CN115786220B - 一种生产2`-岩藻糖基乳糖的重组菌株及构建方法和应用 - Google Patents

一种生产2`-岩藻糖基乳糖的重组菌株及构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种生产2'‑岩藻糖基乳糖的重组菌株及构建方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明提供的重组菌株及其构建方法的特点在于通过基因编辑对setA基因进行原位过表达。本发明提供的重组菌株也可进一步包含对大肠杆菌2'‑岩藻糖基乳糖从头合成途径相关酶的编码基因、2'‑岩藻糖基乳糖补救途径相关酶的编码基因、乳糖lac操纵子序列、2'‑岩藻糖基乳糖合成前体降解相关酶的编码基因的有益基因编辑。本发明提供的重组菌株通过setA基因原位过表达获得了比setA基因质粒过表达更高2'‑岩藻糖基乳糖产率。

Description

一种生产2'-岩藻糖基乳糖的重组菌株及构建方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种生产2'-岩藻糖基乳糖的重组菌株及构建方法和应用。
背景技术
2'-岩藻糖基乳糖(2'-fucosyllactose，2'-FL)是母乳低聚糖（human milkoligosaccharides，HMOs）的重要成分之一。作为母乳成分之一，2'-岩藻糖基乳糖占母乳低聚糖的比例可达30%，并具有较高的营养和药用价值。目前生产2'-岩藻糖基乳糖的方法包括化学合成法、酶法、发酵法等。其中发酵法生产2'-岩藻糖基乳糖具有成本低、环境友好等优势。大肠杆菌细胞具有高代谢活性和高繁殖率的优点，因此各种遗传背景的大肠杆菌是分子生物学和生物技术领域中最常用的生物之一。
本领域已对大肠杆菌发酵生产2'-岩藻糖基乳糖进行了广泛研究，以期提高2'-岩藻糖基乳糖的产率。其中对大肠杆菌合成2'-岩藻糖基乳糖的从头合成途径和补救途径以及相关的关键酶的研究较为深入（Bych K, et al. Production of HMOs usingmicrobial hosts-from cell engineering to large scale production[J]. CurrentOpinion in Biotechnology, 2019, 56:130-137；CN112501106A；CN114276971A等）。从头合成途径和补救途径中涉及的关键酶包括：磷酸甘露糖异构酶ManA、磷酸甘露糖变位酶ManB、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤转移酶ManC、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶Gmd、GDP-岩藻糖合成酶WcaG、2'-岩藻糖基乳糖合成酶FutC等。其中补救途径发酵生产2'-岩藻糖基乳糖所需碳源成本较高，而从头合成途径发酵生产2'-岩藻糖基乳糖的产率较低。乳糖lac操纵子序列中，β-半乳糖苷透性酶编码基因lacY的编码蛋白可将半乳糖苷运入到细胞中，β-半乳糖苷酶编码基因lacZ的编码蛋白则可切断乳糖的半乳糖苷键，调节基因lacI的产物称为lac阻遏物。UDP-葡萄糖脂质载体转移酶编码基因wcaj及GDP-甘露糖水解酶编码基因nudd的编码蛋白则是参与前体 GDP-L-岩藻糖和 GDP-甘露糖降解的酶类（Ni ZJ, et al. Multi-PathOptimization for Efficient Production of 2′-Fucosyllactose in an EngineeredEscherichia coli C41 (DE3) Derivative[J]. Frontiers in Bioengineering andBiotechnology, 2020, 8）。
糖外排转运体（Sugar efflux transporter，Set）是1999年在大肠杆菌中发现的转运蛋白家族，包括SetA、SetB和SetC。该族转运蛋白可将葡萄糖、乳糖、某些单糖和二糖以及诱导分子例如异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropy-β-D-thiogalactoside，IPTG)外排。其中SetA具有广泛的底物特异性，偏好用于具有烷基或芳基取代基的糖苷或半乳糖苷。但常规条件下setA基因表达水平较低且对庚糖或三糖等较大的寡糖转运活性较低（Liu JY,et al. Functional and Biochemical Characterization of Escherichia coli SugarEfflux Transporters[J]. Journal of Biological Chemistry, 1999, 274(33):22977-22984；US8652808B2）。SetA被发现具有外排2'-岩藻糖基乳糖的作用，从而可能通过降低胞内2'-岩藻糖基乳糖提高胞外2'-岩藻糖基乳糖水平，然而SetA同时对碳源乳糖具有外排作用，且导致菌株细胞生长率降低（Hollands K, et al. Engineering two species ofyeast as cell factories for 2′-fucosyllactose[J]. Metabolic Engineering, 52(2019)-232-242）。由于setA基因转录调控机制不完全清楚，其基因过表达对2'-岩藻糖基乳糖生产的影响尚难以预测。因此，目前的研究仅限于质粒过表达setA基因或其他糖外排转运体对大肠杆菌发酵生产2'-岩藻糖基乳糖或其他HMOs的影响（ParschatK,et al.High-Titer De Novo Biosynthesis of the Predominant Human Milk Oligosaccharide2′-Fucosyllactose from Sucrose in Escherichia coli[J]. ACS Synthetic Biology,2020, 9(10)；US8652808B2）。
对大肠杆菌合成2'-岩藻糖基乳糖的从头合成途径和补救途径的关键酶进行编辑以及质粒过表达setA基因等技术手段虽然提高了2'-岩藻糖基乳糖产率，但其产率仍然较低。进一步对菌株进行改良，以提高2'-岩藻糖基乳糖产率，仍是目前需要解决的问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明采用基因编辑技术，对大肠杆菌的糖外排转运体A编码基因setA进行了编辑。发现setA基因的原位过表达出乎预料地提高了2'-岩藻糖基乳糖的产率，其效果优于setA基因的质粒过表达，从而有利于提高2'-岩藻糖基乳糖的生产水平。
在利用原核细胞等细胞体系发酵生产特定物质时，出于提高目的物质产率的目的，往往需要利用基因工程技术对相关基因的表达水平进行上调。使目的基因表达量明显提高的技术，称为基因过表达，包括原位过表达、质粒过表达等。其中质粒过表达是使用具有不同转录或翻译强度的表达调控元件，离位（ex situ）构建质粒文库，并将质粒转化进入微生物细胞内。伴随质粒在细胞质内的自我复制，可快速实现目的基因的表达。而原位过表达或称为染色体原位过表达，是本领域约定俗称的术语，是指在原位（in situ）进行过表达，即通过分子生物学手段，比如启动子、核糖体结合位点及转录调控因子改造或密码子优化等，对位于染色体原位（in situ）的目的基因进行调控，提高基因转录翻译水平。
用于基因过表达（包括原位过表达、质粒过表达）的额外插入的启动子可以是组成型启动子和/或诱导型启动子。毫无疑问，此处所述的启动子，包括组成型启动子和诱导型启动子，是指适用于原核表达系统的启动子，尤其是适用于大肠杆菌表达系统的启动子，包括天然启动子及人工构建的启动子。
本发明的首先提供一种生产2'-岩藻糖基乳糖的重组菌株，相较于setA基因质粒过表达具有更高的2'-岩藻糖基乳糖的产率。该重组菌株以大肠杆菌(学名:Escherichiacoli，通常简写为E. coli)为出发菌株经过基因编辑获得，出发菌株可以是各种遗传背景的大肠杆菌。相较于糖外排转运体A编码基因setA的质粒过表达而言，其主要特点是该重组菌株基因组的糖外排转运体A编码基因setA在原位进行过表达。即通过插入额外的启动子提高setA的染色体原位表达水平，或者通过本领域技术人员比较容易想到的其它方式提高原位表达水平，比如改造setA基因前面的小分子调控RNA基因sgrS的启动子活性，或者在sgrS基因前插入额外的启动子。
进一步地，所述重组菌株基因组的setA前面插入组成型启动子，从而使setA原位过表达。优选的，所述组成型启动子选自P J23102 、P J23104 、P J23105 、P J23108 、P J23100 、P J23110 、P J23111 、P J23113 、P J23119 、P 637 、P 699 中的任一种。进一步优选的，所述组成型启动子选自P J23108 、P J23110 、P J23119 中的任一种。
进一步地，所述重组菌株基因组的setA前插入氯霉素抗性基因的启动子。利用氯霉素抗性基因的启动子使setA原位过表达。或setA基因前插入氯霉素抗性基因的启动子和一种组成型启动子进行原位过表达。当setA前面插入组成型启动子，例如P J23102 、P J23104 、P J23105 、P J23108 、P J23100 、P J23110 、P J23111 、P J23113 、P J23119 、P 637 、P 699 中的一种，并插入氯霉素抗性基因的启动子时，可利用双启动子对setA进行原位过表达。优选的，所述氯霉素抗性基因的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示。
进一步地，所述所述出发菌株是进行过2'-岩藻糖基乳糖从头合成途径相关酶的编码基因的基因改造的重组菌株；优选地，其包括敲除大肠杆菌基因组上的β-半乳糖苷酶编码基因lacZ，并过表达磷酸甘露糖异构酶编码基因manA、磷酸甘露糖变位酶编码基因manB、GDP-岩藻糖合成酶编码基因wcaG、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶编码基因gmd、β-半乳糖苷透性酶编码基因lacY、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤转移酶编码基因manC；更优选地，还包括2'-岩藻糖基乳糖补救途径相关酶的编码基因、乳糖lac操纵子序列（具体是敲除出发菌株的乳糖lac操纵子序列中的P lac 启动子序列及调节基因lacI和lacZ）、敲除2'-岩藻糖基乳糖合成前体降解相关酶的编码基因的基因改造；进一步优选地，
M1：敲除大肠杆菌基因组上的β-半乳糖苷酶编码基因lacZ；
M2：敲除大肠杆菌基因组上的UDP-葡萄糖脂质载体转移酶编码基因wcaj；
M3：敲除大肠杆菌基因组上的GDP-甘露糖水解酶编码基因nudd；
M4：在大肠杆菌基因组上插入磷酸甘露糖异构酶编码基因manA；
M5：在大肠杆菌基因组上插入磷酸甘露糖变位酶编码基因manB；
M6：在大肠杆菌基因组上插入GDP-岩藻糖合成酶编码基因wcaG；
M7：在大肠杆菌基因组上插入GDP-甘露糖-4,6-脱水酶编码基因gmd；
M8：原位过表达β-半乳糖苷透性酶编码基因lacY；
M9：在质粒上过表达甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤转移酶编码基因manC；
M10：在质粒上过表达2'-岩藻糖基乳糖合成酶编码基因futC。
其中，补救途径的相关酶的编码基因改造包括对涉及岩藻糖分解的基因采用敲除手段，如Fuc I、Fuc k、araA、rhaA；和/或对岩藻糖磷酸化相关的基因如fkp、fuc T2进行过表达。其中，核心是L-岩藻糖激酶/GDP-岩藻糖焦磷酸化酶(FKP)，为一种双功能酶，它可以通过GDP-岩藻糖补救合成途径独立完成从L-岩藻糖合成GDP-岩藻糖的过程。因此利用补救途径时，只不过需要在培养体系中添加昂贵的L-岩藻糖。
更进一步地，所述wcaG、gmd、manA、manB为单拷贝插入基因组过表达；所述manC、 futC为多拷贝过表达。
进一步地，所述manA、manB、wcaG、gmd、lacY、manC和futC使用P trc 启动子过表达。
进一步地，所述质粒选自pTrc99a、pSB4K5、pET28a或pET22b中的任一种。
进一步地，所述setA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述lacZ的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述wcaj的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述nudd的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述manA的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述manB的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；所述wcaG的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；所述gmd的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；所述lacY的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；所述manC的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；所述futC的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示；所述P trc 启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。
进一步地，所述出发菌株选自大肠杆菌K12 MG1655、大肠杆菌BL21(DE3) 、大肠杆菌JM109、大肠杆菌BW25113中的任一种。上述菌株已得到大量应用，大肠杆菌K12 MG1655(Escherichia coli strain K12MG1655)是生物学中最著名和研究最充分的生物体之一。其中大肠杆菌K12 MG1655在美国典型培养物保护藏中心已有保藏（保藏编号ATCC 53103、ATCC 47076、ATCC 700926）；大肠杆菌BL21(DE3)在BCCM genecorner已有保藏（保藏编号LMBP 1455）；大肠杆菌JM109在美国典型培养物保护藏中心已有保藏（保藏编号ATCC68635、ATCC68868）；大肠杆菌BW25113在大肠杆菌遗传学保藏中心（Coli GeneticsStock Center）已有保藏（保藏编号CGSC#7636）。作为本领域技术人员常用的出发菌株，本领域技术人员有能力获知上述菌株的来源和购买渠道。
本发明的技术方案之二，提供了一种前述重组菌株的构建方法，具体来说是以大肠杆菌K12 MG1655为出发菌株的构建方法，所述构建方法包括以下步骤（不分先后）：
敲除出发菌株的乳糖lac操纵子序列中的P lac 启动子序列及调节基因lacI和β-半乳糖苷酶编码基因，在原β-半乳糖苷酶编码基因位点之后以P trc 启动子过表达GDP-岩藻糖合成酶编码基因、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶编码基因和β-半乳糖苷透性酶编码基因；
在出发菌株的乙醇脱氢酶编码基因adhe位点上以P trc 启动子过表达磷酸甘露糖异构酶编码基因和磷酸甘露糖变位酶编码基因；
敲除出发菌株的UDP-葡萄糖脂质载体转移酶编码基因和GDP-甘露糖水解酶编码基因；
在出发菌株的setA前面插入组成型启动子，并插入氯霉素抗性基因的启动子；
在出发菌株中导入过表达甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤转移酶编码基因和2'-岩藻糖基乳糖合成酶编码基因的质粒；优选地，通过构建含有该两基因串联的质粒，再导入出发菌株中构建重组菌株。
在一个具体实例中，包括如下步骤：
S1：敲除出发菌株的乳糖lac操纵子序列中的P lac 启动子序列及调节基因lacI和lacZ，在
原lacZ位点之后以P trc 启动子过表达wcaG、gmd和lacY；
S2：在步骤S1所得菌株的乙醇脱氢酶编码基因adhe位点上以P trc 启动子过表达manA
和manB；
S3：敲除步骤S2所得菌株的wcaj和nudd；
S4：在步骤S3所得菌株的setA前面插入组成型启动子，并插入氯霉素抗性基因的启动子；
S5：构建质粒pTrc99a-P trc -futC-manC，所述质粒pTrc99a-Ptrc-futC-manC的核苷酸序列如
SEQ ID NO：18所示；
S6：将步骤S5所得质粒导入步骤S4所得菌株构建重组菌株。
前述组成型启动子的核苷酸序列是公开的，可参见http://parts.igem.org/Part:BBa_J23100提供的公开资源。
本发明发现setA原位过表达相对于setA质粒过表达可出乎预料的提高2'-岩藻糖基乳糖的发酵产率。当setA原位过表达配合2'-岩藻糖基乳糖从头合成途径相关酶的编码基因、2'-岩藻糖基乳糖补救途径相关酶的编码基因、乳糖lac操纵子序列、2'-岩藻糖基乳糖合成前体降解相关酶的编码基因的有益编辑时，更有利于提高2'-岩藻糖基乳糖的发酵产率。有多种遗传背景的大肠杆菌菌株可在市场上购买或由微生物保藏机构对外公开提供。因此，对于本领域而言，利用能合成2'-岩藻糖基乳糖的遗传背景的大肠杆菌菌株，包括已敲除lacZ，过表达wcaG、gmd、lacY、manA、manB，manC，futC。当然，更优选地包括已敲除lacI、lacZ、wcaj、nudd的菌株和/或wcaG、gmd、lacY、manA、manB等已插入或原位过表达的菌株可减少重组菌株的构建步骤，这是不言而喻的。
前述重组菌株及其构建方法涉及的基因编辑技术以及实现前述基因的原位过表达或质粒过表达常用的额外插入的启动子（如组成型启动子P406、P479、P535等；诱导表达型启动子Ptac等）是本领域技公知的，可参见彭秀玲等编著的《基因工程实验技术》（长沙：湖南科学技术出版社1998年第2版）、袁婺洲编著的《基因工程》（北京：化学工业出版社，2019年第2版）韦宇拓编著的《基因工程原理与技术》（北京：北京大学出版社，2017年第1版）、曹卫军编著的《微生物工程》（科学出版社2007年第2版）等。在此前公开的技术文献中，也有充分的公开和报道，例如但不限于以下文献：
(1)Chen D, et al. Development of a DNA double-strand break-free baseediting tool in Corynebacterium glutamicum for genome editing and metabolicengineering - ScienceDirect. Metabolic Engineering Communications, 2020, 11,e00135.
(2)刘洋,等. 微生物细胞工厂的代谢调控. 生物工程学报, 2021, 37(5):1541-1563.
(3)Liang ST, et al. Activities of constitutive promoters inEscherichia coli. Journal of Molecular Biology, 1999, 292(1):19-37.
(4) Zhou L, et al. Chromosome engineering of Escherichia coli forconstitutive production of salvianic acid A. Microbial Cell Factories, 2017,16(1): 84.
(5) Zhao, D, et al. CRISPR/Cas9-assisted gRNA-free one-step genomeediting with no sequence limitations and improved targeting efficiency.Scientific Reports,2017, 7(1):16624.
(6)Guo, M, et al. Using the promoters of MerR family proteins as "rheostats" to engineer whole-cell heavy metal biosensors with adjustablesensitivity[J]. Journal of Biological Engineering, 2019, 13(1):1-9(PMID:31452678).
本发明的技术方案之三，提供了前述重组菌株在发酵生产2'-岩藻糖基乳糖中的应用。
进一步地，所述重组菌株的发酵培养基碳源选自甘油、乳糖中的至少一种；所述重组菌株的发酵培养基有机氮源选自酵母粉、胰蛋白胨、牛肉膏中的至少一种；发酵培养的温度为36℃～40℃；发酵培养的pH为6.8～7.8。
本发明的有益效果：
本发明通过对大肠杆菌的setA基因进行原位过表达，出乎预料的获得了比setA基因质粒过表达更高的2'-岩藻糖基乳糖产率。尤其是setA基因前面插入组成型启动子并保留氯霉素抗性基因的启动子更有利于setA基因的原位过表达。当重组菌株进一步包含对大肠杆菌2'-岩藻糖基乳糖从头合成途径相关酶的编码基因、2'-岩藻糖基乳糖补救途径相关酶的编码基因、乳糖lac操纵子序列、2'-岩藻糖基乳糖合成前体降解相关酶的编码基因的有益基因编辑时，可达到更高的2'-岩藻糖基乳糖产率。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
以下实施例中引物序列的书写顺序均为5’端至3’端。
实施例1构建菌株TKYW1
在专利文献CN112501106A中所述大肠杆菌W2（E.coli K12 MG1655△lacIZ::P trc -wcaG-gmd-lacy, △adhE::P trc -manB-manA）的基础上，敲除基因组上的UDP-葡萄糖脂质载体转移酶编码基因wcaj和GDP-甘露糖水解酶编码基因nudd，构建出菌株TKYW1。
在此基于专利文献CN112501106A的内容对大肠杆菌W2的构建进行简要描述，将大肠杆菌W2构建方法引入本实施例。其中CN112501106A中大肠杆菌W2是以大肠杆菌K12MG1655(Escherichia coli K12 MG1655)为出发菌株构建，敲除出发菌株的乳糖lac操纵子序列中的P lac 启动子序列及调节基因lacI和lacZ，在原lacZ位点之后以P trc 启动子过表达wcaG、gmd和lacY得到W1菌株，进而在乙醇脱氢酶编码基因adhe位点上以P trc 启动子过表达manA和manB得到W2菌株。大肠杆菌W2构建涉及的lacZ的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；manA的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；manB的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；wcaG的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；gmd的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；lacY的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；P trc 启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；lacI的核苷酸序列如SEQID NO：13所示、P lac 启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示，adhE的核苷酸序列如SEQ IDNO：16所示。
1.构建菌株W2△wcaj
使用菌株W2作为出发菌株，利用CRISPR/Cas9技术敲除wcaj（SEQ ID NO：3）。实验中所用的CRISPR/Cas9技术参考前期的研究报道【Zhao D, et al. CRISPR/Cas9-assistedgRNA-free one-step genome editing with no sequence limitations and improvedtargeting efficiency. Sci Rep 7, 16624】。首先，构建第一步同源重组片段，包含上下游同源臂、氯霉素抗性基因cat和通用的N20+NGG序列（tagtccatcgaaccgaagtaagg），将第一步同源重组片段通过电转化导入含有pCAGO质粒的W2菌株中，进行第一步重组，pCAGO质粒含有重组酶基因，以及cas9和gRNA基因等【Zhao D, et al. CRISPR/Cas9-assisted gRNA-free one-step genome editing with no sequence limitations and improvedtargeting efficiency. Scientific Reports, 7, 16624】。挑选正确克隆，进行第二次同源重组。挑取第二次同源重组后的正确克隆，传代丢失pCAGO质粒，从而获得敲除wcaj基因的W2△wcaj菌株。
以下详细描述具体方法：
（1）第一步同源重组片段的构建。以大肠杆菌菌株E.coli K12 MG1655基因组（GeneBank accession NO. NC_000913）为模板，分别利用表1中的引物up-1和up-2，以及引物down-1和down-2，PCR扩增得到同源重组的上、下游同源臂。以实验室保存的一株带有氯霉素抗性基因cat的菌株基因组（核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示。SEQ ID NO：17含有cat基因及其启动子的核苷酸序列）为模板，利用引物cat-1和cat20-2进行PCR扩增，获得带有cat-N20序列的片段。以上、下游同源臂，带有cat-N20序列的片段，这3个片段为模板，利用引物up-1和down-2进行重叠PCR扩增，得到第一步同源重组片段。
（2）第一步同源重组。利用常规的质粒转化法将pCAGO质粒转化到菌株W2中，获得菌株W2 (pCAGO)。利用含有1%葡萄糖以及浓度为0.1 mM的IPTG的LB培养基制备W2 (pCAGO)感受态，利用电转化方法导入第一次同源重组片段，转化后的菌液涂布于含100 mg/L氨苄青霉素和25 mg/L氯霉素，以及1%葡萄糖的LB平板上，30℃培养。挑取转化子进行菌落PCR鉴定，获得正确的第一步同源重组菌株。
（3）第二步同源重组。将第一步同源重组菌株接种到含有100 mg/L氨苄青霉素、0.1 mM的IPTG以及2g/L阿拉伯糖的LB液体培养基中，在30℃培养6h以上，平板划线分离单菌落，筛选出能够在含有100 mg/L氨苄青霉素的LB平板上生长，但是在含有25 mg/L氯霉素的LB平板上不能够生长的克隆。测序验证发生第二次同源重组的正确克隆，进一步将其在37℃条件下培养，丢失其中的pCAGO质粒，从而获得菌株W2△wcaj。
表1敲除wcaj基因所用引物
引物名称 引物序列
up-1 tcaccactttgtcgttctccatcactttc
up-2 aacgatgacaaatctaaaaaagcgcg
cat-1 tttttagatttgtcatcgttattaattaatctcgagtgtgacg
cat20-2 gcgccataaggtgaaaccggccttacttcggttcgatggactattacgccccgccctgccac
down-1 ccggtttcaccttatggcgcagcatgtagccttcaatgaggttcctgttattagccccttaccc
down-2 aacgcggtcgctatcagcaaatcaacctg
2.构建菌株W2△wcaj△nudd
在大肠杆菌菌株W2△wcaj的基础上，利用与上述CRISPR/Cas9技术同样的方法，敲除基因组上的nudd基因（SEQ ID NO：4），构建出菌株W2△wcaj△nudd，命名为ZKYW1。以下详细描述具体方法：
（1）第一步同源重组片段的构建。以菌株E. coli K12 MG1655基因组为模板，分别利用表2中的引物对Nup-1和Nup-2，引物对Ndown-1和Ndown-2，PCR扩增得到同源重组的上、下游同源臂。以构建菌株W2△wcaj时获得的带有cat-N20序列的片段为模板，利用表2中的引物Ncat-1和Ncat20-2进行PCR扩增，获得新的带有cat-N20序列的片段。以上、下游同源臂，新的带有cat-N20序列的片段，这3个片段为模板，利用引物Nup-1和Ndown-2进行重叠PCR扩增，得到第一步同源重组片段。
（2）第一步同源重组。利用常规的质粒转化法将pCAGO质粒转化到菌株W2△wcaj中，获得菌株W2△wcaj(pCAGO)。利用含有1%葡萄糖以及浓度为0.1 mM的IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）的LB培养基制备W2△wcaj(pCAGO)感受态，利用电转化方法导入第一次同源重组片段，转化后的菌液涂布于含100 mg/L氨苄青霉素和25 mg/L氯霉素，以及1%葡萄糖的LB平板上，30℃培养。挑取转化子进行菌落PCR鉴定，获得正确的第一步同源重组菌株。
（3）第二步同源重组。与上述敲除wcaj基因时第二步同源重组的步骤相同。测序验证获得发生第二次同源重组的正确克隆，进一步将其在37℃条件下培养，丢失其中的pCAGO质粒，从而获得菌株W2△wcaj△nudd，命名为TKYW1。
表2敲除nudd基因所用引物
引物名称 序列
Nup-1: ccgcgcatcagaacgacgtgaacaaa
Nup-2 cagctcttcttatgcggcttccagcgtttcgtcttt
Ncat-1 aagccgcataagaagagctgttactgccgattaattaatctcgagtgtgacg
Ncat20-2 tacttcggttcgatggactattacgccccgccctgccac
Ndown-1 tagtccatcgaaccgaagtaaggcgaaacgctggaagccgcataagaagagctgttactgccggatg
Ndown-2 aaagaatgatttttttgttatccggc
实施例2构建菌株TKYW2-1、TKYW2-2、TKYW2-3
在菌株TKYW1的基础上，利用与上述CRISPR/Cas9技术同样的方法，在糖流出转运蛋白基因setA（核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示）前面分别插入3种不同强度的组成型启动子P J23108 、P J23110 、P J23119 (http://parts.igem.org/Part:BBa_J23100)，启动子序列见表3。同时，在利用CRISPR/Cas9进行第二次重组时，保留了氯霉素抗性基因的启动子（核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示），以实现双启动子对setA进行原位过表达，所获菌株分别命名为TKYW2-1、TKYW2-2、TKYW2-3。
表3 在基因组上过表达setA基因所用启动子
启动子名称 序列
P J23108 ctgacagctagctcagtcctaggtataatgctagc
P J23110 tttacggctagctcagtcctaggtacaatgctagc
P J23119 ttgacagctagctcagtcctaggtataatgctagc
1.第一步同源重组片段的构建
以菌株E.coli K12 MG1655基因组为模板，分别利用表4中的引物对Sup-1和Sup-2，引物对Sdown-1和Sdown-2为引物，分别PCR扩增得到同源重组的上、下游同源臂。以构建菌株W2△wcaj时获得的带有cat-N20序列的片段为模板，利用表4中的引物Scm-1和Scm-2进行PCR扩增，获得带有cat基因序列的片段。以N20-1为上游引物，分别以108-2，110-2，119-2为下游引物，不使用模板，进行PCR扩增，获得分别带有P J23108 、P J23110 、P J23119 启动子的3个基因片段。以Sup-1和Sdown-2为引物，利用上述PCR扩增得到的上游同源臂、带有cat基因序列的片段、带有P J23108 （或P J23110 或P J23119 ）启动子的基因片段、以及下游同源臂，共4个片段为模板，进行重叠PCR扩增，得到第一步同源重组用的3种分别带有P J23108 、P J23110 或P J23119 启动子的不同片段。
表4 构建在基因组上过表达setA基因的菌株所用引物
引物名称 序列
Sup-1: gtccatttccagttcacgaccatggtg
Sup-2 acgttccctttttagcgcggcgag
Scat-1 ccgcgctaaaaagggaacgtattaattaatctcgagtgtgac
Scat-2 ccttacttcggttcgatggactattacgccccgccctgccactc
108-2 atcagggttgtagctagcattatacctaggactgagctagctgtcagccttagctcctgaaaatc
110-2 atcagggttgtagctagcattgtacctaggactgagctagccgtaaaccttagctcctgaaaatc
119-2 atcagggttgtagctagcattatacctaggactgagctagctgtcaaccttagctcctgaaaatc
N20-1 tagtccatcgaaccgaagtaaggggcgtattttttgagttatcgagattttcaggagctaagg
Sdown-1 atgctagctacaaccctgataaatgcttctagagaaagaggagaaatactagatgatctggataatgacgatggct
Sdown-2 tactcctgccgccactgctatgaccat
2.第一步同源重组
利用常规的质粒转化法将pCAGO质粒转化到菌株TKYW1中，获得菌株TKYW1(pCAGO)。利用含有1%葡萄糖和浓度为0.1 mM的IPTG的LB培养基制备TKYW1(pCAGO)感受态，利用电转化方法分别导入上述第一次同源重组用的3种分别带有P J23108 、P J23110 、P J23119 启动子的不同片段，转化后的菌液分别涂布于含100mg/L氨苄青霉素和25mg/L氯霉素，以及1%葡萄糖的LB平板上，30℃培养。挑取转化子进行菌落PCR鉴定，获得正确的第一步同源重组后的3种分别带有P J23108 、P J23110 、P J23119 启动子的菌株。
3.第二步同源重组
与上述敲除wcaj基因时第二步同源重组的步骤相同。测序验证获得发生第二次同源重组的正确克隆，进一步将其在37℃条件下培养，丢失其中的pCAGO质粒，从而获得3种分别带有P J23108 ，P J23110 ，P J23119 启动子的菌株，分别命名为TKYW2-1，TKYW2-2，TKYW2-3。
实施例3质粒 pTrc99a-P trc -futC-manC构建
以专利文献CN112501106A所述的质粒pTrc99a-futC-manC为模板（质粒pTrc99a-futC-manC构建涉及的P trc 启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；阿拉伯糖诱导型启动子P ara 启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示；甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤转移酶编码基因manC的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；2'-岩藻糖基乳糖合成酶编码基因futC的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示），以表5中的Darac-F和Darac-R为引物进行PCR扩增，将PCR产物进行纯化和回收后，使用无缝克隆酶（pEASY-Uni SeamlessCloning and Assembly Kit，北京全式金生物技术有限公司）自接，转化到大肠杆菌E.coli JM109感受态细胞中，在含有100 mg/L氨苄青霉素的LB平板上培养，挑取转化子测序验证，获得正确的重组质粒，命名为质粒pTrc99a-P trc -futC-manC，其序列如SEQ ID NO：18所示。
表5构建质粒pTrc99a-P trc -futC-manC所用引物
引物名称 引物序列
Darac-F cggggatcctctagagtcgatttgtttaactttaagaaggagatataccatggcgcagtcgaaac
Darac-R tcgactctagaggatccccgggtaccgagctcg
实施例4在质粒pTrc99a-P trc -futC-manC上过表达setA基因的质粒构建
在质粒 pTrc99a-P trc -futC-manC的基础上，分别利用启动子P trc 、P J23108 、P J23110 、P J23119 过表达setA，构建出质粒pTrc99a-P trc -futC-manC-P trc -setA, pTrc99a-P trc -futC-manC-P J23108 -setA, pTrc99a-P trc -futC-manC-P J23110 -setA和 pTrc99a-P trc -futC-manC-P J23119 -setA。
1. 质粒pTrc99a-P trc -futC-manC-P trc -setA的构建
以质粒pTrc99a-P trc -futC-manC为模板，以表6中的T-AZT-F和AZT-R为引物进行PCR扩增，得到含有futC和manC基因的线性载体片段。以大肠杆菌MG1655基因组为模板，以A-F和A-R1为引物进行PCR扩增，获得带有setA基因的片段，以质粒pTrc99a-P trc -futC-manC为模板，以T-F和T-R为引物进行PCR扩增，获得带有P trc 启动子的基因片段，将上述三种PCR产物进行纯化和回收后，使用无缝克隆酶（pEASY-Uni SeamlessCloning and AssemblyKit ，北京全式金生物技术有限公司）连接，转化到E.coli JM109感受态细胞中，在含有100mg/L氨苄青霉素的LB平板上培养，挑取转化子测序验证，获得正确的重组质粒，命名为pTrc99a-P trc -futC-manC-P trc -setA。
表6构建质粒pTrc99a-P trc -futC-manC-P trc -setA所用引物
引物名称 引物序列
A-F tcaaacgtctttaacctttgc
A-R1 agaaagaggagaaatactagatgatctggataatgacgat
T-AZT-F tggtgcaccgtgcagtcgattgcgtttctacaaactcttt
AZT-R caaaggttaaagacgtttgagtagaacaactgttcaccgt
T-F ctagtatttctcctctttctctagaagcatttatcagggttgtatctgtttcctgtgtg
T-R atcgactgcacggtgcaccaatgcttctg
2. 利用启动子P J23108 ，P J23110 和P J23119 过表达setA的质粒构建
以质粒pTrc99a-P trc -futC-manC为模板，分别以表7中的108-AZT-F，110-AZT-F和119-AZT-F为上游引物，以表6中的AZT-R为下游引物进行PCR扩增，得到3种含有futC和manC基因的线性载体片段。以大肠杆菌MG1655基因组为模板，以表6中的A-F和表7中的A-R为引物进行PCR扩增，获得带有setA基因的片段。将上述PCR产物进行纯化和回收后，使用无缝克隆酶，将3种含有futC和manC基因的线性载体片段分别与带有setA基因的片段连接，分别转化到E.coli JM109感受态细胞中，在含有100 mg/L氨苄青霉素的LB平板上培养，挑取转化子测序验证，获得正确的重组质粒，分别命名为pTrc99a-P trc -futC-manC-P J23108 -setA,pTrc99a-P trc -futC-manC-P J23110 -setA和 pTrc99a-P trc -futC-manC-P J23119 -setA。
表7构建利用pTrc99a-P trc -futC-manC过表达setA的质粒所用引物
引物名称 引物序列
A-R atgctagctacaaccctgataaatgcttctagagaaagaggagaaatactagatgatctggataatgacgatg
108-AZT-F atcagggttgtagctagcattatacctaggactgagctagctgtcagtgcgtttctacaaactcttt
110-AZT-F atcagggttgtagctagcattgtacctaggactgagctagccgtaaatgcgtttctacaaactcttt
119-AZT-F atcagggttgtagctagcattatacctaggactgagctagctgtcaatgcgtttctacaaactcttt
实施例52'-岩藻糖基乳糖生产菌株的构建和发酵测试
利用电转化的方法，将质粒pTrc99a-P trc -futC-manC分别导入到菌株TKYW1，TKYW2-1，TKYW2-2和TKYW2-3中，构建出菌株TKYW1 (pTrc99a-P trc -futC-manC)，TKYW2-1(pTrc99a-P trc -futC-manC)，TKYW2-2 (pTrc99a-P trc -futC-manC)和TKYW2-3 (pTrc99a-P trc -futC-manC)。将质粒pTrc99a-P trc -futC-manC-P trc -setA, pTrc99a-P trc -futC-manC-P J23108 -setA, pTrc99a-P trc -futC-manC-P J23110 -setA和 pTrc99a-P trc -futC-manC-P J23119 - setA分别导入菌株TKYW1中，构建出菌株TKYW1 (pTrc99a-P trc -futC-manC-P trc -setA)，TKYW1 (pTrc99a-P trc -futC-manC-P J23108 -setA)，TKYW1 (pTrc99a-P trc -futC-manC-P J23110 - setA)和TKYW1 (pTrc99a-P trc -futC-manC-P J23119 -setA)。
测试上述菌株发酵生产2'-岩藻糖基乳糖的水平，所用培养基为：LB培养基：NaCl10 g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g /L，pH为7.0。发酵培养基： KH2PO4 3 g/L，酵母粉8 g/L，(NH4)2SO4 4 g/L，柠檬酸 1.7g/L，MgSO4·7H2O2 g/L，硫胺素10 mg/L，甘油10 g/L，乳糖5g/L，1 ml/L微量元素（FeCl3·6H2O 25 g/L，MnCl2·4H2O 9.8 g/L，CoCl2·6H2O 1.6 g/L，CuCl2·H2O 1 g/L，H3BO3 1.9 g/L， ZnCl2 2.6 g/L，Na2MOO4·2H2O 1.1 g/L，Na2SeO3 1.5g/L，NiSO4·6H2O 1.5 g/l），利用氨水调pH为7.2。
发酵测试过程为：
挑取2'-岩藻糖基乳糖生产菌株单菌落，转接到含有50 mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，进行摇瓶培养，摇床温度为37℃、转速为220 转/min，培养过夜。取10微升培养液作为种子，转接到每个孔中含有1 mL发酵培养基的24深孔板中，发酵培养基中含有50 mg/L氨苄青霉素以及0.1 mM的 IPTG，在孔板震荡培养箱中培养，温度为37℃，转速为800转/min。每个菌株平行培养3个样品。培养48 h后取样0.5 ml，利用超声破碎仪破碎细胞，离心收集上清，煮沸十分钟，加入等体积的乙腈，再次离心收集上清，然后利用0.22 μm滤膜过滤。利用HPLC检测2'-岩藻糖基乳糖的浓度，HPLC分析所用色谱柱为Carbohydrate ES 5u250mm*4.6mm，检测器为蒸发光检测器，流动相为70%乙腈（乙腈：水），流速为0.8mL/min，柱温设定为30℃，进样量为5µL。利用2'-岩藻糖基乳糖标准品对样品浓度进行定量。2’-岩藻糖基乳糖产量见表8。
表8 不同菌株生产2'-岩藻糖基乳糖测试结果
菌株 48h产量（g/L）
TKYW1 (pTrc99a-P trc -futC-manC) 1.23±0.11
TKYW1 (pTrc99a-P trc -futC-manC-P trc -setA) 1.75±0.15
TKYW1 (pTrc99a-P trc -futC-manC-Pjm108 -setA) 1.79±0.06
TKYW1 (pTrc99a-P trc -futC-manC-Pjm110 -setA) 2.03±0.13
TKYW1 (pTrc99a-P trc -futC-manC-Pjm119 -setA) 1.92±0.18
TKYW2-1 (pTrc99a-P trc -futC-manC) 2.46±0.16
TKYW2-2 (pTrc99a-P trc -futC-manC) 2.79±0.07
TKYW2-3 (pTrc99a-P trc -futC-manC) 2.58±0.09
从表8可以看出，与对照菌株TKYW1 (pTrc99a-P trc -futC-manC)相比，所有过表达setA基因的测试菌株均能够提高2'-FL产量，利用基因组原位过表达setA基因提高2'-FL产量的效果明显优于利用质粒过表达setA基因的效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (16)

1.一种提高2'-岩藻糖基乳糖生产能力的重组菌株，所述重组菌株的出发菌株为大肠杆菌，其特征在于，所述重组菌株原位过表达糖外排转运体A编码基因，且所述出发菌株为在体内能够合成2'-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌；
所述重组菌株基因组的糖外排转运体A编码基因前插入组成型启动子PJ23108、PJ23110、PJ23119进行原位过表达。
2.根据权利要求1所述的重组菌株，其特征在于，所述糖外排转运体A编码基因前面还插入氯霉素抗性基因的启动子。
3.根据权利要求1所述的重组菌株，其特征在于，所述出发菌株选自大肠杆菌K12MG1655、大肠杆菌BL21(DE3) 、大肠杆菌JM109、大肠杆菌BW25113中的任一种。
4.根据权利要求1所述的重组菌株，其特征在于，所述出发菌株是进行过2'-岩藻糖基乳糖从头合成途径相关酶的编码基因的基因改造的重组菌株。
5.根据权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，所述2'-岩藻糖基乳糖从头合成途径相关酶的编码基因的基因改造包括敲除大肠杆菌基因组上的β-半乳糖苷酶编码基因，并过表达磷酸甘露糖异构酶编码基因、磷酸甘露糖变位酶编码基因、GDP-岩藻糖合成酶编码基因、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶编码基因、β-半乳糖苷透性酶编码基因、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤转移酶编码基因。
6.根据权利要求5所述的重组菌株，其特征在于，还包括敲除大肠杆菌基因组上的lacI、UDP-葡萄糖脂质载体转移酶编码基因、GDP-甘露糖水解酶编码基因。
7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，还包括2'-岩藻糖基乳糖补救途径相关酶的编码基因、乳糖lac操纵子序列、敲除2'-岩藻糖基乳糖合成前体降解相关酶的编码基因的基因改造。
8.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述2'-岩藻糖基乳糖从头合成途径相关酶的编码基因的基因改造包括：
敲除大肠杆菌基因组上的β-半乳糖苷酶编码基因；
敲除大肠杆菌基因组上的UDP-葡萄糖脂质载体转移酶编码基因；
敲除大肠杆菌基因组上的GDP-甘露糖水解酶编码基因；
在大肠杆菌基因组上插入磷酸甘露糖异构酶编码基因；
在大肠杆菌基因组上插入磷酸甘露糖变位酶编码基因；
在大肠杆菌基因组上插入GDP-岩藻糖合成酶编码基因；
在大肠杆菌基因组上插入GDP-甘露糖-4,6-脱水酶编码基因；
原位过表达β-半乳糖苷透性酶编码基因；
在质粒上过表达甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤转移酶编码基因；
在质粒上过表达2'-岩藻糖基乳糖合成酶编码基因。
9.根据权利要求8所述的重组菌株，其特征在于，所述GDP-岩藻糖合成酶编码基因、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶编码基因、磷酸甘露糖异构酶编码基因、磷酸甘露糖变位酶编码基因为单拷贝插入基因组过表达；所述甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤转移酶编码基因、2'-岩藻糖基乳糖合成酶编码基因为多拷贝过表达。
10.根据权利要求8所述的重组菌株，其特征在于，所述磷酸甘露糖异构酶编码基因、磷酸甘露糖变位酶编码基因、GDP-岩藻糖合成酶编码基因、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶编码基因、β-半乳糖苷透性酶编码基因、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤转移酶编码基因、2'-岩藻糖基乳糖合成酶编码基因使用P trc 启动子过表达；所述质粒选自pTrc99a、pSB4K5、pET28a或pET22b中的任一种。
11.根据权利要求9所述的重组菌株，其特征在于，所述糖外排转运体A编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述β-半乳糖苷酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述UDP-葡萄糖脂质载体转移酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述GDP-甘露糖水解酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述磷酸甘露糖异构酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述磷酸甘露糖变位酶编码基因的核苷酸序列如SEQID NO：6所示；所述GDP-岩藻糖合成酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；所述GDP-甘露糖-4,6-脱水酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；所述β-半乳糖苷透性酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；所述甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤转移酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；所述2'-岩藻糖基乳糖合成酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。
12.根据权利要求10所述的重组菌株，其特征在于，所述P trc 启动子的核苷酸序列如SEQID NO：12所示。
13.一种提高2'-岩藻糖基乳糖生产能力的重组菌株的构建方法，其特征在于，所述重组菌株的出发菌株为大肠杆菌，所述构建方法包括不分先后的如下步骤：
敲除出发菌株的乳糖lac操纵子序列中的P lac 启动子序列及调节基因lacI和β-半乳糖苷酶编码基因，在原β-半乳糖苷酶编码基因位点之后以P trc 启动子过表达GDP-岩藻糖合成酶编码基因、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶编码基因和β-半乳糖苷透性酶编码基因；
在出发菌株的乙醇脱氢酶编码基因adhe位点上以P trc 启动子过表达磷酸甘露糖异构酶编码基因和磷酸甘露糖变位酶编码基因；
敲除出发菌株的UDP-葡萄糖脂质载体转移酶编码基因和GDP-甘露糖水解酶编码基因；
在出发菌株的糖外排转运体A编码基因前面插入组成型启动子PJ23108、PJ23110、PJ23119，并插入氯霉素抗性基因的启动子；
在出发菌株中导入过表达甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤转移酶编码基因和2'-岩藻糖基乳糖合成酶编码基因的质粒。
14.如权利要求13所述的构建方法，其特征在于，所述出发菌株是大肠杆菌K12MG1655。
15.权利要求1至12任一项所述的重组菌株或权利要求13或14所述方法构建的重组菌株在发酵生产2'-岩藻糖基乳糖中的应用。
16.如权利要求15所述的应用，其特征在于，发酵所述重组菌株时，其发酵培养基碳源选自甘油、乳糖中的至少一种，有机氮源选自酵母粉、胰蛋白胨、牛肉膏中的至少一种；发酵的温度为36℃～40℃；发酵的pH为6.8～7.8。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116286562A (zh) * 2021-12-10 2023-06-23 虹摹生物科技(上海)有限公司 一种基因工程菌及其制备方法和应用
CN115786220B (zh) * 2022-09-01 2024-03-29 山东合成远景生物科技有限公司 一种生产2`-岩藻糖基乳糖的重组菌株及构建方法和应用
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112501106A (zh) * 2021-02-01 2021-03-16 天津科技大学 一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌及其应用
CN114774343A (zh) * 2022-05-24 2022-07-22 江南大学 一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株及应用

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Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112501106A (zh) * 2021-02-01 2021-03-16 天津科技大学 一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌及其应用
CN114774343A (zh) * 2022-05-24 2022-07-22 江南大学 一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株及应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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基因编辑技术在大肠杆菌中的应用;晁双英等;生物工程学报;第38卷(第4期);第1446-1461页 *

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