CN113106112B - 一种异源表达黄原胶内切酶的基因工程菌及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种异源表达黄原胶内切酶的基因工程菌及应用，属于基因工程技术领域。本发明通过在枯草芽孢杆菌中表达黄原胶内切酶基因EX，启动子P43和信号肽PhoD，使黄原胶内切酶高效表达，酶活最高可达到38U/mL。根据工业上对黄原胶降解产物相对分子量的不同需求，可以通过调节黄原胶内切酶酶促反应的反应条件，在pH 5～8，温度35℃～55℃，转速0～200r/min的条件下反应4～16h，得到不同的相对分子量的低分子量黄原胶。

Description

一种异源表达黄原胶内切酶的基因工程菌及应用
技术领域
本发明涉及一种异源表达黄原胶内切酶的基因工程菌及应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
黄原胶是由野油菜黄单孢菌分泌的一种胞外杂多糖，由若干个五糖基本重复单元构成，β-1,4-糖苷键相连的葡萄糖构成主链，甘露糖→葡萄糖醛酸→甘露糖组成其侧链，分子量一般在2×106～2×107Da之间。低分子量黄原胶具有抗氧化、抑菌、抗肿瘤等特殊生物活性，在各个领域都有所应用，具有较高的市场价值。因此，黄原胶降解工艺的研究对于工业生产和生活具有重要的意义。相对于物理法和化学法，酶法降解法具有反应条件温和、选择性相对较好、产物结构可控等优点，越来越受到关注。尽管黄原胶的主链与纤维素相同，但由于规则的螺旋结构的保护以及侧链所产生的位阻，使得一般的蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶等都很难将其降解。研究发现，Microbacterium sp.XT11能有效降解黄原胶，从其中分离出一种黄原胶内切酶能直接作用于黄原胶主链，从而使黄原胶分子量降低。但其分离纯化工艺复杂，难以分离出纯度较高的黄原胶内切酶。
目前，大肠杆菌是应用最广泛、研究最深入的原核表达系统。因为大肠杆菌表达系统具有遗传背景清晰、分子操作简单、容易培养、发酵周期短、发酵成本低廉等优势，是表达重组蛋白最常用的宿主之一。但大肠杆菌是一种病原性菌株，含有内毒素，对人体和其他哺乳动物都具有副作用，外分泌能力较差，外源蛋白通常为胞内表达，而且外源性重组蛋白在大肠杆菌中表达往往会形成包涵体，不能有效正确折叠。虽然这些问题通过基因工程改造以及发酵条件优化，可以得到一定程度的解决，但是在表达食品工业用酶时，其含有内毒素的劣势始终无法得到解决，所以在表达大分子量的食品工业酶时需要慎重选择表达宿主菌株。相比之下，枯草芽孢杆菌是一个优选的菌株。首先，枯草芽孢杆菌具有大肠杆菌无法比拟的优势，它被美国食品和药物管理局(FDA)列为公认安全微生物，不含内毒素；其次，枯草芽孢杆菌发酵条件简单，周期短，具有有效的分泌途径，能指导外源重组蛋白直接分泌到培养基中，从而有利于外源蛋白的纯化。鉴于它的有效分泌能力，在胞内形成的包涵体就会减少，产生更多折叠正确、有活性的酶。
启动子是枯草芽孢杆菌高效表达目的蛋白的关键元件之一，启动子的转录强度严重影响着外源蛋白的表达量，启动子分为诱导型、时期特异型、组成型和自诱导型。诱导型启动子是指在发酵过程中需要添加化合物诱导或受环境变化来控制基因转录的一类启动子。组成型启动子是一类能够持续表达目的蛋白，且在发酵生产过程中不需要添加任何诱导物的启动子。时期特异性启动子是转录组学分析发系统无需任何诱导剂的添加，就会在特定的生长阶段启动目的基因的转录，还有一部分基因在其它生长周期表达。自诱导启动子在发酵过程中不需要任何诱导，就可以表达目的基因。
发明内容
本发明要解决的而技术问题是提供一种外源高效表达黄原胶内切酶的枯草芽孢杆菌。
本研究首次利用枯草芽孢杆菌外源表达黄原胶内切酶，并对其启动子，信号肽进优化，使得枯草芽孢杆菌能高效表达黄原胶内切酶，并对其酶学性质进行了初步探索，为黄原胶的水解提供的一条新的途径，为高效制备低分子量黄原胶提供一种新的方法。
本发明的第一个目的是提供一种编码黄原胶内切酶的基因，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
本发明的第二个目的是提供携带上述编码黄原胶内切酶基因的载体。
本发明的第三个目的是提供表达上述编码黄原胶内切酶的基因或表达上述编码黄原胶内切酶基因的载体的细胞。
本发明的第四个目的是提供一种基因工程菌，以pHT01为表达载体，在枯草芽孢杆菌中过表达上述黄原胶内切酶基因；黄原胶内切酶基因前连有启动子和信号肽PhoD；所述启动子为启动子PsrfA或启动子P43。
在一种实施方式中，所述基因工程菌，以pHT01为表达载体，在枯草芽孢杆菌中过表达上述黄原胶内切酶基因；黄原胶内切酶基因前连有启动子P43和信号肽PhoD。
在一种实施方式中，编码所述黄原胶内切酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述启动子PsrfA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2，所述启动子P43的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，信号肽PhoD的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌WB800n。
本发明的第五个目的是提供一种构建上述基因工程菌的方法，连接启动子基因片段、信号肽基因片段和黄原胶内切酶基因片段并插入到载体pHT01获得重组质粒；将重组质粒转化至枯草芽孢杆菌获得基因工程菌。
在一种实施方式中，所述黄原胶内切酶基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
发明的第六个目的是提供所述基因工程菌生产黄原胶内切酶的方法。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是将上述基因工程菌在种子培养基中活化，获得种子液；将种子液以体积比1％的接种量接种于发酵培养基中，发酵获得发酵液；将发酵液离心并纯化获得黄原胶内切酶。
在一种实施方式中，所述发酵的反应条件为：35～39℃，180～220rpm的条件下培养20～30h。
在一种实施方式中，所述种子培养基为：8～12g/L蛋白胨、3～7g/L酵母提取物、8～12g/LNaCl。
在一种实施方式中，所述发酵培养基为：10～15g/L胰蛋白胨、22～25g/L酵母提取物、2～6mL/L甘油、70～75mM K2HPO4、15～20mM KH2PO4。
本发明的第七个目的是提供所述基因工程菌生产的发酵上清液水解黄原胶的方法。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是将发酵上清液与黄原胶等比例的添加至反应体系中，在pH 5～8，温度35℃～55℃，转速0～200r/min的条件下反应4～16h。
在本发明的一种实施方式中，所述黄原胶的终浓度为0.3％～0.7％。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵上清液的制备方法是：将上述基因工程菌在种子培养基中活化，获得种子液；将种子液以体积比1％的接种量接种于发酵培养基中，培养获得发酵液；将发酵液离心获得发酵上清液。
在一种实施方式中，所述种子培养基为：8～12g/L蛋白胨、3～7g/L酵母提取物、8～12g/LNaCl；所述发酵培养基为：10～15g/L胰蛋白胨、22～25g/L酵母提取物、3～5mL/L甘油、70～75mM K2HPO4、15～20mM KH2PO4。
在一种实施方式中，所述发酵的反应条件为：35～39℃，180～220rpm的条件下培养20～30h。
本发明还要求保护所述基因工程菌在制备含黄原胶内切酶的产品方面的应用。
有益效果
(1)本发明通过在枯草芽孢杆菌中表达黄原胶内切酶基因EX，启动子P43和信号肽PhoD，使黄原胶内切酶高效表达，酶活最高可达到38U/mL。
(2)根据工业上对黄原胶降解产物相对分子量的不同需求，可以通过调节黄原胶内切酶酶促反应的反应条件，在pH 5～8，温度35℃～55℃，转速0～200r/min的条件下反应4～16h，得到不同的相对分子量的低分子量黄原胶。
附图说明
图1重组质粒pHT01-PsrfA-PhoD-EX构建图谱；
图2重组质粒pHT01-P43-PhoD-EX构建图谱；
图3重组质粒pHT01-PsrfA-PhoD-EXPCR验证电泳图；M1：DNAmarker DL 2000；1：PsrfA基因片段PCR结果电泳图；2：PhoD基因片段PCR结果电泳图；3：EX基因片段PCR结果电泳图；4：PsrfA-PhoD-EX基因片段PCR结果电泳图；M2：DNAmarker DL 10000。
图4重组质粒pHT01-P43-PhoD-EXPCR验证电泳图；M1：DNAmarker DL 2000；1：P43基因片段PCR结果电泳图；2：PhoD基因片段PCR结果电泳图；3：EX基因片段PCR结果电泳图；4：P43-PhoD-EX基因片段PCR结果电泳图；M2：DNAmarker DL 10000。
具体实施方式
(1)下述实施例中涉及的黄原胶内切酶(GenBank:ALX66163.1)来源于黄原胶降解菌(Microbacterium sp.XT11)；下述实施例中涉及的枯草芽孢杆菌WB800n，质粒pHT01均为商业化菌株和质粒，本实验室保藏。
(2)黄原胶内切酶酶活测定方法：BCA工作液由等体积的SolutionA和Solution B均匀混合而成，配制100μM的葡萄糖溶液做储液，将葡萄糖储液稀释成0-100μM 11个不同浓度梯度作为标准液(均为三个平行样)。取1mL葡萄糖标准液迅速加入1mLBCA工作液，混匀，75℃水浴30min，迅速取出放在冰上冷却至室温，测定OD560处的吸光值，空白加入等体积的蒸馏水。根据以葡萄糖标准液的还原糖浓度及OD560处吸光值数据绘制标准曲线。取1mL反应液迅速加入1mLBCA工作液，混匀，75℃水浴30min，迅速取出放在冰上冷却至室温，测定OD560处的吸光值，根据标准曲线确定黄原胶内切酶酶活。
黄原胶内切酶酶活力计算方法：每分钟释放1μM还原糖所需的酶量为1U，酶活单位：U/mL。
(3)培养基
复苏培养基：10g/LNa Cl、10g/L蛋白胨、5g/L酵母浸粉、0.5M山梨醇、0.38M甘露醇；
含氯霉素(30μg/mL)抗性平板：10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/LNaCl、20g/L琼脂、氯霉素溶液(1.0g氯霉素溶解于10mL无水乙醇中)。
LB培养基：10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/LNaCl；
TB培养基：12g/L胰蛋白胨、24g/L酵母提取物、4mL/L甘油、72mM K2HPO4、17mMKH2PO4。
实施例1基因工程菌的构建
步骤1：根据NCBI处获得黄原胶内切酶的氨基酸序列(GenBank:ALX66163.1)设计得到SEQ ID NO.1所示的基因序列，启动子PsrfA基因序列(SEQ ID NO.2)，启动子P43基因序列(SEQ ID NO.3)，由生工生物工程(上海)股份有限公司分别进行全基因合成。
步骤2：以步骤1人工合成的PsrfA基因为模板，以PsrfA-F、PsrfA-R为引物，PCR扩增得到PsrfA基因片段；以枯草芽孢杆菌WB800n基因组为模板，以PhoD-F、PhoD-R为引物，PCR扩增得到PhoD基因片段；以步骤1中人工合成的黄原胶内切酶基因EX为模板，以EX-F、EX-R为引物，PCR扩增得到EX基因片段，再通过重叠PCR的方法将PsrfA基因片段、PhoD基因片段和EX基因片段连接扩增得到PsrfA-PhoD-EX基因片段。将PsrfA-PhoD-EX基因片段连接到pZERO-Blunt平末端构成重组质粒pZERO-PsrfA-PhoD-EX进行基因测序。测序正确后，用限制性内切酶BamH I/AatII分别对重组质粒pZERO-PsrfA-PhoD-EX和载体pHT01进行双酶切并回收PsrfA-PhoD-EX基因片段和载体片段，再用T4连接酶连接两个片段得到重组载体pHT01-PsrfA-PhoD-EX并进行测序验证(图1、图3)。
再用同样的方法得到重组载体pHT01-P43-PhoD-EX，其中以步骤1人工合成的启动子P43基因序列为模板，利用引物P43-F、P43-R扩增得到P43基因片段(图2、图4)。
步骤3：将实验室保存的枯草芽孢杆菌WB800n接种于LB培养基，活化，制备枯草芽孢杆菌WB800n感受态。
步骤4：将步骤2中构建的重组质粒pHT01-PsrfA-PhoD-EX和pHT01-P43-PhoD-EX通过电转的方法(电击条件为2000V、5ms)分别转入步骤3中制备的枯草芽孢杆菌WB800n感受态中，加入1mL复苏培养基于37℃复苏3h后，涂布于含氯霉素(30μg/mL)抗性平板上。
步骤5：将步骤4含氯霉素(30μg/mL)抗性平板上生长的单菌落以P43-F、EX-R为引物进行菌落PCR验证。
步骤6：将步骤5中验证成功的阳性转化子通过摇瓶发酵进行分析，筛选酶活较高的重组菌，获得表达黄原胶内切酶基因的重组枯草芽孢杆菌WB800n-pHT01-PsrfA-PhoD-EX和WB800n-pHT01-P43-PhoD-EX。
表1基因序列表
表2引物表
实施例2不同启动子及信号肽对黄原胶内切酶酶活的影响
(1)将实施例1中构建的可成功分泌表达黄原胶内切酶基因的2株重组枯草芽孢杆菌WB800n-pHT01-PsrfA-PhoD-EX和WB800n-pHT01-P43-PhoD-EX，分别在50mL的液体LB培养基(含氯霉素抗性，30μg/mL)中活化培养，在37℃，200rpm的条件培养12h，即得到活化后的种子液，然后按体积比1％的接种量将种子液转接到100mL的液体TB培养基(含氯霉素抗性，30μg/mL)中发酵培养，在37℃，200rpm的条件下培养24h获得发酵液。
(2)将发酵液在4℃、8000r·min-1下离心10min，弃去沉淀，获得粗酶液，将粗酶液在50kDa的透析袋透析2～3d，在-40℃预冷冻好进行冷冻干燥浓缩，然后将其过0.22μm滤膜得到预处理好的样品。采用Avant蛋白纯化系统将经过预处理好的样品经过阴离子交换柱(HiTrap QFF 5mL)进行分离，平衡相为pH 9.0的10mmol·L-1的PBS缓冲液，4mL·min-1流速，平衡约10～20个柱体积。用泵上好样后，再以含0～50％pH 9.0的10mmol·L-1的PBS缓冲液进行线性洗脱，流速为4mL·min-1，紫外检测波长为218nm，收集每个峰测定酶活。之后将具有酶活的峰进行透析，除去其中的盐离子。最后，采用/>Avant蛋白纯化系统，将经过阴离子交换柱初步纯化后的有酶活的峰进行体积排阻层析(Superdex G100)进行分离，平衡相为pH 9.0的10mmol·L-1的PBS缓冲液，0.5mL·min-1流速，平衡约1～2个柱体积，用Loop环上好样，流速为0.5mL·min-1，紫外检测波长为218nm，收集峰尖测定酶活。之后将具有酶活的峰进行透析，除去其中的盐离子，得到黄原胶内切酶的纯酶液。
(3)在400μL反应体系中，0.1mg/mL步骤(2)中获得的纯酶液(10mM PBS为缓冲液)与终浓度为0.5％黄原胶等体积混合，充分混匀，在40℃水浴反应20min，沸水浴10min终止反应，空白为灭活的酶液(沸水中灭活10min)。
结果如表3示，重组枯草芽孢杆菌WB800n-pHT01-P43-PhoD-EX表达的黄原胶内切酶的比酶活比重组枯草芽孢杆菌WB800n-pHT01-PsrfA-PhoD-EX高27％，所以选择重组枯草芽孢杆菌WB800n-pHT01-P43-PhoD-EX做后续研究。
表3不同启动子及信号肽对酶活的影响
实施例35L发酵罐发酵生产黄原胶内切酶
将实施例1中构建的可成功分泌表达黄原胶内切酶基因的2株重组枯草芽孢杆菌WB800n-pHT01-PsrfA-PhoD-EX和WB800n-pHT01-P43-PhoD-EX，分别在50mL的液体LB培养基(含氯霉素抗性，30μg/mL)中活化培养，在37℃，200rpm的条件培养12h，即得到活化后的种子液，然后按体积比1％的接种量将种子液转接到100mL的液体TB培养基(含氯霉素抗性，30μg/mL)中发酵培养，在37℃，200rpm的条件下培养24h获得发酵液。
将实施例1中构建的重组枯草芽孢杆菌WB800n-pHT01-P43-PhoD-EX在装有TB培养基的5L发酵罐进行发酵培养，发酵罐总装液量为3L，将发酵液以体积比1％的接种量接种至TB培养基中，控制搅拌转速500r/min，通风量0.3vvm，温度37℃，初始pH 7.0，发酵前8h的pH会随着菌体的生长达到8.0，然后控制酸碱的流加，将pH控制在8.0，至32h发酵结束获得发酵液，将发酵液离心获得发酵上清液。
实施例4温度对黄原胶内切酶活力的影响
在1L体系内等体积加入实施例3中的重组枯草芽孢杆菌WB800n-pHT01-P43-PhoD-EX发酵所产生的发酵上清液与0.5％黄原胶，混匀后，分别在25℃、35℃、45℃、55℃、65℃下反应1h，煮沸10min终止反应。对照组为灭活的酶液(沸水中灭活10min)。检测反应体系中的还原糖浓度，计算酶活。结果如表2所示。
表4温度对黄原胶内切酶活力的影响
实施例5pH对黄原胶内切酶活力的影响
在1L体系内等体积加入实施例3中的重组枯草芽孢杆菌WB800n-pHT01-P43-PhoD-EX发酵所产生的发酵上清液与0.5％黄原胶，调节体系pH分别为4、5、6、7、8，反应1h后，煮沸10min终止反应。对照组为灭活的酶液(沸水中灭活10min)。检测反应体系中的还原糖浓度，计算酶活。结果如表3所示。
表5 pH对黄原胶内切酶活力的影响
实施例6不同反应时间对黄原胶内切酶的降解产物的影响
在1L体系内等体积加入实施例3中的重组枯草芽孢杆菌WB800n-pHT01-P43-PhoD-EX发酵所产生的发酵上清液与0.5％黄原胶，在最适反应条件即45℃，pH 7下，反应时间分别为0、4、8、12、16h，对其产物分子量进行测定。结果如表4所示，反应时间不同，可以降解得到不同相对分子质量的低分子量黄原胶。
表6黄原胶内切酶的降解产物研究
实施例7不同转速对黄原胶内切酶的降解产物的影响
在1L体系内等体积加入实施例3中的重组枯草芽孢杆菌WB800n-pHT01-P43-PhoD-EX发酵所产生的发酵上清液与0.5％黄原胶，调整体系pH为7，将体系置于恒温震荡水浴锅中，调整温度45℃，转速分别为0、50、100、150、200r/min，反应8h，对其产物分子量进行测定。结果如表5所示，转速不同，可以降解得到不同相对分子质量的低分子量黄原胶。
表5黄原胶内切酶的降解产物研究
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种异源表达黄原胶内切酶的基因工程菌及应用
<130> BAA210076A
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2856
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgtctagac gtagagcctc ttctatgtgg agaggtgctg ctgttgttac tgctgttgtt 60
cttggtggtg ctgtgatcgc tgccccacca gctgctgctg ccaccattga caaggttact 120
gtttctcaag ctggttactc cgcttccggt tataaggttg gttttgctgt tgctgactct 180
gctgtcccag gttcaacctc ttgcagattg ctgcaaggtg agaccgttgt gttgccatct 240
tgtacattat tagatagggg tactacttgg ggagatagag tttatcaagt tgatttctct 300
gcctttgatg atgttggaac tgattttgct ttggaaattg gtggtgttag atctccaaga 360
ttcgctattg aagataacgt ttggtctgga tatttggacg aaatgatcgc tttctacaga 420
ttgcaaagaa gtggtatgga tactgaagat gcttatccag caggttactc atctatcgct 480
ccatctgata aagttttcca cgctgccggt catttggatg atgctgcttc tgaggacgga 540
actcaacact atgatctgac tggtggatgg tatgacgcag gtgactacgg tatctacggt 600
ggtaatcaat gggttgccgg taacatcgct atttcttact tgagatatgg agatactcct 660
gcagtcggtt ttgacggaga ttctaacgga gttccagact tagttgacga agcttggttt 720
ggttctgaat atttgttgag aatgttggat gctttcggag gtccattttg ggatgttaaa 780
ggttctggtg gttttagaca tcctgaattt catactgacg gtgttattgg tacagctgat 840
gatagaagag tttctggaat gggagttggt ggtagtgcta aagcttctgg tagtctagct 900
gctaccgcta gagctattag ggctgctatt gattctggag atattgatgc tggagctgct 960
gcttcttggg agactagagc agctgaagca gaagaagctg ctgtcgcttt ctatgaatat 1020
gccgatactc atagaggtga ccctcttggt ggttactcta ctactagagg tggtattgca 1080
aattcattgt tgtttgctga agttcaattg tatctgctga gtggagatgc tgcttataga 1140
acctccgctg aggctactat tgccgcaact ccttttacta tcttgtcatc aacaaactat 1200
tgggatatgg ctcctctttc tatggctgag ttgtacccag ctgctaccgc taccggtaaa 1260
attaatattc agagatattt gaagaaacaa cttgattatg ttttgtcctc cactgatgat 1320
actccatacg gtgttatcaa tcaattcaag aacttcggag ttaacgagcc acacgttagc 1380
tacatggcag atgcattaag atattgggag ctgttcggtg accaaagagc cttgagagct 1440
gttcagaagg gattgtactg ggtatttggt aacaatcctt ggggaacttc ctgggtttct 1500
ggtgtcggtg agaagcacac tatgtttttg catactagat tggatgaaca agcccaaaca 1560
caaggtggaa ccggaattat tcttccaggt gccctagtct ctggtccaaa tgctaaagat 1620
cctttagacg ctacttctgc ttctccatgg tatgaagata gacctggaag tgctgatgtt 1680
ggtcaacaat ggagatacaa tgaatactca gtttctattc aagctggatt gttctcttct 1740
gttttcggtc ttgccgctgc aggtgacgct ccttggtcaa ctggtacccc acctaccgct 1800
ttgactattg gttcacctaa gattggacaa tacgttactg gagaagttac tgtttttgct 1860
caatcaggaa gctctctgac tgctcatgcc ttgggtccag attggactcc aatgacctct 1920
tctgctggag tttcaacagg agttgttgat gtcagtggat tggctccata caccaacgct 1980
agaattgacg ttagaggtac tcaagcttca ggtgctcatt cttactcttc aactcactat 2040
accgttgccc ctcctttgcc agctccagat gctccattgc tttatgatgg atttggtagg 2100
gacggtttgt ttggtgttca aggttacact tgggctaatt ggtacaataa tcatgctggt 2160
gtcggacaag tcactaacac tattgttgat ggtagaactg ttggtagatt cttccaaaat 2220
cctgctactg aacaaagtca agctaaattc cagccttggc atcattctgt tgatgctgat 2280
ggatacaggt atttgtctgt cactatgaga tctccatctc ctaaccttag attgaggatt 2340
gaagtgtccg atgctgactc taaccacaga gttaccggaa ctaccccaat tgctatttct 2400
aacgattgga tgacttacga tttcgacttg gctgcttttc caggtttgga cagatctcaa 2460
gctaagttgg tattttggct acaacaaact gctgatactg atggtgaact gtttgttgat 2520
tccgttgagt ttactaatga agaagctggt actcctcctg ttctttcaga tgtttcacat 2580
actgctggac ctttgactcc atccactcct gttacagttc aagctactta cactgatgct 2640
gatggagtag ctccttacgc tgttgaattg gttgttgatg gagttattca tagaatgtct 2700
cctgttgacc caggtgacac tgatgttact gatggtgctc agtattcggt cgctgtctcc 2760
ttggtcaagg gtgttcattc atactttgtt agaactactg atactacttc tgctgttgtt 2820
gagactccat tggttactgg tgtggccgtt ggttaa 2856
<210> 2
<211> 606
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atcgacaaaa atgtcatgaa agaatcgttg taagacgctc ttcgcaaggg tgtctttttt 60
tgcctttttt tcggtttttg cgcggtacac atagtcatgt aaagattgta aattgcattc 120
agcaataaaa aaagattgaa cgcagcagtt tggtttaaaa atttttattt ttctgtaaat 180
aatgtttagt ggaaatgatt gcggcatccc gcaaaaaata ttgctgtaaa taaactggaa 240
tctttcggca tcccgcatga aacttttcac ccatttttcg gtgataaaaa catttttttc 300
atttaaactg aacggtagaa agataaaaaa tattgaaaac aatgaataaa tagccaaaat 360
tggtttctta ttagggtggg gtcttgcggt ctttatccgc ttatgttaaa cgccgcaatg 420
ctgactgacg gcagcctgct ttaatagcgg ccatctgttt tttgattgga agcactgctt 480
tttaagtgta gtactttggg ctatttcggc tgttagttca taagaattaa aagctgatat 540
ggataagaaa gagaaaatgc gttgcacatg ttcactgctt ataaagatta ggggaggtat 600
gacaat 606
<210> 3
<211> 445
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agcttcgtgc atgcaggccg gggcatatgg gaaacagcgc ggacgcagcg gaatttccaa 60
tttcatgccg cagccgcctg cgctgttctc atttgcggct tccttgtaga gctcagcatt 120
attgagtgga tgattatatt ccttttgata ggtggtatgt tttcgcttga acttttaaat 180
acagccattg aacatacggt tgatttaata actgacaaac atcaccctct tgctaaagcg 240
gccaaggacg ctgccgccgg ggctgtttgc gtttttgccg tgatttcgtg tatcattggt 300
ttacttattt ttttgccaaa gctgtaatgg ctgaaaattc ttacatttat tttacatttt 360
tagaaatggg cgtgaaaaaa agcgcgcgat tatgtaaaat ataaagtgat agcggtacca 420
ttataggtaa gagaggaatg tacac 445
<210> 4
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atggcatacg acagtcgttt tgatgaatgg gtacagaaac tgaaagagga aagctttcaa 60
aacaatacgt ttgaccgccg caaatttatt caaggagcgg ggaagattgc aggactttct 120
cttggattaa cgattgccca gtcggttggg gcctttgaag ta 162

Claims (7)

1.一种基因工程菌，其特征在于，以pHT01为表达载体，在枯草芽孢杆菌中过表达核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的黄原胶内切酶基因；黄原胶内切酶基因前连有启动子和信号肽PhoD；所述启动子为启动子PsrfA或启动子P43。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述启动子PsrfA的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，所述启动子P43的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，信号肽PhoD的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.根据权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌WB800n。
4.一种应用权利要求1~3任一所述基因工程菌生产的发酵上清液水解黄原胶的方法，其特征在于，将发酵上清液与黄原胶等比例混合，在pH 5~8，温度35℃~55℃，转速0~200 r/min的条件下反应4~16 h。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述黄原胶的终浓度为0.3%~0.7%。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵上清液的制备方法为：将权利要求1~3任一所述的基因工程菌在种子培养基中活化，获得种子液；将种子液以体积比1%的接种量接种于发酵培养基中，发酵获得发酵液；将发酵液离心获得发酵上清液。
7.权利要求1~3任一所述基因工程菌在制备黄原胶内切酶或制备含有黄原胶内切酶的产品方面的应用。
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