CN117737061A - 一种非编码RNA CsrB突变体、基因工程菌及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种非编码RNA CsrB突变体、基因工程菌及应用。所述非编码RNA CsrB突变体是在Gene ID为2847719的大肠杆菌野生型非编码RNA CsrB基础上获得，至少将第178位t突变为a。对产岩藻糖基乳糖和/或唾液酸基乳糖的大肠杆菌基因工程菌中野生型非编码RNA CsrB进行突变，使其非编码RNA CsrB第178位t突变为a后，所获得的大肠杆菌基因工程菌岩藻糖基乳糖和/或唾液酸基乳糖的产量可得到进一步提高，具有更高的产业应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种非编码RNA CsrB突变体、基因工程菌及应用。
背景技术
岩藻糖基乳糖（2'-岩藻糖基乳糖(2'-fucosyllactose，2'-FL)、3-岩藻糖基乳糖（3-fucosyllactose，3-FL））和唾液酸基乳糖（3'-唾液酸基乳糖(3'-sialyllactose，3'-SL)、6'-唾液酸基乳糖（6'-sialyllactose，6'-SL））是母乳低聚糖（human milkoligosaccharides，HMOs）的重要成分，在调节肠道菌群、免疫力等方面发挥重要作用，具有广阔的市场前景。目前岩藻糖基乳糖和唾液酸基乳糖的生产方法包括化学合成法、酶合成法、微生物发酵法等。微生物发酵法具有环境友好、成本低等优势。大肠杆菌遗传背景清晰、代谢旺盛且增殖迅速，是微生物发酵法中常用的工程菌株。
本领域对岩藻糖基乳糖的从头合成途径和补救途径的关键酶、糖外排转运体等已有深入了解（Zhu YY, et al. Recent advances on 2'-fucosyllactose: physiologicalproperties, applications, and production approaches[J]. Critical Reviews inFood Science and Nutrition, 2022, 62(8):2083-2092.），并通过对相关酶或转运体编码基因的基因编辑，考察了其对岩藻糖基乳糖发酵产率的影响。根据报道，敲除以下基因中的一种或多种：β-半乳糖苷酶编码基因lacZ、UDP-葡萄糖脂质载体转移酶编码基因wcaJ、乳糖lac操纵子序列中的调节基因lacI、L-岩藻糖异构酶编码基因fucI、L-墨角藻糖激酶编码基因fucK、L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶编码基因fucA（Ni ZJ, et al. Multi-PathOptimization for Efficient Production of 2′-Fucosyllactose in anEngineeredEscherichia coliC41 (DE3) Derivative[J]. Frontiers inBioengineering and Biotechnology, 2020, 8:611900.）；和/或过表达以下基因的一种或多种：GDP-岩藻糖合成酶编码基因wcaG、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶编码基因gmd、β-半乳糖苷透性酶编码基因lacY、磷酸甘露糖异构酶编码基因manA、磷酸甘露糖变位酶编码基因manB、糖外排转运体A编码基因setA、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤转移酶编码基因manC、L-阿拉伯糖异构酶编码基因araA、鼠李糖异构酶编码基因rhaA、2'-岩藻糖基乳糖合成酶编码基因futC、L-岩藻糖激酶/GDP-L-岩藻糖焦磷酸化酶编码基因fkp有利于提高岩藻糖基乳糖的发酵产率。由于α-(1,3)-岩藻糖基转移酶(FutA)的低活性和不溶性表达，与2'-岩藻糖基乳糖相比，3-岩藻糖基乳糖的发酵产率较低。因此，进一步过表达或插入α-(1,3)-岩藻糖基转移酶编码基因futA或对α-(1,3)-岩藻糖基转移酶编码基因futA进行有益突变，更有利于提高3-岩藻糖基乳糖的发酵产率（Yun HC,et al. Biosynthesis of the human milkoligosaccharide 3‐fucosyllactose in metabolically engineeredEscherichia coli via the salvage pathway through increasing GTP synthesis and β‐galactosidasemodification[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2019, 116(12):3324-3332.）。并且，本领域对唾液酸基乳糖的从头合成途径已有深入了解（Zhu YY, et al. Recentprogress on health effects and biosynthesis of two key sialylated human milkoligosaccharides, 3'-sialyllactose and 6'-sialyllactose[J]. BiotechnologyAdvances, 2023, 62:108058.），并通过对相关酶编码基因的基因编辑，考察了其对唾液酸基乳糖发酵产率的影响。根据报道，敲除以下基因中的一种或多种：β-半乳糖苷酶编码基因lacZ、乳糖lac操纵子序列中的调节基因lacI、N-乙酰神经氨酸裂解酶NanA、N-乙酰神经氨酸:H+同转运体NanT、N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸2-庚二酸酶NanE、N-乙酰甘露糖胺激酶NanK；和/或过表达以下基因的一种或多种：UDP-GlcNAc差向异构酶NeuC、N-乙酰神经氨酸合酶NeuB、N-乙酰基神经氨酸胞苷酰转移酶NeuA、唾液酸转移酶SiaT，有利于提高唾液酸基乳糖的发酵产率。
CsrB是大肠杆菌碳储存调控系统的一种新的非编码RNA，是包含369个碱基的RNA分子，在大肠杆菌中CsrB结合18个CsrA蛋白（Ashok K Dubey, et al. RNA sequence andsecondary structure participate in high-affinity CsrA-RNA interaction[J]．RNA,2005 11(10):1579-1587.）。CsrA是一种转录后调节大肠杆菌中心碳通量、生物膜形成和运动的调控蛋白，激活菌体指数期的代谢途径，减缓菌体进入稳定期（Suzuki K, et al.Identification of a novel regulatory protein (CsrD) that targets the globalregulatory RNAs CsrB and CsrB for degradation by RNase E[J]．Genes&Development，2006, 20(18):2605-2617.）。CsrB结合CsrA后，减弱CsrA对所调控基因的调控功能（Thomas Weilbacher et al．A novel sRNA component of the carbon storageregulatory system ofEscherichia coli[J]．Mol Microbiol, 2003, 48(3):657-670.）。目前对CsrB的基因编辑主要通过改变其转录水平、或将其截短用于提高间苯三酚（CN104388371A）、氨基酸产量或调控糖原合成及糖异生等(US6537815B2)。
持续提高岩藻糖基乳糖和唾液酸基乳糖菌种水平，对于其工业生产具有重要意义，然而，菌种水平提高的机制仍不明确。目前，未见通过调控CsrB的表达水平，或者对CsrB进行点突变提高岩藻糖基乳糖或唾液酸基乳糖产量的报道。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明通过基因编辑获得一种可提高岩藻糖基乳糖和/或唾液酸基乳糖产率的非编码RNA CsrB突变体，可将其应用于岩藻糖基乳糖和/或唾液酸基乳糖的生产。
为实现上述目的，本发明的技术方案之一，提供一种非编码RNA CsrB突变体。该非编码RNA CsrB突变体的核苷酸序列对应于大肠杆菌K12 MG1655的野生型非编码RNA CsrB(CsrB，Gene ID: 2847719）的核苷酸序列，其第178位t突变为a，即具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或该非编码RNA CsrB突变体的核苷酸序列对应于SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列至少第178位碱基为a，且与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少90%之同源性。与原有非编码CsrB基因转录后的RNA相比，突变体的RNA与转录调控因子CsrA的结合能力发生变化，引起CsrA对微生物的代谢调控发生变化，从而有利于提高岩藻糖基乳糖和唾液酸基乳糖的发酵产量。
本发明提供的技术方案之二，是提供一种产岩藻糖基乳糖和/或唾液酸基乳糖的基因工程菌，该基因工程菌为大肠杆菌基因工程菌，该大肠杆菌基因工程菌的基因组携带前述非编码RNA CsrB突变体核苷酸序列。其中岩藻糖基乳糖可以为2'-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖中的任一种；唾液酸基乳糖为3'-唾液酸基乳糖、6'-唾液酸基乳糖中的任一种。其中所述“产岩藻糖基乳糖和/或唾液酸基乳糖的基因工程菌”是指即便不携带前述非编码RNA CsrB突变体核苷酸序列，其本身已具备发酵生产岩藻糖基乳糖和/或唾液酸基乳糖能力的基因工程菌。
本发明提供的技术方案之三，是提供上述非编码RNA CsrB突变体的应用，特别是在生产岩藻糖基乳糖和/或唾液酸基乳糖中的应用，即用于提高大肠杆菌发酵制备岩藻糖基乳糖和/或唾液酸基乳糖的产量。其中岩藻糖基乳糖可以为2'-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖中的任一种；唾液酸基乳糖为3'-唾液酸基乳糖、6'-唾液酸基乳糖中的任一种。
有益效果
本发明通过基因编辑技术获得一种非编码RNA CsrB突变体，该非编码RNA CsrB突变体应用于发酵生产岩藻糖基乳糖和/或唾液酸基乳糖的大肠杆菌中，可进一步提高岩藻糖基乳糖和唾液酸基乳糖的产量。
本发明的用于提高岩藻糖基乳糖和/或唾液酸基乳糖产量的非编码RNA CsrB突变体，相对于插入诱导基因等技术获得的CsrB RNA基因编辑片段，制备更为简化；尤其是采用单点突变制备的非编码RNA CsrB突变体，制备更为简化。
附图说明
图1为菌株W4第一步同源重组菌落PCR验证图；M为Marker，1、2为PCR验证条带；
图2为菌株W4第二步同源重组菌落PCR验证图；M为Marker，1为PCR验证条带。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案进一步叙述本发明。除非特别说明，以下实施方案所涉及的技术手段、材料等均可以是本领域技术人员所公知的，可以在已知的能解决相应技术问题的手段和材料中选择合适的。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
以下将通过具体实施方式对本发明作进一步地解释说明。
实施例1 构建菌株W4
在专利文献CN115786220A中所述大肠杆菌TKYW1的基础上，对基因组上的非编码RNA CsrB基因进行突变，将第178位碱基t突变为a，构建出菌株W4。
在此基于专利文献CN115786220A的内容对大肠杆菌TKYW1的构建进行简要描述，将大肠杆菌TKYW1构建方法引入本实施例。其中CN115786220A中大肠杆菌TKYW1是以专利文献CN112501106A中所述大肠杆菌W2（E.coliK12 MG1655△lacIZ::Ptrc-wcaG-gmd-lacy,△adhE::Ptrc-manB-manA）为出发菌株构建，敲除出发菌株基因组上的UDP-葡萄糖脂质载体转移酶编码基因wcaJ和GDP-甘露糖水解酶编码基因nudD获得的。大肠杆菌TKYW1构建涉及的wcaJ的核苷酸Gene ID为946583；nudD的核苷酸Gene ID为946559。
大肠杆菌K12 MG1655的野生型非编码RNA CsrB核苷酸序列Gene ID为2847719。在菌株TKYW1的基础上，利用CRISPR/Cas9技术对基因组上的非编码RNA CsrB基因进行突变，将第178位碱基t突变为a，所得非编码RNA CsrB突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，构建出的菌株命名为W4。实验中所用的CRISPR/Cas9技术参考前期的研究报道(Zhao D, etal. CRISPR/Cas9-assisted gRNA-free one-step genome editing with no sequencelimitations and improved targeting efficiency. Sci Rep, 2017, 7(1):16624)。菌株W4具体构建方法如下：
1.同源重组片段的构建
以实验室保存的大肠杆菌K12 MG1655野生型菌株为模板，分别利用表1中的引物对csrB-up-F/R和csrB-down-F/R为引物，PCR扩增得到同源重组的上、下游同源臂。以构建菌株TKYW1时PCR获得的带有cat-N20序列的片段为模板，利用引物对csrB-cat-F/R为引物进行PCR扩增，获得新的带有cat-N20序列的片段。以上、下游同源臂，新的带有cat-N20序列的片段，这3个片段为模板，利用引物csrB-up-F和csrB-down-R进行重叠PCR，得到同源重组片段，该片段含有csrB基因的突变，即野生型csrB基因的第178位碱基t突变为a。
2.第一步同源重组
利用常规的质粒转化法将pCAGO质粒转化到菌株TKYW1中，获得菌株TKYW1(pCAGO)。利用含有1%葡萄糖和浓度为0.1 mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的LB培养基制备TKYW1 (pCAGO)感受态，利用电转化方法导入同源重组片段，转化后的菌液涂布于含100 mg/L氨苄霉素和25 mg/L氯霉素，以及1%葡萄糖的LB平板上，30 ℃培养。挑取转化子进行菌落PCR验证，如果重组正确，条带大小为2900 bp左右，验证结果如图1所示，条带正确，获得了第一步同源重组菌株。
3.第二步同源重组
将长出的单克隆进行菌落PCR验证。如果重组正确，条带大小为1900 bp左右，验证结果如图2所示，条带正确，并将该条带的PCR产物进行测序，测序结果正确，获得了第二步同源重组菌株。将第二步同源重组菌株进一步在37 ℃条件下培养，丢失其中的pCAGO质粒，从而获得带有csrB基因突变（SEQ ID NO.1）的菌株，命名为W4。
表1 构建csrB基因突变菌株所用引物
实施例2 构建质粒pTrc99a-P J23119 -neuB-neuC-P trc -neuA-ist
以质粒pTrc99a为模板构建质粒pTrc99a-P J23119 -neuB-neuC-P trc -neuA-ist。该质粒构建涉及的P trc 启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；N-乙酰神经氨酸合酶neuB基因的核苷酸序列、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖2-差异构酶neuC基因的核苷酸序列、N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶基因neuA的核苷酸序列共用一个GenBank编号：AF400048.1；唾液酸转移酶基因ist的Gene ID为61281137。
以质粒pTrc99a为模板，以表2中的99a-p119-F/R为引物进行PCR扩增，获得线性载体pTrc99a-p119；以neuB-F/R为引物进行PCR扩增，获得线性基因片段neuB；以neuC-F/R为引物进行PCR扩增，获得线性基因片段neuC；以ptrc-neuA-F/R为引物进行PCR扩增，获得线性基因片段P trc ；以neuA-F/R为引物进行PCR扩增，获得线性基因片段neuA；以ist-F/R为引物进行PCR扩增，获得线性基因片段ist。将上述PCR获得的线性载体和线性基因片段纯化、回收，使用ClonExpress®®Ⅱ重组连接试剂盒（诺唯赞生物技术有限公司）进行连接，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在含有100 mg/L氨苄霉素的LB平板上培养，挑取转化子进行菌落PCR以及测序验证，获得正确的重组质粒，命名为质粒pTrc99a-P J23119 -neuB-neuC-P trc -neuA-ist。
表2 构建质粒pTrc99a-P J23119 -neuB-neuC-P trc -neuA-ist所用引物
实施例3 构建质粒pTrc99a-P J23119 -neuB-neuC-P trc -neuA-ST6
以质粒pTrc99a-P J23119 -neuB-neuC-P trc -neuA-ist为模板构建质粒pTrc99a-P J23119 -neuB-neuC-P trc -neuA-ST6。该质粒构建涉及的唾液酸转移酶ST6的GenBank编号为AB293985.1。
以质粒pTrc99a-P J23119 -neuB-neuC-P trc -neuA-ist为模板，以表3中的bst-AB-载-F/R为引物进行PCR扩增，获得线性载体pTrc99a-ST6；以bst-AB-F/R为引物进行PCR扩增，获得线性基因片段ST6；将上述PCR获得的线性载体和线性基因片段纯化、回收，使用ClonExpress®®Ⅱ重组连接试剂盒（诺唯赞生物技术有限公司）进行连接，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在含有100 mg/L氨苄霉素的LB平板上培养，挑取转化子进行菌落PCR以及测序验证，获得正确的重组质粒，命名为质粒pTrc99a-P J23119 -neuB-neuC-P trc -neuA-ST6。
表3 构建质粒pTrc99a-P J23119 -neuB-neuC-P trc -neuA-ST6所用引物
实施例4 岩藻糖乳糖及唾液酸乳糖生产菌种的构建和发酵测试
利用电转化的方法，将质粒pTrc99a-P trc -futC-manC、pTrc99a-P trc -futA-manC、pTrc99a-P J23119 -neuB-neuC-P trc -neuA-ist和pTrc99a-P J23119 -neuB-neuC-P trc -neuA-ST6分别导入TKYW1和W4，分别构建出2'-岩藻糖基乳糖生产菌株F1（TKYW1 (pTrc99a-P trc -futC-manC)）和F2（W4 (pTrc99a-P trc -futC-manC)），3-岩藻糖基乳糖生产菌株F3（TKYW1(pTrc99a-P trc -futA-manC)）和F4（W4 (pTrc99a-P trc -futA-manC)），3'-唾液酸基乳糖生产菌株F5（TKYW1 (pTrc99a-P J23119 -neuB-neuC-P trc -neuA-ist)）和F6（W4 (pTrc99a-P J23119 -neuB-neuC-P trc -neuA-ist)）和6'-唾液酸基乳糖生产菌株F7（TKYW1 (pTrc99a-P J23119 -neuB-neuC-P trc -neuA-ST6)）和F8（W4 (pTrc99a-P J23119 -neuB-neuC-P trc -neuA-ST6)），并测试上述菌株发酵生产水平。质粒pTrc99a-P trc -futC-manC、pTrc99a-P trc -futA-manC的具体构建过程记载于专利文献CN116334025A的实施例3、实施例4。
所用培养基为：
LB培养基：NaCl 10 g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g /L，pH为7.0。
发酵培养基： KH2PO43 g/L，酵母粉8 g/L，(NH4)2SO4 4 g/L，柠檬酸 1.7 g/L，MgSO4·7H2O2 g/L，硫胺素10 mg/L，甘油10 g/L，乳糖5 g/L，1 ml/L微量元素（FeCl3·6H2O25 g/L，MnCl2·4H2O 9.8 g/L，CoCl2·6H2O 1.6 g/L，CuCl2·H2O 1 g/L，H3BO31.9 g/L，ZnCl22.6 g/L，Na2MOO4·2H2O 1.1 g/L，Na2SeO31.5 g/L，NiSO4·6H2O 1.5 g/l），利用氨水调pH为7.2。
发酵测试过程为：
分别挑取岩藻糖基乳糖或唾液酸基乳糖生产菌株单菌落，在含有50 mg/L氨苄霉素的LB液体培养基中，37 ℃、220 rpm/min，培养过夜。取过夜培养的菌液作为种子液，以1%的接种量将菌液转接到含有2 mL发酵培养基的24孔板中，发酵培养基中含有50 mg/L氨苄霉素以及0.1 mmol/L的 IPTG，37 ℃，800 rpm/min条件下进行发酵。每个菌株平行培养3个样品。发酵过程中，测定菌体的生长（OD600）、岩藻糖基乳糖或唾液酸基乳糖含量，利用HPLC检测样品中岩藻糖基乳糖或唾液酸基乳糖的浓度，HPLC分析所用色谱柱为CarbohydrateES 5u 250mm*4.6mm，检测器为蒸发光检测器，流动相为70%乙腈（乙腈：水），流速为0.8 mL/min，柱温为30 ℃，进样量为5 µL。利用岩藻糖基乳糖或唾液酸基乳糖标准品对样品浓度进行定量。结果如表4至表7所示：
由表4至表7可以看出，非编码RNA CsrB基因第178位核苷酸t突变为a，大幅提高了岩藻糖基乳糖及唾液酸基乳糖的产量。
表4 不同菌株生产2'-岩藻糖基乳糖（2'-FL）测试结果
表5 不同菌株生产3-岩藻糖基乳糖（3-FL）测试结果
表6 不同菌株生产3'-唾液酸基乳糖（3'-SL）测试结果
表7 不同菌株生产6'-唾液酸基乳糖（6'-SL）测试结果
虽然本发明已经以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和原理的情况下，可以对这些实施例进行各种形式和细节的变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物所限定。
Claims (10)
1.一种非编码RNA CsrB突变体，其特征在于，所述非编码RNA CsrB突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；或所述非编码RNA CsrB突变体的核苷酸序列对应于SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列至少第178位碱基为a，且与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少90%之同源性。
2.一种产岩藻糖基乳糖和/或唾液酸基乳糖的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为大肠杆菌基因工程菌，所述大肠杆菌基因工程菌的基因组携带权利要求1所述的非编码RNA CsrB突变体核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌基因工程菌的基因组携带SEQ ID NO.1所示的非编码RNA CsrB突变体核苷酸序列。
4.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌基因工程菌为产岩藻糖基乳糖的大肠杆菌基因工程菌。
5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述岩藻糖基乳糖为2'-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖中的任一种。
6.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌基因工程菌为产唾液酸基乳糖的大肠杆菌基因工程菌。
7.根据权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述唾液酸基乳糖为3'-唾液酸基乳糖、6'-唾液酸基乳糖中的任一种。
8.权利要求1所述非编码RNA CsrB突变体的应用，其特征在于，所述非编码RNA CsrB突变体用于提高大肠杆菌发酵制备岩藻糖基乳糖和/或唾液酸基乳糖的产量。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述岩藻糖基乳糖为2'-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖中的任一种。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述唾液酸基乳糖为3'-唾液酸基乳糖、6'-唾液酸基乳糖中的任一种。
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