CN111607548A - 一种产甘露聚糖的重组大肠杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种产甘露聚糖的重组大肠杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。本发明采用来源于植物瓜尔豆的甘露聚糖合酶基因ManS，将其整合至T7启动子控制的pET21a质粒，将重组质粒在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中实现了甘露聚糖的异源合成，产量可以达到0.68g/L。本发明为微生物利用廉价碳源高效发酵制备甘露聚糖奠定了一定的基础，适合于工业化生产应用。

Description

一种产甘露聚糖的重组大肠杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种产甘露聚糖的重组大肠杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

甘露聚糖是一种半纤维素聚多糖，广泛存在与多种生命形式中。甘露聚糖作为一种优良的低热量、高纤维素的水溶性膳食纤维，被广泛应用于食品和医药等行业。甘露聚糖因其独特的分子结构和理化性质而具有独特的生物活性，能在机体内参与一些十分重要的生理过程，如刺激机体免疫应答，促进肠道内有益菌的营养生长，降低血清胆固醇含量等。

甘露聚糖广泛存在于魔芋粉、瓜尔豆胶、田著胶和石斛等植物体及多种微生物细胞壁内，当前商品化的甘露聚糖主要从魔芋和酵母细胞中提取而来。魔芋甘露聚糖提取分离工艺复杂，收率和纯度低；且魔芋甘露聚糖分子量高、粘稠度大，提纯后的产品还需要进一步通过降解制备为低聚甘露糖使用，产品质量不够稳定。尽管近些年来也有采用啤酒酵母进行发酵，从细胞壁中提取甘露聚糖，但局限于其产量水平很低以及复杂的提取工艺，难以实现工业化规模生产。因此，通过代谢工程手段实现异源重组高效微生物发酵法生产甘露聚糖被视为最有希望的一条替代生产途径。

发明内容

为了解决目前存在的问题，本发明提供了一种产甘露聚糖的重组大肠杆菌，是在大肠杆菌中完善甘露聚糖合成途径，实现了从葡萄糖为碳源开始直接发酵产甘露聚糖。

本发明在原核宿主大肠杆菌中构建甘露聚糖代谢合成途径，实现分泌合成甘露聚糖，基于大肠杆菌高效生产效率和易于培养等特性，适用于进行大规模发酵，产品易于分离纯化。该发明操作过程简单，且产品纯度高，易于实现工业化生产制备甘露聚糖。

本发明提供一种产甘露聚糖的重组大肠杆菌，所述大肠杆菌表达甘露聚糖合酶基因ManS，并过表达GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因manC和磷酸甘露糖酶基因manB。

在本发明的一种实施方式中，以E coli BL21(DE3)为出发菌株。

在本发明的一种实施方式中，所述甘露聚糖合酶基因ManS为来源于瓜尔豆的甘露聚糖合酶基因ctManS。

在本发明的一种实施方式中，所述GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因manC和磷酸甘露糖酶基因manB来源于E coli BL21(DE3)。

在本发明的一种实施方式中，所述ManS的GeneBank登录号为：AY372247.1。

在本发明的一种实施方式中，所述manC的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述manB的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，以pET21a为表达载体。

本发明还提供一种生产甘露聚糖的方法，在含有碳源的体系中，以IPTG作为诱导剂，以所述重组大肠杆菌为发酵菌株，在25～35℃下发酵45～50h。

在本发明的一种实施方式中，碳源选自：生物质碳源、蔗糖、果糖、葡萄糖中的一种或多种。

在本发明的一种实施方式中，将重组大肠杆菌活化得到菌液，将菌液接种于发酵培养基，在180～220rpm、25～35℃中培养至OD₆₀₀为0.5～1.0，加入终浓度0.05～0.2mM的IPTG作为诱导剂，诱导培养45～50h。

本发明保护所述重组大肠杆菌，或生产甘露聚糖的方法在化工领域制备甘露聚糖中的应用。

本发明的有益效果：本发明利用大肠杆菌产甘露聚糖，与其他野生菌相比，首先，本发明过程中使用的宿主具有较强的生长效率，胞外分泌杂质少，产品易于分离纯化；其次，以葡萄糖等廉价碳源为底物，可进行高密度发酵；再次，可以基于代谢工程和合成生物学手段强化甘露聚糖的合成途径，强化细胞产甘露聚糖的水平，产量可以达到0.68g/L。基于上述分析，本发明方法在工业上用于制备甘露聚糖具有潜在而非常广泛的价值。

附图说明

图1为重组甘露聚糖合酶质粒构建示意图。

图2为重组甘露聚糖合成途径操纵子质粒构建示意图。

图3为重组工程菌株摇瓶发酵产甘露聚糖。

具体实施方式

发酵培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨2g/L，MgSO₄ 1.5g/L，磷酸盐缓冲液50mM，葡萄糖浓度为10g/L，氨苄青霉素浓度为100μg/mL。

HPLC进行定量分析：以D-甘露糖为标准品，配制浓度1-50mg/mL之间的浓度进行HPLC检测，绘制标准曲线。提取的甘露聚糖产物采用3M HCl在80℃热水中进行水解1h，然后反应物采用NaOH溶液调整pH至7.0，所得的水解产物作适当吸收后，进行HPLC检测。色谱柱：Sugar-D；流动相：乙腈-超纯水(体积比80:20)；流速，1.0μL/min；柱温及检测器温度：50℃；进样量：10μL；检测器：RI。

实施例1：甘露聚糖合酶基因的克隆与重组构建

根据NCBI基因组信息库数据查询，瓜尔豆来源的甘露聚糖合酶基因的cDNA序列进行核酸序列优化，人工合成ctManS基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)。

根据质粒pET21a，设计引物E/ctManS-F和E/ctManS-R；采用引物对E/ctManS-F和E/ctManS-R对ctManS基因序列进行PCR扩增，回收产物经BamHI和SalI限制性内切酶进行双酶切；质粒pET21a采用经BamHI和SalI限制性内切酶进行双酶切。

将片段ctManS和pET21a载体进行重组，采用T4DNA连接酶16℃过夜连接；连接产物转化大肠杆菌JM109感受态，将转化后的菌液经100μg/mL的氨苄青霉素LB平板筛选(37℃培养至长出单克隆)，利用引物E/ctManS-F和E/ctManS-R对单克隆菌落进行PCR鉴定并测序验证后，得到阳性转化子，对阳性转化子在LB液体培养基中培养，并提取重组质粒pET21a-ctmanS。

将提取获得重组质粒pET21a-ctmanS转化BL21(DE3)感受态细胞，经100μg/mL的氨苄青霉素LB平板筛选，再进行PCR菌落鉴定和DNA测序鉴定，确定正确的阳性重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET21a-ctmanS(图1)。

引物序列：5’-3’方向

E/ctManS-F：CGCGGATCCATGCGTAATCTGATTTTCGAAGAAC(SEQ ID NO.5)，

E/ctManS-R：CCGGTCGACTTAGGTCGGCACAATGGTGCCAACC(SEQ ID NO.6)。

实施例2：甘露聚糖合成途径基因操纵子的构建

为了进一步从代谢途径上强化甘露聚糖的合成效率，构建其上游合成途径基因manC-manB操纵子(图2)。

根据E.coli BL21(DE3)基因组信息，对要克隆的manC和manB基因设计引物进行PCR扩增。为了将manC-manB片段重组至实施例1构建得到的pET21a-ctmanS中，在引物对E/manC-F和E/manB-R中分别引入SalI和XhoI限制性酶切位点。

以E.coli BL21(DE3)基因组为模版，采用引物E/manC-F和E/manB-R扩增manC-manB片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)，经回收的DNA片段SalI和XhoI限制性内切酶进行双切，重组质粒pET21a-ctmanS采用SalI和XhoI限制性内切酶进行双切；随后将回收的manC-manB片段与pET21a-ctmanS载体进行重组连接，采用T4 DNA连接酶16℃过夜连接；连接产物转化大肠杆菌JM109感受态，经100μg/mL的氨苄青霉素LB平板筛选，经PCR菌落鉴定和测序验证后，得到阳性转化子，对阳性转化子在LB液体培养基中培养，并提取重组质粒pET21a-ctmanS-manCB；将提取获得重组质粒pET21a-ctmanS-manCB转化BL21(DE3)感受态细胞，经100μg/mL的氨苄青霉素LB平板筛选，再进行PCR菌落鉴定和DNA测序鉴定，测序正确的阳性重组菌株为E.coli BL21(DE3)/pET21a-ctmanS-manCB。

引物序列：5’-3’方向

E/manC-F：CCGGTCGAC AGAAGGAGATATACATATGAGCTCACCTCTTATTCCGGTT(SEQ IDNO.7)，

E/manB-R:CGGCTCGAGTTACTTGTTCAGTAACTCAAGGAT(SEQ ID NO.8)。

实施例3：重组枯草芽孢杆菌菌株的摇瓶发酵

挑取实施例1中的重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET21a-ctmanS和实施例2中的E.coli BL21(DE3)/pET21a-ctmanS-manCB单克隆接种于5mL LB培养基(含100ug/mL氨苄青霉素)，置于200rpm 37℃过夜培养。16h后接种1mL菌液于含100mL发酵培养基的250mL三角摇瓶中，摇瓶置于200rpm 37℃培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，添加终浓度为0.1mM诱导剂IPTG诱导操纵子基因表达，随后摇瓶置于30℃、200rpm培养48h。

发酵结束后收集发酵液，10000rpm下4℃离心10min，收集发酵液上清液，发酵液上清采用3倍体积的无水乙醇进行沉淀甘露聚糖产物，10000rpm下4℃离心10min；此过程重复2-3次后，收集沉淀，将沉淀用2mL溶解，保存至-80℃冰箱。

对照组为E.coli BL21(DE3)/pET21a菌株同等条件下发酵液的回收物。产物经水解后用HPLC进行定量分析，结果显示：对照菌株不产甘露聚糖，实施例1和2制备得到的重组菌甘露糖产量分别为0.37g/L，0.68g/L(图3)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江农林大学

<120> 一种产甘露聚糖的重组大肠杆菌及其应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1581

<212> DNA

<213> Cyamopsis tetragonoloba

<400> 1

atgagaaacc taatcttcga ggagcctgaa gggattccag gcaacagttc aagcagtctg 60

cgctatgcct ggcaatcaat tcgtgcccca gtgatcatac ctcttctaaa actagcagtc 120

atagtgtgct cagttatgtc aatcatgcta tttgttgaaa gagtagccat ggcagctgta 180

attttgattg tcaaagtgct gaggaagaaa agatacacca agtataactt ggaagccatg 240

aaacagaagc tagagagaag caaaaaatac cccatggtgc tgatccaaat acctatgtat 300

aacgagaaag aggtgtacaa gctttccatt ggagcagtat gtgggctttc atggccagct 360

gacaggttca tagttcaagt tcttgatgac tcaacaaatc cagtcttaag ggagttggtt 420

gaaatggagt gtcaaaaatg gatacagaaa ggtgtgaatg tcaagtatga aaataggaga 480

aatcgcaatg gttacaaagc aggtgcctta aaagagggtt tggagaagca atatgtagag 540

gattgtgagt ttgtagcaat atttgatgca gatttccaac cagatgcgga ttttctttgg 600

aacacaattc cttatctgct ggaaaatcca aagttgggtt tggttcaggc gagatggaaa 660

tttgtgaact cagaagaatg tatgatgaca cggcttcaag agatgtcact agattaccac 720

tttagtgttg aacaggaagt cggctcttca acatactcat tcttcggttt caatggaaca 780

gcaggagttt ggcggatcca agccataaaa gatgctggag gatggaaaga ccgaacaacg 840

gtggaggata tggaccttgc agttagagca agcttgcatg gctgggaatt tgtttttgtg 900

ggtgatgtaa aggtcaaaaa tgaattacca agtacattta aagcatatcg atttcagcag 960

cacaggtggt catgcggtcc agctaatctc tttaagaaaa tgaccaagga aatcatctgt 1020

tgcaaaaggg tgccacttct caagagactc catctcatct atgctttctt ctttgtgaga 1080

aaaatagttg cacactgggt tacgttcttc ttttactgca tagttatacc agcttgtgtg 1140

atagttcccg aagttaatct caaaaagcag attgccatat acatcccagc aaccattaca 1200

attctaaatg cagtctccac cccaagatcc atgcatctac tagtactctg gatactcttt 1260

gagaatgtca tgtcactcca tcgaactaaa gcagcaatta ttggactctt ggaagcaaat 1320

cgtgtcaatg aatgggttgt gactgagaag cttggaaatg ccatgaaaca gaggaacaat 1380

gctaggccat caagagcttc acggtttcga attatagaaa ggatccaccc attggagatt 1440

atagtgggga tgtatatgct gcactgtgca acctatgacc tgttattcgg acacgaccat 1500

ttctttgtct atcttctgtt gcaggcaggg gcgttcttta caatgggatt tggcctagta 1560

ggaacaattg tacccaccta a 1581

<210> 2

<211> 1425

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 2

atgagctcac ctcttattcc ggttatatta agtggtggta atggtactag gttatggcca 60

ctatctagag aggaatatcc taagcagttt ttaaaactaa ccgactcaat atcaatgctg 120

caatcaacaa tatctcggtt agactcatta aatacttcct ctccagttgt aatatgcaat 180

gaattacaca gatttattgt tgcagaacaa ctcaggcact taaataaatt agataataat 240

attattttag aaccatctgg tcgcaatact gcacctgcta tttgtattgc tgctttaatt 300

ttaaaaatga agcatccaaa tgaaaatcca cttatgctcg ttcttccagc cgatcactcc 360

gtaaaaaaag tcaaaacttt ttgtaataca ataaaaagtg ctattccctt cgctgaagct 420

ggtaatttgg tttcttttgg tattaaacct actcatcctg agacggggta tggatatata 480

caaaaaggca aagtgttatc tgattctgat atatatgagg tcagtgaagt tagaactttt 540

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aatagtggta tgtatttgtt tagtgttgaa cgttacttac aagagttatc attataccga 660

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attagattgg acgataaaat atttcggaac tgtccacagg agtctattga ttatgctgta 780

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gacatcgttt gccacgagac agaaaatagt tatatttata ctgagtctgg attggtagca 960

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cgcgattcag tacaaaatgt aaaaaatatt gttcagcatc ttgatttgtc aggacgtaaa 1080

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attaagcata gtttggaaaa tattgggaca ataccacttg tgttaataga agtttggacc 1380

ggttcttatc ttgctgatga tgatatcctt cgatttgaag attaa 1425

<210> 3

<211> 1365

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 3

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gcctttgatg gcgattttga ccgctgtttc ctgtttgacg aaaaagggca gtttatcgag 780

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atggaagaaa agacaaaact tatccttgag ttactgaaca agtaa 1365

<210> 4

<211> 2823

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 4

atgagctcac ctcttattcc ggttatatta agtggtggta atggtactag gttatggcca 60

ctatctagag aggaatatcc taagcagttt ttaaaactaa ccgactcaat atcaatgctg 120

caatcaacaa tatctcggtt agactcatta aatacttcct ctccagttgt aatatgcaat 180

gaattacaca gatttattgt tgcagaacaa ctcaggcact taaataaatt agataataat 240

attattttag aaccatctgg tcgcaatact gcacctgcta tttgtattgc tgctttaatt 300

ttaaaaatga agcatccaaa tgaaaatcca cttatgctcg ttcttccagc cgatcactcc 360

gtaaaaaaag tcaaaacttt ttgtaataca ataaaaagtg ctattccctt cgctgaagct 420

ggtaatttgg tttcttttgg tattaaacct actcatcctg agacggggta tggatatata 480

caaaaaggca aagtgttatc tgattctgat atatatgagg tcagtgaagt tagaactttt 540

gttgaaaagc ctaatcttaa aacagcagaa agctttatag aaaaagatga gtattattgg 600

aatagtggta tgtatttgtt tagtgttgaa cgttacttac aagagttatc attataccga 660

ccagacatag ttaaagtatg ccaggaaact gttaaaaata ttcattatga tatggatttt 720

attagattgg acgataaaat atttcggaac tgtccacagg agtctattga ttatgctgta 780

atggagaaaa caaaggatgc tgtagttgct acaatggata tcggttggaa tgatgtagga 840

gcatggtctt cgctttggga attagggaaa aaagactcct ctggtaatgt tatcacggga 900

gacatcgttt gccacgagac agaaaatagt tatatttata ctgagtctgg attggtagca 960

actattggta ttcaagatct tgttattatt catactaaag attcattact ggtttccaga 1020

cgcgattcag tacaaaatgt aaaaaatatt gttcagcatc ttgatttgtc aggacgtaaa 1080

gaacataaag aacataggga agtattcaag tcatggggac gatgtgactc catagatagt 1140

agtgaaaagt accactatca ggtcaaacga ataacagtta atccaagtga aaaattatcg 1200

ttgcaattac atcatcaccg tgcggaacat tgggttgttg taatggggat tgctaaagtt 1260

acagttgcag aagaaataaa aattttaaaa gagaatgagt ctgtatatat tcctgcaggt 1320

attaagcata gtttggaaaa tattgggaca ataccacttg tgttaataga agtttggacc 1380

ggttcttatc ttgctgatga tgatatcctt cgatttgaag attaatatgg tagagcttag 1440

aaatagagag tcttaataat gctaacttgc tttaaagctt atgatattcg cgggaaacta 1500

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tccgggaatg gcgcggcggg gccggtggtg gacgccattg aagcccgctt taaagccctc 2040

ggcgcaccgg tggaattaat caaagtacac aacacgccgg acggcaattt ccccaacggt 2100

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gtgaccgccg cgggcggcac tccggtgatg tcgaaaaccg gacacgcctt tattaaagaa 2400

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gatttcgctt actgcgacag cggcatgatc ccgtggctgc tggtcgccga actggtgtgt 2520

ctgaaaggaa aaacgctggg cgaactggtg cgcgaccgga tggcggcgtt tccggcaagc 2580

ggtgagatca acagcaaact ggcgcacccc gttgaggcga ttaatcgcgt cgaacagcat 2640

tttagccgcg aggcgctggc ggtggatcgc accgatggca tcagcatgac ctttgccgac 2700

tggcgcttta acctgcgctc ctccaacacc gaaccggtgg tgcggttgaa tgtggaatcg 2760

cgcggtgatg taccgctgat ggaagaaaag acaaaactta tccttgagtt actgaacaag 2820

taa 2823

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgcggatcca tgcgtaatct gattttcgaa gaac 34

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccggtcgact taggtcggca caatggtgcc aacc 34

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

agaaggagat atacatatga gctcacctct tattccggtt 40

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cggctcgagt tacttgttca gtaactcaag gat 33

Claims (10)

1.一种产甘露聚糖的重组大肠杆菌，其特征在于，在大肠杆菌中表达甘露聚糖合酶基因，并过表达GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因和磷酸甘露糖酶基因。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述甘露聚糖合酶基因的GeneBank登录号为：AY372247.1。

3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述磷酸甘露糖酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以E coli BL21(DE3)为宿主。

5.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以pET21a为表达载体。

6.一种生产甘露聚糖的方法，其特征在于，在含有碳源的体系中，加入权利要求1～5任一所述的重组大肠杆菌，生产甘露聚糖。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述碳源包含：生物质碳源、蔗糖、果糖、葡萄糖中的一种或多种。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将权利要求1所述重组大肠杆菌培养至OD₆₀₀为0.5～1.0，加入诱导剂培养。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，诱导剂为IPTG，终浓度0.05～0.2mM。

10.权利要求1～5任一所述重组大肠杆菌，或权利要求6～9任一所述方法在化工领域制备甘露聚糖中的应用。

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