CN112501095A - 一种合成3-岩藻乳糖的重组大肠杆菌构建方法及其应用 - Google Patents

一种合成3-岩藻乳糖的重组大肠杆菌构建方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种生产3‑岩藻乳糖的基因工程菌及其构建方法与应用，所述基因工程菌为经过特定基因改造的大肠杆菌；使用该菌利用葡萄糖发酵生产3‑岩藻乳糖能够克服化学合成法反应条件苛刻、能耗大等不足；能够克服酶催化法存在的工艺复杂、生产成本高等不足。发酵48h后，3‑岩藻乳糖产量达到了5‑7g/L，具有非常大的应用前景，为生物法生成3‑岩藻乳糖糖提供了新的思路。

Description

一种合成3-岩藻乳糖的重组大肠杆菌构建方法及其应用
技术领域
本发明涉及利用重组大肠杆菌合成3-岩藻乳糖的方法及其应用，属于代谢工程领域。更具体地说是一种构建重组大肠杆菌生物合成3-岩藻乳糖的方法。
背景技术
母乳寡糖可以作为生长刺激因子在婴儿结肠内选择性地刺激双歧杆菌增殖，也可以形成致病菌受体的可溶性类似物阻止其与肠道上皮细胞表面受体结合，从而保护婴儿免于致病菌以及病毒的感染。母乳中岩藻乳糖水平的高低与婴儿大脑发育密切相关，据报道,α-1,3-链接的岩藻寡糖具有对空肠弯曲杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、产肠毒素的大肠杆菌、幽门螺旋杆菌和诺瓦克病毒等病原体的防护活性。在所有的这些人乳寡糖中，3-岩藻乳糖是母乳中含量较为丰富。因此，其已经成为了一种营养和医药行业的重要功能寡糖。
针对不同的母乳寡糖，近年来相继发展出多种化学合成以及酶法合成策略。这些方法存在成本高、收率低等诸多问题。微生物细胞中存在着丰富的天然糖供体，利用重组菌株进行功能寡糖的生物合成，可直接或间接利用天然糖供体进行目的寡糖的大规模生产。该方法周期短、成本低、代谢易控制、目的产物提取工艺简单，为快速合成寡糖产物提供了可行性支持。
本发明中构建的重组工程菌实现了3-岩藻乳糖的生物合成，为合成生物学方法探索生成目标代谢产物提供了新的研究思路。
发明内容
本发明的目的是提供一种产3-岩藻乳糖的重组大肠杆菌，是通过改造野生型大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，敲除其基因组中的四个关键基因乳糖操纵子β-半乳糖苷酶基因（lacZ）、乳糖转乙酰化酶基因（lacA）、UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因（wcaJ）、ATP依赖的蛋白酶基因（lon），获得重组大肠杆菌，同时过表达3-岩藻乳糖的生物合成途径，实现了从底物葡萄糖、甘油和乳糖到3-岩藻乳糖的生物合成。为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：
一种催化乳糖合成3-岩藻乳糖的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于具有3-岩藻乳糖的合成途径，命名为E. coli TT401-FL3。。
本发明进一步公开了合成3-岩藻乳糖的大肠杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于它具有3-岩藻乳糖的生物合成途径，主要是将葡萄糖和乳糖转化为3-岩藻乳糖，基于λ-Red同源重组的方法删除乳糖操纵子β-半乳糖苷酶基因（lacZ）、乳糖转乙酰化酶基因（lacA）、UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因（wcaJ）、ATP依赖的蛋白酶基因（lon）。
其中所述具有3-岩藻乳糖合成途径，是指过表达密码子优化的磷酸甘露糖酶基因（manB）、磷酸鸟嘌呤转移酶基因（manC）、GDP-甘露糖- 4,6-脱水酶基因（gmd）、GDP-fucose合成酶基因（fcl）、甘露糖-6-磷酸异构酶基因（manA）、GDP-fucose的合成的正调控因子（rcsA）、β-半乳糖苷透性酶基因（lacY）、α-1，3-岩藻糖转移酶基因 （1,3FT）。
其中所述密码子优化的α-1，3-岩藻糖转移酶基因（1,3FT），是指来源于幽门螺旋杆菌、锥状螺旋杆菌、胆型螺旋杆菌、伤寒螺旋杆菌、肝螺旋杆菌、脆弱拟杆菌的其中一种或几种。
本发明更进一步开了基因工程构建的重组大肠杆菌在合成3-岩藻乳糖中的应用。实验结果显示，本发明构建的菌株可以生产得到5-7 g/L的3-岩藻乳糖。
本发明同时也公开了采用基因工程重组大肠杆菌进行发酵合成6’-唾液乳糖的方法，其特征在于按如下的步骤进行：
1）活化大肠杆菌基因工程菌，获得种子液；
2）将步骤1）获得的种子液与含有氯霉素和氨苄青霉素的培养基，按照种子液:培养基=1:100的比例接种至新鲜的培养基，35~37℃，180~220rpm，培养至OD600=0.6~0.8，并加入诱导剂IPTG 0.05~1 mM，然后转入20~25℃，180~220rpm，补加乳糖继续培养24 h；发酵生产3-岩藻乳糖过程中，大肠杆菌基因工程菌所用的培养基包括各种适于所选用的宿主细胞（大肠杆菌）生长的培养基，碳源优选为低成本的葡萄糖和甘油，具体培养基组成如下：
FMT培养基（1L）：Tryptone(胰蛋白胨)：2-10 g，Yeast Extract（酵母提取物）：1-5g，NaCl（氯化钠）：1-5 g，KH2PO4（磷酸二氢钾）：1-5 g，K2HPO4（磷酸氢二钾）：1-5 g，NH4Cl（氯化铵）：1-5 g，MgSO4•7H2O（七水合硫酸镁）：0.1-1.0 g，FeSO4•7H2O（七水合硫酸亚铁）：2-10mg，MnSO4•H2O （水合硫酸锰）：1-5 mg，Na2SO4（硫酸钠）：5-25 mg，ZnSO4（硫酸锌）：5-20 mg,CoCl2•6H2O（六水合氯化钴）：1-5 mg，CuSO4•5H2O （五水合硫酸铜）0.05-0.25 mg， Glucose（葡萄糖）：20-60 g，Glycerol（甘油）：20-60 g，Lactose（乳糖）：0.5-4.5 g。
本发明更加详细的描述如下：
一种催化乳糖合成3-岩藻乳糖的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于具有3-岩藻乳糖的合成途径，命名为E. coli TT401-FL3。合成3-岩藻乳糖的大肠杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于它具有3-岩藻乳糖的生物合成途径，主要是将葡萄糖和乳糖转化为3-岩藻乳糖，基于λ-Red同源重组的方法删除乳糖操纵子β-半乳糖苷酶基因（lacZ）、乳糖转乙酰化酶基因（lacA）、UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因（wcaJ）、ATP依赖的蛋白酶基因（lon）。其中所述具有3-岩藻乳糖合成途径，是指过表达密码子优化的磷酸甘露糖酶基因（manB）、磷酸鸟嘌呤转移酶基因（manC）、GDP-甘露糖- 4,6-脱水酶基因（gmd）、GDP-fucose合成酶基因（fcl）、甘露糖-6-磷酸异构酶基因（manA）、GDP-fucose的合成的正调控因子（rcsA）、β-半乳糖苷透性酶基因（lacY）、α-1，3-岩藻糖转移酶基因 （1,3FT）。其中所述密码子优化的α-1，3-岩藻糖转移酶基因（1,3FT），是指来源于幽门螺旋杆菌、锥状螺旋杆菌、胆型螺旋杆菌、伤寒螺旋杆菌、肝螺旋杆菌、脆弱拟杆菌的其中一种或几种。
其制备的详细过程如下：
1）制备含有密码子优化的磷酸甘露糖酶基因（manB）、磷酸鸟嘌呤转移酶基因（manC）、GDP-甘露糖- 4,6-脱水酶基因（gmd）、GDP-fucose合成酶基因（fcl）、甘露糖-6-磷酸异构酶基因（manA）、GDP-fucose的合成的正调控因子（rcsA）、β-半乳糖苷透性酶基因（lacY）、α-1，3-岩藻糖转移酶基因 （1,3FT）的重组质粒，获得重组合成途径的质粒；
2）将质粒pSim导入转化到宿主菌E. coli K-12 MG1655中，获得携带质粒的宿主菌；
3）以基因组为模板，设计待删除基因的同源臂引物，通过PCR扩增的方法获得同源臂，并转化诱导表达重组酶的感受态细胞E. coli K-12 MG1655（pSim）；
4）电击复苏后涂布于LB+氯霉素(25 ug/ml)或卡那霉素(50 ug/ml)的平板，获得目的基因被删除的重组菌；
5) 将步骤4所得的重组菌进行溶源化处理，利用pCP20质粒进行抗性消除；
6）以步骤5所得的删除一个基因的重组菌为宿主菌，重复步骤2）3）4）5）的操作，每次操作均以上一次操作获得的重组菌为宿主菌，直至将lacZ、lacA、wcaJ、lon基因全部敲除，获得缺失上述所有基因的重组大肠杆菌；
7）将步骤6）中基因改造的大肠杆菌制备感受态，再将步骤1）所得的代谢途径构建质粒转化到感受态中，获得能够利用乳糖合成3-岩藻乳糖的重组大肠杆菌。
所述任一大肠杆菌工程菌在生产3-岩藻乳糖中的应用，也在本发明的保护范围之内。所述应用的步骤如下：
1）活化大肠杆菌基因工程菌，获得种子液；
2）将步骤1）获得的种子液与含有氯霉素和氨苄青霉素的培养基，按照种子液:培养基=1:100的比例接种至新鲜的培养基，35~37℃，180~220rpm，培养至OD600=0.6~0.8，并加入诱导剂IPTG 0.05~1 mM，然后转入20~25℃，180~220rpm，补加乳糖继续培养24 h；发酵生产3-岩藻乳糖过程中，大肠杆菌基因工程菌所用的培养基包括各种适于所选用的宿主细胞（大肠杆菌）生长的培养基，碳源优选为低成本的葡萄糖和甘油，具体培养基组成如下：
FMT培养基（1L）：Tryptone(胰蛋白胨)：2-10 g，Yeast Extract（酵母提取物）：1-5g，NaCl（氯化钠）：1-5 g，KH2PO4（磷酸二氢钾）：1-5 g，K2HPO4（磷酸氢二钾）：1-5 g，NH4Cl（氯化铵）：1-5 g，MgSO4•7H2O（七水合硫酸镁）：0.1-1.0 g，FeSO4•7H2O（七水合硫酸亚铁）：2-10mg，MnSO4•H2O （水合硫酸锰）：1-5 mg，Na2SO4（硫酸钠）：5-25 mg，ZnSO4（硫酸锌）：5-20 mg,CoCl2•6H2O（六水合氯化钴）：1-5 mg，CuSO4•5H2O （五水合硫酸铜）0.05-0.25 mg， Glucose（葡萄糖）：20-60 g，Glycerol（甘油）：20-60 g，Lactose（乳糖）：0.5-4.5 g。
本发明所用到的SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6的序列如下：
SEQ ID NO.1
manB
ATGAAAAAACTGACCTGCTTTAAAGCGTATGATATTCGCGGCAAACTGGGCGAAGAACTGAACGAAGATATTGCGTGGCGCATTGGCCGCGCGTATGGCGAATTTCTGAAACCGAAAACCATTGTGCTGGGCGGCGATGTGCGCCTGACGAGCGAAACCCTGAAACTGGCGCTGGCGAAAGGCCTGCAAGATGCGGGCGTGGATGTGCTGGATATTGGCATGAGCGGCACCGAAGAAATTTATTTTGCGACCTTTCATCTGGGCGTGGATGGCGGCATTGAAGTGACCGCGAGCCATAACCCGATGGACTATAACGGCATGAAACTGGTTCGTGAAGGCGCGCGCCCGATTAGCGGCGATACCGGCCTGCGCGATGTGCAGCGCTTAGCGGAAGCGAACGATTTTCCGCCGGTGGATGAAACCAAACGTGGCCGCTATCAGCAGATTAACCTGCGCGATGCGTATGTGGATCATCTGTTTGGCTATATTAACGTGAAAAACCTGACCCCGCTGAAACTGGTGATTAACAGCGGCAACGGCGCGGCGGGCCCGGTGGTGGATGCGATTGAAGCGCGCTTTAAAGCGCTGGGCGCGCCGGTGGAACTGATTAAAGTGCATAACACCCCGGATGGCAACTTTCCGAACGGCATTCCGAACCCGCTGCTGCCGGAATGCCGCGATGATACCCGCAACGCGGTGATTAAACATGGCGCGGATATGGGCATTGCGTTTGATGGCGATTTTGATCGCTGCTTTCTGTTTGATGAAAAAGGTCAGTTTATTGAAGGCTACTATATTGTGGGCCTGCTGGCGGAAGCGTTTCTGGAGAAAAATCCGGGCGCGAAAATTATTCATGATCCGCGCCTGAGCTGGAACACGGTGGATGTGGTGACCGCCGCGGGTGGCACCCCGGTGATGAGCAAAACCGGCCATGCGTTTATTAAAGAACGTATGCGCAAAGAAGATGCGATTTATGGCGGCGAAATGAGCGCGCATCATTATTTTCGCGATTTTGCGTATTGCGATAGCGGCATGATTCCGTGGCTGCTGGTGGCGGAACTGGTGTGCCTGAAAGATAAAACCCTGGGCGAACTGGTTCGCGATCGCATGGCGGCGTTTCCGGCGAGCGGCGAAATTAACAGCAAACTGGCGCAGCCGGTGGAAGCGATTAACCGCGTGGAACAGCATTTTAGCCGCGAAGCGCTGGCGGTGGATCGCACCGATGGCATTAGCATGACCTTTGCGGATTGGCGCTTTAACCTGCGCACGAGCAACACCGAACCGGTGGTGCGCCTGAACGTGGAAAGCCGCGGTGACGTGCCGCTGATGGAAGCGCGCACCCGCACCCTGCTGACCCTGCTGAACGAATAA
SEQ ID NO.2
manC
ATGGCGCAGAGCAAACTGTATCCGGTGGTGATGGCGGGCGGCAGCGGCAGCCGCCTGTGGCCGCTGAGCCGCGTGCTGTATCCGAAACAGTTTCTGTGCCTGAAAGGCGATCTGACCATGTTACAGACCACCATTTGCCGCCTGAACGGCGTGGAATGCGAAAGCCCGGTGGTGATTTGCAACGAACAGCATCGCTTTATTGTGGCGGAACAGCTGCGTCAGCTGAACAAACTGACCGAAAACATTATTCTGGAACCGGCGGGCCGCAACACGGCGCCGGCGATTGCGTTAGCGGCGCTGGCGGCCAAACGCCATAGCCCGGAAAGCGATCCGCTGATGCTGGTGCTGGCGGCGGATCATGTGATTGCGGATGAAGATGCGTTTCGCGCGGCGGTGCGCAACGCGATGCCGTATGCGGAAGCGGGCAAACTGGTGACCTTTGGCATTGTGCCGGATCTGCCGGAAACCGGCTATGGCTATATTCGCCGCGGCGAAGTGAGCGCGGGCGAACAAGATATGGTGGCGTTTGAAGTGGCGCAGTTTGTGGAAAAACCGAACCTGGAAACCGCGCAAGCGTATGTGGCGAGCGGCGAATATTATTGGAACAGCGGCATGTTTCTGTTTCGCGCGGGCCGCTACCTGGAGGAGCTGAAAAAATATCGCCCGGATATTCTGGATGCGTGCGAAAAAGCGATGAGCGCGGTTGATCCGGATCTGAACTTTATTCGCGTGGATGAAGAAGCGTTTCTGGCGTGCCCGGAAGAAAGCGTGGATTATGCGGTGATGGAACGCACCGCGGATGCGGTGGTTGTGCCGATGGATGCGGGCTGGAGCGATGTGGGCAGCTGGAGCAGCCTGTGGGAAATTAGCGCGCATACCGCGGAAGGCAACGTGTGTCATGGCGATGTGATTAACCATAAAACCGAAAACAGCTATGTGTATGCGGAAAGCGGCCTGGTGACCACCGTGGGCGTGAAAGATCTGGTGGTTGTGCAGACCAAAGATGCGGTGCTGATTGCGGATCGCAACGCGGTGCAAGATGTGAAAAAAGTGGTGGAACAGATTAAAGCGGATGGCCGCCATGAACATCGCGTGCATCGCGAAGTGTATCGCCCGTGGGGCAAATATGATAGCATTGATGCGGGCGATCGCTATCAAGTGAAACGCATTACCGTGAAACCGGGCGAAGGCCTGAGCGTGCAGATGCATCACCATCGCGCGGAACATTGGGTGGTTGTGGCCGGTACGGCGAAAGTGACCATTGATGGCGATATTAAACTGCTGGGCGAAAACGAAAGCATTTATATTCCGCTGGGCGCGACCCATTGCCTGGAAAATCCGGGCAAAATTCCGCTGGATCTGATTGAAGTGCGCAGCGGCAGCTATCTGGAAGAAGATGATGTGGTGCGCTTTGCGGATCGCTATGGCCGCGTGTAA
SEQ ID NO.3
gmd
ATGAGCAAAGTGGCGCTGATTACCGGTGTGACCGGCCAAGATGGCAGCTATCTGGCGGAATTTCTGCTGGAAAAAGGCTATGAAGTGCATGGCATTAAACGCCGCGCGAGCAGCTTTAACACCGAACGCGTGGATCATATTTATCAAGATCCGCATACCTGCAACCCGAAATTTCATCTGCATTATGGCGATCTGAGCGATACGAGCAACCTGACCCGCATTCTGCGCGAAGTGCAGCCGGATGAAGTGTATAACCTGGGCGCGATGAGCCATGTGGCGGTGAGCTTTGAAAGCCCGGAATATACCGCGGATGTGGATGCGATGGGCACCCTGCGCCTGCTGGAAGCGATTCGCTTTCTGGGCCTGGAAAAGAAAACCCGTTTTTATCAAGCGAGCACGAGCGAACTGTATGGCCTGGTGCAAGAAATTCCGCAGAAAGAAACCACCCCGTTTTATCCGCGCAGCCCGTATGCGGTGGCGAAACTGTATGCGTATTGGATTACCGTGAACTATCGCGAAAGCTATGGCATGTATGCGTGCAACGGCATTCTGTTTAACCATGAAAGCCCGCGCCGCGGCGAAACCTTTGTGACCCGCAAAATTACCCGCGCGATTGCGAACATTGCGCAAGGCCTGGAAAGCTGCCTGTATCTGGGCAACATGGATAGCCTGCGCGATTGGGGCCATGCGAAAGATTATGTGAAAATGCAGTGGATGATGTTACAGCAAGAACAGCCGGAAGATTTTGTGATTGCGACCGGCGTGCAGTATAGCGTGCGTCAGTTTGTGGAAATGGCCGCGGCGCAGCTGGGCATTAAACTGCGCTTTGAAGGCACCGGCGTGGAAGAAAAAGGCATTGTGGTGAGCGTGACCGGCCATGATGCGCCGGGCGTGAAACCGGGCGATGTGATTATTGCGGTTGATCCGCGCTATTTTCGCCCGGCGGAAGTGGAAACCCTGCTGGGCGATCCGACCAAAGCGCATGAAAAACTGGGCTGGAAACCGGAAATTACCCTGCGCGAAATGGTGAGCGAAATGGTGGCGAACGATCTGGAAGCGGCGAAAAAACATAGCCTGCTGAAAAGTCATGGCTATGATGTGGCGATTGCGCTGGAAAGCTAA
SEQ ID NO.4
fcl
ATGAGCAAACAGCGCGTGTTTATTGCGGGCCATCGCGGCATGGTGGGCAGCGCGATTCGCCGTCAGCTGGAACAGCGCGGCGATGTGGAACTGGTGCTGCGCACCCGCGATGAACTGAACCTGCTGGATAGCCGCGCGGTGCATGACTTTTTTGCGAGCGAACGCATTGATCAAGTGTATCTGGCCGCGGCGAAAGTGGGCGGCATTGTGGCGAACAACACCTATCCGGCGGATTTTATTTATCAGAACATGATGATTGAAAGCAACATTATTCATGCGGCGCATCAGAACGATGTGAACAAACTGCTGTTTCTGGGCAGCAGCTGCATTTATCCGAAACTGGCGAAACAGCCGATGGCGGAAAGCGAACTGCTGCAAGGCACCCTGGAACCGACCAACGAACCGTATGCGATTGCGAAAATTGCGGGCATTAAACTGTGCGAAAGCTATAACCGTCAGTATGGCCGCGATTATCGCAGCGTGATGCCGACCAACCTGTATGGCCCGCATGATAACTTTCATCCGAGCAACAGCCATGTGATTCCGGCGCTGCTGCGCCGCTTTCATGAAGCGACCGCGCAGAACGCGCCGGATGTGGTTGTGTGGGGCAGCGGCACCCCGATGCGCGAATTTCTGCATGTGGATGATATGGCCGCGGCGAGCATTCATGTGATGGAACTGGCGCATGAAGTGTGGCTGGAAAACACGCAGCCGATGCTGAGCCATATTAACGTGGGCACCGGCGTGGATTGCACCATTCGCGAACTGGCGCAGACCATTGCGAAAGTGGTGGGCTATAAAGGCCGCGTGGTGTTTGATGCGAGCAAACCGGATGGCACCCCGCGCAAACTGCTGGATGTGACCCGCCTGCATCAGCTGGGCTGGTATCATGAAATTAGCCTGGAAGCGGGCCTGGCGAGCACCTATCAGTGGTTTCTGGAAAACCAAGATCGCTTTCGCGGCTAA
SEQ ID NO.5
manA
ATGCAGAAACTGATTAACAGCGTGCAGAACTATGCGTGGGGCAGCAAAACCGCGCTGACCGAACTGTATGGCATGGAAAACCCGAGCAGTCAGCCGATGGCGGAACTGTGGATGGGCGCGCATCCGAAAAGCAGTAGCCGCGTGCAGAATGCGGCGGGCGATATTGTTAGCCTGCGCGATGTGATTGAAAGCGATAAAAGCACCCTGCTGGGCGAAGCGGTGGCGAAACGCTTTGGCGAACTGCCGTTTCTGTTTAAAGTGCTGTGCGCGGCGCAGCCGCTGAGCATTCAAGTGCATCCGAACAAACATAACAGCGAAATTGGCTTTGCGAAAGAAAACGCGGCGGGCATTCCGATGGATGCGGCGGAACGCAACTATAAAGATCCGAACCATAAACCGGAACTGGTGTTTGCGCTGACCCCGTTTCTGGCGATGAACGCGTTTCGCGAATTTAGCGAAATTGTTAGTCTGTTACAACCGGTGGCGGGCGCGCATCCGGCGATTGCGCATTTTTTACAGCAGCCGGATGCGGAACGCCTGAGCGAACTGTTTGCGAGCCTGCTGAACATGCAAGGCGAAGAAAAAAGCCGCGCGCTGGCGATTCTGAAAAGCGCGCTGGATAGTCAGCAAGGCGAACCGTGGCAGACCATTCGCCTGATTAGCGAATTTTATCCGGAAGATAGCGGCCTGTTTAGCCCGCTGTTACTGAACGTGGTGAAACTGAATCCGGGCGAAGCGATGTTTCTGTTTGCGGAAACCCCACATGCGTATCTGCAAGGCGTGGCGCTGGAAGTGATGGCGAACAGCGATAACGTGCTGCGCGCGGGCCTGACCCCGAAATATATTGATATTCCGGAACTGGTGGCGAACGTGAAATTTGAAGCGAAACCGGCGAATCAGCTGCTGACGCAGCCGGTGAAACAAGGCGCGGAACTGGATTTTCCGATTCCGGTGGATGATTTTGCGTTTAGCCTGCATGATCTGAGCGATAAAGAAACCACCATTAGTCAGCAGAGCGCGGCGATTCTGTTTTGCGTGGAAGGCGATGCGACCCTGTGGAAAGGCAGTCAGCAGTTACAGCTGAAACCGGGCGAAAGCGCGTTTATTGCGGCGAACGAAAGCCCGGTGACCGTGAAAGGTCATGGCCGCCTGGCGCGCGTGTATAACAAACTGTAA
SEQ ID NO.6
rcsA
ATGAGCACCATTATTATGGATCTGTGCAGCTATACCCGCCTGGGCCTGACCGGCTATCTGCTGAGCCGCGGCGTGAAAAAACGCGAAATTAACGATATTGAAACCGTGGATGATCTGGCGATTGCGTGCGATAGTCAGCGCCCGAGCGTGGTGTTTATTAACGAAGATTGCTTTATTCATGATGCGAGCAACAGTCAGCGCATTAAACTGATTATTAATCAGCATCCGAACACCCTGTTTATTGTGTTTATGGCGATTGCGAACGTGCATTTTGATGAATATCTGCTGGTGCGCAAAAACCTGCTGATTAGCAGCAAAAGCATTAAACCGGAAAGCCTGGATGATATTCTGGGCGATATTCTGAAAAAAGAAACCACCATTACGAGCTTTCTGAACATGCCGACCCTGAGCCTGAGCCGCACCGAAAGCAGTATGCTGCGCATGTGGATGGCGGGCCAAGGCACCATTCAGATTAGCGATCAGATGAACATTAAAGCGAAAACCGTGAGCAGCCATAAAGGCAACATTAAACGCAAAATTAAAACCCATAACAAACAAGTGATTTATCATGTGGTGCGCCTGACCGATAACGTGACCAACGGCATTTTTGTGAACATGCGCTAA
SEQ ID NO.7
lacY
ATGTATTATCTGAAAAACACCAACTTTTGGATGTTTGGTCTGTTTTTCTTCTTTTACTTTTTTATCATGGGCGCGTATTTTCCGTTTTTTCCGATTTGGCTGCATGATATTAACCATATTAGCAAAAGCGATACCGGCATTATTTTTGCGGCGATTAGCCTGTTTAGCCTGCTGTTTCAGCCGCTGTTTGGCCTGCTGAGCGATAAACTGGGCCTGCGCAAATATCTGCTGTGGATTATTACCGGTATGCTGGTGATGTTTGCGCCGTTTTTTATTTTTATCTTTGGCCCGCTGTTACAGTATAACATTCTGGTGGGCAGCATTGTGGGTGGTATTTATCTGGGCTTTTGCTTTAACGCGGGCGCGCCGGCGGTGGAAGCGTTTATTGAAAAAGTGAGCCGCCGCAGCAACTTTGAATTTGGCCGCGCGCGCATGTTTGGCTGCGTGGGCTGGGCGCTGTGCGCGAGCATTGTGGGCATTATGTTTACCATTAACAATCAGTTTGTGTTTTGGCTGGGCAGCGGCTGCGCGCTGATTCTGGCGGTGCTGCTGTTTTTTGCGAAAACCGATGCGCCGAGCAGCGCGACCGTGGCGAACGCGGTGGGCGCGAACCATAGCGCGTTTAGCCTGAAACTGGCGCTGGAACTGTTTCGTCAGCCGAAACTGTGGTTTCTGAGCCTGTATGTGATTGGCGTGAGCTGCACCTATGATGTGTTTGATCAGCAGTTTGCGAACTTTTTTACGAGCTTTTTTGCGACCGGCGAACAAGGCACCCGCGTGTTTGGCTATGTGACCACGATGGGCGAACTGCTGAACGCGAGCATTATGTTTTTTGCGCCGCTGATTATTAACCGCATTGGCGGCAAAAACGCGCTGTTACTGGCGGGCACCATTATGAGCGTGCGCATCATTGGCAGCAGCTTTGCGACGAGCGCGCTGGAAGTGGTGATTCTGAAAACCCTGCACATGTTTGAAGTGCCGTTTCTGCTGGTGGGCTGCTTTAAATATATTACGAGTCAGTTTGAAGTGCGCTTTAGCGCGACCATTTATCTGGTGTGCTTTTGCTTTTTTAAACAGCTGGCGATGATTTTCATGAGCGTTCTGGCGGGCAACATGTATGAAAGCATTGGCTTTCAAGGCGCGTATCTGGTGCTGGGCCTGGTGGCGCTGGGCTTTACCCTGATTAGCGTGTTTACCCTGAGCGGTCCGGGCCCGCTGAGCCTGCTGCGCCGCCAAGTGAACGAAGTGGCGTAA
SEQ ID NO.8
futB
ATGGTGTTTCAGCCGCTGCTGGATGCGTTTATTGAAAGCGCGAGCATTGAAAAAATGGTGAGCAAAAGCCCGCCACCGCCGCTGAAAATTGCGGTGGCGAACTGGTGGGGCGATGAAGAAATTAAAGAATTTAAGAAAAGCGTGCTGTATTTTATTCTGAGTCAGCGCTATGCGATTACCCTGCATCAGAACCCGAACGAAAGCAGCGATCTGGTGTTTAGCAACCCGCTGGGCGCGGCGCGCAAAATTCTGAGCTATCAGAACACCAAACGCGTGTTTTATACCGGCGAAAACGAAAGCCCGAACTTTAACCTGTTTGATTATGCGATTGGCTTTGATGAACTGGATTTTAACGATCGCTATCTGCGTATGCCGCTGTATTATGCGCATCTGCATTATGAAGCGGAACTGGTGAACGATACCACCGCGCCGTATAAACTGAAAGATAACAGCCTGTATGCGCTGAAAAAACCGAGCCATCATTTTAAAGAAAACCATCCGAACCTGTGCGCGGTGGTGAACGATGAAAGCGATCTGCTGAAACGCGGCTTTGCGAGCTTTGTGGCGAGCAACGCGAACGCGCCGATGCGCAACGCGTTTTATGATGCGCTGAACAGCATTGAACCGGTGACCGGCGGTGGCAGCGTGCGCAACACCCTGGGCTATAAAGTGGGCAACAAAAGCGAATTTCTGAGTCAGTATAAATTTAACCTGTGCTTTGAAAACAGCCAAGGCTATGGCTATGTGACCGAAAAAATTTTAGATGCGTATTTTAGCCATACCATTCCGATTTATTGGGGCAGCCCGAGCGTGGCGAAAGATTTTAACCCGAAGAGCTTTGTGAACGTGCATGATTTTAACAACTTTGATGAAGCGATTGACTATATTAAATATCTGCATACCCATCCGAACGCGTATCTGGATATGCTGTATGAAAACCCGCTGAACACCCTGGATGGCAAAGCGTATTTCTATCAAGATCTGAGCTTCAAGAAAATTCTGGACTTTTTTAAAACCATTCTGGAAAACGATACCATTTATCATAACAACCCGTTTATTTTTTATCGCGATCTGCATGAACCGCTGATTAGCATTGATGATCTGCGCGTGAACTACGATGACCTGCGCGTGAACTATGATGATCTGCGCGTGAACTATGATGACCTGCGCGTTAACTACGATGATCTGCGCGTGAACTATGATGACCTGCGTGTGAATTACGACGATCTGCGCGTGAACTATGATGATTTACGCGTGAACTATGATGATTTACGTGTGAACTATGATGATCTGCGCGTGAACTACGATCGCCTGTTACAGAACGCGAGCCCGCTGCTGGAACTGAGTCAGAACACCACCTTTAAAATTTATCGCAAAGCGTATCAGAAAAGCCTGCCGCTGCTGCGCACCATTCGCCGCTGGGTGAAAAAATAA
SEQ ID NO.9
futA
ATGGGCTTTCAGCCGCTGCTGGATGCGTTTATTGAAAGCGCGAGCATTGAAAAAATGGCGAGCAAAAGCCCGCCACCGCCGCTGAAAATTGCGGTGGCGAACTGGTGGGGCGATGAAGAAATTAAAGAATTTAAGAAAAGCGTGCTGTATTTTATTCTGAGTCAGCGCTATGCGATTACCCTGCATCAGAACCCGAACGAATTTAGCGATCTGGTGTTTAGCAACCCGCTGGGCGCGGCGCGCAAAATTCTGAGCTATCAGAACACCAAACGCGTGTTTTATACCGGCGAAAACGAAAGCCCGAACTTTAACCTGTTTGATTATGCGATTGGCTTTGATGAACTGGATTTTAACGATCGCTATCTGCGTATGCCGCTGTATTATGCGCATCTGCACTATAAAGCGGAACTGGTGAACGATACCACCGCGCCGTATAAACTGAAAGATAACAGCCTGTATGCGCTGAAAAAACCGAGCCATCATTTTAAAGAAAACCATCCGAACCTGTGCGCGGTGGTGAACGATGAAAGCGATCTGCTGAAACGCGGCTTTGCGAGCTTTGTGGCGAGCAACGCGAACGCGCCGATGCGCAACGCGTTTTATGATGCGCTGAACAGCATTGAACCGGTGACCGGCGGTGGCAGCGTGCGCAACACCCTGGGCTATAAAGTGGGCAACAAAAGCGAATTTCTGAGTCAGTATAAATTTAACCTGTGCTTTGAAAACAGCCAAGGCTATGGCTATGTGACCGAAAAAATTCTGGATGCGTATTTTAGCCATACCATTCCGATTTATTGGGGCAGCCCGAGCGTGGCGAAAGATTTTAACCCGAAGAGCTTTGTGAACGTGCATGATTTTAACAACTTTGATGAAGCGATTGACTATATTAAATATCTGCATACCCATCCGAACGCGTATCTGGATATGCTGTATGAAAACCCGCTGAACACCCTGGATGGCAAAGCGTATTTTTATCAAGATCTGAGCTTTAAGAAAATTTTAGATTTTTTCAAAACCATTCTGGAAAACGATACCATTTATCATAAATTTAGCACGAGCTTTATGTGGGAATATGATCTGCATAAACCGCTGGTGAGCATTGACGATCTGCGTGTGAACTATGATGATTTACGCGTGAATTACGATCGCTTATTACAGAACGCGAGCCCGCTGCTGGAACTGAGTCAGAACACCACCTTTAAAATTTATCGCAAAGCGTATCAGAAAAGCCTGCCGCTGCTGCGCGCGGTGCGCAAACTGGTGAAAAAACTGGGCCTGTAA
SEQ ID NO.10
futD
ATGGATAAACAGATTCTGAACATGCGCGTGCTGGATTGGTGGACCGAAGATAACGAACAGAACTTTTATGATAACATTTTTATTCGCCTGTTACAGCGCAAATATGAAGTGGTGTATAGCGATACCCCGGATTTTGTGCTGTGCGGCCCGTTTGGCTATAAACATCTGGAATATCGCGGCGTGCGCATTTTTTGCACCGGCGAAAACGTGCGCCCGGATTTTAACCTGGTGGATTATGCGATTAGCTTTGATTATGCGGTGTTTGGCGATCGCCATCTGCGCACCCCGCTGATGTTTCTGTGCGATGATTATGTGGAAGATATGCAGAAAGTGCTGAACAGCCGCGCGCATCTGATTAAAAGCAAAATTAAATTTTGCAGCTTTATTGCGAGCAACAACTATATGACCGAAATGCGCGATAGCTTTTTTGAAGCGCTGTGCACCTATAAAAAAGTGGATAGCGGCGGCAAATGGAAAAACAACATTGGCGTGTATGTGGATGATAAAATTGAATGGCTGAAAAGCTATAAATTTAACATTTGCTTTGAAAACGATAGCAGTCCGGGCTATCTGACCGAAAAACTGTTTGATGCGTTTATGGGCGGCTGCGTGCCGATTTATTGGGGCGATACGAGCCTGCGCTGCAAAGTGGATAACGAATGCGGCAACCTGATTGAAACCCAAGAAATTGGCTATCATCTGAACCTGGAACAGACCAAAAAAGAAGTGGATTTTGTGTATAACGGCGGTGGCTATGGCATGTTTGATACCCGCATTCCGAACATTCCGGCGTATCTGTTTGACTATAAAATTAACCCGAAAGCGTTTATTAACGCGCATGATTTTCCGACCTTTAAAGAACTGATTGATGAAATTAAACGCATTGATAACGATGAACAAGCGTTTAAAGATATGCTGAACGAACCGGTGTTTCTGAACAACTTTAATCCGAAAGAATTTTATAGTCAGAAAACCTTTCATTTTCTGGACTATATTGTGAGCCAAGGCCCGGTGTGCGCGAAACGCATTGGCCGCGGCAGCCGCTTACAGCGCAAAGAAAATATTATGCGCATGTTTCCGTATGATACCGATAGCGTGCTGATTCCGAACTTTATGAGCTATTGCGTGAAACATAAGAAAATTATTGATCGCGTGCGCCGCGTGTGCGGCTTTCCGCGCGACATCATGCGCACCATTCGCGGCAAATAA
SEQ ID NO.11
futE
ATGCAGAAACAGCAAGTGAAAATGCGCGTGCTGGATTGGTGGAACAAAGATTGCGAAGAAAACTTTTATAACAACTTCTTTATTCAGATTTTACAGAAAAAATATGATGTGGTGTATAGCGATAAACCGGATTTTATTCTGTATGGCCCGTGCGGCTATGAACATCTGAAATATGATTGCGTGCGCATTTTTTATACCGCGGAAAACATTCGCCCGGACTATAACATTGCGGACTATAGCATTGATTATGACTATATTAAATTTGGCGATCGCCATCTGCGCCTGCCGTATATGTTTTGGGTGTTTTGCGATGAAATGCGTCAGAAAGAAATGGATAACCGCATTAGCCTGCTGGATAAAAAAGAAAAATTTTGCGGCTTTATGGTGAGCAACAACGCGCTGACCGATAAACGCGATATGTTTTTTGAAGCGCTGAACAAATATAAACGCGTGGATAGCGGTGGCCGCTGGAAAAACAACATTGGCGGCAACGTGGATGATAAAATTGAATGGCTGAAAAGCTATAAATTTAACCTGTGCTTTGAAAACAGCAGCTATCCGGGCTATCTGACCGAAAAACTGTTTGATGCGTTTCTGGCGGGCTGCGTGCCGATTTATTGGGGCGATACGAGCCTGCGCGTGCATAAAAACACCTGCGCGGATAGCAAAAACAGCGAAAACATTAACAACCGCGGCGGTGGCGGCAACGATACCTTTGATATGCGCATTCCGAACATTAGCCATAGCCTGATTGATTATGAAATTAACCCGAAAGCGTTTATTAACGCGCATAACTTTCCGACCTTTAAAGATCTGATTGATGAAATTAAACGCATTGATAACGATAGCTATGCGTTTGAAAGCATTCTGCGCGAACCGATTTTTCTGAACAACTTTAGCCCGTATGAATTTTATACCGAACAGATTAGCGCGTTTCTGGATCATATTATTATGCAAGGCGCGAACGATGCGCGCCGCTGCGGCGATGGCTATTGGCTGCGCACCCATCTGGAATTTCGCCGCATTAGCGCGAAATATTGGAACCTGCCGAGCGATTTTCTGCATTATTGCTTTAAATATCGCAAAATTATTCAAGGCGTGCGCGATATTAGCGAATATCCGCGCAACTTTATGCGCTTTCTGCGCCGCAAATAA
SEQ ID NO.12
futH
ATGGCGCAGAACTTACAGACCCCGCAAGATAGCAAAACCAAAAAACGCATTTATTTTTGCGATGGCGCGGTGAAAGGCAAAATTCCGGCGATTCTGAGCCGCCATTATGATATTGAAATTACCCCGCATAACCCGGATTATGTGTTTTATAGCGTGATGGGCAACGAACATATTAACTATGATTGCATTCGCATTTTTAGCACCGGCGAAAACGTGCGCGCGGATTTTAACTTTTGCGATTATGCGATTGGCTTTGACTATATGCAGTTTGAAGATCGCTATCTGCGCTATCCGTTTTATCTGCACTATAAAGAAGCGATGGAAAAAGCGCGCAACAAACATCTGCATATTACCCCGCAGACCCTGGAAAACAAAAAACGCTTTTGCACCTTTGTGGTGAGCAACGGCAAAGCGGATAGTATCCGCAGTCAGTTTTTTGATAAACTGATGCAGTATAAACATATTGATAGCGGCGGCAAATATAAAAACAACATTGGCGCGCCGGTGGCGGATAAACTGGCGTTTCTGAGCGAAGGCAAATTTAACATTGCGTTTGAAAACAGCAGCGCGAACGGCTATACCACCGAAAAACTGATTGAAGCGTTTGCGGCGGGCACCATTCCGCTGTATTGGGGCGATGAAAGCGTGAGCCTGCCGCTGGATAGCAGCGGCGGTGGCGTGAACCCGAAGAGCTTTGTGCGCCTGAACGATTTTGCGAGCTTTGAAGAAGCGATTGCGTATATTGAATTTCTGGATACCCATAACGATGCGTATCTGGCGATTCTGCGCGAAGAAACCTTTCTGGATAGCAACCATGAAGCGATTTTTGATAAAAAACTGGAGAGCTTTCTGCTGCATATTTTTAATCAGCCGCTGGAAAAAGCGTATCGCCGCGGCTTTGGTCAGTGGCGCTGCAACATTGAAAAACGCTATAAAAAATATCAGCGCATCCGCAGCTTAACCAACACCTGCGTGAACATTATTAAAAACCCGATTCGCCGCATTAAAAAACTGTTTAAATAA
SEQ ID NO.13
futJ
ATGAAAGATGATCTGGTGATTCTGCATCCGGATGGCGGCATTGCGAGTCAGATTGCGTTTGTGGCGCTGGGCCTGGCGTTTGAACAGAAGGGCGCCAAAGTGAAATATGATCTGAGCTGGTTTGCGGAAGGTGCGAAAGGCTTTTGGAACCCGAGCAACGGCTATGATAAAGTGTATGATATTACCTGGGATATTAGCAAAGCGTTTCCGGCGCTGCATATTGAAATTGCGAACGAAGAGGAAATTGAACGCTATAAAAGCAAATATCTGATTGATAACGATCGCGTGATTGATTATGCGCCGCCGCTGTATTGCTATGGCTATAAAGGCCGCATTTTTCATTATCTGTATGCGCCGTTTTTTGCGCAGAGCTTTGCGCCGAAAGAAGCGCAAGATAGCCATACCCCGTTTGCGGCGCTGCTGCAAGAAATTGAAAGCAGCCCGAGCCCGTGCGGCGTGCATATTCGCCGCGGCGATCTGAGTCAGCCGCATATTGTGTATGGCAACCCGACGAGCAACGAATATTTTGCGAAAAGCATTGAACTGATGTGCCTGCTGCATCCGCAGAGCAGCTTTTATCTGTTTAGCGATGATCTGGCGTTTGTGAAAGAACAGATTGTGCCGCTGCTGAAAGGCAAAACCTATCGCATTTGCGATGTGAACAACCCGAGCCAAGGCTATCTGGATCTGTATCTGCTGAGCCGCTGCCGCAACATTATTGGCAGCCAAGGCAGCATGGGCGAATTTGCGAAAGTGCTGAGCCCGCATAACCCGCTGCTGATTACCCCGCGCTATCGCAACATTTTTAAAGAAGTGGAAAACGTGATGTGCGTGAACTGGGGCGAAAGCGTGCAGCATCCGCCATTAGTGTGTAGCGCGCCGCCACCGCTGGTTAGCCAACTGAAACGCAACGCGCCGCTGAACAGCCGCCTGTATAAAGAAAAAGATAACGCGAGCGCGTAA
SEQ ID NO.14
futK
ATGAACCAAGGCTGCACCAAAACCCATAAACCGACCAAAAAAGTGTATTTTTGCGATGGCGCGGTGAAAGGCAAAATTGTGGCGCTGCTGGAACAGCATTATGAACTGATTCTGACCAACAAAGATCCGGACTATATTTTTTATAGCTGCATGGGCTTTGAACATCTGAACTATAACAAAGTGCGCATTTTTGCGACCGGCGAAAACCTGCGCGCGGATTTTAACTTTTGCGATTATGCGATTGGCTATGACTATATTCATTTTGAAGATCGCTATCTGCGCTATCCGCTGTATCTGCATTGCGAAAGCGATATGCAGAAAGCGATGAACAAACATCTGCATATTACCCCGGAAACCTTACAGAACAAAAGCCGCTTTTGCACCTTTGTGGTGAGCAACGGCAAAGCGGATGAAATTCGCACGCAGTTTTTTGATTTTCTGAGTCAGTATAACCGCGTGGATAGCGGTGGCCGCTATAAAAACAACATTGGCAACCCGGTGGTGGATAAATATGCGTTTCTGAAAGAAGGCAAATTTAACATTGCGTTTGAAAACAGCAGCACCAACGGCTATATTACCGAAAAACTGATTCAAGCGTTTGCGGCGCATACCATTCCGATTTATTGGGGCGATGAACGCATTAGCCTGCCGCTGGATAAAATGGGCGGTGGCATTAACCCGAAGAGCTTTATTAACATGCATAAATATGAAAGCTATAAAGAAGTGCTGGAAACCATTTATTTTCTGGATACCCATGATGAAGCGTATCTGAGTATGCTGAGCGAACCGGTGTTTCTGGATAAAAACCATCAGAAAATTTTTGATGAAAAACTGGAAAACTTTCTGCTGCATATTTTTAATCAGCCGCTGGAAAAAGCGTATCGCCGCGGCTTTGGTCAGTGGCGCTGCAACATTGAAAAACGCTATAAAAAAGCGCAGAAAGCGCGTCAGATTGTGAACAACTTTGCGAACATTTTTCAGATTCCGCTGCGCACCCTGAAAAAATATCTGCTGAGCATTTATCTGAGCGCGACGAGCAAGAGCTTTGTGTTTTTTACCAAAGAACGCACGAGCAAATAA
SEQ ID NO.15
futM
ATGTGCGATTGCCTGAGCATTATTCTGCTGGTGAAAATGAAGAAAATTTATCTGAAATTTGTGGATTTTTGGGATGGCTTTGATACCATTAGCAACTTTATTGTGGATGCGCTGAGCATTCAGTATGAAGTGGTGCTGAGCAACGAACCGGATTATCTGTTTTATAGCTGCTTTGGCACGAGCCATCTGGAATATGATTGCATTAAAATTATGTTTATTGGCGAAAACATTGTGCCGGATTTTAACGTGTGCGATTATGCGATTGGCTTTAACTATATTGATTTTGGCGATCGCTATCTGCGCCTGCCGCTGTATGCGATTTATGATGGCTTTAGCAACTTACAGAACAAGAAAATTGATGTGAACAAAGCGCTGGATCGCAAATTTTGCAGCATTGTGGTGAGCAACAACAAATGGGCCGATCCGATTCGCGAAACCTTTTTTAAACTGCTGAGCAGCTATAAAAAAGTGGATAGCGGTGGCCGCGCGTGGAACAACATTGGCGGCCCGGTGGATAACAAACTGGATTTTATTAGTCAGTATAAATTTAACATTGCGTTTGAAAACAGCCGCGTGCTGGGCTATACCACCGAAAAAATTATGGAACCGATGCAAGTGAACAGCATTCCGGTGTATTGGGGCAACCCGCTGGTGGGCAAAGATTTTAACGTTGACAGCTTTGTGAACGCGCATGATTTTGATAGCCTGGAACGCCTGGTGGAATATATTATTGAACTGGATAGCAGCAAAGATAAATATCTGGAAATGCTGGAAAAACCGTGGCTGCTGGATAAAACCTATCTGGATTGGAAACAGCTGTTACTGAACTTTATTAACAACATTATGATGAAAAGCTATAAAGATGCGAAATATCTGGTGAACTATGGCCATGCGGGCAAATATCGCAACGAACAGCGCTTTTGGGGCCGCTGCGAACGCAAATTTAAATTACAGCGCATTATTGAATACTATAGTCAGCTGTTTGATCGCAAATAA
本发明公开的构建重组大肠杆菌生物合成3-岩藻乳糖的方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：
（1）本发明所构建的大肠杆菌基因工程菌具有以葡萄糖为碳源发酵合成3-岩藻乳糖的特点，发酵12 h，可以得到5-7 g/L的3-岩藻乳糖。
（2）本发明建立了一条3-岩藻乳糖的合成途径，本发明同时克服了现有的技术难题，获得了一个高效的基因敲除方案；原始菌株在通过基因工程改造以后，除了生产3-岩藻乳糖外，没有改变菌株的其它特性，不影响发酵生产；该菌株采用的质粒为成熟的大肠杆菌质粒，因此在代谢过程中不影响细菌生长和正常代谢。
附图说明
图1是质粒pACYC-rcsA-manA的图谱，用来过表达3-岩藻乳糖合成途径中的rcsA、 manA基因；
图2是质粒pET-manB-manC-gmd-fcl的图谱，用来过表达3-岩藻乳糖合成途径中的manB、manC、gmd、fcl基因；
图3是质粒pCDF-lacY-1,3FT的图谱，用来过表达3-岩藻乳糖合成途径中的lacY、1,3FT基因；
图4是本发明中构建的合成3-岩藻乳糖的代谢途径；
图5是ESI-MS检测重组菌株发酵液。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。以下实施例中所用的材料、试剂、仪器和方法未经特殊说明均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得；例如Tryptone(胰蛋白胨)，Yeast Extract（酵母提取物），Agar（琼脂）；卡那霉素，氨苄青霉素，链霉素，E.coliDH5α等等。
本发明中质粒提取采用生工生物工程（上海）有限公司的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒（Catalog NO.：B518191），切胶回收是采用生工生物工程（上海）有限公司的SanPrep柱式胶回收试剂盒（Catalog NO.：B518131），DNA片段的连接是使用fermentas公司的T4 DNA Ligase（Catalog NO.：EL0014），DNA片段的扩增使用fermentas公司的pfu DNApolymerase（Catalog NO.：EP0571）,PCR质粒模板的消化使用fermentas公司的FalstDigelst KpnI（Catalog NO.：FD0524），BamHI（Catalog NO.：FD0054） NcoI（Catalog NO.：FD0574）BglII（Catalog NO.：FD0083）E.coli电击转化实验使用Bio-Rad的电转仪（CatalogNO.：165-2100）。细菌基因组提取使用北京康为世纪生化科技有限公司的细菌基因组提取试剂盒（Catalog NO.：CW0552S）
实施例1
基因的获取
本实施例中，对不同来源的基因进行密码子优化，包括：来源于大肠杆菌MG1655的磷酸甘露糖酶基因manB（优化基因号SEQ ID NO.1），磷酸鸟嘌呤转移酶基因manC（优化基因号SEQ ID NO.2），GDP-甘露糖- 4,6-脱水酶基因gmd（优化基因号SEQ ID NO.3），GDP-fucose合成酶基因fcl（优化基因号SEQ ID NO.4），甘露糖-6-磷酸异构酶基因manA（优化基因号SEQ ID NO.5），GDP-fucose的合成的一个正向调控因子rcsA（优化基因号SEQ IDNO.6），获取来源于大肠杆菌BL21的β-半乳糖苷透性酶基因lacY（优化基因号SEQ IDNO.7），获取来源于幽门螺旋杆菌的α-1，3-岩藻糖转移酶基因 futB（优化基因号SEQ IDNO.8）和futA（优化基因号SEQ ID NO.9）是指来源于幽门螺旋杆菌、锥状螺旋杆菌futD（优化基因号SEQ ID NO.10）、胆型螺旋杆菌futE（优化基因号SEQ ID NO.11）、伤寒螺旋杆菌futH（优化基因号SEQ ID NO.12）、肝螺旋杆菌futJ（优化基因号SEQ ID NO.13）和futK（优化基因号SEQ ID NO.14），脆弱拟杆菌futM（优化基因号SEQ ID NO.15）。
实施例2
重组质粒的制备
对实施例1中获得的密码子优化的来源于大肠杆菌MG1655的磷酸甘露糖酶基因manB，磷酸鸟嘌呤转移酶基因manC进行PCR扩增，扩增后的片段进行切胶纯化，并用NcoI和HindIII进行双酶切，酶切后的片段与同样经过NcoI和HindIII双酶切的质粒pETDuet-1质粒进行连接，将载体：目的片段按摩尔比为1:3的比例混合，加入T4 DNA Ligase后在22℃下酶连5h，连接产物转化E.coliDH5α，并在氨苄青霉素板上进行筛选，获得重组质粒pET-manB-manC。
对实施例1中获得的密码子优化的来源于大肠杆菌MG1655的GDP-甘露糖- 4,6-脱水酶基因gmd，GDP-fucose合成酶基因fcl进行PCR扩增，扩增后的片段进行切胶纯化，并用NdeI和XhoI进行双酶切，酶切后的片段与同样经过NdeI和XhoI双酶切的质粒pET-manB- manC质粒进行连接，将载体：目的片段按摩尔比为1:3的比例混合，加入T4 DNA Ligase后在22℃下酶连5h，连接产物转化E.coliDH5α，并在链霉素板上进行筛选，获得重组质粒pET-manB-manC-gmd-fcl。
对实施例1中获得的密码子优化的来源于大肠杆菌BL21的β-半乳糖苷透性酶基因（lacY）,来源于幽门螺旋杆菌的α-1，3-岩藻糖转移酶基因 futA进行PCR扩增，扩增后的片段进行切胶纯化，并用NcoI和HindIII进行双酶切，酶切后的片段与同样经过NcoI和HindIII双酶切的质粒pCDFDuet-1质粒进行连接，将载体：目的片段按摩尔比为1:3的比例混合，加入T4 DNA Ligase后在22℃下酶连5h，连接产物转化E.coliDH5α，并在链霉素板上进行筛选，获得重组质粒pCDF-lacY-futA。
对实施例1中获得的密码子优化的来源于大肠杆菌MG1655的甘露糖-6-磷酸异构酶基因manA，GDP-fucose的合成的一个正向调控因子rcsA进行PCR扩增，扩增后的片段进行切胶纯化，并用NcoI和HindIII进行双酶切，酶切后的片段与同样经过NcoI和HindIII双酶切的质粒pACYCDuet-1质粒进行连接，将载体：目的片段按摩尔比为1:3的比例混合，加入T4DNA Ligase后在22℃下酶连5h，连接产物转化E.coliDH5α，并在链霉素板上进行筛选，获得重组质粒pACY-manA-rcsA。
实施例3
基因的敲除
本实施例使用λRed重组系统敲除E.coliBL21(DE3)的多个基因，该方法每敲除一个基因都进行抗性的消除。下面以lacZ基因为例，详细阐述基因敲除的步骤，其余2个基因的敲除与此相同。
在NCBI中查找E.coli BL21(DE3) lacZ基因的核苷酸序列，设计lacZ基因的缺失引物和鉴定引物。
实施例4
缺失型E. coli TT401的构建
4.1质粒pSim的转化
挑取-80℃冻存的野生型E.coliBL21(DE3)在无抗性的LB平板上划线，37℃过夜培养。第二天挑取单克隆，接种至5mL LB培养基中，37℃，220rpm，过夜培养。转天按1%的接种量，转接至200ml的LB培养基中。37℃，220rpm，培养至OD600约为0.6-0.8，冰浴20min，5500rpm，5min，收集菌体于已灭菌的50ml离心管中，4℃，5500rpm，离心5min，弃上清，用50ml冰浴过的无菌的10%甘油重悬菌体，4℃，5500rpm，再离心5min，重复上述操作3次，最后一次，利用弃上清时的残余液体重悬菌体，取80μL于至新的无菌EP管中。-80℃冻存。
将-80℃冻存的感受态细胞置于冰中融化10min，加入1μL的pSim质粒，混匀，加入电击杯中，用电转仪转化。设置参数：Ec1，ms，bacteria。电击后立即加入1ml的LB培养基，30℃，140 rpm复苏1 h，取适量菌液涂布于灭瘟素平板上（灭瘟素浓度200μg/ml），30℃倒置避光过夜培养，挑取5个单菌落，以煮菌液为模板，用psim质粒的特异性鉴定引物做鉴定。将鉴定正确的菌株接种到LB液体培养基中，培养过夜。吸取1 ml过夜菌于装有200 μl甘油的菌种保存管中，-80 ℃保存。
4.2 目的基因的敲除
4.2.1同源重组片段的制备
以pKD3质粒为模板，进行PCR扩增，切胶纯化回收，获得两端含有lacZ同源臂的敲除片段lacZ-Fragment I。
4.2.2含psim质粒的E.coli BL21(DE3)菌株感受态的制备
取5 μl含psim质粒的E.coliBL21(DE3)菌接种到5 ml LB液体培养基中，加入10 μl灭瘟素溶液（100 mg/ml），30 ℃避光，180 rpm过夜。按菌：LB培养基=1:100转接于200 mlLB液体培养基中。30 ℃，180 rpm，避光摇2 h，OD600≈0.6 。42 ℃水浴摇床中摇15 min（诱导重组酶表达）。冰浴，置于水平摇床上，30 min。4 ℃，5000 rpm，离心5 min，收集菌体。每管用25 ml 10% 甘油重悬，两两合并。振荡混匀，4 ℃，5000 rpm，离心5 min弃液。剩余两管中，每管各倒入50 ml 10% 甘油重悬菌体，4 ℃，5000 rpm，离心5 min弃液。向管中各倒入25 ml 10% 甘油，重悬菌体，两管合并成一管。4 ℃，5000 rpm，离心5 min弃液。向管内加入50 ml 10% 甘油，振荡重悬菌体，4 ℃，5000 rpm，离心5 min弃液。弃液后，加入1ml 10% 甘油重悬菌体，90 μl分一管，分装到1.5 ml EP管中。置于-80 ℃保存。
4.2.3 lacZ-Fragment I抗性片段的转化
将回收好的带有同源臂的氯霉素抗性片段lacZ-Fragment I取10 μl与制备的含psim质粒的E.coli BL21(DE3)菌株感受态90 μl混合，吹吸混匀后加入的电击杯中。电转仪参数设置：Ec1，ms，Bacteria。37 ℃，140 rpm，摇5 h进行同源重组。取100 μl菌悬液涂布于DFI氯霉素抗性平板上。将剩余复苏液5000 rpm，离心3 min，弃液，沉淀的菌体涂布于DFI氯霉素抗性平板上。37 ℃，180 rpm，过夜。挑取5个单菌落，扎保留板，并标记，以煮菌液为模板。以煮菌液为试验组模板，E.coli BL21(DE3)基因组为对照组模板，用鉴定引物做PCR扩增。将比对正确的基因缺失菌株从保留板上挑下，即E.coliBL21（DE3） ∆lacZ，接种到LB培养基中，37 ℃。180 rpm摇床上培养过夜。在超净工作台中，从过夜菌中取出1 ml加到含有250 μl甘油的无菌保存管中，混合均匀，于-80 ℃保存菌种。
4.2.4 抗性片段的消除
挑取E.coliBL21 (DE3) ∆lacZ单克隆接种至5ml的LB培养基中，按照上面步骤制备感受态，电转pCP20质粒，电击后立即加入1ml的LB培养基，30℃，180rpm，培养20min，取适量菌液涂布于氨苄青霉素平板上（氨苄青霉素浓度100 μg/ml），30℃过夜培养。第二天挑取单克隆至5ml的LB培养基中（氯霉素浓度25μg/ml），30℃，180rpm, 培养10h，转移至新的液体培养基，不加抗生素，42℃，培养6h后，稀释涂板，37℃，倒置过夜培养，第二天挑单克隆，分别在无抗板和氯霉素板上进行影印。氯霉素板上未长，但是无抗板对应位置上长出的单克隆，即为抗性消除成功的阳性克隆，进一步通过PCR鉴定。
4.2.5 lacA、wcaJ、lon的敲除
剩余3个基因的敲除原理和步骤与lacZ相同，以敲除了lacZ基因的菌株为基础，通过重复实验步骤中的4.2，可依次将全部3个基因敲除，最终构建出缺失的E. coli TT401。
实施例5
产3-岩藻乳糖E. coli TT401-FL3菌株的构建
以敲除4个基因的E. coli TT401菌株为基础，制备感受态细胞（方法参照实验步骤4.1），将pCDF-lacY-1,3FT，pET-manB-manC-gmd-fcl，pACYC-rcsA-manA转入，在LB平板（氯霉素50 μg/ml，氨苄青霉素100 μg/ml，链霉素50 μg/ml）上筛选正确的克隆。经双酶切验证得到携带整个3-岩藻乳糖合成途径的菌株E. coli TT401-FL3。得到5~8g/L的3-岩藻乳糖，图4为本发明中合成3-岩藻乳糖的代谢途径。
实施例6
E. coli TT401-FL3菌株生产3-岩藻乳糖
将菌株接种至5mL的LB培养基中（氯霉素50 μg/ml，氨苄青霉素100μg/ml，链霉素50μg/ml），37℃，220rpm，过夜培养。第二天按1%的接种量转接至优化的FMT培养基中，OD600约为0.6时诱导（IPTG浓度0.2mM），转至25℃，诱导2h后，加入2mL乳糖，约4h后取样，4℃，7000 g，离心10min，将上清与沉淀分开。上清过0.22μm滤膜。通过ESI-MS和高效液相色谱检测。
FMT培养基（1L）：Tryptone(胰蛋白胨)：3 g，Yeast Extract（酵母提取物）：2 g，NaCl（氯化钠）：2 g，KH2PO4（磷酸二氢钾）：2 g，K2HPO4（磷酸氢二钾）：1 g，NH4Cl（氯化铵）：1g，MgSO4•7H2O（七水合硫酸镁）：0.2 g，FeSO4•7H2O（七水合硫酸亚铁）：2 mg，MnSO4•H2O （水合硫酸锰）：1 mg，Na2SO4（硫酸钠）：10 mg，ZnSO4（硫酸锌）：10 mg，CoCl2•6H2O（六水合氯化钴）,1 mg，CuSO4•5H2O （五水合硫酸铜）0.1 mg， Glucose（葡萄糖）：20 g，Lactose（乳糖）：2g。
沉淀首先用灭菌水悬浮，4℃，7000 g，离心10min，重复一次，然后采取反复冻融来破碎细胞，破碎后，4℃，5100 g，离心25min，离心，将上清转移至10mL的离心管中，过0.22μm滤膜，通过ESI-MS检测。
3-岩藻乳糖的检测：ESI-MS，
仪器：Finnigan LCQ Advantage MAX ion trap mass spectrometer
(Thermo Electron,CA)
离子化模式：电喷雾负离子模式;
电喷雾范围：400-700m/z;干燥器温度：220℃；
喷雾压力：45psi；毛细管电压：4500V;
进样量：0.2mL/min;
碰撞气体为氮气，辅助气体为氦气；
高效液相检测
色谱柱：Venusil C18柱（5μm particle size，4.6 by 250mm）;
流动相：10% 乙腈， 90% 三乙胺冰醋酸（pH 6.0）;
流速：0.6mL/min;
进样量5μL。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的范围和精神。
序列表
<110> 南开大学
<120> 一种合成3-岩藻乳糖的重组大肠杆菌构建方法及其应用
<141> 2020-12-08
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1371
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
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aacgaagata ttgcgtggcg cattggccgc gcgtatggcg aatttctgaa accgaaaacc 120
attgtgctgg gcggcgatgt gcgcctgacg agcgaaaccc tgaaactggc gctggcgaaa 180
ggcctgcaag atgcgggcgt ggatgtgctg gatattggca tgagcggcac cgaagaaatt 240
tattttgcga cctttcatct gggcgtggat ggcggcattg aagtgaccgc gagccataac 300
ccgatggact ataacggcat gaaactggtt cgtgaaggcg cgcgcccgat tagcggcgat 360
accggcctgc gcgatgtgca gcgcttagcg gaagcgaacg attttccgcc ggtggatgaa 420
accaaacgtg gccgctatca gcagattaac ctgcgcgatg cgtatgtgga tcatctgttt 480
ggctatatta acgtgaaaaa cctgaccccg ctgaaactgg tgattaacag cggcaacggc 540
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gaactgatta aagtgcataa caccccggat ggcaactttc cgaacggcat tccgaacccg 660
ctgctgccgg aatgccgcga tgatacccgc aacgcggtga ttaaacatgg cgcggatatg 720
ggcattgcgt ttgatggcga ttttgatcgc tgctttctgt ttgatgaaaa aggtcagttt 780
attgaaggct actatattgt gggcctgctg gcggaagcgt ttctggagaa aaatccgggc 840
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ggtggcaccc cggtgatgag caaaaccggc catgcgttta ttaaagaacg tatgcgcaaa 960
gaagatgcga tttatggcgg cgaaatgagc gcgcatcatt attttcgcga ttttgcgtat 1020
tgcgatagcg gcatgattcc gtggctgctg gtggcggaac tggtgtgcct gaaagataaa 1080
accctgggcg aactggttcg cgatcgcatg gcggcgtttc cggcgagcgg cgaaattaac 1140
agcaaactgg cgcagccggt ggaagcgatt aaccgcgtgg aacagcattt tagccgcgaa 1200
gcgctggcgg tggatcgcac cgatggcatt agcatgacct ttgcggattg gcgctttaac 1260
ctgcgcacga gcaacaccga accggtggtg cgcctgaacg tggaaagccg cggtgacgtg 1320
ccgctgatgg aagcgcgcac ccgcaccctg ctgaccctgc tgaacgaata a 1371
<210> 2
<211> 1437
<212> DNA
<213> 人工序列()
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ctgaatccgg gcgaagcgat gtttctgttt gcggaaaccc cacatgcgta tctgcaaggc 780
gtggcgctgg aagtgatggc gaacagcgat aacgtgctgc gcgcgggcct gaccccgaaa 840
tatattgata ttccggaact ggtggcgaac gtgaaatttg aagcgaaacc ggcgaatcag 900
ctgctgacgc agccggtgaa acaaggcgcg gaactggatt ttccgattcc ggtggatgat 960
tttgcgttta gcctgcatga tctgagcgat aaagaaacca ccattagtca gcagagcgcg 1020
gcgattctgt tttgcgtgga aggcgatgcg accctgtgga aaggcagtca gcagttacag 1080
ctgaaaccgg gcgaaagcgc gtttattgcg gcgaacgaaa gcccggtgac cgtgaaaggt 1140
catggccgcc tggcgcgcgt gtataacaaa ctgtaa 1176
<210> 6
<211> 624
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
atgagcacca ttattatgga tctgtgcagc tatacccgcc tgggcctgac cggctatctg 60
ctgagccgcg gcgtgaaaaa acgcgaaatt aacgatattg aaaccgtgga tgatctggcg 120
attgcgtgcg atagtcagcg cccgagcgtg gtgtttatta acgaagattg ctttattcat 180
gatgcgagca acagtcagcg cattaaactg attattaatc agcatccgaa caccctgttt 240
attgtgttta tggcgattgc gaacgtgcat tttgatgaat atctgctggt gcgcaaaaac 300
ctgctgatta gcagcaaaag cattaaaccg gaaagcctgg atgatattct gggcgatatt 360
ctgaaaaaag aaaccaccat tacgagcttt ctgaacatgc cgaccctgag cctgagccgc 420
accgaaagca gtatgctgcg catgtggatg gcgggccaag gcaccattca gattagcgat 480
cagatgaaca ttaaagcgaa aaccgtgagc agccataaag gcaacattaa acgcaaaatt 540
aaaacccata acaaacaagt gatttatcat gtggtgcgcc tgaccgataa cgtgaccaac 600
ggcatttttg tgaacatgcg ctaa 624
<210> 7
<211> 1254
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
atgtattatc tgaaaaacac caacttttgg atgtttggtc tgtttttctt cttttacttt 60
tttatcatgg gcgcgtattt tccgtttttt ccgatttggc tgcatgatat taaccatatt 120
agcaaaagcg ataccggcat tatttttgcg gcgattagcc tgtttagcct gctgtttcag 180
ccgctgtttg gcctgctgag cgataaactg ggcctgcgca aatatctgct gtggattatt 240
accggtatgc tggtgatgtt tgcgccgttt tttattttta tctttggccc gctgttacag 300
tataacattc tggtgggcag cattgtgggt ggtatttatc tgggcttttg ctttaacgcg 360
ggcgcgccgg cggtggaagc gtttattgaa aaagtgagcc gccgcagcaa ctttgaattt 420
ggccgcgcgc gcatgtttgg ctgcgtgggc tgggcgctgt gcgcgagcat tgtgggcatt 480
atgtttacca ttaacaatca gtttgtgttt tggctgggca gcggctgcgc gctgattctg 540
gcggtgctgc tgttttttgc gaaaaccgat gcgccgagca gcgcgaccgt ggcgaacgcg 600
gtgggcgcga accatagcgc gtttagcctg aaactggcgc tggaactgtt tcgtcagccg 660
aaactgtggt ttctgagcct gtatgtgatt ggcgtgagct gcacctatga tgtgtttgat 720
cagcagtttg cgaacttttt tacgagcttt tttgcgaccg gcgaacaagg cacccgcgtg 780
tttggctatg tgaccacgat gggcgaactg ctgaacgcga gcattatgtt ttttgcgccg 840
ctgattatta accgcattgg cggcaaaaac gcgctgttac tggcgggcac cattatgagc 900
gtgcgcatca ttggcagcag ctttgcgacg agcgcgctgg aagtggtgat tctgaaaacc 960
ctgcacatgt ttgaagtgcc gtttctgctg gtgggctgct ttaaatatat tacgagtcag 1020
tttgaagtgc gctttagcgc gaccatttat ctggtgtgct tttgcttttt taaacagctg 1080
gcgatgattt tcatgagcgt tctggcgggc aacatgtatg aaagcattgg ctttcaaggc 1140
gcgtatctgg tgctgggcct ggtggcgctg ggctttaccc tgattagcgt gtttaccctg 1200
agcggtccgg gcccgctgag cctgctgcgc cgccaagtga acgaagtggc gtaa 1254
<210> 8
<211> 1434
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
atggtgtttc agccgctgct ggatgcgttt attgaaagcg cgagcattga aaaaatggtg 60
agcaaaagcc cgccaccgcc gctgaaaatt gcggtggcga actggtgggg cgatgaagaa 120
attaaagaat ttaagaaaag cgtgctgtat tttattctga gtcagcgcta tgcgattacc 180
ctgcatcaga acccgaacga aagcagcgat ctggtgttta gcaacccgct gggcgcggcg 240
cgcaaaattc tgagctatca gaacaccaaa cgcgtgtttt ataccggcga aaacgaaagc 300
ccgaacttta acctgtttga ttatgcgatt ggctttgatg aactggattt taacgatcgc 360
tatctgcgta tgccgctgta ttatgcgcat ctgcattatg aagcggaact ggtgaacgat 420
accaccgcgc cgtataaact gaaagataac agcctgtatg cgctgaaaaa accgagccat 480
cattttaaag aaaaccatcc gaacctgtgc gcggtggtga acgatgaaag cgatctgctg 540
aaacgcggct ttgcgagctt tgtggcgagc aacgcgaacg cgccgatgcg caacgcgttt 600
tatgatgcgc tgaacagcat tgaaccggtg accggcggtg gcagcgtgcg caacaccctg 660
ggctataaag tgggcaacaa aagcgaattt ctgagtcagt ataaatttaa cctgtgcttt 720
gaaaacagcc aaggctatgg ctatgtgacc gaaaaaattt tagatgcgta ttttagccat 780
accattccga tttattgggg cagcccgagc gtggcgaaag attttaaccc gaagagcttt 840
gtgaacgtgc atgattttaa caactttgat gaagcgattg actatattaa atatctgcat 900
acccatccga acgcgtatct ggatatgctg tatgaaaacc cgctgaacac cctggatggc 960
aaagcgtatt tctatcaaga tctgagcttc aagaaaattc tggacttttt taaaaccatt 1020
ctggaaaacg ataccattta tcataacaac ccgtttattt tttatcgcga tctgcatgaa 1080
ccgctgatta gcattgatga tctgcgcgtg aactacgatg acctgcgcgt gaactatgat 1140
gatctgcgcg tgaactatga tgacctgcgc gttaactacg atgatctgcg cgtgaactat 1200
gatgacctgc gtgtgaatta cgacgatctg cgcgtgaact atgatgattt acgcgtgaac 1260
tatgatgatt tacgtgtgaa ctatgatgat ctgcgcgtga actacgatcg cctgttacag 1320
aacgcgagcc cgctgctgga actgagtcag aacaccacct ttaaaattta tcgcaaagcg 1380
tatcagaaaa gcctgccgct gctgcgcacc attcgccgct gggtgaaaaa ataa 1434
<210> 9
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
atgggctttc agccgctgct ggatgcgttt attgaaagcg cgagcattga aaaaatggcg 60
agcaaaagcc cgccaccgcc gctgaaaatt gcggtggcga actggtgggg cgatgaagaa 120
attaaagaat ttaagaaaag cgtgctgtat tttattctga gtcagcgcta tgcgattacc 180
ctgcatcaga acccgaacga atttagcgat ctggtgttta gcaacccgct gggcgcggcg 240
cgcaaaattc tgagctatca gaacaccaaa cgcgtgtttt ataccggcga aaacgaaagc 300
ccgaacttta acctgtttga ttatgcgatt ggctttgatg aactggattt taacgatcgc 360
tatctgcgta tgccgctgta ttatgcgcat ctgcactata aagcggaact ggtgaacgat 420
accaccgcgc cgtataaact gaaagataac agcctgtatg cgctgaaaaa accgagccat 480
cattttaaag aaaaccatcc gaacctgtgc gcggtggtga acgatgaaag cgatctgctg 540
aaacgcggct ttgcgagctt tgtggcgagc aacgcgaacg cgccgatgcg caacgcgttt 600
tatgatgcgc tgaacagcat tgaaccggtg accggcggtg gcagcgtgcg caacaccctg 660
ggctataaag tgggcaacaa aagcgaattt ctgagtcagt ataaatttaa cctgtgcttt 720
gaaaacagcc aaggctatgg ctatgtgacc gaaaaaattc tggatgcgta ttttagccat 780
accattccga tttattgggg cagcccgagc gtggcgaaag attttaaccc gaagagcttt 840
gtgaacgtgc atgattttaa caactttgat gaagcgattg actatattaa atatctgcat 900
acccatccga acgcgtatct ggatatgctg tatgaaaacc cgctgaacac cctggatggc 960
aaagcgtatt tttatcaaga tctgagcttt aagaaaattt tagatttttt caaaaccatt 1020
ctggaaaacg ataccattta tcataaattt agcacgagct ttatgtggga atatgatctg 1080
cataaaccgc tggtgagcat tgacgatctg cgtgtgaact atgatgattt acgcgtgaat 1140
tacgatcgct tattacagaa cgcgagcccg ctgctggaac tgagtcagaa caccaccttt 1200
aaaatttatc gcaaagcgta tcagaaaagc ctgccgctgc tgcgcgcggt gcgcaaactg 1260
gtgaaaaaac tgggcctgta a 1281
<210> 10
<211> 1209
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
atggataaac agattctgaa catgcgcgtg ctggattggt ggaccgaaga taacgaacag 60
aacttttatg ataacatttt tattcgcctg ttacagcgca aatatgaagt ggtgtatagc 120
gataccccgg attttgtgct gtgcggcccg tttggctata aacatctgga atatcgcggc 180
gtgcgcattt tttgcaccgg cgaaaacgtg cgcccggatt ttaacctggt ggattatgcg 240
attagctttg attatgcggt gtttggcgat cgccatctgc gcaccccgct gatgtttctg 300
tgcgatgatt atgtggaaga tatgcagaaa gtgctgaaca gccgcgcgca tctgattaaa 360
agcaaaatta aattttgcag ctttattgcg agcaacaact atatgaccga aatgcgcgat 420
agcttttttg aagcgctgtg cacctataaa aaagtggata gcggcggcaa atggaaaaac 480
aacattggcg tgtatgtgga tgataaaatt gaatggctga aaagctataa atttaacatt 540
tgctttgaaa acgatagcag tccgggctat ctgaccgaaa aactgtttga tgcgtttatg 600
ggcggctgcg tgccgattta ttggggcgat acgagcctgc gctgcaaagt ggataacgaa 660
tgcggcaacc tgattgaaac ccaagaaatt ggctatcatc tgaacctgga acagaccaaa 720
aaagaagtgg attttgtgta taacggcggt ggctatggca tgtttgatac ccgcattccg 780
aacattccgg cgtatctgtt tgactataaa attaacccga aagcgtttat taacgcgcat 840
gattttccga cctttaaaga actgattgat gaaattaaac gcattgataa cgatgaacaa 900
gcgtttaaag atatgctgaa cgaaccggtg tttctgaaca actttaatcc gaaagaattt 960
tatagtcaga aaacctttca ttttctggac tatattgtga gccaaggccc ggtgtgcgcg 1020
aaacgcattg gccgcggcag ccgcttacag cgcaaagaaa atattatgcg catgtttccg 1080
tatgataccg atagcgtgct gattccgaac tttatgagct attgcgtgaa acataagaaa 1140
attattgatc gcgtgcgccg cgtgtgcggc tttccgcgcg acatcatgcg caccattcgc 1200
ggcaaataa 1209
<210> 11
<211> 1155
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
atgcagaaac agcaagtgaa aatgcgcgtg ctggattggt ggaacaaaga ttgcgaagaa 60
aacttttata acaacttctt tattcagatt ttacagaaaa aatatgatgt ggtgtatagc 120
gataaaccgg attttattct gtatggcccg tgcggctatg aacatctgaa atatgattgc 180
gtgcgcattt tttataccgc ggaaaacatt cgcccggact ataacattgc ggactatagc 240
attgattatg actatattaa atttggcgat cgccatctgc gcctgccgta tatgttttgg 300
gtgttttgcg atgaaatgcg tcagaaagaa atggataacc gcattagcct gctggataaa 360
aaagaaaaat tttgcggctt tatggtgagc aacaacgcgc tgaccgataa acgcgatatg 420
ttttttgaag cgctgaacaa atataaacgc gtggatagcg gtggccgctg gaaaaacaac 480
attggcggca acgtggatga taaaattgaa tggctgaaaa gctataaatt taacctgtgc 540
tttgaaaaca gcagctatcc gggctatctg accgaaaaac tgtttgatgc gtttctggcg 600
ggctgcgtgc cgatttattg gggcgatacg agcctgcgcg tgcataaaaa cacctgcgcg 660
gatagcaaaa acagcgaaaa cattaacaac cgcggcggtg gcggcaacga tacctttgat 720
atgcgcattc cgaacattag ccatagcctg attgattatg aaattaaccc gaaagcgttt 780
attaacgcgc ataactttcc gacctttaaa gatctgattg atgaaattaa acgcattgat 840
aacgatagct atgcgtttga aagcattctg cgcgaaccga tttttctgaa caactttagc 900
ccgtatgaat tttataccga acagattagc gcgtttctgg atcatattat tatgcaaggc 960
gcgaacgatg cgcgccgctg cggcgatggc tattggctgc gcacccatct ggaatttcgc 1020
cgcattagcg cgaaatattg gaacctgccg agcgattttc tgcattattg ctttaaatat 1080
cgcaaaatta ttcaaggcgt gcgcgatatt agcgaatatc cgcgcaactt tatgcgcttt 1140
ctgcgccgca aataa 1155
<210> 12
<211> 1023
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
atggcgcaga acttacagac cccgcaagat agcaaaacca aaaaacgcat ttatttttgc 60
gatggcgcgg tgaaaggcaa aattccggcg attctgagcc gccattatga tattgaaatt 120
accccgcata acccggatta tgtgttttat agcgtgatgg gcaacgaaca tattaactat 180
gattgcattc gcatttttag caccggcgaa aacgtgcgcg cggattttaa cttttgcgat 240
tatgcgattg gctttgacta tatgcagttt gaagatcgct atctgcgcta tccgttttat 300
ctgcactata aagaagcgat ggaaaaagcg cgcaacaaac atctgcatat taccccgcag 360
accctggaaa acaaaaaacg cttttgcacc tttgtggtga gcaacggcaa agcggatagt 420
atccgcagtc agttttttga taaactgatg cagtataaac atattgatag cggcggcaaa 480
tataaaaaca acattggcgc gccggtggcg gataaactgg cgtttctgag cgaaggcaaa 540
tttaacattg cgtttgaaaa cagcagcgcg aacggctata ccaccgaaaa actgattgaa 600
gcgtttgcgg cgggcaccat tccgctgtat tggggcgatg aaagcgtgag cctgccgctg 660
gatagcagcg gcggtggcgt gaacccgaag agctttgtgc gcctgaacga ttttgcgagc 720
tttgaagaag cgattgcgta tattgaattt ctggataccc ataacgatgc gtatctggcg 780
attctgcgcg aagaaacctt tctggatagc aaccatgaag cgatttttga taaaaaactg 840
gagagctttc tgctgcatat ttttaatcag ccgctggaaa aagcgtatcg ccgcggcttt 900
ggtcagtggc gctgcaacat tgaaaaacgc tataaaaaat atcagcgcat ccgcagctta 960
accaacacct gcgtgaacat tattaaaaac ccgattcgcc gcattaaaaa actgtttaaa 1020
taa 1023
<210> 13
<211> 963
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
atgaaagatg atctggtgat tctgcatccg gatggcggca ttgcgagtca gattgcgttt 60
gtggcgctgg gcctggcgtt tgaacagaag ggcgccaaag tgaaatatga tctgagctgg 120
tttgcggaag gtgcgaaagg cttttggaac ccgagcaacg gctatgataa agtgtatgat 180
attacctggg atattagcaa agcgtttccg gcgctgcata ttgaaattgc gaacgaagag 240
gaaattgaac gctataaaag caaatatctg attgataacg atcgcgtgat tgattatgcg 300
ccgccgctgt attgctatgg ctataaaggc cgcatttttc attatctgta tgcgccgttt 360
tttgcgcaga gctttgcgcc gaaagaagcg caagatagcc ataccccgtt tgcggcgctg 420
ctgcaagaaa ttgaaagcag cccgagcccg tgcggcgtgc atattcgccg cggcgatctg 480
agtcagccgc atattgtgta tggcaacccg acgagcaacg aatattttgc gaaaagcatt 540
gaactgatgt gcctgctgca tccgcagagc agcttttatc tgtttagcga tgatctggcg 600
tttgtgaaag aacagattgt gccgctgctg aaaggcaaaa cctatcgcat ttgcgatgtg 660
aacaacccga gccaaggcta tctggatctg tatctgctga gccgctgccg caacattatt 720
ggcagccaag gcagcatggg cgaatttgcg aaagtgctga gcccgcataa cccgctgctg 780
attaccccgc gctatcgcaa catttttaaa gaagtggaaa acgtgatgtg cgtgaactgg 840
ggcgaaagcg tgcagcatcc gccattagtg tgtagcgcgc cgccaccgct ggttagccaa 900
ctgaaacgca acgcgccgct gaacagccgc ctgtataaag aaaaagataa cgcgagcgcg 960
taa 963
<210> 14
<211> 1080
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 14
atgaaccaag gctgcaccaa aacccataaa ccgaccaaaa aagtgtattt ttgcgatggc 60
gcggtgaaag gcaaaattgt ggcgctgctg gaacagcatt atgaactgat tctgaccaac 120
aaagatccgg actatatttt ttatagctgc atgggctttg aacatctgaa ctataacaaa 180
gtgcgcattt ttgcgaccgg cgaaaacctg cgcgcggatt ttaacttttg cgattatgcg 240
attggctatg actatattca ttttgaagat cgctatctgc gctatccgct gtatctgcat 300
tgcgaaagcg atatgcagaa agcgatgaac aaacatctgc atattacccc ggaaacctta 360
cagaacaaaa gccgcttttg cacctttgtg gtgagcaacg gcaaagcgga tgaaattcgc 420
acgcagtttt ttgattttct gagtcagtat aaccgcgtgg atagcggtgg ccgctataaa 480
aacaacattg gcaacccggt ggtggataaa tatgcgtttc tgaaagaagg caaatttaac 540
attgcgtttg aaaacagcag caccaacggc tatattaccg aaaaactgat tcaagcgttt 600
gcggcgcata ccattccgat ttattggggc gatgaacgca ttagcctgcc gctggataaa 660
atgggcggtg gcattaaccc gaagagcttt attaacatgc ataaatatga aagctataaa 720
gaagtgctgg aaaccattta ttttctggat acccatgatg aagcgtatct gagtatgctg 780
agcgaaccgg tgtttctgga taaaaaccat cagaaaattt ttgatgaaaa actggaaaac 840
tttctgctgc atatttttaa tcagccgctg gaaaaagcgt atcgccgcgg ctttggtcag 900
tggcgctgca acattgaaaa acgctataaa aaagcgcaga aagcgcgtca gattgtgaac 960
aactttgcga acatttttca gattccgctg cgcaccctga aaaaatatct gctgagcatt 1020
tatctgagcg cgacgagcaa gagctttgtg ttttttacca aagaacgcac gagcaaataa 1080
<210> 15
<211> 996
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 15
atgtgcgatt gcctgagcat tattctgctg gtgaaaatga agaaaattta tctgaaattt 60
gtggattttt gggatggctt tgataccatt agcaacttta ttgtggatgc gctgagcatt 120
cagtatgaag tggtgctgag caacgaaccg gattatctgt tttatagctg ctttggcacg 180
agccatctgg aatatgattg cattaaaatt atgtttattg gcgaaaacat tgtgccggat 240
tttaacgtgt gcgattatgc gattggcttt aactatattg attttggcga tcgctatctg 300
cgcctgccgc tgtatgcgat ttatgatggc tttagcaact tacagaacaa gaaaattgat 360
gtgaacaaag cgctggatcg caaattttgc agcattgtgg tgagcaacaa caaatgggcc 420
gatccgattc gcgaaacctt ttttaaactg ctgagcagct ataaaaaagt ggatagcggt 480
ggccgcgcgt ggaacaacat tggcggcccg gtggataaca aactggattt tattagtcag 540
tataaattta acattgcgtt tgaaaacagc cgcgtgctgg gctataccac cgaaaaaatt 600
atggaaccga tgcaagtgaa cagcattccg gtgtattggg gcaacccgct ggtgggcaaa 660
gattttaacg ttgacagctt tgtgaacgcg catgattttg atagcctgga acgcctggtg 720
gaatatatta ttgaactgga tagcagcaaa gataaatatc tggaaatgct ggaaaaaccg 780
tggctgctgg ataaaaccta tctggattgg aaacagctgt tactgaactt tattaacaac 840
attatgatga aaagctataa agatgcgaaa tatctggtga actatggcca tgcgggcaaa 900
tatcgcaacg aacagcgctt ttggggccgc tgcgaacgca aatttaaatt acagcgcatt 960
attgaatact atagtcagct gtttgatcgc aaataa 996

Claims (7)

1.一种催化乳糖合成3-岩藻乳糖的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于具有3-岩藻乳糖的合成途径，命名为E. coli TT401-FL3。
2.一种权利要求1所述催化乳糖合成3-岩藻乳糖的大肠杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于它具有3-岩藻乳糖的生物合成途径，主要是将葡萄糖和乳糖转化为3-岩藻乳糖，基于λ-Red同源重组的方法删除乳糖操纵子β-半乳糖苷酶基因（lacZ）、乳糖转乙酰化酶基因（lacA）、UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因（wcaJ）、ATP依赖的蛋白酶基因（lon）。
3.权利要求2所述的构建方法，其中所述具有3-岩藻乳糖合成途径，是指过表达密码子优化的磷酸甘露糖酶基因（manB）、磷酸鸟嘌呤转移酶基因（manC）、GDP-甘露糖- 4,6-脱水酶基因（gmd）、GDP-fucose合成酶基因（fcl）、甘露糖-6-磷酸异构酶基因（manA）、GDP-fucose的合成的正调控因子（rcsA）、β-半乳糖苷透性酶基因（lacY）、α-1，3-岩藻糖转移酶基因 （1,3FT）。
4.权利要求3所述的构建方法，其中所述密码子优化的α-1，3-岩藻糖转移酶基因（1, 3FT），是指来源于幽门螺旋杆菌、锥状螺旋杆菌、胆型螺旋杆菌、伤寒螺旋杆菌、肝螺旋杆菌、脆弱拟杆菌的其中一种或几种。
5.权利要求1所述基因工程构建的重组大肠杆菌在高效合成3-岩藻乳糖中的应用。
6.权利要求2所述的构建方法，其制备的过程如下：
1）制备含有密码子优化的磷酸甘露糖酶基因（manB）、磷酸鸟嘌呤转移酶基因（manC）、GDP-甘露糖- 4,6-脱水酶基因（gmd）、GDP-fucose合成酶基因（fcl）、甘露糖-6-磷酸异构酶基因（manA）、GDP-fucose的合成的正调控因子（rcsA）、β-半乳糖苷透性酶基因（lacY）、α-1，3-岩藻糖转移酶基因 （1,3FT）的重组质粒，获得重组合成途径的质粒；
2）将质粒pSim导入转化到宿主菌E. coli K-12 MG1655中，获得携带质粒的宿主菌；
3）以基因组为模板，设计待删除基因的同源臂引物，通过PCR扩增的方法获得同源臂，并转化诱导表达重组酶的感受态细胞E. coli K-12 MG1655（pSim）；
4）电击复苏后涂布于LB+氯霉素(25 ug/ml)或卡那霉素(50 ug/ml)的平板，获得目的基因被删除的重组菌；
5) 将步骤4所得的重组菌进行溶源化处理，利用pCP20质粒进行抗性消除；
6）以步骤5所得的删除一个基因的重组菌为宿主菌，重复步骤2）3）4）5）的操作，每次操作均以上一次操作获得的重组菌为宿主菌，直至将lacZ、lacA、wcaJ、lon基因全部敲除，获得缺失上述所有基因的重组大肠杆菌；
7）将步骤6）中基因改造的大肠杆菌制备感受态，再将步骤1）所得的代谢途径构建质粒转化到感受态中，获得能够利用乳糖合成3-岩藻乳糖的重组大肠杆菌。
7.一种采用权利要求1所述的基因工程重组大肠杆菌发酵合成3-岩藻乳糖的方法，其特征在于按如下的步骤进行：
1）活化大肠杆菌基因工程菌，获得种子液；
2）将步骤1）获得的种子液与含有氯霉素和氨苄青霉素的培养基，按照种子液:培养基=1:100的比例接种至新鲜的培养基，35~37℃，180~220rpm，培养至OD600=0.6~0.8，并加入诱导剂IPTG 0.05~1 mM，然后转入20~25℃，180~220rpm，补加乳糖继续培养24 h；发酵生产3-岩藻乳糖过程中，大肠杆菌基因工程菌所用的培养基包括各种适于所选用的宿主细胞（大肠杆菌）生长的培养基，碳源优选为低成本的葡萄糖和甘油，具体培养基组成如下：
FMT培养基（1L）：Tryptone(胰蛋白胨)：2-10 g，Yeast Extract（酵母提取物）：1-5 g，NaCl（氯化钠）：1-5 g，KH2PO4（磷酸二氢钾）：1-5 g，K2HPO4（磷酸氢二钾）：1-5 g，NH4Cl（氯化铵）：1-5 g，MgSO4•7H2O（七水合硫酸镁）：0.1-1.0 g，FeSO4•7H2O（七水合硫酸亚铁）：2-10mg，MnSO4•H2O （水合硫酸锰）：1-5 mg，Na2SO4（硫酸钠）：5-25 mg，ZnSO4（硫酸锌）：5-20 mg,CoCl2•6H2O（六水合氯化钴）：1-5 mg，CuSO4•5H2O （五水合硫酸铜）0.05-0.25 mg， Glucose（葡萄糖）：20-60 g，Glycerol（甘油）：20-60 g，Lactose（乳糖）：0.5-4.5 g；
将所得基因工程菌在5mL含有卡那霉素50 μg/ml，氨苄青霉素100 μg/ml，链霉素50 μg/ml的LB培养基中37℃，220rpm培养12h，转入M9培养基，M9培养基在使用前加入卡那霉素，氨苄青霉素，链霉素（卡那霉素50 μg/ml，氨苄青霉素100 μg/ml，链霉素50 μg/ml），37℃，培养月3h左右，加入IPTG（IPTG 0.2mM）,并转入25℃培养，培养约2h后，加入乳糖，继续培养4h后，取样。
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