 1140
tgcaatctgc cgacgaataa tttgcgcatc gtagacccac accgggcagc caaattcagc 1200
gggcaaacgc agcagatttt cggcggtgag atcggtatcg gtgctgaaca gtgaatgtgg 1260
cat 1263
<210> 7
<211> 3829
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ggggaattgt gagcggataa caattcccct gtagaaataa ttttgtttaa ctttaataag 60
gagatatacc atgggcagca gccatcacca tcatcaccac agccaggatc cgaattcgag 120
ctcggcgcgc ctgcaggtcg acaagcttgc ggccgcataa tgcttaagtc gaacagaaag 180
taatcgtatt gtacacggcc gcataatcga aattaatacg actcactata ggggaattgt 240
gagcggataa caattcccca tcttagtata ttagttaagt ataagaagga gatatacata 300
tggcagatct caattggata tcggccggcc acgcgatcgc tgacgtcggt accctcgagt 360
ctggtaaaga aaccgctgct gcgaaatttg aacgccagca catggactcg tctactagcg 420
cagcttaatt aacctaggct gctgccaccg ctgagcaata actagcataa ccccttgggg 480
cctctaaacg ggtcttgagg ggttttttgc tgaaacctca ggcatttgag aagcacacgg 540
tcacactgct tccggtagtc aataaaccgg taaaccagca atagacataa gcggctattt 600
aacgaccctg ccctgaaccg acgacaagct gacgaccggg tctccgcaag tggcactttt 660
cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat 720
ccgctcatga attaattctt agaaaaactc atcgagcatc aaatgaaact gcaatttatt 780
catatcagga ttatcaatac catatttttg aaaaagccgt ttctgtaatg aaggagaaaa 840
ctcaccgagg cagttccata ggatggcaag atcctggtat cggtctgcga ttccgactcg 900
tccaacatca atacaaccta ttaatttccc ctcgtcaaaa ataaggttat caagtgagaa 960
atcaccatga gtgacgactg aatccggtga gaatggcaaa agtttatgca tttctttcca 1020
gacttgttca acaggccagc cattacgctc gtcatcaaaa tcactcgcat caaccaaacc 1080
gttattcatt cgtgattgcg cctgagcgag acgaaatacg cggtcgctgt taaaaggaca 1140
attacaaaca ggaatcgaat gcaaccggcg caggaacact gccagcgcat caacaatatt 1200
ttcacctgaa tcaggatatt cttctaatac ctggaatgct gttttcccgg ggatcgcagt 1260
ggtgagtaac catgcatcat caggagtacg gataaaatgc ttgatggtcg gaagaggcat 1320
aaattccgtc agccagttta gtctgaccat ctcatctgta acatcattgg caacgctacc 1380
tttgccatgt ttcagaaaca actctggcgc atcgggcttc ccatacaatc gatagattgt 1440
cgcacctgat tgcccgacat tatcgcgagc ccatttatac ccatataaat cagcatccat 1500
gttggaattt aatcgcggcc tagagcaaga cgtttcccgt tgaatatggc tcatactctt 1560
cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt 1620
tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg catgcagcgc tcttccgctt cctcgctcac 1680
tgactcgcta cgctcggtcg ttcgactgcg gcgagcggtg tcagctcact caaaagcggt 1740
aatacggtta tccacagaat caggggataa agccggaaag aacatgtgag caaaaagcaa 1800
agcaccggaa gaagccaacg ccgcaggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 1860
atcacaaaaa tcgacgctca agccagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 1920
aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 1980
gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgtt 2040
ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg 2100
ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac 2160
acgacttatc gccactggca gcagccattg gtaactgatt tagaggactt tgtcttgaag 2220
ttatgcacct gttaaggcta aactgaaaga acagattttg gtgagtgcgg tcctccaacc 2280
cacttacctt ggttcaaaga gttggtagct cagcgaacct tgagaaaacc accgttggta 2340
gcggtggttt ttctttattt atgagatgat gaatcaatcg gtctatcaag tcaacgaaca 2400
gctattccgt tactctagat ttcagtgcaa tttatctctt caaatgtagc acctgaagtc 2460
agccccatac gatataagtt gtaattctca tgttagtcat gccccgcgcc caccggaagg 2520
agctgactgg gttgaaggct ctcaagggca tcggtcgaga tcccggtgcc taatgagtga 2580
gctaacttac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt 2640
gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgcc 2700
agggtggttt ttcttttcac cagtgagacg ggcaacagct gattgccctt caccgcctgg 2760
ccctgagaga gttgcagcaa gcggtccacg ctggtttgcc ccagcaggcg aaaatcctgt 2820
ttgatggtgg ttaacggcgg gatataacat gagctgtctt cggtatcgtc gtatcccact 2880
accgagatgt ccgcaccaac gcgcagcccg gactcggtaa tggcgcgcat tgcgcccagc 2940
gccatctgat cgttggcaac cagcatcgca gtgggaacga tgccctcatt cagcatttgc 3000
atggtttgtt gaaaaccgga catggcactc cagtcgcctt cccgttccgc tatcggctga 3060
atttgattgc gagtgagata tttatgccag ccagccagac gcagacgcgc cgagacagaa 3120
cttaatgggc ccgctaacag cgcgatttgc tggtgaccca atgcgaccag atgctccacg 3180
cccagtcgcg taccgtcttc atgggagaaa ataatactgt tgatgggtgt ctggtcagag 3240
acatcaagaa ataacgccgg aacattagtg caggcagctt ccacagcaat ggcatcctgg 3300
tcatccagcg gatagttaat gatcagccca ctgacgcgtt gcgcgagaag attgtgcacc 3360
gccgctttac aggcttcgac gccgcttcgt tctaccatcg acaccaccac gctggcaccc 3420
agttgatcgg cgcgagattt aatcgccgcg acaatttgcg acggcgcgtg cagggccaga 3480
ctggaggtgg caacgccaat cagcaacgac tgtttgcccg ccagttgttg tgccacgcgg 3540
ttgggaatgt aattcagctc cgccatcgcc gcttccactt tttcccgcgt tttcgcagaa 3600
acgtggctgg cctggttcac cacgcgggaa acggtctgat aagagacacc ggcatactct 3660
gcgacatcgt ataacgttac tggtttcaca ttcaccaccc tgaattgact ctcttccggg 3720
cgctatcatg ccataccgcg aaaggttttg cgccattcga tggtgtccgg gatctcgacg 3780
ctctccctta tgcgactcct gcattaggaa attaatacga ctcactata 3829
<210> 8
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aaggaggaaa atat 14

Claims (9)

1.一种生产四氢嘧啶的大肠杆菌工程菌，其特征在于，进行了如（a）~（c）的改进：
（a）以pRSFDuet-1为载体表达了伸长盐单胞菌来源的EctABC基因簇，编码伸长盐单胞菌来源的二氨基丁酸转乙酰基酶、二氨基丁酸转氨酶的基因和四氢嘧啶合成酶基因，并表达了谷氨酸棒杆菌来源的天冬氨酸激酶；
（b）替换了编码二氨基丁酸转乙酰基酶的基因ectA和编码二氨基丁酸转氨酶的基因ectB的RBS序列；
（c）抑制了thrA基因的表达，或抑制了ptsG和thrA基因的表达；
所述EctABC基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述二氨基丁酸转乙酰基酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第1~579bp所示；所述二氨基丁酸转氨酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.1第662~1927bp所示；所述二氨基丁酸转乙酰基酶基因的RBS替换为SEQ ID NO.7第287~300bp所示序列、二氨基丁酸转氨酶基因的RBS均替换为SEQ ID NO.8所示序列；编码所述天冬氨酸激酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，宿主为E. coli BL21、 E.coli BL21（DE3）、E. coli JM109、E. coli DH5α或E. coli TOP10。
3.构建权利要求1或2所述大肠杆菌工程菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）以线性化的质粒pRSFDuet-1表达EctABC基因簇，获得重组质粒pR-ABC，并转化至E.coli BL21(DE3)感受态得到重组菌株E/pR-ABC；
（2）分别替换pR-ABC上ectA和ectB基因的RBS序列，获得重组质粒R-AB，再将重组质粒R-AB转化至E. coli BL21(DE3)感受态，得到重组菌株ECT-AB；
（3）将天冬氨酸激酶基因连接至表达载体R-AB的第二个T7启动子表达框处，并对第932位核苷酸进行C932T定点突变，得到重组质粒R-AB-L，再将重组质粒R-AB-L转化至E. coliBL21(DE3)感受态，得到重组菌株。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤（3）后，设计以micC为骨架靶向基因thrA的sRNA序列，合成并插入到质粒R-AB-L中，得到重组质粒R-AB-L-micC（thrA），再转化至E. coli BL21(DE3)感受态中。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤（3）后，设计以micC为骨架靶向基因ptsG和thrA的sRNA序列，合成并插入到质粒R-AB-L中，得到重组质粒R-AB-L-micC（pGt），再转化至E. coli BL21(DE3)感受态中。
6.权利要求1或2所述的大肠杆菌工程菌在制备四氢嘧啶或含四氢嘧啶的产品中的应用。
7.一种生产四氢嘧啶的方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的大肠杆菌工程菌在含酵母提取物、蛋白胨、KH2PO4、Na2HPO4、(NH4)2SO4、FeSO4、葡萄糖的培养基中发酵。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵在28~37℃下进行。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，控制发酵体系的溶解氧维持在25-35%，控制pH维持在7.0-7.2。
CN202011191374.8A 2020-10-30 2020-10-30 一种高产四氢嘧啶工程菌株的构建方法与应用 Active CN112280726B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011191374.8A CN112280726B (zh) 2020-10-30 2020-10-30 一种高产四氢嘧啶工程菌株的构建方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011191374.8A CN112280726B (zh) 2020-10-30 2020-10-30 一种高产四氢嘧啶工程菌株的构建方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112280726A CN112280726A (zh) 2021-01-29
CN112280726B true CN112280726B (zh) 2024-03-15

Family

ID=74353311

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011191374.8A Active CN112280726B (zh) 2020-10-30 2020-10-30 一种高产四氢嘧啶工程菌株的构建方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112280726B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112342254B (zh) * 2021-01-08 2021-04-23 江苏省中国科学院植物研究所 一种发酵生产四氢甲基嘧啶羧酸的方法
CN112961815B (zh) * 2021-02-26 2022-07-01 南京工业大学 一种高产四氢嘧啶的基因工程菌及其应用
CN113186143B (zh) * 2021-04-14 2024-01-30 江南大学 一种产四氢嘧啶工程菌株的构建及优化的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105018403A (zh) * 2015-07-14 2015-11-04 天津科技大学 一种产生四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用
CN108441460A (zh) * 2018-03-21 2018-08-24 天津科技大学 一种高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用
CN109182236A (zh) * 2018-08-29 2019-01-11 浙江工业大学 一种重组大肠杆菌及合成四氢嘧啶的应用
CN110699310A (zh) * 2019-11-05 2020-01-17 无锡晶扬生物科技有限公司 一种四氢嘧啶高产谷氨酸棒杆菌及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105018403A (zh) * 2015-07-14 2015-11-04 天津科技大学 一种产生四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用
CN108441460A (zh) * 2018-03-21 2018-08-24 天津科技大学 一种高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用
CN109182236A (zh) * 2018-08-29 2019-01-11 浙江工业大学 一种重组大肠杆菌及合成四氢嘧啶的应用
CN110699310A (zh) * 2019-11-05 2020-01-17 无锡晶扬生物科技有限公司 一种四氢嘧啶高产谷氨酸棒杆菌及其应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Heterologous Ectoine Production in Escherichia coli: Optimization Using Response Surface Methodology;I Putu Parwata et al.;《International Journal of Microbiology》;20190701;第2019卷;第1-13页 *
Identification and Characterization of Ectoine Biosynthesis Genes and Heterologous Expression of the ectABC Gene Cluster from Halomonas sp QHL1, a Moderately Halophilic Bacterium Isolated from Qinghai Lake;Derui Zhu et al.;《Journal of Microbiology》;20140228;第52卷(第2期);第139-147页 *
Pathway construction and metabolic engineering for fermentative production of ectoine in Escherichia coli;Yike Ning et al.;《Metabolic Engineering》;20160309;摘要、第11页图1 *
Yike Ning et al..Pathway construction and metabolic engineering for fermentative production of ectoine in Escherichia coli.《Metabolic Engineering》.2016,第10-18页. *
大肠杆菌中四氢嘧啶合成通路的构建及优化;龚皎;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士) 基础科学辑》;20120915;第34页第3.2.2节 *
大肠杆菌发酵生产四氢嘧啶的途径构建及代谢改造;宁义科;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士) 工程科技Ⅰ辑》;20170715;摘要 *
宁义科.大肠杆菌发酵生产四氢嘧啶的途径构建及代谢改造.《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士) 工程科技Ⅰ辑》.2017,第B018-58页. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112280726A (zh) 2021-01-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112280726B (zh) 一种高产四氢嘧啶工程菌株的构建方法与应用
JP6679803B2 (ja) 新規プロモーター及びその用途
CN110699310B (zh) 一种四氢嘧啶高产谷氨酸棒杆菌及其应用
CN113755354B (zh) 利用葡萄糖生产天麻素的重组酿酒酵母及其用途
CN111394288B (zh) 重组谷氨酸棒杆菌、其构建方法及其生产四氢嘧啶的方法
CN112063572B (zh) 一种高产o-乙酰-l-高丝氨酸的重组大肠杆菌及其应用
CN110819650A (zh) 一种产β-榄香烯工程菌株及应用
CN113337450A (zh) 一种大肠杆菌基因工程菌、构建方法以及全细胞催化生产(r)-香茅醛的方法
CN114480235B (zh) 一种代谢工程改造大肠杆菌发酵制备α-酮异戊酸的方法
CN115851810A (zh) 酿酒酵母从头合成柚皮素工程菌株及其构建方法与应用
CN113502254B (zh) 橄榄醇合成酶变体和表达其的工程化微生物
CN113502255B (zh) 用于生产橄榄醇和橄榄醇酸的工程化微生物
CN107287144B (zh) 一种代谢改造的枯草芽孢杆菌生物转化细胞及其制备方法与应用
CN112574898A (zh) 一种用于生产叶黄素的重组酵母及其应用
CN107674889B (zh) 一种酶反应合成1,2,4-丁三醇的方法
CN114426983B (zh) 敲除谷氨酸棒杆菌中转录调控因子Ncgl0580生产5-氨基乙酰丙酸的方法
CN112779197A (zh) 利用大肠杆菌及基因工程菌生产乙二醇和乙醇酸的方法
CN107988131B (zh) 一种高产α-酮-γ-甲硫基丁酸的方法
CN115109738A (zh) 一种生产l-高丝氨酸的重组大肠杆菌及其应用
KR102303662B1 (ko) 화합물을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 화합물의 생산 방법
CN113308426A (zh) 一种改造tk基因5′端序列的重组棒状杆菌及其应用
KR20170030824A (ko) 하프니아 알베이 유래의 라이신 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자, 이를 포함하는 재조합 벡터, 숙주세포 및 이를 이용한 카다베린의 생산방법
US20140273122A1 (en) Novel microorganism of the genus bacillus
CN115109793B (zh) 一种从头合成络缌的重组大肠杆菌及其构建方法和应用
CN117448249A (zh) 一种生产依克多因的工程菌及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: 214000 1800 Lihu Avenue, Binhu District, Wuxi, Jiangsu

Applicant after: Jiangnan University

Applicant after: Shuiyang Cosmetics Manufacturing Co.,Ltd.

Address before: 214000 1800 Lihu Avenue, Binhu District, Wuxi, Jiangsu

Applicant before: Jiangnan University

Applicant before: HUNAN YUJIA COSMETICS MANUFACTURING Co.,Ltd.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant