CN116042682B - 一株产2’-岩藻糖基乳糖的工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物发酵技术领域,具体涉及一株产2’‑岩藻糖基乳糖的工程菌及其构建方法和应用。本发明提供了一株产2’‑岩藻糖基乳糖的工程菌的构建方法,构建了一条高效的2’‑岩藻糖基乳糖合成路线,利用从头合成途径合成足够多的GDP‑L‑岩藻糖。然后对染色体基因wcaj、nudD和nudK进行基因敲除,并在wcaj位点插入futCB基因,futCB酶催化GDP‑L‑岩藻糖合成2’‑岩藻糖基乳糖的活性非常高,可大量提高2’‑岩藻糖基乳糖的产量。经验证,摇瓶产量达到8.4g/L,上罐发酵产量达到85g/L,实现2’‑岩藻糖基乳糖的大量生产。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域,具体涉及一株产2’-岩藻糖基乳糖的工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
母乳低聚糖(human milkoligosaccharides,HMOs)是母乳中仅次于乳糖和脂肪的第三大营养物质,在母乳中的含量约为15%。现有的研究表明,母乳低聚糖对新生儿有许多重要的影响,实际生活中,常常出现不能使用母乳进行喂养的情况,此时一般会使用婴儿配方奶粉进行替代。目前,美国食品和药物管理局(FDA)和欧洲食品安全局(EFSA)正式批准将母乳低聚糖用作婴儿配方奶粉中的新型食品添加剂。因此,工业合成2’-岩藻糖基乳糖(2‘FL)并提高产量降低生产成本已经成为目前的研究热点。
现有的工业生物合成2’-岩藻糖基乳糖的方法以大肠杆菌作为工程菌,在提供碳源的前提下,利用大肠杆菌内的基因通路,合成2’-岩藻糖基乳糖的前体物质GDP-L-岩藻糖和受体乳糖,并且向工程菌中转入外源的α-1,2-岩藻糖基转移酶,将两个前体结合,从而工业合成2’-岩藻糖基乳糖。生物合成法需要供体GDP-l-focus、受体乳糖和α-1,2-focusyltransferase(FT)的持续供应。其中,乳糖作为一种低廉的底物,一般可以被野生型生产者自身同化和降解,这会导致工程菌的乳糖利用率下降。
GDP-L-岩藻糖是合成2’-岩藻糖基乳糖的关键前体,可以通过两种途径合成。一种是源自colanic acid生物合成的大肠杆菌中自然存在的途径。从中枢代谢中的果糖6-磷酸开始,通过5个酶促步骤(ManA、ManB、ManC、Gmd、WcaG)转化为GDP-L-岩藻糖。另一个是最初来源于真核细胞的补救途径,这需要昂贵的L-focuse作为底物和来自fragilis(B.fragilis)的催化酶Fkp来产生GDP-L-岩藻糖。出于成本考虑,一般选用从头合成途径合成GDP-L-岩藻糖。假如参与可拉酸生物合成的wcaj基因失活,或者阳性调控基因RcsA过表达,均可以增加细胞内的GDP-L-岩藻糖的量,但这一途径中某些中间产物(如GDP-甘露糖)的缺乏,仍可能降低GDP-L-岩藻糖的合成量。由于GDP-L-岩藻糖是合成2’-岩藻糖基乳糖重要的前体物质,如何让合成途径中GDP-L-岩藻糖的量增多是现阶段要解决的技术难点。
发明内容
本发明的目的在于提供一株产2’-岩藻糖基乳糖的工程菌及其构建方法和应用,利用从头合成途径合成足够多的GDP-L-岩藻糖,实现2’-岩藻糖基乳糖的大量生产。
本发明提供了一株产2’-岩藻糖基乳糖的工程菌的构建方法,包括以下步骤:
(1)利用futCB基因替换大肠杆菌Jm109(DE3)基因组中的wcaJ基因,并敲除LacZ、nudD和nudK基因,得E.Coli.Jm109(DE3)::futCBΔZDK;
(2)利用重组载体转化步骤(1)所述E.Coli.Jm109(DE3)::futCBΔZDK,得重组工程菌;
所述重组载体以pRSFDuet-1为基础载体,并插入GW基因片段和CB基因片段,所述GW基因片的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,CB基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的,步骤(1)中,敲除wcaJ基因所用的引物包括wcaJF和sgRNAR,其中wcaJF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,sgRNAR的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示;
扩增futCB基因所用的引物包括FutCBF和FutCBR,其中FutCBF的核苷酸序列如SEQID NO.5所示,FutCBR的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
优选的,步骤(1)中利用futCB基因替换大肠杆菌Jm109(DE3)基因组中的wcaJ基因的方法,包括:①以质粒pTargetF为模板,采用引物wcaJR和sgRNAF进行PCR扩增得到线性化PCR产物,经过DpnⅠ消化和磷酸化后,利用T4DNA连接酶进行连接,转化大肠杆菌trans10感受态,得阳性质粒pTargetF-wcaj;
②以大肠杆菌E.coliBL2的DNA为模板,利用FutCBF和FutCBR进行PCR扩增,得futCB_T7_wcaj;
③将质粒pCas9转化至受体菌株Jm109(DE3)中,并涂布于含有壮观霉素的固体LB培养基中,30℃过夜培养,得到转化子,提质粒获得含有pCas9的重组菌E.coli Jm109(pCas9);
④将阳性质粒pTargetF-wcaj和futCB_T7_wcaj转入E.coli Jm109(pCas9)的感受态细胞中,并涂布于含有氨苄青霉素和壮观霉素的LB固体培养基,30℃过夜培养,得到转化子;
⑤以FutCBF和FutCBR为引物,对步骤④得到的转化子进行菌液PCR,测序后筛选正确的wcaJ基因已经被替换为futCB基因的Amp+Spec抗性基因的单克隆;
⑥将步骤⑤得到的单克隆接种到Amp+Spec抗性液体培养基中,传代3次,除去pCas9质粒,得到的菌株为突变体E.coli Jm109(wcaJ::futCB)。
优选的,步骤(1)中敲除LacZ基因所用的引物包括LacZF、sgRNAR、LacZ301F、LacZ301R、LacZ402F和LacZ402R,其中LacZF的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示,sgRNAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示,LacZ301F的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示,LacZ301R的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示,LacZ402F的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示,LacZ402R的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
优选的,步骤(1)中敲除nudD基因所用的引物包括nudDF、sgRNAR、nudD_501F、nudD_501R、nudD_182F和nudD_182R,其中nudDF的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示,sgRNAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示,nudD_501F的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示,nudD_501R的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示,nudD_182F的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示,nudD_182R的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。
优选的,步骤(1)中敲除nudK基因所用的引物包括nudKF、sgRNAR、nudK_501F、nudK_501R、nudK_302F和nudK_302R,其中nudKF的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示,sgRNAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示,nudK_501F的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示,nudK_501R的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示,nudK_302F的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示,nudK_302R的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。
优选的,步骤(2)中将GW基因片段插入pRSFDuet-1的Nde I和Kpn I之间,将CB基因片段插入pRSFDuet-1的Nco I和Hind III之间。
本发明还提供了利用上述构建方法得到的重组工程菌。
本发明还提供了上述重组工程菌在生产2’-岩藻糖基乳糖中的应用。
本发明还提供了一种生产2’-岩藻糖基乳糖的方法,包括将上述重组工程菌接种到发酵培养液中,以乳糖为底物,在IPTG诱导下,发酵液中包含所述2’-岩藻糖基乳糖。
有益效果:本发明提供选用了一株产2’-岩藻糖基乳糖的工程菌的构建方法,构建了一条高效的2’-岩藻糖基乳糖合成路线,利用从头合成途径合成足够多的GDP-L-岩藻糖。然后对染色体基因wcaj、nudD和nudK进行基因敲除,并在wcaj位点插入futCB基因,futCB酶催化GDP-L-岩藻糖合成2’-岩藻糖基乳糖的活性非常高,可大量提高2’-岩藻糖基乳糖的产量。此外,一对异源阳性调控因子RcsA和RcsB可以增强ManA、ManB、ManC、Gmd、WcaG的表达量从而促进GDP-L-岩藻糖的形成,最终实现2’-岩藻糖基乳糖的大量生产,摇瓶产量达到8.4g/L,上罐发酵产量达到85g/L。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例中Strain1(E.coli Jm109(DE3-pETDuet-1-futC)和Strain2(E.coliJm109(DE3-pETDuet-1-futCB)的发酵最终产量对比结果;
图2为实施例中构建的pRSFDuet-1-CB-GW载体图谱,第50-3001位核苷酸为GW基因序列,第3117-5246位核苷酸为CB基因序列;
图3为本发明构建重组工程菌在不同培养基中进行摇瓶发酵培养得到的2’-岩藻糖基乳糖产量对比图。
具体实施方式
本发明提供了一株产2’-岩藻糖基乳糖的工程菌的构建方法,包括以下步骤:
(1)利用futCB基因替换大肠杆菌Jm109(DE3)基因组中的wcaJ基因,并敲除LacZ、nudD和nudK基因,得E.Coli.Jm109(DE3)::futCBΔZDK;
(2)利用重组载体转化步骤(1)所述E.Coli.Jm109(DE3)::futCBΔZDK,得重组工程菌;
所述重组载体以pRSFDuet-1为基础载体,并插入GW基因片段和CB基因片段,所述GW基因片的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,CB基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的步骤(1)中,敲除wcaJ基因(NCBIACCESSION:NC_000913.3)所用的引物优选包括wcaJF和sgRNAR,其中wcaJF的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示,sgRNAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;扩增futCB基因(NCBI ACCESSION:WP_002174293.1)所用的引物包括FutCBF和FutCBR,其中FutCBF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示,FutCBR的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。具体序列如下:
wcaJF:tcctaggtataatactagtgtcagcacattgataaactggttttagagctagaaatagc;
sgRNAR:actagtattatacctaggactgagctagctgtcaag;
FutCBF:ccaacacagccaaacatccgcgc;
FutCBR:ggcatcgttcccactgcgatgc。
本发明利用futCB基因替换大肠杆菌Jm109(DE3)基因组中的wcaJ基因的方法,优选包括:①以质粒pTargetF(源自Jiang et al.,Appl Environ Microbiol,2015,81:2506-2514)为模板,采用引物wcaJR和sgRNAF进行PCR扩增得到线性化PCR产物,经过DpnⅠ消化和磷酸化后,利用T4DNA连接酶进行连接,转化大肠杆菌trans10感受态,得阳性质粒pTargetF-wcaj;
②以大肠杆菌E.coliBL2的DNA为模板,利用FutCBF和FutCBR进行PCR扩增,得futCB_T7_wcaj;
③将质粒pCas9转化至受体菌株Jm109(DE3)中,并涂布于含有壮观霉素的固体LB培养基中,30℃过夜培养,得到转化子,提质粒获得含有pCas9的重组菌E.coli Jm109(pCas9);
④将阳性质粒pTargetF-wcaj和futCB_T7_wcaj转入E.coli Jm109(pCas9)的感受态细胞中,并涂布于含有氨苄青霉素和壮观霉素的LB固体培养基,30℃过夜培养,得到转化子;
⑤以FutCBF和FutCBR为引物,对步骤④得到的转化子进行菌液PCR,测序后筛选正确的wcaJ基因已经被替换为futCB基因的Amp+Spec抗性基因的单克隆;
⑥将步骤⑤得到的单克隆接种到Amp+Spec抗性液体培养基中,37℃传代3次,除去pCas9质粒,得到的菌株为突变体E.coli Jm109(wcaJ::futCB)。
本发明步骤①中,所述PCR扩增的程序优选为95℃预变性15s;95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸15s,循环25次;步骤②中所述PCR扩增的程序优选为95℃预变性15s;95℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸30s,循环25次;步骤⑤中所述菌液PCR所用的引物对优选为FutCBF和FutCBR,其PCR程序与上相同,在此不再赘述。
本发明敲除LacZ基因所用的引物,优选包括LacZF、sgRNAR、LacZ301F、LacZ301R、LacZ402F和LacZ402R,其中LacZF的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示,sgRNAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示,LacZ301F的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示,LacZ301R的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示,LacZ402F的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示,LacZ402R的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示;敲除nudD基因所用的引物包括nudDF、sgRNAR、nudD_501F、nudD_501R、nudD_182F和nudD_182R,其中nudDF的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示,sgRNAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示,nudD_501F的核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示,nudD_501R的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示,nudD_182F的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示,nudD_182R的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示;敲除nudK基因所用的引物包括nudKF、sgRNAR、nudK_501F、nudK_501R、nudK_302F和nudK_302R,其中nudKF的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示,sgRNAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示,nudK_501F的核苷酸序列如SEQ IDNO.18所示,nudK_501R的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示,nudK_302F的核苷酸序列如SEQ IDNO.20所示,nudK_302R的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。本发明敲除基因所用的引物信息如下:
LacZF:TCCTAGGTATAATACTAGTGAGTGTGATCATCTGGTCGCGTTTT AGAGCTAGAAATAGC;
sgRNAR:actagtattatacctaggactgagctagctgtcaag;
LacZ301F:acgcgaaatacgggcagaca;
LacZ301R:ctacgtctgaacgtcgggtctgcgctgcggg;
LacZ402F:cgacgttcagacgtagtgtgacg;
LacZ402R:gccaggacagtcgtttgcc;
nudDF:tcctaggtataatactagtaccgagcaccacatagtgaggttttagagctagaaatagc;
nudD501_F:TTATCGACGTTATGCAGTCC;
nudD501_R:AAATACTGGTCTACGGCATTA;
nudD502_F:CGTAGACCAGTATTTCCGAAAGCGGTCTTGATT;
nudD502_R:AATCATACAACCGCCAGTAC;
nudKF:tcctaggtataatactagtaccgagcaccacatagtgaggttttagagctagaaatagc;
nudK501_F01:GGTGATTGCCTTCCCTTCCTGA;
nudK501_R01:TGGCTCAATCCGACAAATCCG;
nudK502_F01:TTGTCGGATTGAGCCACAGCGCGAAATGAACAAT;
nudK502_R01:AGAAAGAAGTGAAGAACGCCCG。
本发明步骤(2)中,优选将GW基因片段插入pRSFDuet-1的Nde I和Kpn I之间,将CB基因片段插入pRSFDuet-1的Nco I和Hind III之间,构建得到重组载体pRSFDuet-1-CB-GW。
本发明对步骤(2)中所述转化的方法并没有特殊限定,实施例中以化学转化为例进行说明,但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。
本发明还提供了利用上述构建方法得到的重组工程菌。
本发明还提供了上述重组工程菌在生产2’-岩藻糖基乳糖中的应用。
本发明还提供了一种生产2’-岩藻糖基乳糖的方法,包括将上述重组工程菌接种到发酵培养液中,以乳糖为底物,在IPTG诱导下,发酵液中包含所述2’-岩藻糖基乳糖。
本发明所述发酵培养基优选包括以下浓度的成分:5.0~7.0g/L酵母粉,7.0~10.0g/L胰蛋白胨,20~50g/L甘油,10~25g/LNa2HPO4·12H2O,1.0~2.0g/L(NH4)2HPO4,3.0~4.0g/L KH2PO4,1.0~2.5g/LNH4Cl,2.0~2.5g/L柠檬酸钠,0.5~1.0g/L MgSO4·7H2O,10.0mg/L硫胺素,40~80μg/mL卡那霉素,1mL/L的金属离子液,其中金属离子液的成分为:25.0g/L FeCl3·6H2O,2.3g/LCaCl2·2H2O,2.6g/L ZnCl2,2.0g/L CuSO4·5H2O,2.5g/LMnSO4·H2O,2.6g/LNa2MoO4·2H2O和0.7g/L H3BO3,pH 6.9.。
为了进一步说明本发明,下面结合附图和实施例对本发明提供的一株产2’-岩藻糖基乳糖的工程菌及其构建方法和应用进行详细地描述,但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
α-1,2-岩藻糖基转移酶(α-1,2-FT)的筛选
为了提高α-1,2-岩藻糖基转移酶(α-1,2-FT)体内催化效率及蛋白表达,本发明筛选了两种不同来源的α-1,2-FT,分别为幽门螺旋杆菌来源的futC(NCBI ACCESSION:EF452503.1)和枯草芽孢杆菌来源的futCB(NCBI ACCESSION:WP_002174293.1),并整合至pETDuet-1载体的HindⅢ和NdeⅠ之间,并转化至E.coli Jm109(DE3)感受态,构建获得Strain1(E.coli Jm109(DE3-pETDuet-1-futC)和Strain2(E.coli Jm109(DE3-pETDuet-1-futCB),以上基因合成的相关工作由北京擎科生物科技有限公司(www.tsingke.net/)完成。
将Strain1和Strain2的甘油菌划线至氨苄抗性的LB平板(氨苄抗性的工作浓度为100μg/mL)37℃培养24h活化,挑取活化后形态饱满的单菌落至含有LB液体培养基的试管(装液量5mL),37℃,200rpm,摇床培养16h,至OD600>1.2,即可以1%的转接量转接至一级种子瓶(250mL的锥形瓶装有50mL的LB液体培养基),37℃,200rpm,摇床培养8h,至OD600约为1.0,即可转接至发酵培养基(250mL的锥形瓶装有50mL的LB液体培养基),37℃,200rpm培养60h,待OD600=0.6~0.8时,加入0.25mM的IPTG进行诱导,同时补加4~6g/L的乳糖用于2’-FL的合成。最终60h发酵结束后的发酵液离心去除菌体,得最终Strain1和Strain2的发酵上清液。取上清液5mL,过0.22μm的滤膜后,使用液相色谱的示差折光检测器进行2’-FL的产量检测,流动相为5mM硫酸,使用0.6ml/min流速,柱温50℃。
结果如图1所示,Strain1和Strain2最终的2’-FL产量分别为1.5g/L和2.81g/L,即使用futCB基因在2’-FL的生产中效果更好,因此以下均使用futCB进行2’-FL细胞工厂的构建。
实施例2
构建重组菌E.coli Jm109(DE3)wcaJ::futCB
1)合成wcaJ基因敲除所用的引物wcaJF和sgRNAR,
2)以质粒pTargetF为模板,采用引物wcaJR和sgRNAF进行PCR扩增得到线性化PCR产物,PCR的程序为95℃预变性15s,95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸15s,循环25次,经过DpnⅠ消化、磷酸化;T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌trans10感受态,挑取阳性转化子送测序,提取质粒命名为pTargetF-wcaj。
3)以大肠杆菌E.coli BL21的DNA为模板,利用引物FutCBF和FutCBR进行PCR扩增,PCR扩增的程序优选为95℃预变性15s,95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸32s,循环25次;得到2138bp的DNA片段,命名为fu tCB_T7_wcaj,琼脂糖凝胶电泳对得到的DNA片段进行纯化。经过测序,futCB_T7_wcaj核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示。
4)利用电转的方法将质粒pCas9转化至受体菌株Jm109(DE3)中,并涂布于含有壮观霉素(50μg/mL,下同)的固体LB培养基中,30℃过夜培养,得到转化子,提质粒验证,获得含有pCas9的重组菌,记为E.coli Jm109(pCas9)。
5)将E.coli Jm109(pCas9)接种到含有壮观霉素的LB液体培养基中,30℃过夜培养,接下来制备E.coli Jm109(pCas9)的电转感受态细胞,将步骤2)获得的重组质粒和步骤3)得到的DNA片段转入E.coli Jm109(pCas9)感受态细胞中,并涂布于含有氨苄青霉素(100μg/mL,下同)和壮观霉素的LB固体培养基,30℃过夜培养,得到转化子。
6)利用菌落PCR的方法,以FutCBF和FutCBR为引物进行PCR,将PCR产物纯化之后测序,筛选正确的wcaJ基因已经被替换为FutCB基因的Amp+Spec抗性基因的克隆。
7)将步骤6)得到的菌种接种到Amp+Spec抗性液体培养基中,37℃传代3次,除去pCas9质粒,将得到的菌株命名为突变体E.coli Jm109(wcaJ::futCB)。
实施例3
利用实施例2的重组菌E.coli Jm109(wcaJ::futCB)构建进一步重组菌Jm109(DE3)wcaJ::futCB△ZDK
1、敲除LacZ基因
1)合成LacZ基因敲除所用的引物:LacZF、sgRNAR、LacZ301F、LacZ301R、LacZ402F和LacZ402R
2)以质粒pTargetF为模板,采用引物LacZF和sgRNAR进行扩增,PCR的程序为95℃预变性15s;95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸15s,循环25次,得到线性化PCR产物,经过DpnⅠ消化、磷酸化;T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌trans10感受态,挑取阳性转化子送测序,对测序结果正确的进行质粒提取,命名为pTargetF-LacZ。
3)以大肠杆菌E.coli BL21的DNA为模板,分别用引物对LacZ301和LacZ402进行PCR扩增,PCR的程序为95℃预变性15s;95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸8s,循环25次,得到两个350bp左右的DNA片段LacZ301和LacZ402,琼脂糖凝胶电泳对得到的DNA片段进行纯化,再以两个纯化产物为模板,LacZ301F和LacZ402R为引物进行扩增,PCR的程序为95℃预变性15s,95℃变性30s,62℃退火30s,72℃延伸12s,循环25次,得到750bp左右的LacZ同源重组片段,琼脂糖凝胶电泳对得到的DNA片段进行纯化。经过测序,LacZ同源重组片段核苷酸序列为SEQ ID NO.23。
4)利用电转的方法将质粒pCas9转化至受体菌株E.coli Jm109(DE3)wcaJ::futCB中,并涂布于含有壮观霉素的固体LB培养基中,30℃过夜培养,得到转化子,提质粒验证,获得含有pCas9的重组菌,记为E.coli Jm109(DE3)wcaJ::futCB(pCas9)。
5)将E.coli Jm109(DE3)wcaJ::futCB(pCas9)接种到含有壮观霉素的LB液体培养基中,30℃过夜培养,接下来制备电转感受态细胞,将步骤1)和步骤2)获得的重组质粒和DNA片段转入E.coli Jm109(DE3)wcaJ::futCB(pCas9)感受态细胞中,并涂布于同时含有氨苄青霉素和壮观霉素的LB固体培养基,30℃过夜培养,得到转化子。
6)利用菌落PCR的方法,以LacZ301F和LacZ402R为引物进行PCR,将PCR产物纯化之后测序,筛选正确的LacZ基因已经被替为Amp+Spec抗性基因的克隆。
7)将步骤6)得到的菌种接种到Amp+Spec抗性液体培养基中,37℃传代3次,除去pCas9质粒,将得到的菌株命名为突变体E.coli Jm109(DE3)wcaJ::futCB△Z。
2、敲除nudD基因
与上述步骤1的方法基本相同,不同的是引物序列不同,以及如下:
利用nudD基因敲除引物得到的nudD同源重组片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.24。
抗性为Amp。所用转化受体菌株为上述步骤1得到的突变体E.coli Jm109(DE3)wcaJ::futCB△Z。利用菌落PCR的方法验证转化子,以nudD_501F、nudD_182R为引物,得到阳性克隆片段。将该阳性克隆送去测序,其为敲除E.coli Jm109(DE3)wcaJ::futCB△Z基因组上nudD基因得到的菌,将该菌种接种到LB液体培养基中,37℃传代三次,除去pCas9,将得到的菌株命名为突变体E.coli Jm109(DE3)wcaJ::futCB△ZD。
3、敲除nudK基因
与上述步骤1的方法基本相同,不同的是引物序列不同,以及如下:
利用nudK基因敲除引物得到的nudK同源重组片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.25,抗性为Amp。所用转化受体菌株为上述步骤2得到的突变体E.coli Jm109(DE3)wcaJ::futCB△ZD。利用菌落PCR的方法验证转化子,以nudK_501F、nudK_302R为引物,得到200bp的片段阳性克隆。将该阳性克隆送去测序,其为敲除E.coli Jm109(DE3)wcaJ::futCB△ZD基因组上nudK基因得到的菌,将该菌种接种到LB液体培养基中,37℃传代三次,除去pCas9,将得到的菌株命名为突变体E.coli Jm109(DE3)wcaJ::futCB△ZDK。
实施例4
manC、manB和gmD、wcaG表达载体构建
1)目的基因的获取
由于在大肠杆菌的基因组里,gmD和wcaG基因是连续的,因此可以同时获取这两个基因。
对于GW基因片段,即SEQ ID NO.1所示的DNA片段,以寡核苷酸GW-F(SEQ IDNO.26):5’-GTATAAGAAGGAGATATACAATGTCAAAAGTCGCTCTCATCACC-3’为正向引物,以GW-R(SEQ ID NO.27):5’-TTACCAGACTCGAGGGTACCTTACCCCCGAAAGCGGTCTT-3’为反向引物,以E.coli MG1655为模板,进行PCR反应,PCR的程序为95℃预变性15s,95℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸31s,循环25次,将PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳,GW片段的长度约为2090bp。
manC和manB基因也是连续的,也可以同时获取。由于没有成功通过PCR反应获得CB基因片段,交由华大基因科技有限公司合成。
对于CB基因片段,即SEQ ID NO.2所示的DNA片段,以寡核苷酸CB-F(SEQ IDNO.28):5’-ACTTTAATAAGGAGATATACATGGCGCAGTCGAAACTCTATC-3’为正向引物,CB-R(SEQ IDNO.29):5’-GCATTATGCGGCCGCAAGCTTTACTCGTTCAGCAACGTCAG-3’为反向引物,以E.coliMG1655为模板,CB片段的长度约为2952bp。
2)重组表达载体pRSFDuet-1-GW的构建
将质粒pRSFDuet-1用内切酶NdeⅠ和KpnⅠ进行双酶切反应,回收得到大小约为3829bp的DNA片段。
配制10μL连接体系:双酶切过的载体pRSFDuet-10.016pmols、GW基因片段0.032pmols、GibsonAssemble Master Mix(2×)连接液5μL,补加无菌水至10μL,载体与插入片段的摩尔比为1:2。轻轻混匀,于放入50℃水浴中孵育30min,即得到重组质粒,命名为重组质粒pRSFDuet-1-GW。反应结束立即放在冰上进行转化。
3)重组表达载体pRSFDuet-1-CB-GW的构建
将质粒pRSFDuet-1-GW用内切酶NcoⅠ和HindⅢ进行双酶切反应,回收得到大小约为5870bp的DNA片段。
配制10μL连接体系:双酶切过的载体pRSFDuet-1-GW 0.016pmols、CB基因片段0.032pmols、GibsonAssemble MasterMix(2×)连接液5μL,补加无菌水至10μL,载体与插入片段的摩尔比为1:2。轻轻混匀,于放入50℃水浴中孵育30min,即得到重组质粒,命名为重组质粒pRSFDuet-1-CB-GW(图2,简称pRS-GW-CB)。反应结束立即放在冰上进行转化。
4)验证
将上一步得到的重组质粒通过化学转化法转入top10感受态细胞,并涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基中,在37℃下孵育,固体培养基中长出单菌落,则证明载体构建成功。
实施例5
转化构建菌种
将pRSFDuet-1-CB-GW质粒化学转化于E.coli Jm109(DE3)wcaJ::futCB△ZDK中,步骤如下:
将感受态细胞置于冰上融化,取50μL感受态细胞于1.5mL无菌EP管中,加入目标片段后混合,然后在冰水浴中静置20~30min;静置完成,在42℃条件下对上述混合物进行60s热激;迅速放入冰水浴中,静置1~2min;加入450μL无抗生素的无菌LB液体培养基,混合均匀后水平放置EP管,在37℃、160r/min条件下振荡培养40min,使细菌复苏;复苏完毕后,吸取100μL菌液涂布在1‰卡那霉素的LB固体培养基上,在37℃下孵育,固体培养基中长出单菌落,则证明转化成功。
实施例6
设计5种不同的培养基进行相同的摇瓶培养,每瓶培养基分别50ml培养基,接种量均为1%,培养条件37℃转速200rpm,培养6小时,加入0.2mM IPTG诱导,降低培养温度至25℃,在诱导开始后的0、10、20、30小时分别加入0.2g乳糖作为底物。
培养基Ⅰ:KH2PO43 g/L,K2HPO412 g/L,(NH4)2SO45 g/L,MgSO4·7H2O 0.3g/L,CaCl2·2H2O 0.015g/L,NaCl 0.1g/L,甘油10g/L,FeSO4·7H2O 7.5g/L、柠檬酸钠100g/L,硫胺素7.5μg/L,金属离子液33ml/L.
培养基II:5.0g/L酵母提取物,10.0g/L色氨酸,17.1g/LNa2HPO4·12H2O,1.0g/L(NH4)2HPO4,3.0g/LKH2PO4,2.0g/LNH4Cl,2.0g/L柠檬酸钠,1.4g/LMgSO4·7H2O,10.0mg/L硫胺素,1.0mL/L金属离子液。
培养基Ⅲ:8.0g/L酵母提取物,12.0g/L色氨酸,1.0g/L柠檬酸,13.2g/LK2HPO4,9.3g/LKH2PO4,4.0g/L(NH4)2SO4,1.4g/LMgSO4·7H2O,10mg/L硫胺素,1mL金属离子液,另外添加20g/L甘油作为碳源。
培养基Ⅳ:5.0g/L酵母提取物,10.0g/L色氨酸,10.0g/LNaCl,20g/L甘油。
培养基Ⅴ:12.8g/L Na2HPO4·7H2O,3g/L KH2PO4,2g/L NH4Cl,0.5g/LNaCl,0.25g/LMgSO4·7H2O,14.7mg/L CaCl2·2H2O,,10mg/L硫胺素,2g/L酵母提取物,0.1%(v/v)Triton-X 100,1mL/L金属离子液。
培养结束后,使用高效液相色谱-示差折光检测器测定2’-岩藻糖基乳糖含量以计算产量,结果如图3所示,诱导40小时后,培养基II产量最高,其中2‘FL产量达到8.4g/L。
检测方法
采用高效液相色谱-示差折光检测器对产物2’-岩藻糖基乳糖进行定性分析。
首先,需要对样品进行预处理。取适量的发酵液,12000rpm,4℃离心10min后收集上清液,并配制2’-岩藻糖基乳糖标准溶液,将适度稀释后的样品上清液和标准溶液经过0.22μm微孔滤膜过滤后,得到的样品用于后续液相色谱分析。
HPLC采用SCIEX Triple QuadTM 5500LC-MS/MS高效液相色谱仪。色谱柱:ACQUITYUPLC BEN C181.7μm 2.1mm×50mm;检测器:示差折光检测器;流动相:溶液A(氨水10%(v/v)),溶液B(乙腈);流速:0.4mL/min;柱温:25℃;进样量:10μL。
实施例7发酵罐放大工艺
该发酵工艺显著提高了大肠杆菌的菌体浓度和2’-FL的单位滴度,包括:菌种活化、种子培养和补料分批发酵。
菌种活化:将冻存于液氮中保存有基因工程菌的甘油管放置于冰上缓慢解冻,划线于含有卡那霉素抗性的LB平板中,37℃培养24~36h,挑取平板中形态饱满,边缘光滑的单菌落,接种于预先装有5~10mL LB培养基(卡那霉素浓度为40~80μg/mL)的50mL试管,放入摇床35~37℃,200rpm转速下培养过夜,将此步获得的菌保存于25~30%甘油管中并建立发酵菌种库;
种子培养:将的活化后的菌液以1~5%的接种量接种于装有100mL LB培养基(卡那霉素浓度为40~80μg/mL)的500mL锥形瓶中,35~37℃,200rpm,培养8~9h,此步获得一级种子液。二级种子需要放大至50L发酵罐,装液LB培养基35L(卡那霉素浓度为40~80μg/mL),将一级种子按5~10%的接种量接种至二级种子罐,搅拌转速200~450rpm,通气1~1.5vvm,控制溶氧25~35%,待种子罐OD长至0.8~1.2,此时应处于对数生长后期,即可获得二级种子;
补料分批发酵:将培养结束的二级种子液以5~10%的接种量转种至含发酵培养基600L的1000L的发酵罐中,每隔2h取一次样检测OD600、菌体干湿重、2’-FL产量。其中发酵培养基的配方为5.0~7.0g/L酵母粉,7.0~10.0g/L胰蛋白胨,20~50g/L甘油,10~25g/LNa2HPO4·12H2O,1.0~2.0g/L(NH4)2HPO4,3.0~4.0g/LKH2PO4,1.0~2.5g/LNH4Cl,2.0~2.5g/L柠檬酸钠,0.5~1.0g/LMgSO4·7H2O,10.0mg/L硫胺素,40~80μg/mL卡那霉素,1mL/L的金属离子液。其中,培养的温度为30~37℃,初始转速为100rpm,通气1vvm,待溶氧降至30%以下缓慢提高转速和通气,通过溶氧与搅拌偶联控制发酵液的溶氧量为25~40%,发酵液的pH值通过氨水自控至6.8~7.2;在培养过程中,通过向发酵液补加补料培养基来控制基因工程菌的比生长速率在0.2~0.5之间。其中补料培养基的配方为600~800g/L甘油,10~30g/LMgSO4·7H2O,50~100g/L胰蛋白胨,10~20mL/L的微量元素溶液。待甘油消耗完之后,OD600约为20~25,以2.0~4.0g/L/h的速率补入补料培养基,控制大肠杆菌的比生长速率不低于0.2。与此同时,培养温度降低至25℃,加入45g IPTG进行诱导,诱导后继续培养60小时,其中每隔4h补加4800g的乳糖。结束发酵后测量OD及产物,此时的OD达到120,2’-FL的产量可达85g/L。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述,但它仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部实施例,人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例,这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (8)
1.一株产2’-岩藻糖基乳糖的工程菌的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)利用futCB基因替换大肠杆菌Jm109(DE3)基因组中的wcaJ基因,并敲除LacZ、nudD和nudK基因,得E.Coli.Jm109(DE3)::futCBΔZDK;所述futCB基因的NCBI ACCESSION : WP_002174293.1;
(2)利用重组载体转化步骤(1)所述E.Coli.Jm109(DE3)::futCBΔZDK,得重组工程菌;
所述重组载体以pRSFDuet-1为基础载体,并插入GW基因片段和CB基因片段,所述GW基因片的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,CB基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;将GW基因片段插入pRSFDuet-1的Nde I和Kpn I之间,将CB基因片段插入pRSFDuet-1的Nco I和Hind III之间。
2.根据权利要求1所述构建方法,其特征在于,步骤(1)中利用futCB基因替换大肠杆菌Jm109(DE3)基因组中的wcaJ基因的方法,包括:①以质粒pTargetF为模板,采用引物wcaJF和sgRNAR进行PCR扩增得到线性化PCR产物,经过DpnⅠ消化和磷酸化后,利用T4DNA连接酶进行连接,转化大肠杆菌trans10感受态,得阳性质粒pTargetF-wcaj;其中wcaJF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,sgRNAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;
②以大肠杆菌E.coli BL21的DNA为模板,利用FutCBF和FutCBR进行PCR扩增,得futCB_T7_wcaj;FutCBF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示,FutCBR的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示;所述futCB_T7_wcaj的核苷酸序列如SEQ ID No.22所示;
③将质粒pCas9转化至受体菌株Jm109 (DE3)中,并涂布于含有壮观霉素的固体LB培养基中,30℃过夜培养,得到转化子,提质粒获得含有pCas9的重组菌E.coli Jm109 (pCas9);
④将阳性质粒pTargetF-wcaj和futCB_T7_wcaj转入E.coli Jm109 (pCas9) 的感受态细胞中,并涂布于含有氨苄青霉素和壮观霉素的LB固体培养基,30℃过夜培养,得到转化子;
⑤以FutCBF和FutCBR为引物,对步骤④得到的转化子进行菌液PCR,测序后筛选正确的wcaJ基因已经被替换为futCB 基因的Amp+Spec抗性基因的单克隆;
⑥将步骤⑤得到的单克隆接种到Amp+Spec抗性液体培养基中,传代3次,除去pCas9质粒,得到的菌株为突变体E.coli Jm109 (wcaJ::futCB)。
3.根据权利要求1所述构建方法,其特征在于,步骤(1)中敲除LacZ基因所用的引物包括LacZF、sgRNAR、LacZ301F、LacZ301R、LacZ402F和LacZ402R,其中LacZF的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示,sgRNAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示,LacZ301F的核苷酸序列如SEQID NO.8所示,LacZ301R的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示,LacZ402F的核苷酸序列如SEQID NO.10所示,LacZ402R的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
4.根据权利要求1所述构建方法,其特征在于,步骤(1)中敲除nudD基因所用的引物包括nudDF、sgRNAR、nudD_501F、nudD_501R、nudD_182F和nudD_182R,其中nudDF的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示,sgRNAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示,nudD_501F的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示,nudD_501R的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示,nudD_182F的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示,nudD_182R的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。
5.根据权利要求1所述构建方法,其特征在于,步骤(1)中敲除nudK基因所用的引物包括nudKF、sgRNAR、nudK_501F、nudK_501R、nudK_302F和nudK_302R,其中nudKF的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示,sgRNAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示,nudK_501F的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示,nudK_501R的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示,nudK_302F的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示,nudK_302R的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。
6.利用权利要求1~5任一项所述构建方法得到的重组工程菌。
7.权利要求6所述重组工程菌在生产2’-岩藻糖基乳糖中的应用。
8.一种生产2’-岩藻糖基乳糖的方法,包括将权利要求6所述重组工程菌接种到发酵培养液中,以乳糖为底物,在IPTG诱导下,发酵液中包含所述2’-岩藻糖基乳糖。
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2022
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