CN110804577A - 一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种生产2’‑岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株，通过CRISPR/Cas9基因编辑系统，敲除原始菌株2’‑岩藻糖基乳糖合成代谢途径中的相关基因；构建模块化代谢通路，通过不同质粒组合调控代谢途径中的磷酸甘露糖变位酶(ManB)，甘露糖‑1‑磷酸鸟嘌呤基转移酶(ManC)，GDP‑甘露糖‑6‑脱氢酶(Gmd)，GDP‑岩藻糖合成酶(WcaG)，L‑岩藻糖1‑激酶/GDP‑岩藻糖焦磷酸化酶(Fkp)以及2’‑岩藻糖基乳糖合成酶(FucT2)的表达水平，使细胞内能积累更高浓度的2’‑岩藻糖基乳糖。本发明还提供了一种高效生产2’‑岩藻糖基乳糖的方法。

Description

一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株
技术领域
本发明涉及一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株，属于微生物基因工程领域。
背景技术
母乳通常被认为是提供婴儿营养的最重要的来源。作为母乳中的含量第三的固体组分，对于婴幼儿肠道菌群的发育以及预防病原菌与上皮细胞的粘附，人乳寡糖的合成发挥着重要的作用。岩藻糖基化乳糖，包括2’-岩藻糖基乳糖、3’-岩藻糖基乳糖、乳酰-N-岩藻五糖等，能选择性地刺激双歧杆菌的生长并形成致病菌受体的类似物，从而保护婴儿防止肠道病原体的感染，如肠道病原体，大肠杆菌、霍乱弧菌和沙门氏菌。2’-岩藻糖基乳糖作为人乳寡糖中含量最高的成分，受到广泛关注，具备应用于婴幼儿产品的广泛前景。
相比于酶法和化学法，以微生物发酵法合成2’-岩藻糖基乳糖更加高效和安全。目前微生物发酵法发酵法生产2’-岩藻糖基乳糖主要有两个代谢通路，分别是从头合成途径和补救途径。从头合成途径主要是通过将磷酸甘露糖变位酶(ManB)，甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶(ManC)，GDP-甘露糖-6-脱氢酶(Gmd),GDP-岩藻糖合成酶(WcaG)中的一个或多个基因在大肠杆菌中过表达，或者通过补救合成途径，过表达L-岩藻糖1-激酶/GDP-岩藻糖焦磷酸化酶(Fkp)和2’-岩藻糖基乳糖合成酶(FucT2)；Lee等将从头合成途径的ManB、ManC、Gmd、WcaG以及FucT2共表达于失去β-半乳糖糖苷酶活性的E.coli JM109，提高了乳糖利用率，2’-岩藻糖基乳糖的摇瓶发酵产量最终达到了1.25g/L。但E.coli JM109菌株在发酵过程中形成的生物膜可带来很多严重的后果，难以应用于高密度发酵。还有报道通过基因整合的方式将GDP-岩藻糖从头合成途径的关键基因以及FucT2整合到E.coli JM109染色体组上，避免了抗生素的食品安全问题，在无抗生素的13L补料发酵中，得到了20.28g/L的产量。但相对与传统的质粒表达，基因整合的过程较为复杂，基因的表达水平较低。
此外，Chin等构建了2’-岩藻糖基乳糖生产的补救途径，敲除大肠杆菌中代谢乳糖的lacZ基因，2’-岩藻糖基乳糖的产率提高了4.3倍；同时又敲除代谢岩藻糖的fucIK基因簇，使2’-岩藻糖基乳糖的产量得到进一步提高，摇瓶发酵产量达到2.1g/L。尽管2’-岩藻糖基乳糖的产量得到显著提高，但用于其生产的L-岩藻糖价格昂贵,2’-岩藻糖基乳糖的产率也较低(67.7％)，较难应用于大规模的发酵生产。
发明内容
针对现有的技术难点及存在的问题，本发明提供了一种高效生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌及其构建方法。
本发明的第一个目的是提供一种高效生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌，所述大肠杆菌工程菌组合调控磷酸甘露糖变位酶ManB，甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶ManC，GDP-甘露糖-6-脱氢酶Gmd，GDP-岩藻糖合成酶WcaG、L-岩藻糖1-激酶/GDP-岩藻糖焦磷酸化酶Fkp以及2-岩藻糖基乳糖合成酶FucT2的表达。
在本发明的一种实施例中，所述大肠杆菌工程菌还敲除了β-半乳糖苷酶LacZ、UDP-葡萄糖脂质载体转移酶WcaJ、岩藻糖异构酶/墨角藻糖激酶FucI-FucK基因簇。
在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌工程菌的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)，表达载体为pETuet-1和pCDFDuet-1。
在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌工程菌以pCDFDuet-1表达manC-manB和gmd-wacG，以pETuet-1表达fkp和fucT2。
在本发明的一种实施方式中，ManB、ManC、Gmd、WcaG的基因来源于大肠杆菌K-12(Escherichia coli k-12)，核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～4所示。
在本发明的一种实施方式中，Fkp和FucT2的基因分别来源于脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)9343和幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)，核苷酸序列依次为SEQID NO.5、SEQ ID NO.6所示。
本发明的第二个目的是提供一种提高大肠杆菌产2’-岩藻糖基乳糖能力的方法，其特征在于，组合调控ManB、ManC、Gmd、WcaG、Fkp以及FucT2的表达。所述调控表达是采用中拷贝表达元件调控ManB、ManC、Gmd、WcaG的表达，采用高拷贝表达元件调控Fkp和FucT2的表达。
本发明的第三个目的是提供一种高效生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)采用CRISPR/Cas9基因编辑系统分别构建敲除了wacJ基因、wacJ和lacZ基因、wacJ，lacZ和fucIK基因的大肠杆菌BL21(DE3)工程菌；
(2)分别以pETDuet-1，pCDFDuet-1和pACYCDuet-1为表达载体，构建过表达ManB-ManC-Gmd-WcaG和Fkp-FucT2的重组表达载体；
(3)将pACYCDuet-1-ManB-ManC-Gmd-WcaG和pETDuet-1-Fkp-FucT2同时转化敲除了wacJ基因、wacJ和lacZ基因、wacJ，lacZ和fucIK基因的大肠杆菌BL21(DE3)工程菌，筛选出具有最高2’-岩藻糖基乳糖产量的敲除基因宿主菌株；
(4)以筛选出的具有最高2’-岩藻糖基乳糖产量的，敲除了wacJ，lacZ和fucIK基因的大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，将步骤(2)中构建的重组表达载体导入宿主菌中，筛选出具有最高2’-岩藻糖基乳糖产量的重组质粒组合。
本发明的第四个目的是提供一种高效生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌的发酵方法，是以所述基因工程菌为发酵微生物，以乳糖和L-岩藻糖为底物，以甘油或葡萄糖作为碳源合成2’-岩藻糖基乳糖。
本发明还要求保护所述工程菌在制备2’-岩藻糖基乳糖及其衍生产品中的应用。
本发明的有益效果：
本发明通过敲除大肠杆菌宿主2’-岩藻糖基乳糖合成途径中LacZ、WcaJ和FucIK的表达，并组合调控2’-岩藻糖基乳糖头合成途径中ManB、ManC、Gmd、WcaG、Fkp和FucT2的表达，从而精确调控代谢通路的碳通量，缓解代谢压力，提高2’-岩藻糖基乳糖的产量，将大肠杆菌生产2’-岩藻糖基乳糖的能力由0.22g/L提升至3.81g/L，与现有技术中2.1g/L的2’-岩藻糖基乳糖产量相比，本发明2’-岩藻糖基乳糖的产量提高至现有技术的1.81倍，具备工业应用的前景。
附图说明
图1为2’-岩藻糖基乳糖生产的从头合成途径和补救途径；
图2为敲除lacZ基因的PCR验证结果；
图3为pETDuet-1-ManB-ManC-Gmd-WcaG载体构建图；
图4为pCDDuet-1-Fkp-FucT2过表达载体构建图；
图5为不同敲除菌株发酵生产2’-岩藻糖基乳糖的产量比较；
图6不同质粒组合的工程菌发酵生产2’-岩藻糖基乳糖的产量比较；
图7敲除宿主中菌株BWLF1 2’-岩藻糖基乳糖产量的HPLC检测结果
具体实施方式
以下结合实例更加详细说明本发明的内容，以下实例中所使用的质粒、内切酶、PCR酶、柱式DNA抽提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒等采用商用产品，具体操作按照试剂盒说明书进行。菌落PCR、核酸琼脂糖凝胶电泳、蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳、热击转化、电转化、感受态细胞的制备和细菌基因组的提取保存等常规操作方法根据Molecular Cloning:ALaboratory Manual(Fourth Edition)进行。质粒和DNA产物的测序工作交予上海生工生物工程公司完成。
实施例1大肠杆菌BL21 wacJ、lacZ、fucIK基因敲除
利用CRISPR-Cas9基因敲除系统敲除大肠杆菌BL21中wacJ、lacZ、fucIK，具体步骤如下(所涉及到的引物序列见表1)：
(1)以大肠杆菌BL21基因组为模板，使用wcaJ-up-F/R和wcaJ-down-F/R，lacZ-up-F/R和lacZ-down-F/R，fucIK-up-F/R和fucIK-down-F/R通过PCR分别扩增出wacJ、lacZ、fucIK的上下游片段，胶回收。再分别以wacJ、lacZ、fucIK上下游片段为模板，采用wcaJ-up-F/wcaJ-down-R、lacZ-up-F/lacZ-down-R和fucIK-up-F/fucIK-down-R引物通过inversePCR得到完整的wacJ、lacZ、fucIK模板，胶回收DNA片段。
(2)以原始pTargetF质粒为模板，wcaJ-sg-F/R、lacZ-sg-F/R和fucIK-sg-F/R为引物，采用PCR扩增将原始质粒上的N20序列分别替换为与wacJ、lacZ、fucIK序列互补的N20序列，得到带有靶向wacJ、lacZ、fucIK的pTargetF质粒。PCR产物采用DpnⅠ去除模板DNA，转化大肠杆菌DH5α感受态，涂布LB平板(含壮观霉素)，37℃扩大培养提取质粒并测序。
(3)取pCas质粒及大肠杆菌BL21感受态，冰上放置5min至感受态融化，取5uL质粒加入100uL感受态细胞中，轻轻混匀。冰浴20min，42℃热激90s，立即置于冰上5min。加入1mLLB培养基，30℃，180rpm培养1h。取200uL浓缩菌液，均匀涂布于LB平板(含卡那霉素)上，30℃倒置培养过夜成为大肠杆菌BL21/pCas。
(4)挑取大肠杆菌BL21/pCas单菌落于LB培养基中，30℃培养1.0h，加入终浓度为10mM/L的L-阿拉伯糖以诱导pCas-λ-red系统表达。当OD600达到0.6-0.8时，制备大肠杆菌BL21/pCas感受态。
(5)将100ng pTargetF质粒和400ng的供体DNA片段，电转上述大肠杆菌BL21/pCas感受态，涂布于LB平板(卡那霉素和壮观霉素)，30℃培养24h，PCR验证wacJ，lacZ和fucIK敲除效果(敲除验证结果见图2)。
(6)将上述阳性克隆菌落挑至4ml LB液体试管，加入终浓度为1mM的IPTG和30mg/L卡那霉素，30℃培养8-16h，去除pTargetF质粒。42℃培养12h，去除pCas质粒。最终获得BW(ΔwacJ)、BWL(ΔwacJΔlacZ)、BWLF(ΔwacJΔlacZΔfucIK)三种大肠杆菌BL21敲除菌株。
表1基因敲除引物
Figure BDA0002293076170000041
Figure BDA0002293076170000051
实施例2重组表达载体的构建
重组表达载体构建具体步骤如下(所涉及到的引物序列见表2)：
(1)manC-manB和gmd-wacG基因簇片段的获得：以大肠杆菌K-12(Escherichiacoli)的基因组为模板，以manCB-F/R(NcoI)和GW-F/R(NdeI)为引物，PCR分别扩增出manC-manB和gmd-wacG基因簇片段，胶回收DNA片段；
(2)fkp基因片段的获得：以脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis 9343)基因组为模板，以Fkp-F/R(NdeI)为引物，PCR扩增出fkp基因片段，胶回收DNA片段
(4)fucT2基因片段的获得：以幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)基因组为模板，以FucT2-F/R(NcoI)为引物，PCR扩增出fucT2基因片段，胶回收DNA片段
(5)采用NcoI和NdeI将manC-manB和gmd-wacG基因簇片段分别进行单酶切处理后，插入到经过相同酶切处理的质粒pETDuet-1，pCDFDuet-1和pACYCDuet-1中，DNA连接酶过夜连接，从而构建pET-BCGW，pCD-BCGW,pAC-BCGW表达载体(BCGW即过表达manC-manB和gmd-wacG；载体构建流程参考图2，以pET-BCGW为例)。
(7)采用NdeI和NcoI将fkp和fucT2基因片段分别进行单酶切处理后，插入到经过相同酶切处理的质粒pETDuet-1，pCDFDuet-1和pACYCDuet-1中，DNA连接酶过夜连接，从而构建pET-FF,pCD-FF,pAC-FF表达载体(FF即过表达fkp和fucT2；载体构建流程参考图3，以pCD-FF为例)。
表2质粒构建引物
Figure BDA0002293076170000061
实施例3大肠杆菌工程菌株的构建
培养wacJ、lacZ、fucIK基因敲除菌株BWLF并制备感受态细胞，利用化学转化法将抽提后的质粒pET-BCGW和pCD-FF导入菌株，在双抗LB平板(氨苄和链霉素)37℃过夜培养，得到产2’-岩藻糖基乳糖的基因工程菌。其他重组基因工程菌的构建如上，具体重组质粒、工程菌及其详细信息见表3。
表3质粒和工程菌详细信息
Figure BDA0002293076170000062
实施例4 2-岩藻糖基乳糖发酵过程及检测
Luria-Bertani(LB)培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L。
发酵培养基：13.5g/L磷酸二氢钾,4.0g/L磷酸铵，1.7g/L柠檬酸，1.4g/L七水合硫酸镁，10mL/L微量金属元素溶液(10g/L氯化铁，2.25g/L七水合硫酸锌，1.0g/L五水合硫酸铜，0.35g/L一水合硫酸锰，0.23g/L十水合硼酸钠，0.11g/L钼酸铵，2.0g/L二水合氯化钙，pH 6.8；甘油20g/L。
(1)2-岩藻糖基乳糖发酵过程：将实施例(3)中的菌株接种于LB液体培养基，37℃，200rpm，过夜培养12h，作为种子液以2％的接种量接入25ml发酵培养基(含20g/L甘油)，37℃，200rpm，培养至0D600 0.6，加入终浓度为0.2mM IPTG，同时加入10g/L乳糖，5g/L L-岩藻糖，30℃，200rpm诱导培养70h。取5mL发酵液，5000rpm，离心25min，取上清，用于HPLC测定；将菌体沉淀用1mL去离子水悬浮，5000rpm，离心25min，去上清。再用1mL超纯水悬浮菌体沉淀，100℃，煮沸5min，5000rpm，离心25min，取上清用于HPLC测定。
(3)HPLC检测条件：HPLC(Waters e2695)；色谱柱：Carbohydrate Analysiscolumn(Rezex ROA-organic acid H+(8％)300×7.8mm)；流动相：0.5mM H2SO4；流速：0.6mL/min；检测器：示差检测器；柱温60℃；进样量：10μL。
实施例5高效生产2’-岩藻糖基乳糖宿主工程菌的筛选
(1)不同敲除宿主之间的2’-岩藻糖基乳糖的产量差异
由于已有研究表明过表达manC、manB、gmd、wacG或Fkp、FucT2可提高2’-岩藻糖基乳糖的产量，因此直接将构建好的重组质粒pAC-BCGW和pET-FF同时转化原始BL21(DE3)，BW，BWL和BWLF菌株，构建B1、BW1、BWL1、BWLF1工程菌株。按实施例4所述方法发酵生产2’-岩藻糖乳糖。敲除不同基因后2’-岩藻糖基乳糖的产量如图5(HPLC检测结果如图7所示，以BWLF1为例)。可以看出，B1、BW1、BWL1、BWLF1菌株中2’-岩藻糖基乳糖的产量分别为0.22g/L、0.35g/L、2.40g/L和2.98g/L，BW1菌株2’-岩藻糖基乳糖产量是原始菌株的1.59倍，表明wcaJ基因的敲除，促使细胞内GDP-岩藻糖的积累，提高了2’-岩藻糖基乳糖的产量；BWL1菌株2’-岩藻糖基乳糖产量是原始菌株B1的11倍，是BW1菌株的6.86倍，说明lacZ基因的敲除对2’-岩藻糖基乳糖的产量提高有重要作用。BWLF1菌株2-岩藻糖基乳糖的产量相比于BWL1增加了1.24倍，说明fucIK基因簇的敲除，使细胞内L-岩藻糖更多流向2’-岩藻糖基乳糖的生产，故确定BWLF菌株为下一步发酵的优选菌株。
(2)不同质粒组合的菌株生产2’-岩藻糖乳糖的差异
质粒pETDuet-1具有较高的拷贝数，质粒pCDFDuet-1有中等的拷贝数，而质粒pACYCDuet-1具有较低的拷贝数。不同拷贝数的质粒被使用以平衡多酶体系中不同酶的表达量。为了减轻菌体的代谢负担，进一步提高2’-岩藻糖基乳糖的产量，我们在BWLF菌株中构建了不同质粒组合的重组菌株：BWLF1、BWLF2、BWLF3、BWLF4、BWLF5、BWLF6，并按实施例4所述方法发酵生产2’-岩藻糖乳糖，结果如图6所示，BWLF4在构建的6种菌株中BWLF4的产量最低，为0.62g/L；BWLF6的产量次低，为1.58g/L。BWLF3、BWLF1、BWLF5、BWLF2的产量分别为3.52g/L、3.02g/L、2.36g/L、2.28g/L，分别是BWLF4的5.68、4.87、3.81、3.68倍。其中在Fkp及fucT2的表达中，BWLF1和BWLF2菌株，选用中拷贝数质粒pCDFDuet-1；BWLF3，BWLF4菌株选用高拷贝数质粒pETDuet-1，而BWLF4，BWLF6选用低拷贝数质粒pACYCDuet-1，表明当补救合成途径Fkp以及fucT2表达选用较高拷贝数质粒时，菌体内积累了较多的GDP-岩藻糖，同时被高效转化为目标产物，故2’-岩藻糖基乳糖的产量得到显著提高；BWLF6菌株的产量1.58g/L，与BWLF4相比，2’-岩藻糖基乳糖的产量提高了2.55倍，表明提高从头合成途径中相关基因的表达量，也能显著改善2’-岩藻糖基乳糖的产量；类似的，BWLF3的产量高于BWLF1，BWLF5的产量高于BWLF2。当FucT2和Fkp选用高拷贝数质粒pETDuet-1表达，同时来自于上游途径的ManC，ManB，Gmd，WcaG选择中等拷贝数质粒pCDFDuet-1表达时，菌体内积累大量GDP-岩藻糖，同时也被有效转化为终产物，减轻菌体代谢负担，所以菌株BWLF3的2’-岩藻糖基乳糖产量最高，为3.52g/L。因此确定表达中等水平的ManC，ManB，Gmd，WcaG和表达较高水平的FucT2、Fkp的菌株BWLF3为最优发酵菌株。
实施例6：
具体实施方式同实施例4，区别在于，将诱导温度由30℃改为37℃，以BWLF3菌株为发酵微生物，所得的2’-岩藻糖基乳糖产量为3.81g/L。
对比例1：
具体实施方式同实施例4，区别在于，将20g/L甘油改为20g/L葡萄糖，以BWLF3菌株为发酵微生物，所得的2’-岩藻糖基乳糖产量为0.8g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1371
<212> DNA
<213> Escherichia coli k-12
<400> 1
atgaaaaaat taacctgctt taaagcctat gatattcgcg ggaaattagg cgaagaactg 60
aatgaagata tcgcctggcg cattggtcgc gcctatggcg aatttctcaa accgaaaacc 120
attgtgttag gcggtgatgt ccgcctcacc agcgaaacct taaaactggc gctggcgaaa 180
ggtttacagg atgcgggcgt tgacgtgctg gatattggta tgtccggcac cgaagagatc 240
tatttcgcca cgttccatct cggcgtggat ggcggcattg aagttaccgc cagccataat 300
ccgatggatt ataacggcat gaagctggtt cgcgaggggg ctcgcccgat cagcggagat 360
accggactgc gcgacgtcca gcgtctggct gaagccaacg actttcctcc cgtcgatgaa 420
accaaacgcg gtcgctatca gcaaatcaac ctgcgtgacg cttacgttga tcacctgttc 480
ggttatatca atgtcaaaaa cctcacgccg ctcaagctgg tgatcaactc cgggaacggc 540
gcagcgggtc cggtggtgga cgccattgaa gcccgcttta aagccctcgg cgcgcccgtg 600
gaattaatca aagtgcacaa cacgccggac ggcaatttcc ccaacggtat tcctaaccca 660
ctactgccgg aatgccgcga cgacacccgc aatgcggtca tcaaacacgg cgcggatatg 720
ggcattgctt ttgatggcga ttttgaccgc tgtttcctgt ttgacgaaaa agggcagttt 780
attgagggct actacattgt cggcctgttg gcagaagcat tcctcgaaaa aaatcccggc 840
gcgaagatca tccacgatcc acgtctctcc tggaacaccg ttgatgtggt gactgccgca 900
ggtggcacgc cggtaatgtc gaaaaccgga cacgccttta ttaaagaacg tatgcgcaag 960
gaagacgcca tctatggtgg cgaaatgagc gcccaccatt acttccgtga tttcgcttac 1020
tgcgacagcg gcatgatccc gtggctgctg gtcgccgaac tggtgtgcct gaaagataaa 1080
acgctgggcg aactggtacg cgaccggatg gcggcgtttc cggcaagcgg tgagatcaac 1140
agcaaactgg cgcaacccgt tgaggcgatt aaccgcgtgg aacagcattt tagccgtgag 1200
gcgctggcgg tggatcgcac cgatggcatc agcatgacct ttgccgactg gcgctttaac 1260
ctgcgcacct ccaataccga accggtggtg cgcctgaatg tggaatcgcg cggtgatgtg 1320
ccgctgatgg aagcgcgaac gcgaactctg ctgacgttgc tgaacgagta a 1371
<210> 2
<211> 1437
<212> DNA
<213> Escherichia coli k-12
<400> 2
atggcgcagt cgaaactcta tccagttgtg atggcaggtg gctccggtag ccgcttatgg 60
ccgctttccc gcgtacttta tcccaagcag tttttatgcc tgaaaggcga tctcaccatg 120
ctgcaaacca ccatctgccg cctgaacggc gtggagtgcg aaagcccggt ggtgatttgc 180
aatgagcagc accgctttat tgtcgcggaa cagctgcgtc aactgaacaa acttaccgag 240
aacattattc tcgaaccggc agggcgaaac acggcacctg ccattgcgct ggcggcgctg 300
gcggcaaaac gtcatagccc ggagagcgac ccgttaatgc tggtattggc ggcggatcat 360
gtgattgccg atgaagacgc gttccgtgcc gccgtgcgta atgccatgcc atatgccgaa 420
gcgggcaagc tggtgacctt cggcattgtg ccggatctac cagaaaccgg ttatggctat 480
attcgtcgcg gtgaagtgtc tgcgggtgag caggatatgg tggcctttga agtggcgcag 540
tttgtcgaaa aaccgaatct ggaaaccgct caggcctatg tggcaagcgg cgaatattac 600
tggaacagcg gtatgttcct gttccgcgcc ggacgctatc tcgaagaact gaaaaaatat 660
cgcccggata tcctcgatgc ctgtgaaaaa gcgatgagcg ccgtcgatcc ggatctcaat 720
tttattcgcg tggatgaaga agcgtttctc gcctgcccgg aagagtcggt ggattacgcg 780
gtcatggaac gtacggcaga tgctgttgtg gtgccgatgg atgcgggctg gagcgatgtt 840
ggctcctggt cttcattatg ggagatcagc gcccacaccg ccgagggcaa cgtttgccac 900
ggcgatgtga ttaatcacaa aactgaaaac agctatgtgt atgctgaatc tggcctggtc 960
accaccgtcg gggtgaaaga tctggtagtg gtgcagacca aagatgcggt gctgattgcc 1020
gaccgtaacg cggtacagga tgtgaaaaaa gtggtcgagc agatcaaagc cgatggtcgc 1080
catgagcatc gggtgcatcg cgaagtgtat cgtccgtggg gcaaatatga ctctatcgac 1140
gcgggcgacc gctaccaggt gaaacgcatc accgtgaaac cgggcgaggg cttgtcggta 1200
cagatgcacc atcaccgcgc ggaacactgg gtggttgtcg cgggaacggc aaaagtcacc 1260
attgatggtg atatcaaact gcttggtgaa aacgagtcca tttatattcc gctgggggcg 1320
acgcattgcc tggaaaaccc ggggaaaatt ccgctcgatt taattgaagt gcgctccggc 1380
tcttatctcg aagaggatga tgtggtgcgt ttcgcggatc gctacggacg ggtgtaa 1437
<210> 3
<211> 1122
<212> DNA
<213> Escherichia coli k-12
<400> 3
atgtcaaaag tcgctctcat caccggtgta accggacaag acggttctta cctggcagag 60
tttctgctgg aaaaaggtta cgaggtgcat ggtattaagc gtcgcgcatc gtcattcaac 120
accgagcgcg tggatcacat ttatcaggat ccgcacacct gcaacccgaa attccatctg 180
cattatggcg acctgagtga tacctctaac ctgacgcgca ttttgcgtga agtacagccg 240
gatgaagtgt acaacctggg cgcaatgagc cacgttgcgg tctcttttga gtcaccagaa 300
tataccgctg acgtcgacgc gatgggtacg ctgcgcctgc tggaggcgat ccgcttcctc 360
ggtctggaaa agaaaactcg tttctatcag gcttccacct ctgaactgta tggtctggtg 420
caggaaattc cgcagaaaga gaccacgccg ttctacccgc gatctccgta tgcggtcgcc 480
aaactgtacg cctactggat caccgttaac taccgtgaat cctacggcat gtacgcctgt 540
aacggaattc tcttcaacca tgaatccccg cgccgcggcg aaaccttcgt tacccgcaaa 600
atcacccgcg caatcgccaa catcgcccag gggctggagt cgtgcctgta cctcggcaat 660
atggattccc tgcgtgactg gggccacgcc aaagactacg taaaaatgca gtggatgatg 720
ctgcagcagg aacagccgga agatttcgtt atcgcgaccg gcgttcagta ctccgtgcgt 780
cagttcgtgg aaatggcggc agcacagctg ggcatcaaac tgcgctttga aggcacgggc 840
gttgaagaga agggcattgt ggtttccgtc accgggcatg acgcgccggg cgttaaaccg 900
ggtgatgtga ttatcgctgt tgacccgcgt tacttccgtc cggctgaagt tgaaacgctg 960
ctcggcgacc cgaccaaagc gcacgaaaaa ctgggctgga aaccggaaat caccctcaga 1020
gagatggtgt ctgaaatggt ggctaatgac ctcgaagcgg cgaaaaaaca ctctctgctg 1080
aaatctcacg gctacgacgt ggcgatcgcg ctggagtcat aa 1122
<210> 4
<211> 963
<212> DNA
<213> Escherichia coli k-12
<400> 4
agtaaacaac gagtttttat tgctggtcat cgcgggatgg tcggttccgc catcaggcgg 60
cagctcgaac agcgcggtga tgtggaactg gtattacgca cccgcgacga gctgaacctg 120
ctggacagcc gcgccgtgca tgatttcttt gccagcgaac gtattgacca ggtctatctg 180
gcggcggcga aagtgggcgg cattgttgcc aacaacacct atccggcgga tttcatctac 240
cagaacatga tgattgagag caacatcatt cacgccgcgc atcagaacga cgtgaacaaa 300
ctgctgtttc tcggatcgtc ctgcatctac ccgaaactgg caaaacagcc gatggcagaa 360
agcgagttgt tgcagggcac gctggagccg actaacgagc cttatgctat tgccaaaatc 420
gccgggatca aactgtgcga atcatacaac cgccagtacg gacgcgatta ccgctcagtc 480
atgccgacca acctgtacgg gccacacgac aacttccacc cgagtaattc gcatgtgatc 540
ccagcattgc tgcgtcgctt ccacgaggcg acggcacaga atgcgccgga cgtggtggta 600
tggggcagcg gtacaccgat gcgcgaattt ctgcacgtcg atgatatggc ggcggcgagc 660
attcatgtca tggagctggc gcatgaagtc tggctggaga acacccagcc gatgttgtcg 720
cacattaacg tcggcacggg cgttgactgc actatccgcg agctggcgca aaccatcgcc 780
aaagtggtgg gttacaaagg ccgggtggtt tttgatgcca gcaaaccgga tggcacgccg 840
cgcaaactgc tggatgtgac gcgcctgcat cagcttggct ggtatcacga aatctcactg 900
gaagcggggc ttgccagcac ttaccagtgg ttccttgaga atcaagaccg ctttcggggg 960
taa 963
<210> 5
<211> 2850
<212> DNA
<213> Bacteroides fragilis 9343
<400> 5
atgcaaaaac tactatcttt accgtccaat ctggttcagt cttttcatga actggagagg 60
gtgaatcgta ccgattggtt ttgtacttcc gacccggtag gtaagaaact tggttccggt 120
ggtggaacat cctggctgct tgaagaatgt tataatgaat attcagatgg tgctactttt 180
ggagagtggc ttgaaaaaga aaaaagaatt cttcttcatg cgggtgggca aagccgtcgt 240
ttacccggct atgcaccttc tggaaagatt ctcactccgg ttcctgtgtt ccggtgggag 300
agagggcaac atctgggaca aaatctgctt tctctgcaac ttcccctata tgaaaaaatc 360
atgtctttgg ctccggataa actccataca ctgattgcga gtggtgatgt ctatattcgt 420
tcggagaaac ctttgcagag tattcccgaa gcggatgtgg tttgttatgg actgtgggta 480
gatccgtctc tggctaccca tcatggcgtg tttgcttccg atcgcaaaca tcccgaacaa 540
ctcgacttta tgcttcagaa gccttcgttg gcagaattgg aatctttatc gaagacccat 600
ttgttcctga tggacatcgg tatatggctt ttgagtgacc gtgccgtaga aatcttgatg 660
aaacgttctc ataaagaaag ctctgaagaa ctaaagtatt atgatcttta ttccgatttt 720
ggattagctt tgggaactca tccccgtatt gaagacgaag aggtcaatac gctatccgtt 780
gctattctgc ctttgccggg aggagagttc tatcattacg ggaccagtaa agaactgatt 840
tcttcaactc tttccgtaca gaataaggtt tacgatcagc gtcgtatcat gcaccgtaaa 900
gtaaagccca atccggctat gtttgtccaa aatgctgtcg tgcggatacc tctttgtgcc 960
gagaatgctg atttatggat cgagaacagt catatcggac caaagtggaa gattgcttca 1020
cgacatatta ttaccggggt tccggaaaat gactggtcat tggctgtgcc tgccggagtg 1080
tgtgtagatg tggttccgat gggtgataag ggctttgttg cccgtccata cggtctggac 1140
gatgttttca aaggagattt gagagattcc aaaacaaccc tgacgggtat tccttttggt 1200
gaatggatgt ccaaacgcgg tttgtcatat acagatttga aaggacgtac ggacgattta 1260
caggcagttt ccgtattccc tatggttaat tctgtagaag agttgggatt ggtgttgagg 1320
tggatgttgt ccgaacccga actggaggaa ggaaagaata tctggttacg ttccgaacat 1380
ttttctgcgg acgaaatttc ggcaggtgcc aatctgaagc gtttgtatgc acaacgtgaa 1440
gagttcagaa aaggaaactg gaaagcattg gccgttaatc atgaaaaaag tgttttttat 1500
caacttgatt tggccgatgc agctgaagat tttgtacgtc ttggtttgga tatgcctgaa 1560
ttattgcctg aggatgctct gcagatgtca cgcatccata accggatgtt gcgtgcgcgt 1620
attttgaaat tagacgggaa agattatcgt ccggaagaac aggctgcttt tgatttgctt 1680
cgtgacggct tgctggacgg gatcagtaat cgtaagagta ccccaaaatt ggatgtatat 1740
tccgatcaga ttgtttgggg acgtagcccc gtgcgcatcg atatggcagg tggatggacc 1800
gatactcctc cttattcact ttattcggga ggaaatgtgg tgaatctagc cattgagttg 1860
aacggacaac ctcccttaca ggtctatgtg aagccgtgta aagacttcca tatcgtcctg 1920
cgttctatcg atatgggtgc tatggaaata gtatctacgt ttgatgaatt gcaagattat 1980
aagaagatcg gttcaccttt ctctattccg aaagccgctc tgtcattggc aggctttgca 2040
cctgcgtttt ctgctgtatc ttatgcttca ttagaggaac agcttaaaga tttcggtgca 2100
ggtattgaag tgactttatt ggctgctatt cctgccggtt ccggtttggg caccagttcc 2160
attctggctt ctaccgtact tggtgccatt aacgatttct gtggtttagc ctgggataaa 2220
aatgagattt gtcaacgtac tcttgttctt gaacaattgc tgactaccgg aggtggatgg 2280
caggatcagt atggaggtgt gttgcagggt gtgaagcttc ttcagaccga ggccggcttt 2340
gctcaaagtc cattggtgcg ttggctaccc gatcatttat ttacgcatcc tgaatacaaa 2400
gactgtcact tgctttatta taccggtata actcgtacgg caaaagggat cttggcagaa 2460
atagtcagtt ccatgttcct caattcatcg ttgcatctca atttactttc ggaaatgaag 2520
gcgcatgcat tggatatgaa tgaagctata cagcgtggaa gttttgttga gtttggccgt 2580
ttggtaggaa aaacctggga acaaaacaaa gcattggata gcggaacaaa tcctccggct 2640
gtggaggcaa ttatcgatct gataaaagat tataccttgg gatataaatt gccgggagcc 2700
ggtggtggcg ggtacttata tatggtagcg aaagatccgc aagctgctgt tcgtattcgt 2760
aagatactga cagaaaacgc tccgaatccg cgggcacgtt ttgtcgaaat gacgttatct 2820
gataagggat tccaagtatc acgatcataa 2850
<210> 6
<211> 903
<212> DNA
<213> Helicobacter pylori
<400> 6
atggctttta aagtggtgca aatttgtggg gggcttggga atcaaatgtt tcaatacgct 60
ttcgctaaaa gtttgcaaaa acaccttaat acgcccgtgc tattagacac tacttctttt 120
gattggagca ataggaaaat gcaattagag cttttcccta ttgatttgcc ctatgcgaat 180
gcaaaagaaa tcgctatagc taaaatgcaa catctcccca agttagtaag agatgcactc 240
aaatacatag gatttgatag ggtgagtcaa gaaatcgttt ttgaatacga gcctaaattg 300
ttaaagccaa gccgtttgac ttattttttt ggctatttcc aagatccacg atattttgat 360
gctatatcct ctttaatcaa gcaaaccttc actctacccc ccccccccga aaataataaa 420
aataataata aaaaagagga agaataccag cgcaagcttt ctttgatttt agccgctaaa 480
aacagcgtat ttgtgcatat aagaagaggg gattatgtgg ggattggctg tcagcttggt 540
attgattatc aaaaaaaggc gcttgagtat atggcaaagc gcgtgccaaa catggagctt 600
tttgtgtttt gcgaagactt aaaattcacg caaaatcttg atcttggcta ccctttcacg 660
gacatgacca ctagggataa agaagaagag gcgtattggg atatgctgct catgcaatct 720
tgcaagcatg gcattatcgc taatagcact tatagctggt gggcggctta tttgatggaa 780
aatccagaaa aaatcattat tggccccaaa cactggcttt ttgggcatga aaatattctt 840
tgtaaggaat gggtgaaaat agaatcccat tttgaggtaa aatcccaaaa atataacgct 900
taa 903

Claims (10)

1.一种高效生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌，其特征在于，组合调控磷酸甘露糖变位酶ManB，甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶ManC，GDP-甘露糖-6-脱氢酶Gmd，GDP-岩藻糖合成酶WcaG、L-岩藻糖1-激酶/GDP-岩藻糖焦磷酸化酶Fkp以及2-岩藻糖基乳糖合成酶FucT2的表达；所述调控表达是采用中拷贝表达元件调控ManB、ManC、Gmd、WcaG的表达，采用高拷贝表达元件调控Fkp和FucT2的表达。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，还敲除了β-半乳糖苷酶LacZ、UDP-葡萄糖脂质载体转移酶WcaJ和岩藻糖异构酶/墨角藻糖激酶FucI-FucK基因簇。
3.根据权利要求1或2所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述工程菌的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
4.根据权利要求1～3所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述工程菌的表达载体为pETuet-1和pCDFDuet-1。
5.根据权利要求1～4所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，以pCDFDuet-1表达manC-manB和gmd-wacG，以pETuet-1表达fkp和fucT2。
6.根据权利要求1～5所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，ManB、ManC、Gmd、WcaG、Fkp和FucT2的核苷酸序列依次为SEQ ID NO.1～6。
7.一种提高大肠杆菌产2’-岩藻糖基乳糖能力的方法，其特征在于，组合调控ManB、ManC、Gmd、WcaG、Fkp以及FucT2的表达。所述调控表达是采用中拷贝表达元件调控ManB、ManC、Gmd、WcaG的表达，采用高拷贝表达元件调控Fkp和FucT2的表达。
8.构建权利要求1所述大肠杆菌工程菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)构建敲除wacJ、lacZ和fucIK基因的大肠杆菌BL21(DE3)工程菌；
(2)分别以pETDuet-1和pCDFDuet-1为表达载体，构建过表达ManB-ManC-Gmd-WcaG和Fkp-FucT2的重组表达载体；
(3)将步骤(2)构建的pACYCDuet-1-ManB-ManC-Gmd-WcaG和pETDuet-1-Fkp-FucT2同时转化至步骤(1)构建的敲除wacJ、lacZ和fucIK基因的大肠杆菌BL21(DE3)工程菌。
9.一种生产2’-岩藻糖基乳糖的方法，是以权利要求1所述大肠杆菌工程菌为发酵微生物，以甘油或葡萄糖作为碳源，在含乳糖和L-岩藻糖的环境下合成2’-岩藻糖基乳糖。
10.权利要求1所述菌株在制备2’-岩藻糖基乳糖及其衍生产品中的应用。
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Assignee: Beijing Huaxi Rongxi Biotechnology Research Co.,Ltd.

Assignor: Jiangnan University

Contract record no.: X2023980054219

Denomination of invention: Construction method and application of a recombinant bacterium for efficient production of 2 '- fucosyllactose

Granted publication date: 20210528

License type: Exclusive License

Record date: 20231227

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