CN116042682B - 一株产2’-岩藻糖基乳糖的工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

一株产2’-岩藻糖基乳糖的工程菌及其构建方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116042682B
CN116042682B CN202211653612.1A CN202211653612A CN116042682B CN 116042682 B CN116042682 B CN 116042682B CN 202211653612 A CN202211653612 A CN 202211653612A CN 116042682 B CN116042682 B CN 116042682B
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
nucleotide sequence
gene
futcb
wcaj
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202211653612.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN116042682A (zh
Inventor
朱天择
刘珞
季立豪
高苗苗
李柚西
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zeno Suzhou Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Zeno Suzhou Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zeno Suzhou Biotechnology Co ltd filed Critical Zeno Suzhou Biotechnology Co ltd
Priority to CN202211653612.1A priority Critical patent/CN116042682B/zh
Publication of CN116042682A publication Critical patent/CN116042682A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN116042682B publication Critical patent/CN116042682B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
    • C12N9/2471—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01069—Galactoside 2-alpha-L-fucosyltransferase (2.4.1.69)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01023—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一株产2’‑岩藻糖基乳糖的工程菌及其构建方法和应用。本发明提供了一株产2’‑岩藻糖基乳糖的工程菌的构建方法，构建了一条高效的2’‑岩藻糖基乳糖合成路线，利用从头合成途径合成足够多的GDP‑L‑岩藻糖。然后对染色体基因wcaj、nudD和nudK进行基因敲除，并在wcaj位点插入futCB基因，futCB酶催化GDP‑L‑岩藻糖合成2’‑岩藻糖基乳糖的活性非常高，可大量提高2’‑岩藻糖基乳糖的产量。经验证，摇瓶产量达到8.4g/L，上罐发酵产量达到85g/L，实现2’‑岩藻糖基乳糖的大量生产。

Description

一株产2’-岩藻糖基乳糖的工程菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一株产2’-岩藻糖基乳糖的工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
母乳低聚糖(human milkoligosaccharides，HMOs)是母乳中仅次于乳糖和脂肪的第三大营养物质，在母乳中的含量约为15％。现有的研究表明，母乳低聚糖对新生儿有许多重要的影响，实际生活中，常常出现不能使用母乳进行喂养的情况，此时一般会使用婴儿配方奶粉进行替代。目前，美国食品和药物管理局(FDA)和欧洲食品安全局(EFSA)正式批准将母乳低聚糖用作婴儿配方奶粉中的新型食品添加剂。因此，工业合成2’-岩藻糖基乳糖(2‘FL)并提高产量降低生产成本已经成为目前的研究热点。
现有的工业生物合成2’-岩藻糖基乳糖的方法以大肠杆菌作为工程菌，在提供碳源的前提下，利用大肠杆菌内的基因通路，合成2’-岩藻糖基乳糖的前体物质GDP-L-岩藻糖和受体乳糖，并且向工程菌中转入外源的α-1,2-岩藻糖基转移酶，将两个前体结合，从而工业合成2’-岩藻糖基乳糖。生物合成法需要供体GDP-l-focus、受体乳糖和α-1,2-focusyltransferase(FT)的持续供应。其中，乳糖作为一种低廉的底物，一般可以被野生型生产者自身同化和降解，这会导致工程菌的乳糖利用率下降。
GDP-L-岩藻糖是合成2’-岩藻糖基乳糖的关键前体，可以通过两种途径合成。一种是源自colanic acid生物合成的大肠杆菌中自然存在的途径。从中枢代谢中的果糖6-磷酸开始，通过5个酶促步骤(ManA、ManB、ManC、Gmd、WcaG)转化为GDP-L-岩藻糖。另一个是最初来源于真核细胞的补救途径，这需要昂贵的L-focuse作为底物和来自fragilis(B.fragilis)的催化酶Fkp来产生GDP-L-岩藻糖。出于成本考虑，一般选用从头合成途径合成GDP-L-岩藻糖。假如参与可拉酸生物合成的wcaj基因失活，或者阳性调控基因RcsA过表达，均可以增加细胞内的GDP-L-岩藻糖的量，但这一途径中某些中间产物(如GDP-甘露糖)的缺乏，仍可能降低GDP-L-岩藻糖的合成量。由于GDP-L-岩藻糖是合成2’-岩藻糖基乳糖重要的前体物质，如何让合成途径中GDP-L-岩藻糖的量增多是现阶段要解决的技术难点。
发明内容
本发明的目的在于提供一株产2’-岩藻糖基乳糖的工程菌及其构建方法和应用，利用从头合成途径合成足够多的GDP-L-岩藻糖，实现2’-岩藻糖基乳糖的大量生产。
本发明提供了一株产2’-岩藻糖基乳糖的工程菌的构建方法，包括以下步骤：
(1)利用futCB基因替换大肠杆菌Jm109(DE3)基因组中的wcaJ基因，并敲除LacZ、nudD和nudK基因，得E.Coli.Jm109(DE3)：：futCBΔZDK；
(2)利用重组载体转化步骤(1)所述E.Coli.Jm109(DE3)：：futCBΔZDK，得重组工程菌；
所述重组载体以pRSFDuet-1为基础载体，并插入GW基因片段和CB基因片段，所述GW基因片的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，CB基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的，步骤(1)中，敲除wcaJ基因所用的引物包括wcaJF和sgRNAR，其中wcaJF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，sgRNAR的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；
扩增futCB基因所用的引物包括FutCBF和FutCBR，其中FutCBF的核苷酸序列如SEQID NO.5所示，FutCBR的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
优选的，步骤(1)中利用futCB基因替换大肠杆菌Jm109(DE3)基因组中的wcaJ基因的方法，包括：①以质粒pTargetF为模板，采用引物wcaJR和sgRNAF进行PCR扩增得到线性化PCR产物，经过DpnⅠ消化和磷酸化后，利用T4DNA连接酶进行连接，转化大肠杆菌trans10感受态，得阳性质粒pTargetF-wcaj；
②以大肠杆菌E.coliBL2的DNA为模板，利用FutCBF和FutCBR进行PCR扩增，得futCB_T7_wcaj；
③将质粒pCas9转化至受体菌株Jm109(DE3)中，并涂布于含有壮观霉素的固体LB培养基中，30℃过夜培养，得到转化子，提质粒获得含有pCas9的重组菌E.coli Jm109(pCas9)；
④将阳性质粒pTargetF-wcaj和futCB_T7_wcaj转入E.coli Jm109(pCas9)的感受态细胞中，并涂布于含有氨苄青霉素和壮观霉素的LB固体培养基，30℃过夜培养，得到转化子；
⑤以FutCBF和FutCBR为引物，对步骤④得到的转化子进行菌液PCR，测序后筛选正确的wcaJ基因已经被替换为futCB基因的Amp+Spec抗性基因的单克隆；
⑥将步骤⑤得到的单克隆接种到Amp+Spec抗性液体培养基中，传代3次，除去pCas9质粒，得到的菌株为突变体E.coli Jm109(wcaJ::futCB)。
优选的，步骤(1)中敲除LacZ基因所用的引物包括LacZF、sgRNAR、LacZ301F、LacZ301R、LacZ402F和LacZ402R，其中LacZF的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，sgRNAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，LacZ301F的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，LacZ301R的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，LacZ402F的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，LacZ402R的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
优选的，步骤(1)中敲除nudD基因所用的引物包括nudDF、sgRNAR、nudD_501F、nudD_501R、nudD_182F和nudD_182R，其中nudDF的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，sgRNAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，nudD_501F的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，nudD_501R的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，nudD_182F的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，nudD_182R的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。
优选的，步骤(1)中敲除nudK基因所用的引物包括nudKF、sgRNAR、nudK_501F、nudK_501R、nudK_302F和nudK_302R，其中nudKF的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，sgRNAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，nudK_501F的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，nudK_501R的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，nudK_302F的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，nudK_302R的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。
优选的，步骤(2)中将GW基因片段插入pRSFDuet-1的Nde I和Kpn I之间，将CB基因片段插入pRSFDuet-1的Nco I和Hind III之间。
本发明还提供了利用上述构建方法得到的重组工程菌。
本发明还提供了上述重组工程菌在生产2’-岩藻糖基乳糖中的应用。
本发明还提供了一种生产2’-岩藻糖基乳糖的方法，包括将上述重组工程菌接种到发酵培养液中，以乳糖为底物，在IPTG诱导下，发酵液中包含所述2’-岩藻糖基乳糖。
有益效果：本发明提供选用了一株产2’-岩藻糖基乳糖的工程菌的构建方法，构建了一条高效的2’-岩藻糖基乳糖合成路线，利用从头合成途径合成足够多的GDP-L-岩藻糖。然后对染色体基因wcaj、nudD和nudK进行基因敲除，并在wcaj位点插入futCB基因，futCB酶催化GDP-L-岩藻糖合成2’-岩藻糖基乳糖的活性非常高，可大量提高2’-岩藻糖基乳糖的产量。此外，一对异源阳性调控因子RcsA和RcsB可以增强ManA、ManB、ManC、Gmd、WcaG的表达量从而促进GDP-L-岩藻糖的形成，最终实现2’-岩藻糖基乳糖的大量生产，摇瓶产量达到8.4g/L，上罐发酵产量达到85g/L。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例中Strain1(E.coli Jm109(DE3-pETDuet-1-futC)和Strain2(E.coliJm109(DE3-pETDuet-1-futCB)的发酵最终产量对比结果；
图2为实施例中构建的pRSFDuet-1-CB-GW载体图谱，第50-3001位核苷酸为GW基因序列，第3117-5246位核苷酸为CB基因序列；
图3为本发明构建重组工程菌在不同培养基中进行摇瓶发酵培养得到的2’-岩藻糖基乳糖产量对比图。
具体实施方式
本发明提供了一株产2’-岩藻糖基乳糖的工程菌的构建方法，包括以下步骤：
(1)利用futCB基因替换大肠杆菌Jm109(DE3)基因组中的wcaJ基因，并敲除LacZ、nudD和nudK基因，得E.Coli.Jm109(DE3)：：futCBΔZDK；
(2)利用重组载体转化步骤(1)所述E.Coli.Jm109(DE3)：：futCBΔZDK，得重组工程菌；
所述重组载体以pRSFDuet-1为基础载体，并插入GW基因片段和CB基因片段，所述GW基因片的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，CB基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的步骤(1)中，敲除wcaJ基因(NCBIACCESSION:NC_000913.3)所用的引物优选包括wcaJF和sgRNAR，其中wcaJF的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，sgRNAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；扩增futCB基因(NCBI ACCESSION:WP_002174293.1)所用的引物包括FutCBF和FutCBR，其中FutCBF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，FutCBR的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。具体序列如下：
wcaJF：tcctaggtataatactagtgtcagcacattgataaactggttttagagctagaaatagc；
sgRNAR：actagtattatacctaggactgagctagctgtcaag；
FutCBF：ccaacacagccaaacatccgcgc；
FutCBR：ggcatcgttcccactgcgatgc。
本发明利用futCB基因替换大肠杆菌Jm109(DE3)基因组中的wcaJ基因的方法，优选包括：①以质粒pTargetF(源自Jiang et al.,Appl Environ Microbiol,2015,81:2506-2514)为模板，采用引物wcaJR和sgRNAF进行PCR扩增得到线性化PCR产物，经过DpnⅠ消化和磷酸化后，利用T4DNA连接酶进行连接，转化大肠杆菌trans10感受态，得阳性质粒pTargetF-wcaj；
②以大肠杆菌E.coliBL2的DNA为模板，利用FutCBF和FutCBR进行PCR扩增，得futCB_T7_wcaj；
③将质粒pCas9转化至受体菌株Jm109(DE3)中，并涂布于含有壮观霉素的固体LB培养基中，30℃过夜培养，得到转化子，提质粒获得含有pCas9的重组菌E.coli Jm109(pCas9)；
④将阳性质粒pTargetF-wcaj和futCB_T7_wcaj转入E.coli Jm109(pCas9)的感受态细胞中，并涂布于含有氨苄青霉素和壮观霉素的LB固体培养基，30℃过夜培养，得到转化子；
⑤以FutCBF和FutCBR为引物，对步骤④得到的转化子进行菌液PCR，测序后筛选正确的wcaJ基因已经被替换为futCB基因的Amp+Spec抗性基因的单克隆；
⑥将步骤⑤得到的单克隆接种到Amp+Spec抗性液体培养基中，37℃传代3次，除去pCas9质粒，得到的菌株为突变体E.coli Jm109(wcaJ::futCB)。
本发明步骤①中，所述PCR扩增的程序优选为95℃预变性15s；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸15s，循环25次；步骤②中所述PCR扩增的程序优选为95℃预变性15s；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，循环25次；步骤⑤中所述菌液PCR所用的引物对优选为FutCBF和FutCBR，其PCR程序与上相同，在此不再赘述。
本发明敲除LacZ基因所用的引物，优选包括LacZF、sgRNAR、LacZ301F、LacZ301R、LacZ402F和LacZ402R，其中LacZF的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，sgRNAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，LacZ301F的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，LacZ301R的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，LacZ402F的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，LacZ402R的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；敲除nudD基因所用的引物包括nudDF、sgRNAR、nudD_501F、nudD_501R、nudD_182F和nudD_182R，其中nudDF的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，sgRNAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，nudD_501F的核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示，nudD_501R的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，nudD_182F的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，nudD_182R的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；敲除nudK基因所用的引物包括nudKF、sgRNAR、nudK_501F、nudK_501R、nudK_302F和nudK_302R，其中nudKF的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，sgRNAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，nudK_501F的核苷酸序列如SEQ IDNO.18所示，nudK_501R的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，nudK_302F的核苷酸序列如SEQ IDNO.20所示，nudK_302R的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。本发明敲除基因所用的引物信息如下：
LacZF：TCCTAGGTATAATACTAGTGAGTGTGATCATCTGGTCGCGTTTT AGAGCTAGAAATAGC；
sgRNAR：actagtattatacctaggactgagctagctgtcaag；
LacZ301F:acgcgaaatacgggcagaca；
LacZ301R:ctacgtctgaacgtcgggtctgcgctgcggg；
LacZ402F:cgacgttcagacgtagtgtgacg；
LacZ402R:gccaggacagtcgtttgcc；
nudDF：tcctaggtataatactagtaccgagcaccacatagtgaggttttagagctagaaatagc；
nudD501_F:TTATCGACGTTATGCAGTCC；
nudD501_R:AAATACTGGTCTACGGCATTA；
nudD502_F:CGTAGACCAGTATTTCCGAAAGCGGTCTTGATT；
nudD502_R:AATCATACAACCGCCAGTAC；
nudKF：tcctaggtataatactagtaccgagcaccacatagtgaggttttagagctagaaatagc；
nudK501_F01:GGTGATTGCCTTCCCTTCCTGA；
nudK501_R01:TGGCTCAATCCGACAAATCCG；
nudK502_F01:TTGTCGGATTGAGCCACAGCGCGAAATGAACAAT；
nudK502_R01:AGAAAGAAGTGAAGAACGCCCG。
本发明步骤(2)中，优选将GW基因片段插入pRSFDuet-1的Nde I和Kpn I之间，将CB基因片段插入pRSFDuet-1的Nco I和Hind III之间，构建得到重组载体pRSFDuet-1-CB-GW。
本发明对步骤(2)中所述转化的方法并没有特殊限定，实施例中以化学转化为例进行说明，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。
本发明还提供了利用上述构建方法得到的重组工程菌。
本发明还提供了上述重组工程菌在生产2’-岩藻糖基乳糖中的应用。
本发明还提供了一种生产2’-岩藻糖基乳糖的方法，包括将上述重组工程菌接种到发酵培养液中，以乳糖为底物，在IPTG诱导下，发酵液中包含所述2’-岩藻糖基乳糖。
本发明所述发酵培养基优选包括以下浓度的成分：5.0～7.0g/L酵母粉，7.0～10.0g/L胰蛋白胨，20～50g/L甘油，10～25g/LNa2HPO4·12H2O，1.0～2.0g/L(NH4)2HPO4，3.0～4.0g/L KH2PO4，1.0～2.5g/LNH4Cl，2.0～2.5g/L柠檬酸钠，0.5～1.0g/L MgSO4·7H2O，10.0mg/L硫胺素，40～80μg/mL卡那霉素，1mL/L的金属离子液，其中金属离子液的成分为：25.0g/L FeCl3·6H2O，2.3g/LCaCl2·2H2O，2.6g/L ZnCl2，2.0g/L CuSO4·5H2O，2.5g/LMnSO4·H2O，2.6g/LNa2MoO4·2H2O和0.7g/L H3BO3，pH 6.9.。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一株产2’-岩藻糖基乳糖的工程菌及其构建方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
α-1,2-岩藻糖基转移酶(α-1,2-FT)的筛选
为了提高α-1,2-岩藻糖基转移酶(α-1,2-FT)体内催化效率及蛋白表达，本发明筛选了两种不同来源的α-1,2-FT，分别为幽门螺旋杆菌来源的futC(NCBI ACCESSION:EF452503.1)和枯草芽孢杆菌来源的futCB(NCBI ACCESSION:WP_002174293.1)，并整合至pETDuet-1载体的HindⅢ和NdeⅠ之间，并转化至E.coli Jm109(DE3)感受态，构建获得Strain1(E.coli Jm109(DE3-pETDuet-1-futC)和Strain2(E.coli Jm109(DE3-pETDuet-1-futCB)，以上基因合成的相关工作由北京擎科生物科技有限公司(www.tsingke.net/)完成。
将Strain1和Strain2的甘油菌划线至氨苄抗性的LB平板(氨苄抗性的工作浓度为100μg/mL)37℃培养24h活化，挑取活化后形态饱满的单菌落至含有LB液体培养基的试管(装液量5mL)，37℃，200rpm，摇床培养16h，至OD600>1.2，即可以1％的转接量转接至一级种子瓶(250mL的锥形瓶装有50mL的LB液体培养基)，37℃，200rpm，摇床培养8h，至OD600约为1.0，即可转接至发酵培养基(250mL的锥形瓶装有50mL的LB液体培养基)，37℃，200rpm培养60h，待OD600＝0.6～0.8时，加入0.25mM的IPTG进行诱导，同时补加4～6g/L的乳糖用于2’-FL的合成。最终60h发酵结束后的发酵液离心去除菌体，得最终Strain1和Strain2的发酵上清液。取上清液5mL，过0.22μm的滤膜后，使用液相色谱的示差折光检测器进行2’-FL的产量检测，流动相为5mM硫酸，使用0.6ml/min流速，柱温50℃。
结果如图1所示，Strain1和Strain2最终的2’-FL产量分别为1.5g/L和2.81g/L，即使用futCB基因在2’-FL的生产中效果更好，因此以下均使用futCB进行2’-FL细胞工厂的构建。
实施例2
构建重组菌E.coli Jm109(DE3)wcaJ::futCB
1)合成wcaJ基因敲除所用的引物wcaJF和sgRNAR，
2)以质粒pTargetF为模板，采用引物wcaJR和sgRNAF进行PCR扩增得到线性化PCR产物，PCR的程序为95℃预变性15s，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸15s，循环25次，经过DpnⅠ消化、磷酸化；T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌trans10感受态，挑取阳性转化子送测序，提取质粒命名为pTargetF-wcaj。
3)以大肠杆菌E.coli BL21的DNA为模板，利用引物FutCBF和FutCBR进行PCR扩增，PCR扩增的程序优选为95℃预变性15s，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸32s，循环25次；得到2138bp的DNA片段，命名为fu tCB_T7_wcaj，琼脂糖凝胶电泳对得到的DNA片段进行纯化。经过测序，futCB_T7_wcaj核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示。
4)利用电转的方法将质粒pCas9转化至受体菌株Jm109(DE3)中，并涂布于含有壮观霉素(50μg/mL，下同)的固体LB培养基中，30℃过夜培养，得到转化子，提质粒验证，获得含有pCas9的重组菌，记为E.coli Jm109(pCas9)。
5)将E.coli Jm109(pCas9)接种到含有壮观霉素的LB液体培养基中，30℃过夜培养，接下来制备E.coli Jm109(pCas9)的电转感受态细胞，将步骤2)获得的重组质粒和步骤3)得到的DNA片段转入E.coli Jm109(pCas9)感受态细胞中，并涂布于含有氨苄青霉素(100μg/mL，下同)和壮观霉素的LB固体培养基，30℃过夜培养，得到转化子。
6)利用菌落PCR的方法，以FutCBF和FutCBR为引物进行PCR，将PCR产物纯化之后测序，筛选正确的wcaJ基因已经被替换为FutCB基因的Amp+Spec抗性基因的克隆。
7)将步骤6)得到的菌种接种到Amp+Spec抗性液体培养基中，37℃传代3次，除去pCas9质粒，将得到的菌株命名为突变体E.coli Jm109(wcaJ::futCB)。
实施例3
利用实施例2的重组菌E.coli Jm109(wcaJ::futCB)构建进一步重组菌Jm109(DE3)wcaJ::futCB△ZDK
1、敲除LacZ基因
1)合成LacZ基因敲除所用的引物：LacZF、sgRNAR、LacZ301F、LacZ301R、LacZ402F和LacZ402R
2)以质粒pTargetF为模板，采用引物LacZF和sgRNAR进行扩增，PCR的程序为95℃预变性15s；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸15s，循环25次，得到线性化PCR产物，经过DpnⅠ消化、磷酸化；T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌trans10感受态，挑取阳性转化子送测序，对测序结果正确的进行质粒提取，命名为pTargetF-LacZ。
3)以大肠杆菌E.coli BL21的DNA为模板，分别用引物对LacZ301和LacZ402进行PCR扩增，PCR的程序为95℃预变性15s；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸8s，循环25次，得到两个350bp左右的DNA片段LacZ301和LacZ402，琼脂糖凝胶电泳对得到的DNA片段进行纯化，再以两个纯化产物为模板，LacZ301F和LacZ402R为引物进行扩增，PCR的程序为95℃预变性15s，95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸12s，循环25次，得到750bp左右的LacZ同源重组片段，琼脂糖凝胶电泳对得到的DNA片段进行纯化。经过测序，LacZ同源重组片段核苷酸序列为SEQ ID NO.23。
4)利用电转的方法将质粒pCas9转化至受体菌株E.coli Jm109(DE3)wcaJ::futCB中，并涂布于含有壮观霉素的固体LB培养基中，30℃过夜培养，得到转化子，提质粒验证，获得含有pCas9的重组菌，记为E.coli Jm109(DE3)wcaJ::futCB(pCas9)。
5)将E.coli Jm109(DE3)wcaJ::futCB(pCas9)接种到含有壮观霉素的LB液体培养基中，30℃过夜培养，接下来制备电转感受态细胞，将步骤1)和步骤2)获得的重组质粒和DNA片段转入E.coli Jm109(DE3)wcaJ::futCB(pCas9)感受态细胞中，并涂布于同时含有氨苄青霉素和壮观霉素的LB固体培养基，30℃过夜培养，得到转化子。
6)利用菌落PCR的方法，以LacZ301F和LacZ402R为引物进行PCR，将PCR产物纯化之后测序，筛选正确的LacZ基因已经被替为Amp+Spec抗性基因的克隆。
7)将步骤6)得到的菌种接种到Amp+Spec抗性液体培养基中，37℃传代3次，除去pCas9质粒，将得到的菌株命名为突变体E.coli Jm109(DE3)wcaJ::futCB△Z。
2、敲除nudD基因
与上述步骤1的方法基本相同，不同的是引物序列不同，以及如下：
利用nudD基因敲除引物得到的nudD同源重组片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.24。
抗性为Amp。所用转化受体菌株为上述步骤1得到的突变体E.coli Jm109(DE3)wcaJ::futCB△Z。利用菌落PCR的方法验证转化子，以nudD_501F、nudD_182R为引物，得到阳性克隆片段。将该阳性克隆送去测序，其为敲除E.coli Jm109(DE3)wcaJ::futCB△Z基因组上nudD基因得到的菌，将该菌种接种到LB液体培养基中，37℃传代三次，除去pCas9，将得到的菌株命名为突变体E.coli Jm109(DE3)wcaJ::futCB△ZD。
3、敲除nudK基因
与上述步骤1的方法基本相同，不同的是引物序列不同，以及如下：
利用nudK基因敲除引物得到的nudK同源重组片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.25，抗性为Amp。所用转化受体菌株为上述步骤2得到的突变体E.coli Jm109(DE3)wcaJ::futCB△ZD。利用菌落PCR的方法验证转化子，以nudK_501F、nudK_302R为引物，得到200bp的片段阳性克隆。将该阳性克隆送去测序，其为敲除E.coli Jm109(DE3)wcaJ::futCB△ZD基因组上nudK基因得到的菌，将该菌种接种到LB液体培养基中，37℃传代三次，除去pCas9，将得到的菌株命名为突变体E.coli Jm109(DE3)wcaJ::futCB△ZDK。
实施例4
manC、manB和gmD、wcaG表达载体构建
1)目的基因的获取
由于在大肠杆菌的基因组里，gmD和wcaG基因是连续的，因此可以同时获取这两个基因。
对于GW基因片段，即SEQ ID NO.1所示的DNA片段，以寡核苷酸GW-F(SEQ IDNO.26)：5’-GTATAAGAAGGAGATATACAATGTCAAAAGTCGCTCTCATCACC-3’为正向引物，以GW-R(SEQ ID NO.27)：5’-TTACCAGACTCGAGGGTACCTTACCCCCGAAAGCGGTCTT-3’为反向引物，以E.coli MG1655为模板，进行PCR反应，PCR的程序为95℃预变性15s，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸31s，循环25次，将PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，GW片段的长度约为2090bp。
manC和manB基因也是连续的，也可以同时获取。由于没有成功通过PCR反应获得CB基因片段，交由华大基因科技有限公司合成。
对于CB基因片段，即SEQ ID NO.2所示的DNA片段，以寡核苷酸CB-F(SEQ IDNO.28)：5’-ACTTTAATAAGGAGATATACATGGCGCAGTCGAAACTCTATC-3’为正向引物，CB-R(SEQ IDNO.29)：5’-GCATTATGCGGCCGCAAGCTTTACTCGTTCAGCAACGTCAG-3’为反向引物，以E.coliMG1655为模板，CB片段的长度约为2952bp。
2)重组表达载体pRSFDuet-1-GW的构建
将质粒pRSFDuet-1用内切酶NdeⅠ和KpnⅠ进行双酶切反应，回收得到大小约为3829bp的DNA片段。
配制10μL连接体系：双酶切过的载体pRSFDuet-10.016pmols、GW基因片段0.032pmols、GibsonAssemble Master Mix(2×)连接液5μL，补加无菌水至10μL，载体与插入片段的摩尔比为1:2。轻轻混匀，于放入50℃水浴中孵育30min，即得到重组质粒，命名为重组质粒pRSFDuet-1-GW。反应结束立即放在冰上进行转化。
3)重组表达载体pRSFDuet-1-CB-GW的构建
将质粒pRSFDuet-1-GW用内切酶NcoⅠ和HindⅢ进行双酶切反应，回收得到大小约为5870bp的DNA片段。
配制10μL连接体系：双酶切过的载体pRSFDuet-1-GW 0.016pmols、CB基因片段0.032pmols、GibsonAssemble MasterMix(2×)连接液5μL，补加无菌水至10μL，载体与插入片段的摩尔比为1:2。轻轻混匀，于放入50℃水浴中孵育30min，即得到重组质粒，命名为重组质粒pRSFDuet-1-CB-GW(图2，简称pRS-GW-CB)。反应结束立即放在冰上进行转化。
4)验证
将上一步得到的重组质粒通过化学转化法转入top10感受态细胞，并涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基中，在37℃下孵育，固体培养基中长出单菌落，则证明载体构建成功。
实施例5
转化构建菌种
将pRSFDuet-1-CB-GW质粒化学转化于E.coli Jm109(DE3)wcaJ::futCB△ZDK中，步骤如下：
将感受态细胞置于冰上融化，取50μL感受态细胞于1.5mL无菌EP管中，加入目标片段后混合，然后在冰水浴中静置20～30min；静置完成，在42℃条件下对上述混合物进行60s热激；迅速放入冰水浴中，静置1～2min；加入450μL无抗生素的无菌LB液体培养基，混合均匀后水平放置EP管，在37℃、160r/min条件下振荡培养40min，使细菌复苏；复苏完毕后，吸取100μL菌液涂布在1‰卡那霉素的LB固体培养基上，在37℃下孵育，固体培养基中长出单菌落，则证明转化成功。
实施例6
设计5种不同的培养基进行相同的摇瓶培养，每瓶培养基分别50ml培养基，接种量均为1％，培养条件37℃转速200rpm，培养6小时，加入0.2mM IPTG诱导，降低培养温度至25℃，在诱导开始后的0、10、20、30小时分别加入0.2g乳糖作为底物。
培养基Ⅰ：KH2PO43 g/L，K2HPO412 g/L，(NH4)2SO45 g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，CaCl2·2H2O 0.015g/L，NaCl 0.1g/L，甘油10g/L，FeSO4·7H2O 7.5g/L、柠檬酸钠100g/L，硫胺素7.5μg/L，金属离子液33ml/L.
培养基II：5.0g/L酵母提取物，10.0g/L色氨酸，17.1g/LNa2HPO4·12H2O，1.0g/L(NH4)2HPO4，3.0g/LKH2PO4，2.0g/LNH4Cl，2.0g/L柠檬酸钠，1.4g/LMgSO4·7H2O，10.0mg/L硫胺素，1.0mL/L金属离子液。
培养基Ⅲ：8.0g/L酵母提取物，12.0g/L色氨酸，1.0g/L柠檬酸，13.2g/LK2HPO4，9.3g/LKH2PO4，4.0g/L(NH4)2SO4，1.4g/LMgSO4·7H2O，10mg/L硫胺素，1mL金属离子液，另外添加20g/L甘油作为碳源。
培养基Ⅳ：5.0g/L酵母提取物，10.0g/L色氨酸，10.0g/LNaCl，20g/L甘油。
培养基Ⅴ：12.8g/L Na2HPO4·7H2O，3g/L KH2PO4，2g/L NH4Cl，0.5g/LNaCl，0.25g/LMgSO4·7H2O，14.7mg/L CaCl2·2H2O,，10mg/L硫胺素，2g/L酵母提取物，0.1％(v/v)Triton-X 100，1mL/L金属离子液。
培养结束后，使用高效液相色谱-示差折光检测器测定2’-岩藻糖基乳糖含量以计算产量，结果如图3所示，诱导40小时后，培养基II产量最高，其中2‘FL产量达到8.4g/L。
检测方法
采用高效液相色谱-示差折光检测器对产物2’-岩藻糖基乳糖进行定性分析。
首先，需要对样品进行预处理。取适量的发酵液，12000rpm，4℃离心10min后收集上清液，并配制2’-岩藻糖基乳糖标准溶液，将适度稀释后的样品上清液和标准溶液经过0.22μm微孔滤膜过滤后，得到的样品用于后续液相色谱分析。
HPLC采用SCIEX Triple QuadTM 5500LC-MS/MS高效液相色谱仪。色谱柱：ACQUITYUPLC BEN C181.7μm 2.1mm×50mm；检测器：示差折光检测器；流动相：溶液A(氨水10％(v/v))，溶液B(乙腈)；流速：0.4mL/min；柱温：25℃；进样量：10μL。
实施例7发酵罐放大工艺
该发酵工艺显著提高了大肠杆菌的菌体浓度和2’-FL的单位滴度，包括：菌种活化、种子培养和补料分批发酵。
菌种活化：将冻存于液氮中保存有基因工程菌的甘油管放置于冰上缓慢解冻，划线于含有卡那霉素抗性的LB平板中，37℃培养24～36h，挑取平板中形态饱满，边缘光滑的单菌落，接种于预先装有5～10mL LB培养基(卡那霉素浓度为40～80μg/mL)的50mL试管，放入摇床35～37℃，200rpm转速下培养过夜，将此步获得的菌保存于25～30％甘油管中并建立发酵菌种库；
种子培养：将的活化后的菌液以1～5％的接种量接种于装有100mL LB培养基(卡那霉素浓度为40～80μg/mL)的500mL锥形瓶中，35～37℃，200rpm，培养8～9h，此步获得一级种子液。二级种子需要放大至50L发酵罐，装液LB培养基35L(卡那霉素浓度为40～80μg/mL)，将一级种子按5～10％的接种量接种至二级种子罐，搅拌转速200～450rpm，通气1～1.5vvm，控制溶氧25～35％，待种子罐OD长至0.8～1.2，此时应处于对数生长后期，即可获得二级种子；
补料分批发酵：将培养结束的二级种子液以5～10％的接种量转种至含发酵培养基600L的1000L的发酵罐中，每隔2h取一次样检测OD600、菌体干湿重、2’-FL产量。其中发酵培养基的配方为5.0～7.0g/L酵母粉，7.0～10.0g/L胰蛋白胨，20～50g/L甘油，10～25g/LNa2HPO4·12H2O，1.0～2.0g/L(NH4)2HPO4，3.0～4.0g/LKH2PO4，1.0～2.5g/LNH4Cl，2.0～2.5g/L柠檬酸钠，0.5～1.0g/LMgSO4·7H2O，10.0mg/L硫胺素，40～80μg/mL卡那霉素，1mL/L的金属离子液。其中，培养的温度为30～37℃，初始转速为100rpm，通气1vvm，待溶氧降至30％以下缓慢提高转速和通气，通过溶氧与搅拌偶联控制发酵液的溶氧量为25～40％，发酵液的pH值通过氨水自控至6.8～7.2；在培养过程中，通过向发酵液补加补料培养基来控制基因工程菌的比生长速率在0.2～0.5之间。其中补料培养基的配方为600～800g/L甘油，10～30g/LMgSO4·7H2O，50～100g/L胰蛋白胨，10～20mL/L的微量元素溶液。待甘油消耗完之后，OD600约为20～25，以2.0～4.0g/L/h的速率补入补料培养基，控制大肠杆菌的比生长速率不低于0.2。与此同时，培养温度降低至25℃，加入45g IPTG进行诱导，诱导后继续培养60小时，其中每隔4h补加4800g的乳糖。结束发酵后测量OD及产物，此时的OD达到120，2’-FL的产量可达85g/L。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (8)

1.一株产2’-岩藻糖基乳糖的工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）利用futCB基因替换大肠杆菌Jm109（DE3）基因组中的wcaJ基因，并敲除LacZ、nudD和nudK基因，得E.Coli.Jm109（DE3）：：futCBΔZDK；所述futCB基因的NCBI ACCESSION : WP_002174293.1；
（2）利用重组载体转化步骤（1）所述E.Coli.Jm109（DE3）：：futCBΔZDK，得重组工程菌；
所述重组载体以pRSFDuet-1为基础载体，并插入GW基因片段和CB基因片段，所述GW基因片的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，CB基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；将GW基因片段插入pRSFDuet-1的Nde I和Kpn I之间，将CB基因片段插入pRSFDuet-1的Nco I和Hind III之间。
2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤（1）中利用futCB基因替换大肠杆菌Jm109（DE3）基因组中的wcaJ基因的方法，包括：①以质粒pTargetF为模板，采用引物wcaJF和sgRNAR进行PCR扩增得到线性化PCR产物，经过DpnⅠ消化和磷酸化后，利用T4DNA连接酶进行连接，转化大肠杆菌trans10感受态，得阳性质粒pTargetF-wcaj；其中wcaJF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，sgRNAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
②以大肠杆菌E.coli BL21的DNA为模板，利用FutCBF和FutCBR进行PCR扩增，得futCB_T7_wcaj；FutCBF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，FutCBR的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述futCB_T7_wcaj的核苷酸序列如SEQ ID No.22所示；
③将质粒pCas9转化至受体菌株Jm109 (DE3)中，并涂布于含有壮观霉素的固体LB培养基中，30℃过夜培养，得到转化子，提质粒获得含有pCas9的重组菌E.coli Jm109 (pCas9)；
④将阳性质粒pTargetF-wcaj和futCB_T7_wcaj转入E.coli Jm109 (pCas9) 的感受态细胞中，并涂布于含有氨苄青霉素和壮观霉素的LB固体培养基，30℃过夜培养，得到转化子；
⑤以FutCBF和FutCBR为引物，对步骤④得到的转化子进行菌液PCR，测序后筛选正确的wcaJ基因已经被替换为futCB 基因的Amp+Spec抗性基因的单克隆；
⑥将步骤⑤得到的单克隆接种到Amp+Spec抗性液体培养基中，传代3次，除去pCas9质粒，得到的菌株为突变体E.coli Jm109 (wcaJ::futCB)。
3.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤（1）中敲除LacZ基因所用的引物包括LacZF、sgRNAR、LacZ301F、LacZ301R、LacZ402F和LacZ402R，其中LacZF的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，sgRNAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，LacZ301F的核苷酸序列如SEQID NO.8所示，LacZ301R的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，LacZ402F的核苷酸序列如SEQID NO.10所示，LacZ402R的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
4.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤（1）中敲除nudD基因所用的引物包括nudDF、sgRNAR、nudD_501F、nudD_501R、nudD_182F和nudD_182R，其中nudDF的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，sgRNAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，nudD_501F的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，nudD_501R的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，nudD_182F的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，nudD_182R的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。
5.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤（1）中敲除nudK基因所用的引物包括nudKF、sgRNAR、nudK_501F、nudK_501R、nudK_302F和nudK_302R，其中nudKF的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，sgRNAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，nudK_501F的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，nudK_501R的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，nudK_302F的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，nudK_302R的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。
6.利用权利要求1~5任一项所述构建方法得到的重组工程菌。
7.权利要求6所述重组工程菌在生产2’-岩藻糖基乳糖中的应用。
8.一种生产2’-岩藻糖基乳糖的方法，包括将权利要求6所述重组工程菌接种到发酵培养液中，以乳糖为底物，在IPTG诱导下，发酵液中包含所述2’-岩藻糖基乳糖。
CN202211653612.1A 2022-12-22 2022-12-22 一株产2’-岩藻糖基乳糖的工程菌及其构建方法和应用 Active CN116042682B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211653612.1A CN116042682B (zh) 2022-12-22 2022-12-22 一株产2’-岩藻糖基乳糖的工程菌及其构建方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211653612.1A CN116042682B (zh) 2022-12-22 2022-12-22 一株产2’-岩藻糖基乳糖的工程菌及其构建方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN116042682A CN116042682A (zh) 2023-05-02
CN116042682B true CN116042682B (zh) 2024-01-23

Family

ID=86115564

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211653612.1A Active CN116042682B (zh) 2022-12-22 2022-12-22 一株产2’-岩藻糖基乳糖的工程菌及其构建方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116042682B (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110804577A (zh) * 2019-11-28 2020-02-18 江南大学 一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株
CN111471606A (zh) * 2020-03-17 2020-07-31 山东大学 一株优化的高产岩藻糖基乳糖的酿酒酵母菌株及其应用
CN112342176A (zh) * 2020-10-15 2021-02-09 江南大学 产2’-岩藻糖基乳糖的基因工程菌及其应用
CN113186142A (zh) * 2021-04-12 2021-07-30 江南大学 一种高效生产2′-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株
CN114480240A (zh) * 2022-02-22 2022-05-13 江南大学 一种产岩藻糖基乳糖的基因工程菌及生产方法
CN114874964A (zh) * 2022-06-13 2022-08-09 江南大学 一种高产2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110804577A (zh) * 2019-11-28 2020-02-18 江南大学 一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株
CN111471606A (zh) * 2020-03-17 2020-07-31 山东大学 一株优化的高产岩藻糖基乳糖的酿酒酵母菌株及其应用
CN112342176A (zh) * 2020-10-15 2021-02-09 江南大学 产2’-岩藻糖基乳糖的基因工程菌及其应用
CN113186142A (zh) * 2021-04-12 2021-07-30 江南大学 一种高效生产2′-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株
CN114480240A (zh) * 2022-02-22 2022-05-13 江南大学 一种产岩藻糖基乳糖的基因工程菌及生产方法
CN114874964A (zh) * 2022-06-13 2022-08-09 江南大学 一种高产2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN116042682A (zh) 2023-05-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113186142B (zh) 一种高效生产2′-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株
WO2022174597A1 (zh) 一种用于l-肌氨酸生产的基因工程菌及构建方法与应用
CN114874964B (zh) 一种高产2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用
CN104195190B (zh) 一种利用重组大肠杆菌厌氧生产5‑氨基乙酰丙酸的方法
CN112501095B (zh) 一种合成3-岩藻乳糖的重组大肠杆菌构建方法及其应用
CN116555145A (zh) 重组大肠杆菌及其构建方法和生产2′-岩藻糖基乳糖的方法
CN106399216A (zh) 一种高效合成α‑氨基丁酸的单细胞工厂及其构建与应用
CN113832092B (zh) 一种提高乳酰-n-岩藻五糖产量的基因工程菌及其生产方法
CN107287144B (zh) 一种代谢改造的枯草芽孢杆菌生物转化细胞及其制备方法与应用
CN117645967A (zh) 一种适用于高密度发酵产酶的枯草芽孢杆菌底盘细胞
CN116042682B (zh) 一株产2’-岩藻糖基乳糖的工程菌及其构建方法和应用
CN114854659B (zh) 一种麦角硫因生产工艺及其应用
CN111607608A (zh) 基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及提高ε-聚赖氨酸产量的方法和应用
CN113684163B (zh) 一种提高乳酰-n-四糖产量的基因工程菌及其生产方法
CN116769808A (zh) 一种专一生产2′-岩藻糖基乳糖的菌株及应用
CN114806991A (zh) 一种提高岩藻糖基乳糖产量的工程大肠杆菌及生产方法
CN111471636B (zh) 表达人表皮生长因子的基因工程菌及其应用
CN116200360B (zh) 一种futCB突变体及生物合成2’-岩藻糖基乳糖的方法
CN115125180B (zh) 一种利用双途径产乙偶姻的重组运动发酵单胞菌及其构建方法与应用
CN113957073B (zh) 一种tkt基因启动子突变体及其在生产L-赖氨酸中的应用
CN118126922B (zh) 一种l-苏氨酸生产菌株及其构建方法与应用
CN116478894A (zh) 一种提高唾液酸乳糖产量的基因工程菌及其生产方法
CN117004625A (zh) 一种氧调控基因及其过表达突变株和用于维生素b12工业生产中的应用
CN118222525A (zh) 葡萄糖脱氢酶突变体、核酸分子、重组载体、工程菌及应用
CN114231474A (zh) 一种构建基因工程淀粉酶产色链霉菌及提高ε-聚赖氨酸产量的方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant