CN113186143B - 一种产四氢嘧啶工程菌株的构建及优化的方法 - Google Patents

一种产四氢嘧啶工程菌株的构建及优化的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113186143B
CN113186143B CN202110400206.3A CN202110400206A CN113186143B CN 113186143 B CN113186143 B CN 113186143B CN 202110400206 A CN202110400206 A CN 202110400206A CN 113186143 B CN113186143 B CN 113186143B
Authority
CN
China
Prior art keywords
tetrahydropyrimidine
gene
ect
coli
plasmid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110400206.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113186143A (zh
Inventor
康振
王阳
陈坚
堵国成
王道安
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN202110400206.3A priority Critical patent/CN113186143B/zh
Publication of CN113186143A publication Critical patent/CN113186143A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113186143B publication Critical patent/CN113186143B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1217—Phosphotransferases with a carboxyl group as acceptor (2.7.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
    • C12Y102/01011—Aspartate-semialdehyde dehydrogenase (1.2.1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y104/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12Y104/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.4.1)
    • C12Y104/01002—Glutamate dehydrogenase (1.4.1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y104/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12Y104/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.4.1)
    • C12Y104/01021—Aspartate dehydrogenase (1.4.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/02—Phosphotransferases with a carboxy group as acceptor (2.7.2)
    • C12Y207/02004—Aspartate kinase (2.7.2.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01031—Phosphoenolpyruvate carboxylase (4.1.1.31)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y604/00—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4)
    • C12Y604/01—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4.1)
    • C12Y604/01001—Pyruvate carboxylase (6.4.1.1)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种产四氢嘧啶工程菌株的构建及优化的方法，属于生物工程技术领域。本发明提供了能够在低盐条件下生产四氢嘧啶的大肠杆菌工程菌ECT‑LA，该菌以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为基础，包含由T7启动子控制的四氢嘧啶合成基因簇ectABC及外源基因lysCC932T和asd，并优化了四氢嘧啶的制备方法。本发明构建的重组大肠杆菌以葡萄糖为底物，分批补料发酵56h后，四氢嘧啶产量可达60g/L。

Description

一种产四氢嘧啶工程菌株的构建及优化的方法
技术领域
本发明涉及一种产四氢嘧啶工程菌株的构建及优化的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
四氢嘧啶(Ectoine)又称依可多因，属于天冬氨酸衍生物，作为一种相容溶质，可以协助细胞维持胞内外的渗透压平衡；与蛋白质、核酸等大分子以及细胞膜相互作用以提高其稳定性，提高细胞承受高温、高盐度、高酸碱度、射线等极端环境的能力，已广泛应用于新型化妆品、药物、皮肤创伤修复以及器官移植维持等领域。
四氢嘧啶可以通过中度嗜盐菌以“细菌挤奶”的方法生产，但这种工艺依赖高盐胁迫的诱导，发酵周期长、提取困难且产量低，且不利于设备维护，同时由于四氢嘧啶的手性结构等问题，导致化学合成四氢嘧啶的难度与成本增加。为满足日益增加的工业需求，构建系统代谢工程菌株以高产四氢嘧啶成为研究热点，大肠杆菌作为目前微生物发酵工业中应用最广泛的菌株成为重要选择。谢希贤等(201510410080.2)通过构建具有特定基因型的E.coli W3110，包含来源于伸长盐单胞菌ectABC基因；lysA、thrA、iclR三个基因缺陷型；具有lac启动子控制的谷氨酸棒状杆菌lysC基因；trc启动子控制的ppc基因，葡萄糖为底物发酵20-28h后，四氢嘧啶产量达12-18g/L，但关键支路途径导致氨基酸缺陷型，一定程度上会抑制菌体生长，给菌体造成一定的压力，进而影响四氢嘧啶的生产。王鸿等(201810996222.1)通过构建具有特定基因型的E.coli MG1655，包括伸长盐单胞菌ectABC基因；lysA基因缺陷型，L天冬氨酸钠为底物，全细胞转化法合成四氢嘧啶，2030h产量达2.53.5g/L，但全细胞催化法发酵工艺复杂，成本高。以上两种大肠杆菌生产四氢嘧啶工艺产量不高，大大影响了四氢嘧啶相关研究进展以及商业应用的推进。
发明内容
本发明利用合成生物学技术和基因工程的手段，以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)做为出发菌株，表达伸长盐单胞菌来源四氢嘧啶合成途径相关基因簇ectABC，实现四氢嘧啶的异源合成；并通过组合表达谷氨酸棒杆菌来源的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc、谷氨酸棒杆菌来源的丙酮酸羧化酶基因pyc、铜绿假单胞菌来源的天冬氨酸脱氢酶基因aspDH、谷氨酸棒杆菌来源并解除反馈抑制的天冬氨酸激酶基因lysCC932T、伸长盐单胞菌来源的天冬氨酸半醛脱氢酶基因asd、枯草芽孢杆菌来源的谷氨酸脱氢酶基因rocG，获得了四氢嘧啶产量提高的重组大肠杆菌。
本发明提供了一种生产四氢嘧啶的大肠杆菌工程菌，表达了伸长盐单胞菌来源的四氢嘧啶合成基因簇ectABC，所述四氢嘧啶合成基因簇ectABC包括二氨基丁酸转乙酰基酶基因ectA、二氨基丁酸转氨酶ectB和四氢嘧啶合成酶ectC，并表达了(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)中至少一种基因；其中：
(a)谷氨酸棒杆菌来源的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc；
(b)谷氨酸棒杆菌来源的丙酮酸羧化酶基因pyc；
(c)铜绿假单胞菌来源的天冬氨酸脱氢酶基因aspDH；
(d)谷氨酸棒杆菌来源的天冬氨酸激酶基因lysC；
(e)伸长盐单胞菌来源的天冬氨酸半醛脱氢酶基因asd；
(f)枯草芽孢杆菌来源的谷氨酸脱氢酶基因rocG。
在一种实施方式中，所述大肠杆菌工程菌含有双质粒表达系统；所述双质粒包括pRSFDuet-1和pACYCDuet-1。
在一种实施方式中，所述四氢嘧啶合成基因簇ectABC通过pRSFDuet-1质粒表达。
在一种实施方式中，所述基因ppc、pyc、aspDH、lysC、asd或rocG中的一个或多个基因通过pACYCDuet-1质粒表达。
在一种实施方式中，大肠杆菌工程菌通过双T7启动子分别调控天冬氨酸半醛脱氢酶基因asd和天冬氨酸激酶基因lysC表达；基因asd位于pACYCDuet-1质粒第一个T7启动子下游；基因lysC位于第二个T7启动子下游。
在一种实施方式中，大肠杆菌工程菌通过双T7启动子分别调控天冬氨酸半醛脱氢酶基因asd和天冬氨酸激酶基因lysC、天冬氨酸脱氢酶基因aspDH的表达；基因asd位于pACYCDuet-1质粒第一个T7启动子下游；基因lysC和基因aspDH位于第二个T7启动子下游。
在一种实施方式中，大肠杆菌工程菌通过双T7启动子分别调控天冬氨酸半醛脱氢酶基因asd和天冬氨酸激酶基因lysC、丙酮酸羧化酶基因pyc的表达；基因asd位于pACYCDuet-1质粒第一个T7启动子下游；基因lysC和基因pyc位于第二个T7启动子下游。
在一种实施方式中，大肠杆菌工程菌通过双T7启动子分别调控天冬氨酸半醛脱氢酶基因asd和天冬氨酸激酶基因lysC、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc的表达；基因asd位于pACYCDuet-1质粒第一个T7启动子下游；基因lysC和基因ppc位于第二个T7启动子下游。
在一种实施方式中，大肠杆菌工程菌通过双T7启动子分别调控天冬氨酸半醛脱氢酶基因asd和丙酮酸羧化酶基因pyc，天冬氨酸激酶基因lysC和天冬氨酸脱氢酶基因aspDH的表达；基因asd和pyc位于pACYCDuet-1质粒第一个T7启动子下游；基因lysC和基因aspDH位于第二个T7启动子下游。
在一种实施方式中，T7启动子与位于其下游的基因之间具有RBS序列。
在一种实施方式中，所述的四氢嘧啶合成基因簇ectABC的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
在一种实施方式中，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
在一种实施方式中，所述丙酮酸羧化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在一种实施方式中，所述解除反馈抑制的天冬氨酸激酶基因lysCC932T如SEQ IDNO.4所示，是在天冬氨酸激酶lysC的基础上进行了C932T突变获得的。
在一种实施方式中，所述天冬氨酸脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在一种实施方式中，所述天冬氨酸半醛脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
在一种实施方式中，所述谷氨酸脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
本发明还提供所述基因工程菌的构建方法，将SEQ ID NO.1所示的基因连接至pRSFDuet-1的第二个T7启动子下游43bp处，获得重组质粒后转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，获得产四氢嘧啶的重组菌ECT。
在一种实施方式中，所述方法以质粒pACYCDuet-1作为表达载体，在第二个T7启动子下游39bp处整合ppc、pyc、aspDH、lysCC932T、asd、rocG其中一个基因，获得重组质粒并转化至ECT感受态细胞中。
在一种实施方式中，所述方法以质粒pACYC-L作为载体，在第一个T7启动子启动子下游43bp处整合ppc、pyc、aspDH、asd、rocG其中一个基因，获得重组质粒并转化至ECT感受态细胞中。
在一种实施方式中，所述方法以质粒pACYC-LA作为载体，在lysCC932T以及asd基因后面整合ppc、pyc、aspDH、rocG其中一个基因，获得重组质粒并转化至ECT感受态细胞中。
本发明还提供一种发酵生产四氢嘧啶的方法，将所述大肠杆菌工程菌在分批补料发酵培养基中发酵至少48h。
在一种实施方式中，应用上述产生四氢嘧啶的基因工程菌ECT-LA进行分批发酵，具体步骤如下：
(1)将所述产生四氢嘧啶的基因工程菌经平板活化后接种至LB培养基中，37℃，220r/min培养8h；
(2)将步骤(1)培养好的种子液按2％(v/v)的接种量，转接到250mL装样量为30mL的分批发酵培养基，培养温度为30℃，转速为220r/min；转接的同时加入0.2mmol/L的IPTG，诱导菌体产四氢嘧啶，发酵周期48h。
在一种实施方式中，所述分批发酵培养基组成为(g/L)：酵母提取物2.0，KH2PO43.0，Na2HPO4·12H2O 25.0，(NH4)2SO4 16.0，MgSO4·7H2O 1.0，MnSO4·7H2O 0.01，d-葡萄糖20.0，调节pH为7.0，用去离子水定容。
在一种实施方式中，应用上述产生四氢嘧啶的基因工程菌ECT-LA，进行分批补料发酵，具体步骤如下：
(1)种子培养，将所述产生四氢嘧啶的基因工程菌经平板活化后接种至装有分批补料发酵种子培养基的250mL圆底三角瓶中，其中接种环每刮取一环使用种子培养基50mL，于37℃，220rpm/min培养8h；
(2)发酵培养，以20％的接种量将步骤(1)的种子培养物接入含有1.5L发酵培养基的3-L发酵罐中，37℃条件下培养4h，添加0.2mmol/L的IPTG于30℃诱导培养，通过控制搅拌转速以及通气量使溶解氧维持在20-30％，通过补加氨水来控制pH维持在7.0，流加450g/L葡萄糖控制残糖浓度在5-10g/L。
在一种实施方式中，用于步骤(1)中分批补料发酵的种子培养基组成为：酵母提取物10.0g，蛋白胨5.0g，KH2PO4 2.0g，柠檬酸2.0g，NaCl 1.0g，MgSO4·7H2O 1.0g，生物素0.1mg，d-葡萄糖25.0g，微量元素l ml，调节pH至7.0，用去离子水定容至1L。
在一种实施方式中，用于步骤(2)中分批补料发酵的发酵培养基组成为：酵母提取物6.0g，蛋白胨4.0g，Na2HPO4·12H2O 25.0g，KH2PO4 6.0g，柠檬酸2.0g，MgSO4·7H2O 1.0g，生物素0.1mg，d-葡萄糖20.0g，微量元素溶液l ml，调节pH至7.0，用去离子水定容至1L。
在一种实施方式中，所述微量元素溶液组成为(g/L)：FeCl3·6H2O 2.4，CoCl2·6H2O 0.8，CuCl2·2H2O 0.15，ZnCl2 0.3，Na2MoO4·2H2O 0.3，H3BO3 0.075，MnSO4 1.2，CaCl2·2H2O 10，溶解于120mM HCl中，用去离子水定容。
本发明还要求保护所述大肠杆菌工程菌或所述方法在生产含四氢嘧啶的食品、药品、保健品或化妆品方面的应用。
有益效果：
本发明首次使用双T7启动子表达系统表达基因簇ectABC，同时组合表达ppc、pyc、aspDH、lysCC932T、asd、rocG基因，对大肠杆菌中四氢嘧啶合成关键途径进行鉴定；同时优化四氢嘧啶的制备方法，取得了如下效果：
(1)本发明的四氢嘧啶合成基因工程菌通过表达外源基因，筛选出大肠杆菌中合成四氢嘧啶的关键途径，并得到途径强化基因的最佳组合方法，同时表达lysCC932T和asd最有利于四氢嘧啶的合成产量最高，同时避免了基因敲除策略对菌体生长带来的压力。
(2)本发明提供了一种四氢嘧啶的制备方法，实现了在非高盐浓度的常规发酵条件下，56h时分批补料发酵四氢嘧啶产量可达60g/L，与现阶段大肠杆菌生产四氢嘧啶工艺相比产率有很大提升，同时原料成本较低，培养条件简单，设备损耗小，四氢嘧啶生产效率较高。
附图说明
图1是菌株代谢示意图。
图2是途径强化基因组合质粒结构示意图。
图3是不同实施例构建的菌株发酵48h的四氢嘧啶产量图。
图4是四氢嘧啶标准样品的高效液相色谱图。
图5是产四氢嘧啶菌株发酵液的高效液相色谱图。
具体实施方式
材料：
大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为商业化的常用宿主。
PrimeSTAR DNA聚合酶、磷酸化酶、DNA Marker、Solution I、AvrII等酶类试剂购自TaKaRa(大连)。
ClonExpress一步法定向克隆试剂盒购自Vazyme Biotech(南京)。
胶回收试剂盒购自Thermo fisher Scientific公司。
质粒抽提试剂盒购自生物工程(上海)有限公司。
各种分析纯试剂购自国药集团。
四氢嘧啶标准样品购自Sigma-Aldrich公司(上海)。
LB固体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10，琼脂粉20。
LB液体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10。
分批发酵培养基(g/L)：酵母提取物2.0，KH2PO4 3.0，Na2HPO4·12H2O 25.0，(NH4)2SO416.0，MgSO4·7H2O 1.0，MnSO4·7H2O 0.01，d-葡萄糖20.0，调节pH为7.0，用去离子水定容。
分批补料发酵种子培养基：酵母提取物10.0g，蛋白胨5.0g，KH2PO4 2.0g，柠檬酸2.0g，NaCl 1.0g，MgSO4·7H2O 1.0g，生物素VH 0.1mg，d-葡萄糖25.0g，微量元素l ml，调节pH至7.0，用去离子水定容至1L。
分批补料发酵培养基：酵母提取物6.0g，蛋白胨4.0g，Na2HPO4·12H2O 25.0g，KH2PO46.0g，柠檬酸2.0g，MgSO4·7H2O 1.0g，生物素VH 0.1mg，d-葡萄糖20.0g，微量元素溶液l ml，调节pH至7.0，用去离子水定容至1L。
微量元素溶液(g/L)：FeCl3·6H2O 2.4，CoCl2·6H2O 0.8，CuCl2·2H2O 0.15，ZnCl2 0.3，Na2MoO4·2H2O 0.3，H3BO3 0.075，MnSO4 1.2，CaCl2·2H2O 10，溶解于120mM HCl中，用去离子水定容。
四氢嘧啶的检测：
(1)检测样品制备：取1mL实施例3中发酵液离心(13000rpm，2min)，将获得的上清使用超纯水稀释适当倍数，再经0.22um的水系微孔滤膜过滤后打入液相瓶中。
(2)HPLC检测：使用Agilent 1260高效液相色谱仪测定四氢嘧啶。设置进样量为5μl，色谱柱为250*4.6mm 5um Hypersil GOLD aQ色谱柱，柱温30℃，流动相为2％乙腈/98％水，流速0.6mL/min，紫外检测波长210nm。
实施例1：重组质粒pRSF-Ect构建
(1)SEQ ID NO.1所示的四氢嘧啶合成基因簇ectABC交由金唯智公司合成。
(2)提取质粒pARSFDuet-1，设计引物Ect-F1/Ect-R1，以质粒pRSFDuet-1为模板，进行PCR扩增，获得线性化的载体。
Ect-F1：acgaccagaagccgctgtaacctcgagtctggtaaagaaaccg；
Ect-R1：ggctctgtggttgcgttcattatgtatatctccttcttatacttaactaatatactaagatgggg；
(3)利用一步克隆酶将步骤(1)和(2)获得的片段对应进行连接，获得的重组载体与E.coli JM109感受态细胞混匀后于冰中放置30min。
(4)将上述冰浴后的混合体系迅速热击(42℃，90s)然后迅速置于冰上，静置2min，然后无菌室加入900μL不加抗生素的LB液体培养基，恢复培养(40-60min，37℃，220rpm)。
(5)培养液离心(4000-5000rpm，2min)，弃800μL上清，混匀浓缩至200μL，涂布卡那霉素抗性平板，37℃恒温培养12-16h，挑选阳性克隆进行菌落PCR验证，测序正确后即为重组了外源基因的质粒pRSF-Ect。
实施例2：重组菌株ECT构建及分批发酵
(1)将实施例1中所获得的重组质粒pRSF-Ect转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞获得重组菌株ECT。
(2)待活化菌ECT取自-80℃保存的甘油管，使用无菌接种环划线至卡那霉素抗性的LB固体培养基上，密封倒置于37℃恒温培养12-16h至长出单菌落。
(3)从活化的LB平板上挑取单菌落接种至50mL含LB培养基的离心管中(装液量为5mL)，37℃，220r/min培养8h，获得种子液。
将培养好的种子液按2％(v/v)的接种量，转接到250mL锥形瓶装样量为30mL的分批发酵培养基中，培养温度为30℃，转速为220r/min；转接的同时加入0.2mmol/L的IPTG诱导菌体产四氢嘧啶，发酵48h。检测重组菌株ECT发酵液中的四氢嘧啶含量，如图4所示为四氢嘧啶标准样品液相色谱检测结果，图5所示为四氢嘧啶发酵样品液相色谱检测结果。结果显示，在大肠杆菌实现了四氢嘧啶的异源合成，发酵48h的产量为1.6g/L。
实施例3：重组质粒pACYC-LysC构建及验证
(1)SEQ ID NO.2～7所示的基因ppc、pyc、aspDH、lysCC932T、asd、rocG交由金唯智公司合成。
(2)提取质粒pACYCDuet-1，设计引物Ppc-F1/Ppc-R1；Pyc-F1/Pyc-R1；AspDH-F1/AspDH-R1；LysC-F1/LysC-R1；Asd-F1/Asd-R1；RocG-F1/RocG-R1，以质粒pRSFDuet-1为模板，进行PCR扩增，获得在第二个T7启动子表达框处实现线性化的载体。
Ppc-F1：cgctgcgcaactccggctaggctgccaccgctgagcaataa；
Ppc-R1：tcgcgtaaaaaatcagtcataaaaaaacctccttatacttaactaatatactaagatggggaattgt；
Pyc-F1：tgatcgtcgtcgtttcctaagctgccaccgctgagcaataa；
Pyc-R1：ataacaattccccatcttagtatattagttaagtataaggaggttttttcgtgtcgactcacacatcttc；
AspDH-F1：gcccacgcgatttcgatctaggctgccaccgctgagcaataa；
AspDH-R1：atcatgacgatattcagcataaaaaacctccttatacttaactaatatactaagatggggaattgttatccg；
LysC-F1：tttatgcaggcaccggacgctaagctgccaccgctgagcaataa；
LysC-R1：tttctgtacgaccagggccatggtatatctcctttatacttaactaatatactaagatggggaattgttatccg；
Asd-F1：caagatcctgcgcgagcagtgagctgccaccgctgagcaataa；
Asd-R1：cgacgaaaccgactttcaacataaaaaaacctccttatacttaactaatatactaagatggggaattgttatc；
RocG-F1：tttccgcggatgggtctaagctgccaccgctgagc；
RocG-R1：ctttcgagacttgctttgctgacataaaaaacctccttatacttaactaatatactaagatggggaattgttatc；
(3)利用一步克隆酶分别将ppc、pyc、aspDH、asd、rocG基因片段与步骤(1)的线性化载体对应连接，按实施例2的方法验证得到重组两个外源基因的质粒pACYC-Ppc、pACYC-Pyc、pACYC-AspDH、pACYC-LysC、pACYC-Asd、pACYC-RocG。
实施例4：重组菌株ECT-LysC构建及分批发酵
将实施例3中获得的重组质粒pACYC-Ppc、pACYC-Pyc、pACYC-AspDH、pACYC-LysC、pACYC-Asd、pACYC-RocG按实施例1的转化方式分别转化至实施例2构建的重组菌ECT中，获得重组菌株ECT-Ppc、ECT-Pyc、ECT-AspDH、ECT-LysC、ECT-Asd、ECT-RocG并按照实施例2的方式进行分批发酵，经检测，分批发酵48h后重组菌株ECT-LysC产量为2.6g/L(如图3所示)，在以下实施例中将该菌株名称简写为ECT-L，对应重组质粒简写为pACYC-L。
实施例5：重组质粒pACYC-L-Asd构建及验证
(1)设计引物Ppc-F2/Ppc-R2；Pyc-F2/Pyc-R2；AspDH-F2/AspDH-R2；Asd-F2/Asd-R2；RocG-F2/RocG-R2，以实施例3中构建的质粒pACYC-L为模板进行PCR，获得线性化载体。
Ppc-F2：actgcgctgcgcaactccggctagaagtcgaacagaaagtaatcgtattgtacacg；
Ppc-R2：tcatcgcgtaaaaaatcagtcatggtatatctccttattaaagttaaacaaaattatttctacaggggaattgttatcc；
Pyc-F2：acttgatcgtcgtcgtttcctaaaagtcgaacagaaagtaatcgtattgtacacg；
Pyc-R2：gaagatgtgtgagtcgacacggtatatctccttattaaagttaaacaaaattatttctacaggggaattgt；
AspDH-F2：gcccacgcgatttcgatctagaagtcgaacagaaagtaatcgtattgtacacg；
AspDH-R2：cgatcatgacgatattcagcatggtatatctccttattaaagttaaacaaaattatttctacagggg；
Asd-F2：aagatcctgcgcgagcagtgaaagtcgaacagaaagtaatcgtattgtacacg；
Asd-R2：ccatccgacgaaaccgactttcaacatggtatatctccttattaaagttaaacaaaattatttctacagggg；
RocG-F2：cgtttccgcggatgggtctaaaagtcgaacagaaagtaatcgtattgtacacg；
RocG-R2：ctttcgagacttgctttgctgacatggtatatctccttattaaagttaaacaaaattatttctacagggg；
(2)利用一步克隆酶将ppc、pyc、aspDH、asd、rocG基因片段分别与步骤(1)获得的线性化载体对应连接，按实施例1的方法验证得到重组两个外源基因的质粒pACYC-L-Ppc、pACYC-L-Pyc、pACYC-L-AspDH、pACYC-L-Asd、pACYC-L-RocG。
实施例6：重组菌株ECT-L-Asd构建及分批发酵
将实施例5获得的重组质粒pACYC-L-Ppc、pACYC-L-Pyc、pACYC-L-AspDH、pACYC-L-Asd、pACYC-L-RocG分别按实施例1的转化方式转化至实施例2构建的重组菌ECT中，获得重组菌株ECT-L-Ppc、ECT-L-Pyc、ECT-L-AspDH、ECT-L-Asd、ECT-L-RocG，并按照实施例2的方法分批发酵，经检测，分批发酵48h后重组菌株ECT-L-Asd产量达5.5g/L，在后续实施例中将该菌株的名称简写为ECT-LA，对应重组质粒简写为pACYC-LA。
实施例7：重组质粒pACYC-LA-AspDH构建及验证
(1)设计引物Ppc-F3/Ppc-R3；Pyc-F3/Pyc-R3；AspDH-F3/AspDH-R3；RocG-F3/RocG-R3，以实施例5中构建的质粒pACYC-LA为模板进行PCR，获得线性化载体。
Ppc-F3：gcgctgcgcaactccggctaggctgccaccgctgagcaataa；
Ppc-R3：catcgcgtaaaaaatcagtcatggtatatctcctttagcgtccggtgcctgcat；
Pyc-F3：cgacttgatcgtcgtcgtttcctaagctgccaccgctgagcaataact；
Pyc-R3：ttgaagatgtgtgagtcgacacggtatatctcctttagcgtccggtgcctgcata；
AspDH-F3：cacgcccacgcgatttcgatctaggctgccaccgctgagcaataac；
AspDH-R3：gatcatgacgatattcagcatggtatatctcctttagcgtccggtgcctgcataaa；
RocG-F3：gcgtttccgcggatgggtctaagctgccaccgctgagcaataa；
RocG-R3：cgagacttgctttgctgacatggtatatctcctttagcgtccggtgcctgcataaa；
(2)利用一步克隆酶分别将ppc、pyc、aspDH、rocG基因片段与步骤(1)的线性化载体对应连接，按实施例1的方法验证得到同时重组三个外源基因的质粒pACYC-LA-Ppc、pACYC-LA-Pyc、pACYC-LA-AspDH、pACYC-LA-RocG。
实施例8：重组菌株ECT-LA-AspDH构建及分批发酵
将实施例7中获得的重组质粒pACYC-LA-Ppc、pACYC-LA-Pyc、pACYC-LA-AspDH、pACYC-LA-RocG分别按实施例1的转化方式转化至实施例2构建的重组菌ECT中，获得重组菌株ECT-LA-Ppc、ECT-LA-Pyc、ECT-LA-AspDH、ECT-LA-RocG并进行分批发酵，经检测，分批发酵48h后重组菌株ECT-LA-AspDH产量达4.7g/L，在后续实施例中将该菌株的名称简写为ECT-LAA，对应重组质粒名称简写为pACYC-LAA。
实施例9：重组质粒pACYC-LAA-Pyc构建及验证
(1)设计引物Ppc-F4/Ppc-R4；Pyc-F4/Pyc-R4；RocG-F4/RocG-R4，以实施例8中构建的质粒pACYC-LAA为模板进行PCR，获得线性化载体。
Ppc-F4：tgcgctgcgcaactccggctaggtcgaacagaaagtaatcgtattgtacacggccgcat；
Ppc-R4：catcgcgtaaaaaatcagtcatggtatatctccttcactgctcgcgcaggatcttgagcatccg；
Pyc-F4：cttgatcgtcgtcgtttcctaagtcgaacagaaagtaatcgtattgtacacggccgcat；
Pyc-R4：tgaagatgtgtgagtcgacacggtatatctccttcactgctcgcgcaggatcttgagcatccg；
RocG-F4：cgtttccgcggatgggtctaagtcgaacagaaagtaatcgtattgtacacggccgcat；
RocG-R4：tcgagacttgctttgctgacatggtatatctccttcactgctcgcgcaggatcttgagcatccg；
(2)利用一步克隆酶将ppc、pyc、rocG基因片段与步骤(1)的线性化载体对应连接，按实施例2的方法验证得到同时重组四个外源基因的质粒pACYC-LAA-Ppc、pACYC-LAA-Pyc、pACYC-LAA-RocG。
实施例10：重组菌株ECT-LAA-Pyc构建及分批发酵
将实施例9中获得的重组质粒pACYC-LAA-Ppc、pACYC-LAA-Pyc、pACYC-LAA-RocG分别按实施例1的转化方式转化至实施例2构建的重组菌ECT中，获得重组菌株ECT-LAA-Ppc、ECT-LAA-Pyc、ECT-LAA-RocG并按照实施例2的方法进行分批发酵，经检测，分批发酵48h后重组菌株ECT-LAA-Pyc产量为4.9g/L。
实施例11：四氢嘧啶生产工程菌ECT-LA的分批补料发酵
(1)平板活化：将实施例6构建的四氢嘧啶生产菌株ECT-LA从-80℃保存的甘油管中使用无菌接种环划线至具有卡那霉素及氯霉素抗性的LB固体培养基上，密封倒置于37℃恒温培养12h至长出单菌落
(2)种子培养：使用接种环刮取一环步骤(1)培养的单菌落到装液量为50mL种子培养基的250mL圆底三角瓶中，37℃，220rpm/min培养8h，获得OD为6-8的种子液。
(3)3-L发酵罐分批补料发酵：按照20％的接种量将步骤(2)获得的种子培养基接入含有1.5L发酵培养基的3-L发酵罐中，在37℃条件下培养4h，添加0.2mmol/L的IPTG进行诱导，诱导后30℃培养，通过控制搅拌桨转速以及通气量使溶解氧维持在20-30％，通过补加氨水来控制pH维持在7.0，流加450g/L葡萄糖以控制残糖浓度在5-10g/L，并随葡萄糖同样速度流加浓度为12g/L的酵母提取物持续发酵进行，发酵周期56h，四氢嘧啶的产量达到了60g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种产四氢嘧啶工程菌株的构建及优化的方法
<130> BAA210254A
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2433
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgaacgcaa ccacagagcc ctttacaccc tccgccgacc tggccaagcc cagcgtggcc 60
gatgccgtgg tcggccatga ggcctcaccg ctcttcatcc gcaagccaag ccccgatgac 120
ggctggggca tctacgagct ggtcaagtcc tgtccgcctc tcgacgtcaa ttccgcctac 180
gcctatctgt tgctggccac ccagttccgc gatagctgcg ccgtggcgac caacgaagag 240
ggcgagatcg tcggcttcgt ttccggctac gtgaagagca acgcccccga tacctatttc 300
ctctggcagg ttgccgtggg cgagaaggca cgtggcaccg gcctggcccg tcgtctggtg 360
gaagccgtga tgacacgccc ggaaatggcc gaggtccacc atctcgagac cactatcacg 420
cccgacaacc aggcgtcctg gggcttgttc cgccgtctcg ccgatcgctg gcaggcgccg 480
ttgaacagcc gcgaatactt ctccaccgat caactcggcg gtgagcatga cccggaaaac 540
ctcgttcgca tcggcccgtt ccagaccgac cagatctgag ccgggacgcc gcctggccgg 600
cccggtacgg gccggcaacc cgtcttttcg ttttatcact ttccccccac aggaggtcgc 660
aatgcagacc cagattctcg aacgcatgga gtccgacgtt cggacctact cccgctcctt 720
cccggtcgtc ttcaccaagg cgcgcaatgc ccgcctgacc gacgaggaag ggcgcgagta 780
catcgacttc ctggccggtg ccggcaccct gaactacggc cacaacaacc cgcacctcaa 840
gcaggcgctg ctcgactata tcgacagcga cggcatcgtc cacggcctgg acttctggac 900
tgcggccaag cgcgactatc tggaaaccct ggaagaggtg atcctcaagc cgcgcggtct 960
cgactacaag gtgcatctgc ccggaccgac tggcaccaac gccgtcgagg cggccattcg 1020
cctggcccgg gtcgccaagg ggcgccacaa tatcgtctcc ttcaccaacg gctttcatgg 1080
cgtcaccatg ggcgcgctgg cgaccaccgg taaccgcaag ttccgcgagg ccaccggtgg 1140
cgtgccgacc caggctgctt ccttcatgcc gttcgatggc tacctcggca gcagcaccga 1200
caccctcgac tacttcgaga agctgctcgg cgacaagtcc ggcggcctgg acgtgcccgc 1260
ggcggtgatc gtcgagacag tgcagggcga gggcggtatc aatgtcgccg gcctggagtg 1320
gctcaagcgc ctcgagagca tctgccgcgc caatgacatc ctgctgatca tcgacgacat 1380
ccaggcgggc tgcggccgga ccggcaagtt cttcagcttc gagcatgccg gcatcacgcc 1440
ggatatcgtg accaactcca agtcgctgtc cggttacggc ctgccgttcg ctcacgtcct 1500
gatgcgcccc gagctcgaca agtggaagcc cggtcagtac aacggcacct tccgcggctt 1560
caacctggct ttcgccactg ctgctgccgc catgcgcaag tactggagcg acgacacctt 1620
cgagcgtgac gtgcagcgca aggctcgcat cgtcgaggaa cgcttcggca agatcgccgc 1680
ctggctgagc gagaacggca tcgaggcctc cgagcgcggc cgcgggctga tgcggggcat 1740
cgacgtgggt tccggcgata tcgccgacaa gatcacccac caagccttcg agaacgggtt 1800
gatcatcgaa accagcggtc aggacggcga agtggtcaag tgcctgtgcc cgctgaccat 1860
tcccgacgaa gacctggtcg agggactcga catcctcgag accagcacca agcaggcctt 1920
tagctgatcg cctgaggtgc gccatcgggc ctgtccatgg catcctgtat cggtcggccg 1980
tgcgcggccg gccagtcatt gattcactgg agaatcgaca tgatcgttcg caatctcgaa 2040
gaagcgcgcc agaccgaccg tctggtcacc gccgaaaacg gcaactggga cagcacccgc 2100
ctgtcgctgg ccgaagatgg tggcaactgc tccttccaca tcacccgcat cttcgagggt 2160
accgagaccc acatccacta taagcatcac ttcgaggctg tttattgcat cgaaggcgag 2220
ggcgaagtgg aaaccctggc cgatggcaag atctggccca tcaagccggg tgacatctac 2280
atcctcgacc agcacgacga gcacctgctg cgcgccagca agaccatgca cctggcctgc 2340
gtgttcacgc cgggcctgac cggcaacgaa gtgcaccgcg aagacggttc ctacgcacct 2400
gccgacgaag ccgacgacca gaagccgctg taa 2433
<210> 2
<211> 2760
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgactgatt ttttacgcga tgacatcagg ttcctcggtc aaatcctcgg tgaggtaatt 60
gcggaacaag aaggccagga ggtttatgaa ctggtcgaac aagcgcgcct gacttctttt 120
gatatcgcca agggcaacgc cgaaatggat agcctggttc aggttttcga cggcattact 180
ccagccaagg caacaccgat tgctcgcgca ttttcccact tcgctctgct ggctaacctg 240
gcggaagacc tctacgatga agagcttcgt gaacaggctc tcgatgcagg cgacacccct 300
ccggacagca ctcttgatgc cacctggctg aaactcaatg agggcaatgt tggcgcagaa 360
gctgtggccg atgtgctgcg caatgctgag gtggcgccgg ttctgactgc gcacccaact 420
gagactcgcc gccgcactgt ttttgatgcg caaaagtgga tcaccaccca catgcgtgaa 480
cgccacgctt tgcagtctgc ggagcctacc gctcgtacgc aaagcaagtt ggatgagatc 540
gagaagaaca tccgccgtcg catcaccatt ttgtggcaga ccgcgttgat tcgtgtggcc 600
cgcccacgta tcgaggacga gatcgaagta gggctgcgct actacaagct gagccttttg 660
gaagagattc cacgtatcaa ccgtgatgtg gctgttgagc ttcgtgagcg tttcggcgag 720
ggtgttcctt tgaagcccgt ggtcaagcca ggttcctgga ttggtggaga ccacgacggt 780
aacccttatg tcaccgcgga aacagttgag tattccactc accgcgctgc ggaaaccgtg 840
ctcaagtact atgcacgcca gctgcattcc ctcgagcatg agctcagcct gtcggaccgc 900
atgaataagg tcaccccgca gctgcttgcg ctggcagatg cagggcacaa cgacgtgcca 960
agccgcgtgg atgagcctta tcgacgcgcc gtccatggcg ttcgcggacg tatcctcgcg 1020
acgacggccg agctgatcgg cgaggacgcc gttgagggcg tgtggttcaa ggtctttact 1080
ccatacgcat ctccggaaga attcttaaac gatgcgttga ccattgatca ttctctgcgt 1140
gaatccaagg acgttctcat tgccgatgat cgtttgtctg tgctgatttc tgccatcgag 1200
agctttggat tcaaccttta cgcactggat ctgcgccaaa actccgaaag ctacgaggac 1260
gtcctcaccg agcttttcga acgcgcccaa gtcaccgcaa actaccgcga gctgtctgaa 1320
gcagagaagc ttgaggtgct gctgaaggaa ctgcgcagcc ctcgtccgct gatcccgcac 1380
ggttcagatg aatacagcga ggtcaccgac cgcgagctcg gcatcttccg caccgcgtcg 1440
gaggctgtta agaaattcgg gccacggatg gtgcctcact gcatcatctc catggcatca 1500
tcggtcaccg atgtgctcga gccgatggtg ttgctcaagg aattcggact catcgcagcc 1560
aacggcgaca acccacgcgg caccgtcgat gtcatcccac tgttcgaaac catcgaagat 1620
ctccaggccg gcgccggaat cctcgacgaa ctgtggaaaa ttgatctcta ccgcaactac 1680
ctcctgcagc gcgacaacgt ccaggaagtc atgctcggtt actccgattc caacaaggat 1740
ggcggatatt tctccgcaaa ctgggcgctt tacgacgcgg aactgcagct cgtcgaacta 1800
tgccgatcag ccggggtcaa gcttcgcctg ttccacggcc gtggtggcac cgtcggccgc 1860
ggtggcggac cttcctacga cgcgattctt gcccagccca ggggggctgt ccaaggttcc 1920
gtgcgcatca ccgagcaggg cgagatcatc tccgctaagt acggcaaccc cgaaaccgcg 1980
cgccgaaacc tcgaagccct ggtctcagcc acgcttgagg catcgcttct cgacgtctcc 2040
gaactcaccg atcaccaacg cgcgtacgac atcatgagtg agatctctga gctcagcttg 2100
aagaagtacg cctccttggt gcacgaggat caaggcttca tcgattactt cacccagtcc 2160
acgccgctgc aggagattgg atccctcaac atcggatcca ggccttcctc acgcaagcag 2220
acctcctcgg tggaagattt gcgagccatc ccatgggtgc tcagctggtc acagtctcgt 2280
gtcatgctgc caggctggtt tggtgtcgga accgcattag agcagtggat tggcgaaggg 2340
gagcaggcca cccaacgcat tgccgagctg caaacactca atgagtcctg gccatttttc 2400
acctcagtgt tggataacat ggctcaggtg atgtccaagg cagagctgcg tttggcaaag 2460
ctctacgcag acctgatccc agatacggaa gtagccgagc gagtctattc cgtcatccgc 2520
gaggagtact tcctgaccaa gaagatgttc tgcgtaatca ccggctctga tgatctgctt 2580
gatgacaacc cacttctcgc acgctctgtc cagcgccgat acccctacct gcttccactc 2640
aacgtgatcc aggtagagat gatgcgacgc taccgaaaag gcgaccaaag cgagcaagtg 2700
tcccgcaaca ttcagctgac catgaacggt ctttccactg cgctgcgcaa ctccggctag 2760
<210> 3
<211> 3423
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gtgtcgactc acacatcttc aacgcttcca gcattcaaaa agatcttggt agcaaaccgc 60
ggcgaaatcg cggtccgtgc tttccgtgca gcactcgaaa ccggtgcagc cacggtagct 120
atttaccccc gtgaagatcg gggatcattc caccgctctt ttgcttctga agctgtccgc 180
attggtaccg aaggctcacc agtcaaggcg tacctggaca tcgatgaaat tatcggtgca 240
gctaaaaaag ttaaagcaga tgccatttac ccgggatacg gcttcctgtc tgaaaatgcc 300
cagcttgccc gcgagtgtgc ggaaaacggc attactttta ttggcccaac cccagaggtt 360
cttgatctca ccggtgataa gtctcgcgcg gtaaccgccg cgaagaaggc tggtctgcca 420
gttttggcgg aatccacccc gagcaaaaac atcgatgaga tcgttaaaag cgctgaaggc 480
cagacttacc ccatctttgt gaaggcagtt gccggtggtg gcggacgcgg tatgcgtttt 540
gttgcttcac ctgatgagct tcgcaaatta gcaacagaag catctcgtga agctgaagcg 600
gctttcggcg atggcgcggt atatgtcgaa cgtgctgtga ttaaccctca gcatattgaa 660
gtgcagatcc ttggcgatca cactggagaa gttgtacacc tttatgaacg tgactgctca 720
ctgcagcgtc gtcaccaaaa agttgtcgaa attgcgccag cacagcattt ggatccagaa 780
ctgcgtgatc gcatttgtgc ggatgcagta aagttctgcc gctccattgg ttaccagggc 840
gcgggaaccg tggaattctt ggtcgatgaa aagggcaacc acgtcttcat cgaaatgaac 900
ccacgtatcc aggttgagca caccgtgact gaagaagtca ccgaggtgga cctggtgaag 960
gcgcagatgc gcttggctgc tggtgcaacc ttgaaggaat tgggtctgac ccaagataag 1020
atcaagaccc acggtgcagc actgcagtgc cgcatcacca cggaagatcc aaacaacggc 1080
ttccgcccag ataccggaac tatcaccgcg taccgctcac caggcggagc tggcgttcgt 1140
cttgacggtg cagctcagct cggtggcgaa atcaccgcac actttgactc catgctggtg 1200
aaaatgacct gccgtggttc cgactttgaa actgctgttg ctcgtgcaca gcgcgcgttg 1260
gctgagttca ccgtgtctgg tgttgcaacc aacattggtt tcttgcgtgc gttgctgcgg 1320
gaagaggact tcacttccaa gcgcatcgcc accggattca ttgccgatca cccgcacctc 1380
cttcaggctc cacctgctga tgatgagcag ggacgcatcc tggattactt ggcagatgtc 1440
accgtgaaca agcctcatgg tgtgcgtcca aaggatgttg cagctcctat cgataagctg 1500
cctaacatca aggatctgcc actgccacgc ggttcccgtg accgcctgaa gcagcttggc 1560
ccagccgcgt ttgctcgtga tctccgtgag caggacgcac tggcagttac tgataccacc 1620
ttccgcgatg cacaccagtc tttgcttgcg acccgagtcc gctcattcgc actgaagcct 1680
gcggcagagg ccgtcgcaaa gctgactcct gagcttttgt ccgtggaggc ctggggcggc 1740
gcgacctacg atgtggcgat gcgtttcctc tttgaggatc cgtgggacag gctcgacgag 1800
ctgcgcgagg cgatgccgaa tgtaaacatt cagatgctgc ttcgcggccg caacaccgtg 1860
ggatacaccc cgtacccaga ctccgtctgc cgcgcgtttg ttaaggaagc tgccagctcc 1920
ggcgtggaca tcttccgcat cttcgacgcg cttaacgacg tctcccagat gcgtccagca 1980
atcgacgcag tcctggagac caacaccgcg gtagccgagg tggctatggc ttattctggt 2040
gatctctctg atccaaatga aaagctctac accctggatt actacctaaa gatggcagag 2100
gagatcgtca agtctggcgc tcacatcttg gccattaagg atatggctgg tctgcttcgc 2160
ccagctgcgg taaccaagct ggtcaccgca ctgcgccgtg aattcgatct gccagtgcac 2220
gtgcacaccc acgacactgc gggtggccag ctggcaacct actttgctgc agctcaagct 2280
ggtgcagatg ctgttgacgg tgcttccgca ccactgtctg gcaccacctc ccagccatcc 2340
ctgtctgcca ttgttgctgc attcgcgcac acccgtcgcg ataccggttt gagcctcgag 2400
gctgtttctg acctcgagcc gtactgggaa gcagtgcgcg gactgtacct gccatttgag 2460
tctggaaccc caggcccaac cggtcgcgtc taccgccacg aaatcccagg cggacagttg 2520
tccaacctgc gtgcacaggc caccgcactg ggccttgcgg atcgtttcga actcatcgaa 2580
gacaactacg cagccgttaa tgagatgctg ggacgcccaa ccaaggtcac cccatcctcc 2640
aaggttgttg gcgacctcgc actccacctc gttggtgcgg gtgtggatcc agcagacttt 2700
gctgccgatc cacaaaagta cgacatccca gactctgtca tcgcgttcct gcgcggcgag 2760
cttggtaacc ctccaggtgg ctggccagag ccactgcgca cccgcgcact ggaaggccgc 2820
tccgaaggca aggcacctct gacggaagtt cctgaggaag agcaggcgca cctcgacgct 2880
gatgattcca aggaacgtcg caatagcctc aaccgcctgc tgttcccgaa gccaaccgaa 2940
gagttcctcg agcaccgtcg ccgcttcggc aacacctctg cgctggatga tcgtgaattc 3000
ttctacggcc tggtcgaagg ccgcgagact ttgatccgcc tgccagatgt gcgcacccca 3060
ctgcttgttc gcctggatgc gatctctgag ccagacgata agggtatgcg caatgttgtg 3120
gccaacgtca acggccagat ccgcccaatg cgtgtgcgtg accgctccgt tgagtctgtc 3180
accgcaaccg cagaaaaggc agattcctcc aacaagggcc atgttgctgc accattcgct 3240
ggtgttgtca ccgtgactgt tgctgaaggt gatgaggtca aggctggaga tgcagtcgca 3300
atcatcgagg ctatgaagat ggaagcaaca atcactgctt ctgttgacgg caaaatcgat 3360
cgcgttgtgg ttcctgctgc aacgaaggtg gaaggtggcg acttgatcgt cgtcgtttcc 3420
taa 3423
<210> 4
<211> 1266
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atggccctgg tcgtacagaa atatggcggt tcctcgcttg agagtgcgga acgcattaga 60
aacgtcgctg aacggatcgt tgccaccaag aaggctggaa atgatgtcgt ggttgtctgc 120
tccgcaatgg gagacaccac ggatgaactt ctagaacttg cagcggcagt gaatcccgtt 180
ccgccagctc gtgaaatgga tatgctcctg actgctggtg agcgtatttc taacgctctc 240
gtcgccatgg ctattgagtc ccttggcgca gaagcccaat ctttcacggg ctctcaggct 300
ggtgtgctca ccaccgagcg ccacggaaac gcacgcattg ttgatgtcac tccaggtcgt 360
gtgcgtgaag cactcgatga gggcaagatc tgcattgttg ctggtttcca gggtgttaat 420
aaagaaaccc gcgatgtcac cacgttgggt cgtggtggtt ctgacaccac tgcagttgcg 480
ttggcagctg ctttgaacgc tgatgtgtgt gagatttact cggacgttga cggtgtgtat 540
accgctgacc cgcgcatcgt tcctaatgca cagaagctgg aaaagctcag cttcgaagaa 600
atgctggaac ttgctgctgt tggctccaag attttggtgc tgcgcagtgt tgaatacgct 660
cgtgcattca atgtgccact tcgcgtacgc tcgtcttata gtaatgatcc cggcactttg 720
attgccggct ctatggagga tattcctgtg gaagaagcag tccttaccgg tgtcgcaacc 780
gacaagtccg aagccaaagt aaccgttctg ggtatttccg ataagccagg cgaggctgcg 840
aaggttttcc gtgcgttggc tgatgcagaa atcaacattg acatggttct gcagaacgtc 900
tcttctgtag aagacggcac caccgacatc atcttcacct gccctcgttc cgacggccgc 960
cgcgcgatgg agatcttgaa gaagcttcag gttcagggca actggaccaa tgtgctttac 1020
gacgaccagg tcggcaaagt ctccctcgtg ggtgctggca tgaagtctca cccaggtgtt 1080
accgcagagt tcatggaagc tctgcgcgat gtcaacgtga acatcgaatt gatttccacc 1140
tctgagattc gtatttccgt gctgatccgt gaagatgatc tggatgctgc tgcacgtgca 1200
ttgcatgagc agttccagct gggcggcgaa gacgaagccg tcgtttatgc aggcaccgga 1260
cgctaa 1266
<210> 5
<211> 804
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atgctgaata tcgtcatgat cggctgcggc gccatcggcg ccggcgtcct ggaactgttg 60
gagaacgatc cgcaactgag ggtcgatgcg gtgatcgttc ctcgcgactc cgagacccag 120
gtccgccatc gcctggccag cctgcgccgg ccgccgcggg tactcagcgc gctgccggcc 180
ggagagcgcc ccgatcttct ggtggagtgc gccgggcacc gcgccatcga gcagcacgtg 240
ctgccggcgc tggcccaagg cattccctgc ctggtggtct cggtgggcgc gctgtccgag 300
ccgggcctgg tggagcgcct ggaagccgcg gcgcaggccg gaggcagccg catcgagctg 360
ctgcccggcg ccatcggcgc catcgatgcg ctgtcggcgg ccagggtcgg tggcctcgaa 420
tcggtgcgct acaccgggcg caagccggcg agcgcctggc tgggcacgcc aggcgagacg 480
gtctgcgacc tgcagcgcct ggagaaggcg cgggtgatct tcgacggcag cgcccgcgag 540
gcggcgcggc tctatccgaa gaacgccaat gtcgccgcca ccctgtcgct cgccggcctc 600
ggcctggacc gcacccaggt gcgcctgatc gccgaccccg aaagctgcga gaacgtgcac 660
caggtggaag ccagcggcgc cttcggcggc ttcgaactga ccttgcgcgg caaaccgctg 720
gcggccaacc cgaagacatc ggcgctgacc gtgtacagcg tggtccgagc gttgggcaac 780
cacgcccacg cgatttcgat ctag 804
<210> 6
<211> 1113
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atgttgaaag tcggtttcgt cggatggcgt ggcatggtgg gctccgtgct catgcaacgc 60
atggtggaag atggagactt caatggcatc gagccgatct tcttcaccac ctcccaggtc 120
ggtcaacccg gccccgacgt cggcgtggac gtgcctccgc tgaaggatgc cttcgacctg 180
gaggcgctga aggccctgga tgtgatcgtc acctgccagg gcggcgacta caccaagaag 240
gtctacgagg acctgcgcgg cggtggctgg aagggctact ggatcgacgc cgccagcacc 300
ctgcgcatgg ccgacgaggc caccatcgtg ctggatccgg tcaaccgcaa ggtgatcgac 360
gaccaactgg cgcgtggtgc caagaccttc gtcggcggca actgcaccgt tagcctgatg 420
atgatgggcc tgggcggcct gttcgaggcc gacatggtcg agtggatgac ctccatgacc 480
tatcaggcgg cttccggttc cggcgccaag cacatgcgcg agctgctcaa ccagatgggg 540
gcgctgcgtg acagcgtgtc cgctgagctg gccgatcccg gcagcgccat cctcgacatc 600
gaccgcaagg tcaccgcggc catgcgcggt ggcgacttcc cggtcgacaa cttcggtgct 660
ccgctggccg gcagcctgct gccctggatc gattccaagc tcgacaacgg ccagagccgc 720
gaagagtgga agggctcagt ggagaccaac aagatcctcg gtcggcagga aaatccggtg 780
cccatcgacg ggctttgcgt gcgcatcggc gccatgcgct cccatagcca ggccttcacc 840
atcaagctca agcaggatgt gccgctcgac gagatcgagg agcgcatcgc gacccataac 900
gactgggtca agctgatccc caacgacaag gatgccacca acgacggcct gactccggcc 960
gccgctaccg gcaccctgac cgtgccggtg ggtcgcctgc gcaagctggc catgggcggc 1020
gagtacctgt ccgccttcag tgtcggcgac cagctgctgt ggggcgccgc cgagccgctc 1080
aagcggatgc tcaagatcct gcgcgagcag tga 1113
<210> 7
<211> 1275
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atgtcagcaa agcaagtctc gaaagatgaa gaaaaagaag ctcttaactt atttctgtct 60
acccaaacaa tcattaagga agcccttcgg aagctgggtt atccgggaga tatgtatgaa 120
ctcatgaaag agccgcagag aatgctcact gtccgcattc cggtcaaaat ggacaatggg 180
agcgtcaaag tgttcacagg ctaccggtca cagcacaatg atgctgtcgg tccgacaaag 240
gggggcgttc gcttccatcc agaagttaat gaagaggaag taaaggcatt atccatttgg 300
atgacgctca aatgcgggat tgccaatctt ccttacggcg gcgggaaggg cggtattatt 360
tgtgatccgc ggacaatgtc atttggagaa ctggaaaggc tgagcagggg gtatgtccgt 420
gccatcagcc agatcgtcgg tccgacaaag gatattccag ctcccgatgt gtacaccaat 480
tcgcagatta tggcgtggat gatggatgag tacagccggc tgcgggaatt cgattctccg 540
ggctttatta caggtaaacc gcttgttttg ggaggatcgc aaggacggga aacagcgacg 600
gcacagggcg tcacgatttg tattgaagag gcggtgaaga aaaaagggat caagctgcaa 660
aacgcgcgca tcatcataca gggctttgga aacgcgggta gcttcctggc caaattcatg 720
cacgatgcgg gcgcgaaggt gatcgggatt tctgatgcca atggcgggct ctacaaccca 780
gacggccttg atatccctta tttgctcgat aaacgggaca gctttggtat ggtcaccaat 840
ttatttactg acgtcatcac aaatgaggag ctgcttgaaa aggattgcga tattttagtg 900
cctgccgcga tctccaatca aatcacagcc aaaaacgcac ataacattca ggcgtcaatc 960
gtcgttgaag cggcgaacgg cccgacaacc attgatgcca ctaagatcct gaatgaaaga 1020
ggcgtgctgc ttgtgccgga tatcctagcg agtgccggcg gcgtcacggt ttcttatttt 1080
gaatgggtgc aaaacaacca aggatattat tggtcggaag aagaggttgc agaaaaactg 1140
agaagcgtca tggtcagctc gttcgaaaca atttatcaaa cagcggcaac acataaagtg 1200
gatatgcgtt tggcggctta catgacgggc atcagaaaat cggcagaagc atcgcgtttc 1260
cgcggatggg tctaa 1275

Claims (7)

1.一种生产四氢嘧啶的大肠杆菌工程菌，其特征在于，通过pRSFDuet-1质粒表达了伸长盐单胞菌来源的四氢嘧啶合成基因簇ectABC，并通过pACYCDuet-1质粒表达了谷氨酸棒杆菌来源的天冬氨酸激酶基因lysC C932T，伸长盐单胞菌来源的天冬氨酸半醛脱氢酶基因asd；所述的四氢嘧啶合成基因簇ectABC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述天冬氨酸激酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述天冬氨酸半醛脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，通过双T7启动子分别调控天冬氨酸半醛脱氢酶基因asd和天冬氨酸激酶基因lysC C932T表达。
3.根据权利要求1或2所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，宿主为E. coli BL21、 E. coli BL21(DE3)、E. coli JM109、E. coli DH5α或E. coli TOP10。
4.构建权利要求1所述大肠杆菌工程菌的方法，其特征在于，将四氢嘧啶合成基因簇ectABC连接至pRSFDuet-1的T7启动子下游，获得重组质粒，再将获得的重组质粒转化至E. coli BL21(DE3)感受态细胞，获得产四氢嘧啶的重组菌ECT；以质粒pACYCDuet-1作为表达载体，在T7启动子下游整合lysC C932T基因，获得重组质粒，将重组质粒转化至重组菌ECT中，获得重组菌ECT-L；以质粒pACYCDuet-1作为表达载体，在T7启动子下游整合asd基因，获得重组质粒，再将获得的重组质粒转化至重组菌ECT-L的感受态细胞中。
5.一种发酵生产四氢嘧啶的方法，其特征在于，将权利要求1~3任一所述的大肠杆菌工程菌在发酵培养基中发酵至少48 h。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，发酵过程中控制pH为6.8~7.5，并流加葡萄糖控制残糖浓度为5~10 g/L。
7.权利要求1~3任一所述的大肠杆菌工程菌或权利要求4~6任一所述的方法在生产含四氢嘧啶的食品、药品、保健品或化妆品方面的应用。
CN202110400206.3A 2021-04-14 2021-04-14 一种产四氢嘧啶工程菌株的构建及优化的方法 Active CN113186143B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110400206.3A CN113186143B (zh) 2021-04-14 2021-04-14 一种产四氢嘧啶工程菌株的构建及优化的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110400206.3A CN113186143B (zh) 2021-04-14 2021-04-14 一种产四氢嘧啶工程菌株的构建及优化的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113186143A CN113186143A (zh) 2021-07-30
CN113186143B true CN113186143B (zh) 2024-01-30

Family

ID=76974052

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110400206.3A Active CN113186143B (zh) 2021-04-14 2021-04-14 一种产四氢嘧啶工程菌株的构建及优化的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113186143B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113637624A (zh) * 2021-09-01 2021-11-12 珠海瑞德林生物有限公司 一种重组枯草芽孢杆菌及其应用和利用酶法合成谷胱甘肽的废水生产四氢嘧啶的方法
CN113621549A (zh) * 2021-09-01 2021-11-09 珠海瑞德林生物有限公司 重组枯草芽孢杆菌的应用和利用酶法合成烟酰胺单核苷酸的废水生产四氢嘧啶的方法
CN114621968B (zh) * 2022-05-17 2022-07-15 深圳中科翎碳生物科技有限公司 四氢嘧啶生物合成基因簇、突变体及制备四氢嘧啶的方法
CN116987649A (zh) * 2023-04-01 2023-11-03 山东泓达生物科技有限公司 一株高效生产依克多因的基因工程菌及其制备和应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105018403A (zh) * 2015-07-14 2015-11-04 天津科技大学 一种产生四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用
CN108441460A (zh) * 2018-03-21 2018-08-24 天津科技大学 一种高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用
WO2018205563A1 (zh) * 2017-05-12 2018-11-15 清华大学 一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵生产四氢嘧啶的方法
CN110699310A (zh) * 2019-11-05 2020-01-17 无锡晶扬生物科技有限公司 一种四氢嘧啶高产谷氨酸棒杆菌及其应用
CN112280726A (zh) * 2020-10-30 2021-01-29 江南大学 一种高产四氢嘧啶工程菌株的构建方法与应用
CN112501102A (zh) * 2020-12-16 2021-03-16 江南大学 一株高效生产四氢嘧啶的大肠杆菌重组菌

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105018403A (zh) * 2015-07-14 2015-11-04 天津科技大学 一种产生四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用
WO2018205563A1 (zh) * 2017-05-12 2018-11-15 清华大学 一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵生产四氢嘧啶的方法
CN108441460A (zh) * 2018-03-21 2018-08-24 天津科技大学 一种高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用
CN110699310A (zh) * 2019-11-05 2020-01-17 无锡晶扬生物科技有限公司 一种四氢嘧啶高产谷氨酸棒杆菌及其应用
CN112280726A (zh) * 2020-10-30 2021-01-29 江南大学 一种高产四氢嘧啶工程菌株的构建方法与应用
CN112501102A (zh) * 2020-12-16 2021-03-16 江南大学 一株高效生产四氢嘧啶的大肠杆菌重组菌

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Microbial production of ectoine and hydroxyectoine as high-value chemicals;Mengshuang Liu et al.;《Microb Cell Fact》;20210326;第8页右栏第1段、图3 *
Pathway construction and metabolic engineering for fermentative production of ectoine in Escherichia coli;Yike Ning et al.;《Metabolic Engineering》;20160309;第12页左栏第2段 *
Rational flux-tuning of Halomonas bluephagenesis for co-production of bioplastic PHB and ectoine;Hong Ma et al.;《NATURE COMMUNICATIONS》;20200703;第2页右栏第4段、第3页图1、第5页右栏第2段、第9页左栏第2段 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113186143A (zh) 2021-07-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113186143B (zh) 一种产四氢嘧啶工程菌株的构建及优化的方法
JP4173777B2 (ja) 微生物株、プラスミド、微生物株の製造方法及びホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸の製造方法
US11512333B2 (en) Method for producing tetrahydropyrimidine by fermenting recombinant Corynebacterium glutamicum
CN111471638B (zh) 一株产l-高丝氨酸的谷氨酸棒杆菌突变株的构建与应用
CN114774343B (zh) 一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株及应用
CN109777763B (zh) 一株用于l-茶氨酸生产的基因工程菌及其构建与应用
JP2022547432A (ja) Ｌ－トリプトファン産生効率を向上させるトランスポーター遺伝子の大腸菌における使用
CN112280726B (zh) 一种高产四氢嘧啶工程菌株的构建方法与应用
CN112501095A (zh) 一种合成3-岩藻乳糖的重组大肠杆菌构建方法及其应用
CN115074376A (zh) 一种利用重组大肠杆菌发酵高效合成d-阿洛酮糖的方法
CN107287144B (zh) 一种代谢改造的枯草芽孢杆菌生物转化细胞及其制备方法与应用
CN112375723B (zh) 生产马来酸的工程菌及其构建方法和应用
CN107099497B (zh) 一种促进生物素合成的质粒、细胞及其促进方法
CN117866865A (zh) 一种高效生产依克多因的基因工程菌及其构建方法和应用
CN114806995B (zh) 一种基于乙酰辅酶a代谢改造后高效合成四氢嘧啶的基因工程菌的构建和应用
TW202233833A (zh) 生產鄰胺苯甲酸之重組宿主細胞
CN114606253B (zh) 一种无外源氨基酸作用下高产l-甲硫氨酸的重组大肠杆菌及其应用
CN115109793B (zh) 一种从头合成络缌的重组大肠杆菌及其构建方法和应用
CN116656587A (zh) 一种生产四氢嘧啶的代谢工程大肠杆菌构建方法
CN113817659B (zh) 一种代谢工程改造大肠杆菌发酵制备β-丙氨酸的方法
CN112266892B (zh) AroG的突变体及其在产氨基酸基因工程菌中的应用
CN116904416A (zh) 一种高效生产四氢嘧啶的重组大肠杆菌及其构建方法
CN116904379A (zh) 一种高产四氢嘧啶的基因重组菌株及其构建方法和应用
CN117904020A (zh) 大肠杆菌乙酰化突变菌株的构建及其生产3-羟基丙酸的应用
CN117844728A (zh) 一种l-缬氨酸生产菌株及其构建方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant