CN110699310A - 一种四氢嘧啶高产谷氨酸棒杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种四氢嘧啶高产谷氨酸棒杆菌及其应用，属于生物工程领域。本发明通过对谷氨酸棒杆菌天冬氨酸激酶基因lysC进行定点突变，解除了产物的反馈抑制，并通过置换启动子强化突变的LysC的表达。进一步，通过置换启动子进一步强化宿主菌的磷酸戊糖途径以满足四氢嘧啶高效合成中对还原力NADPH的需求。最后，将来源于施氏假单胞菌P.stutzeri的四氢嘧啶合成基因簇ectABC转入上述重组菌获得四氢嘧啶高产谷氨酸棒杆菌。本发明的重组谷氨酸棒杆菌可以利用葡萄糖和玉米浆等廉价原料高效合成四氢嘧啶，与重组大肠杆菌生产菌株相比具有更好的生物安全性，对四氢嘧啶的工业化生产和大规模应用具有重大意义。

Description

一种四氢嘧啶高产谷氨酸棒杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种四氢嘧啶高产谷氨酸棒杆菌及其应用，属于生物工程领域。
背景技术
四氢嘧啶是一种广泛存在于耐盐及嗜盐微生物中的相容性溶质，四氢嘧啶作为一种渗透压调节物质具有稳定蛋白质、核酸、生物膜以及整个细胞的功能，可以增强细胞在多种逆境(如高盐、热、干燥和冷冻等)中的耐受性。因此，在医药、美容以及酶制剂等众多领域展现出重要的应用价值和广泛的应用前景。
目前，四氢嘧啶主要是利用嗜盐微生物通过“细菌挤奶法”发酵生产，通过高盐诱导合成、低盐释放，渗透压多次循环冲击实现四氢嘧啶的胞内积累和分泌。该方法虽然可以获得较高的产量，但复杂的工艺流程对生产设备的要求高，高盐浓度的培养基不仅会腐蚀设备而且会增加下游纯化的难度，导致生产成本居高不下。
目前虽然已开发出利用重组大肠杆菌在低盐条件下合成四氢嘧啶的方法，避免了使用高盐培养基带来的一些弊端，但由于大肠杆菌本身会产生内毒素，并且大肠杆菌大规模发酵经常面临噬菌体污染的问题，因此，严重制约了大肠杆菌用于四氢嘧啶的工业化生产和大规模应用。与大肠杆菌相比，谷氨酸棒杆菌作为另一种成熟的工业微生物生产菌株，具有发酵稳定、不产内毒素的特点，是公认的安全菌株，因此，开发一种四氢嘧啶谷氨酸棒杆菌高产菌株从而简化生产工艺、提高合成效率、降低生产成本，对四氢嘧啶的应用有重要的实践意义。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是利用重组大肠杆菌发酵生产四氢嘧啶时，存在的内毒素、噬菌体污染问题。
[技术方案]
本发明提供了一种重组谷氨酸棒杆菌，能够用于合成四氢嘧啶，所述重组谷氨酸棒杆菌表达了来自耐盐细菌的四氢嘧啶合成基因簇ectABC。进一步地，所述重组谷氨酸棒杆菌中lysC基因编码的天冬氨酸激酶发生了定点突变，第311位的苏氨酸突变为异亮氨酸。进一步地，所述重组谷氨酸棒杆菌中编码天冬氨酸激酶的基因lysC的启动子被替换为谷氨酸棒杆菌强组成型启动子Pglya。进一步地，所述重组谷氨酸棒杆菌中的磷酸戊糖途径基因簇的启动子被替换为谷氨酸棒杆菌强组成型启动子Pglya。
在本发明的一种实施方式中，所述四氢嘧啶合成基因簇ectABC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示序列中的27～2294bp。
在本发明的一种实施方式中，以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为宿主。
在本发明的一种实施方式中，表达耐盐细菌的四氢嘧啶合成基因簇ectABC时，以质粒pXMJ19为表达质粒，以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为宿主。
在本发明的一种实施方式中，定点突变的编码天冬氨酸激酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10的209～1474bp所示。可以利用Gibson Assembly构建含突变位点序列的同源重组片段，通过同源重组将谷氨酸棒杆菌基因组上编码天冬氨酸激酶的基因置换为发生定点突变后的基因。
在本发明的一种实施方式中，所述启动子Pglya的核苷酸序列如SEQ ID NO.10中的1～176bp所示。
在本发明的一种实施方式中，置换启动子时，可以采用Gibson Assembly构建同源重组片段，通过同源重组置换谷氨酸棒杆菌基因组上的启动子。
本发明还提供了一种提高谷氨酸棒杆菌合成四氢嘧啶产量的方法，是对谷氨酸棒杆菌四氢嘧啶相关合成途径进行了改造，包括：首先对四氢嘧啶合成途径中的关键酶天冬氨酸激酶基因LysC定点突变解除了苏氨酸和赖氨酸对该酶的反馈抑制；接着通过启动子置换强化突变后的LysC基因的表达从而进一步加强四氢嘧啶合成前体L-天冬氨酸磷酸盐的积累；然后通过置换启动子进一步强化宿主菌的磷酸戊糖途径以满足四氢嘧啶高效合成中对还原力NADPH的需求；最后通过表达耐盐菌特有的四氢嘧啶合成基因簇ectABC赋予谷氨酸棒杆菌合成四氢嘧啶的能力，该菌株在发酵罐进行高密度发酵培养实现了四氢嘧啶的高效分泌。
在本发明的一种实施方式中，所述四氢嘧啶合成基因簇ectABC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的27～2294bp所示。
在本发明的一种实施方式中，表达耐盐菌的四氢嘧啶合成基因簇ectABC时，以质粒pXMJ19为表达质粒。
在本发明的一种实施方式中，所述四氢嘧啶合成基因簇ectABC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的27～2294bp所示；表达耐盐菌的四氢嘧啶合成基因簇ectABC时，以质粒pXMJ19为表达质粒。
在本发明的一种实施方式中，定点突变的编码天冬氨酸激酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10的209～1474bp所示。
在本发明的一种实施方式中，所述启动子Pglya的核苷酸序列如SEQ ID NO.10中的1～176bp所示。
本发明还提供了应用所述重组谷氨酸棒杆菌发酵生产四氢嘧啶的方法，包括种子培养和发酵培养，发酵培养过程中，先培养繁殖重组菌，然后，诱导表达四氢嘧啶合成基因簇ectABC。
在本发明一种实施方式中，种子培养基为BHI培养基，即37g/L的脑心浸出液。种子培养基中，还可以视菌株携带质粒的情况添加抗生素。
在本发明一种实施方式中，摇瓶发酵培养基(CGXII)：每升培养基含(NH4)2SO4 5g，尿素5g，MOPS 21g，K2HPO4 1g，KH2PO4 1g，MgSO4 250mg，CaCl2 10mg，生物素0.2mg，1ml微量元素，葡萄糖40g。微量元素：每升含FeSO4·7H2O 16.4g，MnSO4·H2O 100mg，CuSO4 200mg，ZnSO4·7H2O 1g，NiCl2·6H2O 20mg。视菌株携带质粒的情况添加抗生素，例如：添加终浓度为12.5μg/ml氯霉素。
在本发明一种实施方式中，发酵罐发酵培养基：每升培养基含玉米浆15-20g，(NH4)2SO4 15-20g，糖蜜5-10g，丝肽粉0.5-1g，尿素1-2g K2HPO4 1-2g，KH2PO4 1-2g，MgSO4250-300mg，生物素0.2-0.4mg，微量元素1-2mL，葡萄糖30-40g；每升微量元素含：KI 15mg，FeSO4·7H2O 16.4g，MnSO4·H2O 100mg，CuSO4 200mg，ZnSO4·7H2O 1g，NiCl2·6H2O 20mg。视菌株携带质粒的情况添加抗生素，例如：添加终浓度为12.5μg/ml氯霉素。补料培养基：每升含葡萄糖400g,(NH4)2SO4 50g。
在本发明一种实施方式中，以10％的接种量将种子液接种到1L发酵罐培养基当中，发酵采用2.5L的发酵罐，控制温度为30℃，通气量为1vvm，通过流加3M磷酸和3M氨水维持pH值稳定在6.8-7.2。发酵6小时左右OD600到10时加入终浓度为0.5mM的IPTG；发酵16小时后开始流加补料培养基维持葡萄糖浓度在2-5g/L范围。整个发酵过程中调整转速使得溶氧水平保持在10％以上。所述发酵罐发酵培养基：每升培养基含玉米浆15-20g，(NH4)2SO4 15-20g，糖蜜5-10g，丝肽粉0.5-1g，尿素1-2g K2HPO4 1-2g，KH2PO4 1-2g，MgSO4 250-300mg，生物素0.2-0.4mg，微量元素1-2mL，葡萄糖30-40g；每升微量元素含：KI 15mg，FeSO4·7H2O16.4g，MnSO4·H2O 100mg，CuSO4 200mg，ZnSO4·7H2O 1g，NiCl2·6H2O 20mg。
[有益效果]
本发明通过在谷氨酸棒杆菌中表达耐盐菌特有的四氢嘧啶合成基因簇ectABC赋予谷氨酸棒杆菌合成分泌四氢嘧啶的能力。
本发明对谷氨酸棒杆菌中的四氢嘧啶合成途径中的关键酶天冬氨酸激酶基因lysC进行了定点突变，解除了苏氨酸和赖氨酸对该酶的反馈抑制，提高了四氢嘧啶的产量。
本发明将谷氨酸棒杆菌中天冬氨酸激酶基因lysC的启动子替换为谷氨酸棒杆菌强组成型启动子Pglya，从而加强四氢嘧啶合成前体L-天冬氨酸磷酸盐的积累，提高了四氢嘧啶的产量。
本发明通过置换启动子，强化谷氨酸棒杆菌的磷酸戊糖途径以满足四氢嘧啶高效合成中对还原力NADPH的需求。
本发明构建的重组谷氨酸棒杆菌CG-ECT3在2.5L发酵罐上发酵60h，能够产出41.2g/L的四氢嘧啶，单位菌体的四氢嘧啶产量达到1.83g/g(CDW)。
附图说明
图1为重组谷氨酸棒杆菌中四氢嘧啶的合成途径
图2为重组菌株摇瓶培养四氢嘧啶合成水平的比较
图3为重组菌株CG-ECT3发酵罐培养合成四氢嘧啶的分析
具体实施方式
谷氨酸棒杆菌的培养及四氢嘧啶的检测
(1)种子液培养
将谷氨酸棒杆菌野生菌株ATCC13032以及重组菌株在BHI平板上过夜培养。挑取单菌落接种到含有20ml种子培养基的100ml摇瓶中，30℃，200rpm培养12小时。
种子培养基的配方：BHI(即脑心浸出液37g/L)。带有质粒pXMJ19-EctABC的四氢嘧啶表达菌株需在培养基中额外添加终浓度为12.5μg/ml的氯霉素。
(2)摇瓶发酵培养
以5％接种量将种子液接种到装有50ml发酵培养基的250ml摇瓶中，30℃，200rpm培养48小时。其中，培养约4小时，OD600达到2时添加终浓度为0.5mM的IPTG。分别在培养24小时和48小时时取样测定四氢嘧啶的含量。
摇瓶发酵培养基(CGXII)：每升培养基含(NH4)2SO4 5g，尿素5g，MOPS 21g，K2HPO41g，KH2PO4 1g，MgSO4 250mg，CaCl2 10mg，生物素0.2mg，1ml微量元素，葡萄糖40g。微量元素：每升含FeSO4·7H2O 16.4g，MnSO4·H2O 100mg，CuSO4 200mg，ZnSO4·7H2O 1g，NiCl2·6H2O 20mg。抗生素终浓度为12.5μg/ml的氯霉素。
(3)四氢嘧啶的检测
发酵液上清采用高效液相色谱法测定四氢嘧啶含量，HPLC检测仪为Agilent1260Infinity LC，检测柱为Agilent ZOBAX-NH2氨基柱，紫外检测波长为215nm，流动相70％(V/V)乙腈水溶液,流速为1.0mL/min，进样量为10uL，采用外标法按峰面积定量。Sigma四氢嘧啶标准品作为定性及定量标准。
实施例1：重组谷氨酸棒杆菌四氢嘧啶高产菌株的构建及改造
(1)四氢嘧啶表达质粒的构建
根据施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri A1501)中的四氢嘧啶合成基因簇ectABC设计引物ect-PF和ect-PR，以施氏假单胞菌A1501基因组DNA为模板PCR扩增出5’端带有人工设计的RBS的ectABC基因(带有人工设计的RBS的ectABC基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，其中，1～26bp为人工设计的RBS)，获得约为2.3kb的基因片段并进行PCR产物纯化。
引物：
ect-PF：acagaattaattaagcttgtttaactttaagaaggagatataccatgcctaccctaaaaaggaattcaatcaac，SEQ ID NO.2，
ect-PR：agctcggtacccggggatcctcagacggtttcggcctccagagga，SEQ ID NO.3。
以谷氨酸棒杆菌商业化表达质粒pXMJ19(公司：Biovector Co.,LTD,北京；目录号：Biovector6476432)为模板，设计引物pXMJ19-PF1、pXMJ19-PR1扩增得到大小为6.4kb的pXMJ19片段并进行PCR产物纯化。
引物：pXMJ19-PF1：ggatccccgggtaccgagct，即SEQ ID NO.4；
pXMJ19-PR1：aagcttaattaattctgtttcctgtgtgaa，即SEQ ID NO.5。
用Gibson Assembly试剂盒(NEB公司)将带有人工设计的RBS的ectABC片段以及pXMJ19片段相连接，获得的质粒命名为pXMJ19-ectABC。
利用电穿孔仪(BIO-RAD)将重组质粒pXMJ19-ectABC通过电转化转入到谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，电击条件为电压2.5KV，电阻200Ω，电容25μF(电击杯宽度为2mm)，在含有12.5mg/L氯霉素的BHI平板上筛选获得重组菌并命名为CG-ECT。
将谷氨酸棒杆菌野生菌株ATCC13032以及重组菌株CG-ECT分别在BHI平板上过夜培养。挑取单菌落接种到含有20ml种子培养基的100ml摇瓶中，30℃，200rpm培养12小时。以5％接种量将种子液接种到装有50ml发酵培养基的250ml摇瓶中，30℃，200rpm培养48小时。其中培养约4小时OD600达到2时添加终浓度为0.5mM的IPTG。
摇瓶发酵结束后，利用HPLC测定发酵上清液中的四氢嘧啶的含量。结果表明，重组菌株CG-ECT菌可以利用CGXII培养基中的葡萄糖、尿素和硫酸铵为底物从头合成四氢嘧啶，摇瓶发酵培养24小时和48小时，发酵液上清中的四氢嘧啶的含量分别达到0.95g/L和1.21g/L。谷氨酸棒杆菌野生菌株ATCC13032的发酵液上清中未检测出四氢嘧啶。
(2)点突变解除天冬氨酸激酶LysC的反馈抑制
在四氢嘧啶的合成途径中，天冬氨酸激酶LysC催化天门冬氨酸到四氢嘧啶的第一步反应，该酶的催化活性直接影响四氢嘧啶的合成效率，而谷氨酸棒杆菌内源的天冬氨酸激酶与大肠杆菌一样都受到苏氨酸和赖氨酸的反馈抑制。因此本发明通过对谷氨酸棒杆菌lysC基因中引入点突变T311I以解除苏氨酸和赖氨酸对该酶的反馈抑制。
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，用引物LysC-PF1和LysC-PR1进行PCR扩增，获得带有突变位点的大小为0.7Kb的上游同源臂片段LysC1。用引物LysC-PF2和LysC-PR2进行PCR扩增，获得带有突变位点的大小为0.7Kb的下游同源臂片段LysC2。将谷氨酸棒杆菌自杀性质粒pK18mobsacB(Gene,145(1994)69-73)用限制性内切酶BamHI线性化，利用Gibson Assembly试剂盒(NEB)将片段LysC1和LysC2一步连接到pK18mobsacB上，获得同源重组打靶质粒pK18-LysC1。
引物：
LysC-PF1：aattcgagctcggtacccggtctaacgctctcgtcgccatggcta，即SEQ ID NO.6；
LysC-PR1：agggcaggtgaaaatgatgtcggtgg，即SEQ ID NO.7；
LysC-PF2：ccaccgacatcattttcacctgccct，即SEQ ID NO.8；
LysC-PR2：gcctgcaggtcgactctagacggaagggttcacctcagagacgat，即SEQ ID NO.9。
利用电穿孔仪(BIO-RAD)将重组质粒pK18-LysC1通过电转化转入到谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，电击条件为电压2.5KV，电阻200Ω，电容25μF(电击杯宽度为2mm)，转化子在含25mg/L卡那霉素的BHI平板上进行第一次筛选获得单交换重组菌，在BHI液体培养基里过夜培养后稀释涂布于含有20％蔗糖的BHI平板上进行二次筛选获得同源重组双交换菌株。双交换重组菌用引物LysC-PF1和LysC-PR2进行PCR扩增，测序鉴定突变位点。测序正确的菌株命名为CG-LysC1，该菌基因组DNA上编码的天冬氨酸激酶第311位的苏氨酸突变为异亮氨酸，该突变解除了苏氨酸和赖氨酸对LysC的反馈抑制。
将重组质粒pXMJ19-ectABC通过电转化转入突变菌株CG-LysC1中，获得重组菌并命名为CG-ECT1。利用CGXII培养基发酵培养24小时，发酵液上清中的四氢嘧啶的含量达到1.62g/L，比CG-ECT提高了75％。
(3)启动子置换增强天冬氨酸激酶LysC的表达
利用谷氨酸棒杆菌强组成型启动子Pglya替换LysC基因原始的启动子Plysc，以增强天冬氨酸激酶的表达，进一步促进四氢嘧啶的合成。
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，用两组引物LysC-PF3、LysC-PR3和LysC-PF4、LysC-PR4分别扩增出同源重组上游和下游的同源臂，大小均约为500bp并进行PCR产物纯化。用引物GlyA-PF1和GlyA-PR1扩增出带有glyA基因启动子序列和人工设计RBS的片段，大小约为200bp并进行PCR产物纯化。利用Gibson Assembly试剂盒将上述PCR获得的三个片段连接到BamHI线性化处理的谷氨酸棒杆菌自杀性质粒pK18mobsacB上，获得同源重组打靶质粒pK18-LysC2。带有glyA基因启动子序列和人工设计的RBS的编码天冬氨酸激酶第311位的苏氨酸突变为异亮氨酸的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，其中，1～176bp是glyA基因启动子序列，177～208bp是人工设计的RBS。
引物：
LysC-PF3：aattcgagctcggtacccggggtagcccagaagatttcagttcgg，即SEQ IDNO.11；
LysC-PR3：gaggagtgttttctttctgcacagg，即SEQ ID NO.12；
LysC-PF4：gtcgagaaggaggtaaaataatggccctggtcgtacagaaatatg，即SEQ IDNO.13；
LysC-PR4：gcctgcaggtcgactctagagcgttcaaagcagctgccaa，即SEQ ID NO.14；
GlyA-PF1：gcagaaagaaaacactcctcagctactccactagtgtgatcgggg，即SEQ IDNO.15；
GlyA-PR1：tattttacctccttctcgacgtgtttaatgatgcgtaagacctcactcgcggga，即SEQID NO.16。
利用电穿孔仪将重组质粒pK18-LysC2电转化转入到谷氨酸棒杆菌lysC基因点突变菌株CG-LysC1中，电击条件为电压2.5KV，电阻200Ω，电容25μF(电击杯宽度为2mm)，转化子在含25mg/L卡那霉素的BHI平板上进行第一次筛选获得单交换重组菌，在BHI液体培养基里过夜培养后稀释涂布于含有20％蔗糖的BHI平板上进行二次筛选获得同源重组双交换菌株。用引物GlyA-PF1和LysC-PR4对双交换重组子PCR鉴定，并对扩增片段测序鉴定。将测序正确的菌株命名为CG-LysC2。
将重组质粒pXMJ19-ectABC电转化转入CG-LysC2中，获得重组菌并命名为CG-ECT2。重组菌CG-ECT2在CGXII培养基中发酵培养24小时，由于替换了LysC的启动子和RBS序列，四氢嘧啶的合成量达到1.85g/L，比CG-ECT1提高了14％。
(4)启动子置换增强磷酸戊糖途径增加还原力NADPH的供给
在四氢嘧啶的合成途径中L-天冬氨酸-β-半醛脱氢酶Asd催化天冬氨酸到四氢嘧啶的第二步反应，即将L-天冬氨酸磷酸盐转化为L-天冬氨酸-β-半醛，该步反应由NADPH提供还原力。所以通过将原始的启动子Ptkt置换为强启动子Pglya能够增强磷酸戊糖途径编码基因簇tkt-operon的表达促进NADPH的合成从而进一步提高重组菌四氢嘧啶的合成水平。
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，用两组引物PPP-PF1、PPP-PR1和PPP-PF2、PPP-PR2分别扩增出同源重组上游和下游的同源臂，大小约为500bp并进行PCR产物纯化。用引物GlyA-PF2和GlyA-PR2扩增出带有glyA基因启动子序列和人工设计RBS的片段，大小约为200bp并进行PCR产物纯化。利用Gibson Assembly试剂盒将上述PCR获得的三个片段连接到BamHI线性化处理的谷氨酸棒杆菌自杀性质粒pK18mobsacB上，获得同源重组打靶质粒pK18-PPP。
引物：
PPP-PF1：aattcgagctcggtacccggggtggacgccaacctttaaaaagct，即SEQ ID NO.17；
PPP-PR1：aggtgatctaccccgaaagtagtct，即SEQ ID NO.18；
PPP-PF2：tcactaaggaggattttactatgaccaccttgacgctgtcacctg，即SEQ ID NO.19；
PPP-PR2：gcctgcaggtcgactctagaggtcgaatggggattcgccc，即SEQ ID NO.20；
GlyA-PF2：actttcggggtagatcacctagctactccactagtgtgatcgggg，即SEQ IDNO.21；
GlyA-PR2：agtaaaatcctccttagtgagtagatttaaagcgtaagacctcactcgcggga，即SEQID NO.22。
利用电穿孔仪将重组质pK18-PPP电转化转入到谷氨酸棒杆菌LysC突变菌株CG-LysC2中，电击条件为电压2.5KV，电阻200Ω，电容25μF(电击杯宽度为2mm)，转化子在含25mg/L卡那霉素的BHI平板上进行第一次筛选获得单交换重组菌，在BHI液体培养基里过夜培养后稀释涂布于含有20％蔗糖的BHI平板上进行二次筛选获得同源重组双交换菌株。用引物GlyA-PF2和PPP-PR2对双交换重组子PCR鉴定，并对扩增片段测序鉴定。将测序正确的菌株命名为CG-LysC3。
将重组质粒pXMJ19-ectABC电转化转入CG-LysC3中，获得重组菌并命名为CG-ECT3。重组菌在CGXII培养基中发酵培养24小时，四氢嘧啶的合成量达到2.46g/L，比CG-ECT2提高了33％。
通过一些列的改造最终获得的四氢嘧啶高产菌株CG-ECT3对比对照菌株CG-ECT的合成能力有大幅提高，发酵24小时四氢嘧啶产量提高了1.6倍，发酵48小时产量达到2.98g/L。
实施例2：重组谷氨酸棒杆菌发酵罐培养合成四氢嘧啶
在发酵罐水平通过高密度培养对重组谷氨酸棒杆菌高产菌株CG-ECT3的四氢嘧啶合成能力进行了分析。
以10％(体积比)的接种量将种子液接种到装有1L发酵罐培养基的2.5L发酵罐中，控制温度为30℃，通气量为1vvm，通过流加3M磷酸和3M氨水维持pH值稳定在6.8-7.2。发酵6小时左右，OD600到10时，加入终浓度为0.5mM的IPTG；发酵16小时后开始流加补料培养基维持葡萄糖浓度在2-5g/L范围。整个发酵过程中调整转速使得溶氧水平保持在10％(将接种前的溶氧标定为100％)以上。
发酵罐培养基：每升培养基含玉米浆15g，(NH4)2SO4 15g，糖蜜5g，丝肽粉0.5g，尿素1g K2HPO4 1g，KH2PO4 1g，MgSO4 250mg，生物素0.2mg，1ml微量元素，葡萄糖30g；微量元素每升含：KI 15mg，FeSO4·7H2O 16.4g，MnSO4·H2O 100mg，CuSO4 200mg，ZnSO4·7H2O 1g，NiCl2·6H2O 20mg。抗生素终浓度为12.5μg/ml氯霉素。
补料培养基：每升含葡萄糖400g、(NH4)2SO4 50g。
如图2所示，加入IPTG诱导后菌体开始大量合成四氢嘧啶，发酵16小时菌体OD600值达到48，残糖浓度降到2g/L以下时开始补糖，随着葡萄糖的流加发酵液中四氢嘧啶的浓度稳步增长，发酵60小时四氢嘧啶的产量达到41.2g/L，菌体密度OD600达到90，细胞干重约为22.7g/L(细胞干重CDW(g/L)＝0.252x OD600)，单位菌体的四氢嘧啶产量达到1.81g/g(CDW)。而对照菌株CG-ECT采用同样的培养条件发酵60小时四氢嘧啶的产量仅为6.1g/L。
实施例3：重组谷氨酸棒杆菌发酵罐培养合成四氢嘧啶
在发酵罐水平通过高密度培养对重组谷氨酸棒杆菌高产菌株CG-ECT3的四氢嘧啶合成能力进行了分析。
以10％(体积比)的接种量将种子液接种到装有1L发酵罐培养基的2.5L发酵罐中，控制温度为30℃，通气量为1vvm，通过流加3M磷酸和3M氨水维持pH值稳定在6.8-7.2。发酵6小时左右，OD600到10时，加入终浓度为0.5mM的IPTG；发酵16小时后开始流加补料培养基维持葡萄糖浓度在2-5g/L范围。整个发酵过程中调整转速使得溶氧水平保持在10％(将接种前的溶氧标定为100％)以上。
发酵罐培养基：每升培养基含玉米浆20g，(NH4)2SO4 20g，糖蜜10g，丝肽粉1g，尿素2g K2HPO4 2g，KH2PO4 2g，MgSO4 300mg，生物素0.4mg，2ml微量元素，葡萄糖30g；微量元素每升含：KI 15mg FeSO4·7H2O 16.4g，MnSO4·H2O 100mg，CuSO4 200mg，ZnSO4·7H2O 1g，NiCl2·6H2O 20mg。抗生素终浓度为12.5μg/ml氯霉素。
补料培养基：每升含葡萄糖400g、(NH4)2SO4 50g。
加入IPTG诱导后菌体开始大量合成四氢嘧啶，发酵16小时菌体OD600值达到48，残糖浓度降到2g/L以下时开始补糖，随着葡萄糖的流加发酵液中四氢嘧啶的浓度稳步增长，发酵60小时四氢嘧啶的产量达到41.5g/L，菌体密度OD600达到89.5，细胞干重约为22.6g/L(细胞干重CDW(g/L)＝0.252x OD600)，单位菌体的四氢嘧啶产量达到1.84g/g(CDW)。而对照菌株CG-ECT采用同样的培养条件发酵60小时四氢嘧啶的产量仅为6.3g/L。
实施例4：重组谷氨酸棒杆菌发酵罐培养合成四氢嘧啶
在发酵罐水平通过高密度培养对重组谷氨酸棒杆菌高产菌株CG-ECT3的四氢嘧啶合成能力进行了分析。
以10％(体积比)的接种量将种子液接种到装有1L发酵罐培养基的2.5L发酵罐中，控制温度为30℃，通气量为1vvm，通过流加3M磷酸和3M氨水维持pH值稳定在6.8-7.2。发酵6小时左右，OD600到10时，加入终浓度为0.5mM的IPTG；发酵16小时后开始流加补料培养基维持葡萄糖浓度在2-5g/L范围。整个发酵过程中调整转速使得溶氧水平保持在10％(将接种前的溶氧标定为100％)以上。
发酵罐培养基：每升培养基含玉米浆15g，(NH4)2SO4 15g，糖蜜10g，丝肽粉1g，尿素2g K2HPO4 1g，KH2PO4 1g，MgSO4250mg，生物素0.2mg，1ml微量元素，葡萄糖40g；微量元素每升含：KI 15mg FeSO4·7H2O 16.4g，MnSO4·H2O 100mg，CuSO4 200mg，ZnSO4·7H2O 1g，NiCl2·6H2O 20mg。抗生素终浓度为12.5μg/ml氯霉素。
补料培养基：每升含葡萄糖400g、(NH4)2SO4 50g。
加入IPTG诱导后菌体开始大量合成四氢嘧啶，发酵16小时菌体OD600值达到48，残糖浓度降到2g/L以下时开始补糖，随着葡萄糖的流加发酵液中四氢嘧啶的浓度稳步增长，发酵60小时四氢嘧啶的产量达到41.7g/L，菌体密度OD600达到90.2，细胞干重约为22.7g/L(细胞干重CDW(g/L)＝0.252x OD600)，单位菌体的四氢嘧啶产量达到1.84g/g(CDW)。而对照菌株CG-ECT采用同样的培养条件发酵60小时四氢嘧啶的产量仅为6.2g/L。
实施例5：重组谷氨酸棒杆菌发酵罐培养合成四氢嘧啶
在发酵罐水平通过高密度培养对重组谷氨酸棒杆菌高产菌株CG-ECT3的四氢嘧啶合成能力进行了分析。
以10％(体积比)的接种量将种子液接种到装有1L发酵罐培养基的2.5L发酵罐中，控制温度为30℃，通气量为1vvm，通过流加3M磷酸和3M氨水维持pH值稳定在6.8-7.2。发酵6小时左右，OD600到10时，加入终浓度为0.5mM的IPTG；发酵16小时后开始流加补料培养基维持葡萄糖浓度在2-5g/L范围。整个发酵过程中调整转速使得溶氧水平保持在10％(将接种前的溶氧标定为100％)以上。
发酵罐培养基：每升培养基含玉米浆20g，(NH4)2SO4 20g，糖蜜5g，丝肽粉0.5g，尿素1g K2HPO4 2g，KH2PO4 2g，MgSO4 300mg，生物素0.4mg，2ml微量元素，葡萄糖40g；微量元素每升含：KI15mg FeSO4·7H2O 16.4g，MnSO4·H2O 100mg，CuSO4 200mg，ZnSO4·7H2O 1g，NiCl2·6H2O 20mg。抗生素终浓度为12.5μg/ml氯霉素。
补料培养基：每升含葡萄糖400g、(NH4)2SO4 50g。
加入IPTG诱导后菌体开始大量合成四氢嘧啶，发酵16小时菌体OD600值达到48，残糖浓度降到2g/L以下时开始补糖，随着葡萄糖的流加发酵液中四氢嘧啶的浓度稳步增长，发酵60小时四氢嘧啶的产量达到41.7g/L，菌体密度OD600达到89.8，细胞干重约为22.6g/L(细胞干重CDW(g/L)＝0.252x OD600)，单位菌体的四氢嘧啶产量达到1.85g/g(CDW)。而对照菌株CG-ECT采用同样的培养条件发酵60小时四氢嘧啶的产量仅为6.3g/L。
谷氨酸棒杆菌作为一种成熟的工业微生物具有发酵稳定、不产内毒素等大肠杆菌不具备的特点，目前已广泛的应用于各种氨基酸的生产。本发明通过对谷氨酸棒杆菌四氢嘧啶合成途径的改造构建获得一株四氢嘧啶高产菌株，通过发酵罐补料培养四氢嘧啶产量达到41g/L以上，与已报道的重组大肠杆菌四氢嘧啶生产技术相比不仅降低了噬菌体污染的风险同时也避免了内毒素的残留对产品质量的影响，大大的降低了生产成本，对四氢嘧啶的工业化生产和大规模应用具有重要的应用价值。
虽然，本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 无锡晶扬生物科技有限公司
<120> 一种四氢嘧啶高产谷氨酸棒杆菌及其应用
<130> BAA191161A
<160> 22
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2294
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtttaacttt aagaaggaga tataccatgc ctaccctaaa aaggaattca atcaacaacc 60
ccaaaggcat tgttttgagt ttccccaccg taatgctccg tcgcccaacc gacggcgacg 120
gttacaacct tcatcagctg gtggcgcgct gccagcccct cgataccaat tcggtctact 180
gcaacctgct gcagtgttcc gatttcgctg acaccgccat cgccgcagag aacgcccaag 240
gcgagctggt cggtttcatc tcgggttacc gccccccttc gcggccggac acgctgttcg 300
tctggcaggt cgccgtcgac agttcgatgc gcggtcaggg gctggccctg cgcatgctgc 360
tggcactgac cgcccgggtc gctcgcgagt acggcgtgcg ttacatggaa accaccatct 420
cgccggacaa cggggcgtca caggcgctgt tcaagcgggc cttcgaccgc ctcgatgcca 480
actgcacgac gcgcacgctg tttgcccgcg acacgcattt cgccggtcag cacgaggacg 540
aggtgctcta ccgcgccggc ccgttcaccg tttcccatct agaagaagag ctcaaggagc 600
acgcatgaaa acttttgaac tgaatgaatc cagggttcgc agctactgcc gttccttccc 660
cgtggtcttc aagcaggccc agggcgccga actggtcact caggacggca agcgctacat 720
cgacttcctc gctggtgccg gcacgctcaa ctacgggcac aaccacccgg tgctcaagca 780
ggcgctgctc gagtacatcg agagcgacgg catcacccac ggcctggaca tgtacaccga 840
agccaaggag cgtttcctcg aaaccttcaa ccggctgatc ctcgagccgc gcggcatggg 900
cgactaccgc atgcagttca ccggcccgac cggcaccaac gcggtcgagg cggcgatgaa 960
gctggcgcgc aaggtcaccg ggcgcaacaa catcatcagt ttcaccaacg gcttccacgg 1020
ctgcagcatt ggcgcgctgg ccgccaccgg caaccagcat caccgcggcg gctccggcat 1080
cggcctcacc gatgtcagcc gcatgccgta cgccaactat ttcggcgaca agaccaacac 1140
catcggcatg atggacaagc tgctctccga cccgtccagc gggatcgaca agcccgccgc 1200
ggtgatcgtc gaggtggtcc agggcgaagg cggtctgaac acagcatcgg ccgagtggat 1260
gcgcaagctc gagaagctct gccgcaagca cgagatgctg ctgatcgtcg atgacatcca 1320
ggccggctgc ggccgcaccg ggactttctt cagcttcgaa gagatgggca tccagccgga 1380
tatcgtcacg ctgtccaagt cgctgtccgg ctacggcctg ccgttcgcca tggtgttgct 1440
gcgccaagag ctggaccagt ggaagcccgg cgaacacaac ggcaccttcc gcggcaacaa 1500
ccatgcattc gtcacggcgg ccgcggcggt cgagcacttc tggcagaacg acgcgttcgc 1560
caacagcgtg aaggccaagg gcaagcgcat cgccgacggc atgcagcgca tcatccgtcg 1620
ccacggcccg gattcgctgt tcctcaaggg ccgcgggatg atgatcggca tcagctgccc 1680
cgatggcgag attgccgccg cagtgtgccg ccacgccttc gaaaacggcc tggtgatcga 1740
gaccagcggc gcccacagcg aagtggtcaa gtgcctctgc ccgctgatca tcagcgatga 1800
gcagatcgac caggcacttt ccatcctcga caaggccttt gccgccgtga tgagcgagca 1860
gaccgagaac caagcttcct gaggtatccg caatgatcgt cagaaccctc gccgagtgcg 1920
aaaagaccga ccgcaaggtc cacagccaga ccggcacctg ggacagcacg cgcatgctgc 1980
tcaaggacga caaggtggga ttctccttcc acatcaccac catctacgcc ggcagcgaga 2040
cgcacatcca ctaccagaac cacttcgagt cggtgtactg catcagcggc aatggcgaga 2100
tcgaaaccat cgccgacggc aagatctaca agatcgagcc gggcacgctg tacgtgctgg 2160
agaagcatga cgagcacctg ctgcgcggtg gcagcgaaga catgaagctg gcctgcgtct 2220
tcaacccgcc gctcaacggg cgcgaagtgc atgacgaaag cggcgtctat cctctggagg 2280
ccgaaaccgt ctga 2294
<210> 2
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acagaattaa ttaagcttgt ttaactttaa gaaggagata taccatgcct accctaaaaa 60
ggaattcaat caac 74
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<212> DNA
<213> 人工序列
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agctcggtac ccggggatcc tcagacggtt tcggcctcca gagga 45
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ggatccccgg gtaccgagct 20
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<212> DNA
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<212> DNA
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ccaccgacat cattttcacc tgccct 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gcctgcaggt cgactctaga cggaagggtt cacctcagag acgat 45
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<211> 1474
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
agctactcca ctagtgtgat cggggttatt ttttcacttc aatgggtggc taaaagacgt 60
gggcacgtga gtaaactcat gcgcgcgaaa cgatgggagt gaacccatac ttttatatat 120
gggtatcggc ggtctatgct tgtgggcgta cctgtcccgc gagtgaggtc ttacgcatca 180
ttaaacacgt cgagaaggag gtaaaataat ggccctggtc gtacagaaat atggcggttc 240
ctcgcttgag agtgcggaac gcattagaaa cgtcgctgaa cggatcgttg ccaccaagaa 300
ggctggaaat gatgtcgtgg ttgtctgctc cgcaatggga gacaccacgg atgaacttct 360
agaacttgca gcggcagtga atcccgttcc gccagctcgt gaaatggata tgctcctgac 420
tgctggtgag cgtatttcta acgctctcgt cgccatggct attgagtccc ttggcgcaga 480
agcccaatct ttcacgggct ctcaggctgg tgtgctcacc accgagcgcc acggaaacgc 540
acgcattgtt gatgtcactc caggtcgtgt gcgtgaagca ctcgatgagg gcaagatctg 600
cattgttgct ggtttccagg gtgttaataa agaaacccgc gatgtcacca cgttgggtcg 660
tggtggttct gacaccactg cagttgcgtt ggcagctgct ttgaacgctg atgtgtgtga 720
gatttactcg gacgttgacg gtgtgtatac cgctgacccg cgcatcgttc ctaatgcaca 780
gaagctggaa aagctcagct tcgaagaaat gctggaactt gctgctgttg gctccaagat 840
tttggtgctg cgcagtgttg aatacgctcg tgcattcaat gtgccacttc gcgtacgctc 900
gtcttatagt aatgatcccg gcactttgat tgccggctct atggaggata ttcctgtgga 960
agaagcagtc cttaccggtg tcgcaaccga caagtccgaa gccaaagtaa ccgttctggg 1020
tatttccgat aagccaggcg aggctgcgaa ggttttccgt gcgttggctg atgcagaaat 1080
caacattgac atggttctgc agaacgtctc ttctgtagaa gacggcacca ccgacatcat 1140
tttcacctgc cctcgttccg acggccgccg cgcgatggag atcttgaaga agcttcaggt 1200
tcagggcaac tggaccaatg tgctttacga cgaccaggtc ggcaaagtct ccctcgtggg 1260
tgctggcatg aagtctcacc caggtgttac cgcagagttc atggaagctc tgcgcgatgt 1320
caacgtgaac atcgaattga tttccacctc tgagattcgt atttccgtgc tgatccgtga 1380
agatgatctg gatgctgctg cacgtgcatt gcatgagcag ttccagctgg gcggcgaaga 1440
cgaagccgtc gtttatgcag gcaccggacg ctaa 1474
<210> 11
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<210> 22
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<212> DNA
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<400> 22
agtaaaatcc tccttagtga gtagatttaa agcgtaagac ctcactcgcg gga 53

Claims (10)

1.一种重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，谷氨酸棒杆菌为宿主表达了来自耐盐细菌的四氢嘧啶合成基因簇ectABC；并且，所述重组谷氨酸棒杆菌中lysC基因编码的天冬氨酸激酶的第311位的苏氨酸突变为异亮氨酸，编码天冬氨酸激酶的基因lysC的启动子被替换为谷氨酸棒杆菌来源的强组成型启动子Pglya，磷酸戊糖途径基因簇的启动子被替换为谷氨酸棒杆菌来源的强组成型启动子Pglya。
2.根据权利要求1所述的一种重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述四氢嘧啶合成基因簇ectABC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的27～2294bp所示。
3.根据权利要求1所述的一种重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为宿主。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，表达耐盐细菌的四氢嘧啶合成基因簇ectABC时，以质粒pXMJ19为表达质粒，以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为宿主。
5.根据权利要求1～4任一所述的一种重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，编码第311位的苏氨酸突变为异亮氨酸的天冬氨酸激酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10的209～1474bp所示。
6.根据权利要求1～5任一所述的一种重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述启动子Pglya的核苷酸序列如SEQ ID NO.10中的1～176bp所示。
7.应用权利要求1～6任一所述的一种重组谷氨酸棒杆菌发酵生产四氢嘧啶的方法，其特征在于，先进行种子培养，利用获得的种子液进行发酵生产四氢嘧啶。
8.应用权利要求7所述的一种重组谷氨酸棒杆菌发酵生产四氢嘧啶的方法，其特征在于，每升发酵培养基含：玉米浆15-20g，(NH4)2SO4 15-20g，糖蜜5-10g，丝肽粉0.5-1g，尿素1-2g，K2HPO4 1-2g，KH2PO4 1-2g，MgSO4 250-300mg，生物素0.2-0.4mg，微量元素1-2mL，葡萄糖30-40g；每升微量元素含：KI 15mg，FeSO4·7H2O 16.4g，MnSO4·H2O 100mg，CuSO4200mg，ZnSO4·7H2O 1g，NiCl2·6H2O 20mg；优选地，采用所述发酵培养基时，2.5L发酵罐装1L发酵培养基，控制温度为30℃，通气量为1vvm，将此时的溶氧水平标定为100％，然后，以10％的接种量将种子液接种到发酵培养基中；发酵液的OD600达到10时，加入终浓度为0.5mM的IPTG；发酵16小时后，开始流加补料培养基维持葡萄糖浓度在2-5g/L范围；整个发酵过程中，通过流加3M磷酸和3M氨水维持pH值稳定在6.8-7.2，通过调整转速使得溶氧水平保持在10％以上。
9.应用权利要求8所述的一种重组谷氨酸棒杆菌发酵生产四氢嘧啶的方法，其特征在于，每升补料培养基含：葡萄糖400g,(NH4)2SO4 50g。
10.一种提高谷氨酸棒杆菌合成四氢嘧啶产量的方法，其特征在于，表达来自耐盐细菌的四氢嘧啶合成基因簇ectABC；将重组谷氨酸棒杆菌中lysC基因编码的天冬氨酸激酶的第311位的苏氨酸突变为异亮氨酸，将编码天冬氨酸激酶的基因lysC的启动子替换为谷氨酸棒杆菌来源的强组成型启动子Pglya，将磷酸戊糖途径基因簇的启动子替换为谷氨酸棒杆菌来源的强组成型启动子Pglya。
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