CN114875057A

CN114875057A - 一种可高效表达饲用低温酸性α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌的构建方法

Info

Publication number: CN114875057A
Application number: CN202210673454.XA
Authority: CN
Inventors: 游锡火; 王玉万; 薛栋升; 夏胜; 曾徐浩; 蒋慧; 胡燕; 梁大明; 田美华; 姜本荣; 齐义清; 沈力
Original assignee: Zhongnong Huawei Biopharmaceutical Hubei Co ltd
Current assignee: Zhongnong Huawei Biopharmaceutical Hubei Co ltd
Priority date: 2022-06-14
Filing date: 2022-06-14
Publication date: 2022-08-09

Abstract

本发明公开了一种重组表达载体、应用和菌株，重组表达载体为pMA5‑amy‑prsA，以该载体构建菌株，并以菌株发酵产生低温α‑淀粉酶，显著提高了酶活。

Description

一种可高效表达饲用低温酸性α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌的构建方法

技术领域

本发明涉及基因工程和发酵技术领域，更具体地说是涉及一种可高效表达饲用低温酸性α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌的构建方法。

背景技术

淀粉是单胃动物能量的主要来源，其供能占总能量需求的60％～80％。幼龄动物消化系统发育不成熟，淀粉酶分泌不足，限制了淀粉的消化吸收。随着动物日粮配方的富营养化、饲养条件应激和环境污染问题越来越突出，成年健康动物添加“外源性营养消化酶”的作用也越来越明显，意义也越来越大。通过添加外源性淀粉酶来提高饲料淀粉的消化吸收，对于提高动物生产性能、节约饲料资源意义重大。

目前饲料专用淀粉酶的研究开发较少，一般均采用食品加工、化纤，印染等工业用酶。中温α-淀粉酶是饲料工业中应用最多的淀粉酶，其最适作用温度为70～80℃，pH值5.0以下失活严重。动物生理环境温度一般为37～42℃，胃内pH值较低，中温淀粉酶在动物消化道内发挥作用甚微。低温淀粉酶最适作用温度比中温淀粉酶要低20～30℃，因此，研究开发低温淀粉酶对饲料用酶而言具有重要意义。

饲用淀粉酶应具备以下几个条件:在动物体温(37～42℃)的温度条件下能发挥高的活性；最适pH值与消化道内食糜的pH相一致；对淀粉有高的酶解效率(内切酶)；具有良好的稳定性(在饲料高温制粒过程中的稳定性、保存过程中的稳定性以及在动物消化道中对胃酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶、金属离子等的耐受性)。

α-淀粉酶最适温度为35℃左右，与饲用淀粉酶标准相似，如果能通过发酵工程策略，将表达α-淀粉酶的基因转化至菌种中，提高枯草芽孢杆菌外源蛋白表达量，则可以提高专用α-淀粉酶的产量。

因此，如何构建一种重组表达载体、应用、菌株及发酵方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种重组表达载体、应用、菌株及发酵方法，通过将分子伴侣和α-淀粉酶同时表达，提高了低温酸性的α-淀粉酶表达量，为饲料专用低温酸性α-淀粉酶的发酵生产提供参考。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种构建高效表达饲用低温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌用重组表达载体，其特所述重组表达载体为pMA5-amy-prsA载体，所述载体由amy序列连接到表达载体pMA5上并进行优化，得到重组质粒pMA5-amy；同时，将pMA5-amy载体双酶切，在多克隆位点上重组分子伴侣基因得到。

作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护上述重组表达载体在构建高效表达饲用低温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌菌株中的应用。

作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种高效表达饲用低温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌菌株的构建方法，过程为：将amy序列连接到表达载体pMA5上并进行优化，得到重组质粒pMA5-amy；同时，将pMA5-amy载体双酶切，在另一个多克隆位点上重组分子伴侣基因，得到重组质粒pMA5-amy-prsA；将重组质粒转化至枯草芽孢杆菌的感受态细胞中，得到高效表达饲用低温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌菌株。

作为上述技术方案优选的技术方案，重组质粒pMA5-amy的构建过程为：以SEQ IDNO.5为模板，SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所述为引物，扩增phod信号肽和低温酸性α-淀粉酶的目的基因amy，构建可分泌表达α-淀粉酶的pMA5-amy表达载体。

作为上述技术方案优选的技术方案，重组质粒pMA5-amy-prsA的构建过程为：以SEQ ID NO.6为模板，SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4所述为引物，扩增p43启动子以及伴侣因子prsA的目的基因，构建表达载体pMA5-amy-prsA。

作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种高效表达饲用低温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌菌株，所述菌株由所述的构建方法构建得到。

作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护任一所述的构建方法构建得到的枯草芽孢杆菌菌株在产饲用低温α-淀粉酶中的应用。

作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种发酵产饲用低温α-淀粉酶的方法，过程包括：

1)将所述的枯草芽孢杆菌菌株于LB液体培养基中，37℃、200rpm培养12h；

2)取菌悬液离心去上清，使菌体重悬于LB液体培养基，控制起始OD_6oo为0.5，37℃、250rpm培养；

3)连续培养至36h，离心收集上清液，得到饲用低温α-淀粉酶溶液。

综上所述，本发明达到的技术效果是：本发明利用分子伴侣加速蛋白折叠，从而提高前体蛋白的转运效率，以及防止蛋白在转运过程中被降解，从而提高目标蛋白在枯草芽孢杆菌中的分泌表达量。采用在枯草芽孢杆菌中表达一些具有分子伴侣功能的外源蛋白或者是提高枯草芽孢杆菌自身分子伴侣蛋白的表达剂量来提高目标蛋白的分泌水平，本发明具体以WB600为感受态细胞，相对于初始的基因工程菌WB600-amy而言，本发明的基因工程菌株WB600-amy-prsA在摇瓶发酵时酶活提高了近2倍，分泌量有很大程度提高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明pMA5-amy载体图谱；

图2附图为本发明pMA5-amy-prsA载体图谱。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

WB600菌株购自北京百奥莱博科技有限公司；pMA5质粒购自丰晖生物。

琼脂糖、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、乙二胺四乙酸、核酸染料4S Green、甘氨酸、十二烷基硫酸钠、溴酚蓝、甘油、二硫苏糖醇、考马斯亮蓝G250、无水乙醇、冰醋酸、丙烯酰胺、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸铵、N,N,N,N-四甲基乙二胺、蔗糖、甘油、均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；氨苄青霉素、购自赛国生物科技有限责任公司；酵母提取物、蛋白胨、甲醇、核酸Marker、蛋白Marker购自赛默飞世尔科技公司；一般化学试剂购自国药集团有限公司。2xTaqPlus PCRMasterMix试剂盒、质粒小量提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。

用到的序列为：

PF1：5’-cgggatccatggcatacgacagtcgttttg-3’，如SEQ ID NO.1所示；带下划线部分为BamHI酶切位点；

PR1：5’-cggctagcttaccacatgccaacgataagg-3’，如SEQ ID NO.2所示；带下划线部分为NheI酶切位点；

PF2：5’-cggaattctttgataggtggtatgttttcg-3’，如SEQ ID NO.3所示；；带下划线部分为EcoRI酶切位点；

PR2：5’-cgggtaccttatttagagttagaagaagaa-3’，如SEQ ID NO.4所示；带下划线部分为Kpn I酶切位点。

BamHI和NheI、EcoRI、Kpn I限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自NEB公司。

实施例1含分子伴侣和α-淀粉酶表达的PMA5载体的构建

根据NCBI处获得的Aspergillus niger CBS 513.88的α-淀粉酶的氨基酸序列(GenBank：XP_001393626.1)其序列为SEQ ID NO.7，根据枯草芽孢杆菌的偏好性进行序列优化设计得到SEQ ID NO.8基因序列，phod信号肽基因序列+α-淀粉酶编码序列为SEQ IDNO.5，启动子p43序列+分子伴侣prsA编码序列SEQ ID NO.6，分子伴侣prsA基因序列SEQ IDNO.9，均由擎科生物分别进行全基因合成，连接在pUC57克隆载体上。

pMA5-amy载体的构建

上游引物PF1PF1：5’-cgggatccatggcatacgacagtcgttttg-3’，如SEQ ID NO.1所示；带下划线部分为BamHI酶切位点；

以SEQ ID NO.5为模板，用天根生化科技有限公司生产的2xTaq Plus PCRMasterMix试剂盒扩增phod信号肽和α-淀粉酶目的基因。PCR反应体系如下：总体积为50μL的PCR反应体系中，加入25μL 2xTaq Plus PCR MasterMix，2.5μL(10μM)上游引物PF，2.5μL(10μM)下游引物PR，1μL模板，加灭菌蒸馏水至50μL。PCR反应程序：(1)94℃预变性3min，(2)94℃变性30sec，(3)55℃退火30sec，(4)72℃延伸2min，步骤(2)～(4)共进行30个循环。4℃保存PCR产物。PCR结束后，取样进行琼脂糖凝胶电泳检验扩增结果，凝胶浓度为1％。切胶回收，用天根生化科技有限公司生产的凝胶回收试剂盒处理(过程按说明书进行)，得到PCR扩增产物即phod信号肽和α-淀粉酶的目的基因。-20℃下保存。

将从公司购买的保存有质粒pMA5的大肠杆菌在含Amp的LB培养基进行活化，传代培养，当OD值达到1.0左右时，使用质粒小量提取试剂盒进行质粒提取(提取步骤按说明书进行)，获得pMA5表达载体，进行下一步酶切反应。

获得phod信号肽和α-淀粉酶目的基因和pMA5表达载体连接后，分别在PCR小管中加入双蒸水、内切酶缓冲液、酶切底物、限制性内切酶(购自NEB公司的BamHI和NheI，使用规格和方法按说明书进行)，进行双酶切反应，加入顺序从多到少。目的基因和pMA5置于37℃下分别进行双酶切。

目的基因片段双酶切体系：超纯水11μL，BamHI 1μL，NheI 1μL，Buffer3μL，α-淀粉酶目的基因14μL。

pMA5双酶切体系：pMA5质粒43μL，BamHI 1μL，NheI 1μL，Buffer 5μL。

使用BamHI和NheI限制性内切酶在37℃下进行双酶切反应3h后，加入LoadingBuffer终止反应，并根据天根生化科技有限公司生产的胶回收试剂盒说明书纯化、回收双酶切产物。

经过相同的限制性内切酶切割后，双酶切产物具有相同的粘性末端，可以通过DNA连接酶连接成完整的质粒。将含有相同粘性末端的α-淀粉酶基因和pMA5双酶切产物置于同一个PCR小管中，连接反应采用10μL体系：将3μL目的基因酶切产物，1μL pMA5质粒酶切产物，1μL T4 DNA连接酶和5μL超纯水混匀，在16℃下连接过夜。将成功连接的质粒命名为pMA5-amy，载体图谱见图1。

含分子伴侣的pMA5-amy-prsA载体的构建

上游引物PF2：5’-cggaattctttgataggtggtatgttttcg-3’，SEQ ID NO.3；带下划线部分为EcoRI酶切位点；

下游引物PR2：5’-cgggtaccttatttagagttagaagaagaa-3’；SEQ ID NO.4；带下划线部分为Kpn I酶切位点。

将构建好的pMA5-amy载体进行双酶切，然后将p43和prsA基因酶连上去，构建了pMA5-amy-prsA，载体图谱见图2。

实施例2枯草芽孢杆菌工程菌的构造

1、枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备

将枯草芽孢杆菌WB600甘油菌在LB培养基中划线培养，37℃培养过夜；然后将长出来的单菌落接到新鲜的LB液体培养基中，37℃下激烈震荡培养至OD600＝0.4-0.6；

取1ml培养液转移到无菌离心管中，在冰上放置30min后在4℃，4000rpm条件下离心5min，弃上清，回收菌体；

用1ml预冷的无菌去离子水清洗菌体，4℃，4000rpm条件下离心5min,弃上清，重复2次；

用1mLHG溶液再清洗菌体，4℃，4000rpm离心5min，弃上清，用200μL的HG溶液重悬菌体，即可用于电激或置于-20℃保存；

HG溶液:10％甘油，1mM Hepes(pH7.0)。

2、枯草芽孢杆菌感受态细胞的电转化和筛选

将待转化的重组表达质粒加入制备好的枯草芽孢杆菌感受态细胞中,4℃保温10min；

在2.5KV/cm，25u F，720Q条件下电击6ms进行电转化，然后4℃保温10min；

加入500μLSOC培养基，于37℃、100rpm条件下复苏培养2h,取200ul涂布于LB(含筛选所需的抗生素)固体培养基上，将平板置于室温直至液体被吸收,倒置培养皿，于37℃培养12-16h；

挑选转化子，提质粒验证是否转化成功。

SOC液体培养基:蛋白陈2％、酵母提取物0.5％、NaCl 0.05％、KCl 2.5mM、MgCl₂10mM、葡萄糖20mM，pH7.0。

实施例3枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶酶活分析

1.工程菌发酵

(1)将构建好的重组子WB600-amy和WB600-amy-prsA分别接种于10mL LB液体培养基中，37℃、200rpm培养12h左右。

(2)取适量菌悬液8000rpm离心去上清，使菌体重悬于含有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，控制重组菌起始OD₆₀₀为0.5，37℃、250rpm培养。

(3)连续培养至36h，离心收集上清液和菌体用于酶活性检测。

2.酶活检测

1.试剂配置

0.05mol/L硫代硫酸钠：将13g Na₂S₂O₃.5H₂O和0.1g无水碳酸钠溶解定容至1000ml

费林试剂：

铜溶液:硫酸铜34.66g溶解在水中，定容至500mL。

酒石酸钾钠碱溶液:酒石酸钾钠173g和氢氧化钠50g溶解在水中，定容至500mL。

使用前，精确地取等体积的铜溶液和碱液充分混合。

1mol/L乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH 5.0)

l mol/L乙酸钠溶液:三水合乙酸钠溶解在水中，定容至250ml；

1mol/L乙酸溶液:冰乙酸15ml溶解在水中,定容至250ml；

将1mol/L乙酸钠溶液加入到1mol/L的乙酸溶液中，调pH值至5.0。

30％碘化钾溶液：

将碘化钾150g溶解于350ml水中，保存在褐色试剂瓶中。

25％硫酸溶液：硫酸125g溶于373ml水中。

可溶性淀粉溶液(pH值5.0)

称取0.5g的可溶性淀粉，缓慢加入到50ml水中，煮沸5min，冷却后，加入1mol/L乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH值5.0)5ml，用水定容至100ml。

测定方法

将可溶性淀粉溶液加到100ml三角瓶中，置于35℃恒温水浴中。预热10～15min。加入稀释酶液，准确加热30min后，加入费林试剂使酶失活。将三角烧瓶直接在电炉上加热2min后,立即放在自来水中冷却。随后，加入30％碘化钾溶液和25％硫酸溶液，用0.05mol/L硫代硫酸钠溶液滴定游离出的碘，以蓝色消失作为滴定终点T30(ml)。

空白对照试验:以水取代酶液。在另一个三角烧瓶中用上述同样的操作步骤测定空白对照值T_o，临近终点时，加入1％可溶性淀粉溶液1～2滴，以蓝色消失作为滴定终点。

酶活力单位定义为:1g固体酶粉(或1ml液体酶),于35℃，pH值5.0条件下，反应30min，反应液中产生相当于10mg葡萄糖的还原糖所需的酶量为1个酶活力单位。

淀粉酶活力(U/ml)＝(T₀-T₃₀)×f×1.62×1/10×n

式中:

T₃₀—酶反应液滴定消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积(ml)；

T₀—空白溶液滴定消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积(ml)；

f—0.05mol硫代硫酸钠溶液浓度的校正系数；

1.62—换算系数；

1/10—该分析方法的常数(相当于10mg葡萄糖的还原糖)；

n—样品的稀释倍数。

经多次平行实验，不含分子伴侣的WB600-amy发酵液中α-淀粉酶的酶活为680U/mL，而WB600-amy-prsA发酵液中α-淀粉酶的酶活为1430U/mL.提高了2倍左右，表明分子伴侣prsA提高了α-淀粉酶的分泌表达量。

对比例1

除用SEQIDNO.10的序列替换SEQIDNO.6的序列外，其它同实例1，不含分子伴侣的WB600-amy发酵液中α-淀粉酶的酶活为680U/mL，而WB600-amy-prsA发酵液中α-淀粉酶的酶活为960U/mL。

对比例2

除用SEQIDNO.11的序列替换SEQIDNO.6的序列外，其它同实例1，不含分子伴侣的WB600-amy发酵液中α-淀粉酶的酶活为680U/mL，而WB600-amy-prsA发酵液中α-淀粉酶的酶活为1088U/mL。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 中农华威生物制药（湖北）有限公司

<120> 一种可高效表达饲用低温酸性α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌的构建方法

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcatacg acagtcgttt tg 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttaccacatg ccaacgataa gg 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tttgataggt ggtatgtttt cg 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttatttagag ttagaagaag aa 22

<210> 5

<211> 1830

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggcatacg acagtcgttt tgatgaatgg gtacagaaac tgaaagagga aagctttcaa 60

aacaatacgt ttgaccgccg caaatttatt caaggagcgg ggaagattgc aggactttct 120

cttggattaa cgattgccca gtcggttggg gcctttgaag taatggtttc tatgtctgct 180

cttcgtcatg gccttggcgt tctttacctt gcttcttggc ttggctcttc tcttgctgct 240

tctacagaac aatggaaatc tcgttctatc taccaaacaa tgacagatcg tttcgctcgt 300

acagatggct ctacaacatc tccttgcaac acaacagaag gcctttactg cggcggcaca 360

tggcgtggca tgatcaacca tcttgattac atccaaggca tgggcttcga tgctgttatg 420

atctctccta tcatcgaaaa cgttgaaggc cgtgttgaat acggcgaagc ttaccatggc 480

tactggcctg ttgatcttta ctctcttaac tctcatttcg gcacacatca agatcttctt 540

gatctttctg atgctcttca tgctcgtgat atgtacctta tgatggatac agttatcaac 600

aacatggctt acatcacaaa cggctctgat cctgctacac atatcgatta ctctacactt 660

acacctttca actcttcttc ttactaccat ccttactgca aaatcacaga ttggaacaac 720

ttcacaaacg ctcaactttg ccaaacaggc gataacatcg ttgctcttcc tgatctttac 780

acagaacatg ctgaagttca agaaacactt tctaactggg ctaaagaagt tatctctaca 840

tactctatcg atggccttcg tatcgatgct gctaaacatg ttaaccctgg cttccttaaa 900

aacttcggcg atgctcttga tatcttcatg acaggcgaag ttcttcaaca agaagtttct 960

acaatctgcg attaccaaaa caactacatc ggctctcttc ctaactaccc tgtttactac 1020

gctatgctta aagctttcac acttggcaac acatctgctc ttgctacaca agttcaatct 1080

atgaaaaact cttgcaacga tgttacagct ctttcttctt tctctgaaaa ccatgatgtt 1140

gctcgtttcg cttctatgac acatgatatg gctcttgcta aaaacatcct tacattcaca 1200

cttcttttcg atggcgttcc tatgatctac caaggccaag aacaacatct tgatggccct 1260

ggctctcctg aaaaccgtga agctatctgg ctttctgaat acaacacaga tgctgaactt 1320

tacaaactta tcggcaaact taacgctatc cgtaaacatg cttaccgtct tgataaccat 1380

taccctgatg ttgaaacata ccctatcttc gaaggcggct ctgaacttgg cttccgtaaa 1440

ggcatcgaag gccgtcaagt tgttatgctt ctttctacac aaggcacaaa ctcttctgct 1500

tacaaccttt ctatgcctgt ttctttcaca ggcggcacag ttgttacaga aatccttaac 1560

tgcgttaact acacagttaa cacacaatct gaacttgttg ttcctatgga taaaggcgaa 1620

cctcgtgttt tcttccctgc tgatcttatg cctggctctg gcctttgcgg ccttcctgtt 1680

gctaacgtta catacgctgc tcttcgtaca caaggcgctg ctgctgctga agctgctctt 1740

tctcttggca tcaaaacaga tgctgcttct tctgctcttc tttctcttgg cctttctgtt 1800

gttgctggcc ttatcgttgg catgtggtaa 1830

<210> 6

<211> 1161

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tttgataggt ggtatgtttt cgcttgaact tttaaataca gccattgaac atacggttga 60

tttaataact gacaaacatc accctcttgc taaagcggcc aaggacgctg ccgccggggc 120

tgtttgcgtt tttgccgtga tttcgtgtat cattggttta cttatttttt tgccaaagct 180

gtaatggctg aaaattctta catttatttt acatttttag aaatgggcgt gaaaaaaagc 240

gcgcgattat gtaaaatata aagtgatagc ggtaccatta taatgaaaaa aatcgctatc 300

gctgctatca cagctacatc tatccttgct ctttctgctt gctcttctgg cgataaagaa 360

gttatcgcta aaacagatgc tggcgatgtt aaaatgatgg aactttacac aaacatgaaa 420

aaaacagctg gcgcttctgt tcttacacaa cttgttcaag aaaaagttct tgataaaaaa 480

tacaaagttt ctgataaaga aatcgataac aaacttaaag aatacaaaac acaacttggc 540

gatcaataca cagctcttga aaaacaatac ggcaaagatt accttaaaga acaagttaaa 600

tacgaacttc ttacacaaaa agctgctaaa gataacatca aagttacaga tgctgatatc 660

aaagaatact gggaaggcct taaaggcaaa atccgtgctt ctcatatcct tgttgctgat 720

aaaaaaacag ctgaagaagt tgaaaaaaaa cttaaaaaag gcgaaaaatt cgaagatctt 780

gctaaagaat actctacaga ttcttctgct tctaaaggcg gcgatcttgg ctggttcgct 840

aaagaaggcc aaatggatga aacattctct aaagctgctt tcaaacttaa aacaggcgaa 900

gtttctatgc ctgttaaaac acaatacggc taccatatca tcaaaaaaac agaagaacgt 960

ggcaaatacg atgatatgaa aaaagaactt aaatctgaag ttcttgaaca aaaacttaac 1020

gataacgctg ctgttcaaga agctgttcaa aaagttatga aaaaagctga tatcgaagtt 1080

aaagataaag atcttaaaga tacattcaac acatcttcta catctaactc tacatcttct 1140

tcttcttcta actctaaata a 1161

<210> 7

<211> 555

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Val Ser Met Ser Ala Leu Arg His Gly Leu Gly Val Leu Tyr Leu

1 5 10 15

Ala Ser Trp Leu Gly Ser Ser Leu Ala Ala Ser Thr Glu Gln Trp Lys

20 25 30

Ser Arg Ser Ile Tyr Gln Thr Met Thr Asp Arg Phe Ala Arg Thr Asp

35 40 45

Gly Ser Thr Thr Ser Pro Cys Asn Thr Thr Glu Gly Leu Tyr Cys Gly

50 55 60

Gly Thr Trp Arg Gly Met Ile Asn His Leu Asp Tyr Ile Gln Gly Met

65 70 75 80

Gly Phe Asp Ala Val Met Ile Ser Pro Ile Ile Glu Asn Val Glu Gly

85 90 95

Arg Val Glu Tyr Gly Glu Ala Tyr His Gly Tyr Trp Pro Val Asp Leu

100 105 110

Tyr Ser Leu Asn Ser His Phe Gly Thr His Gln Asp Leu Leu Asp Leu

115 120 125

Ser Asp Ala Leu His Ala Arg Asp Met Tyr Leu Met Met Asp Thr Val

130 135 140

Ile Asn Asn Met Ala Tyr Ile Thr Asn Gly Ser Asp Pro Ala Thr His

145 150 155 160

Ile Asp Tyr Ser Thr Leu Thr Pro Phe Asn Ser Ser Ser Tyr Tyr His

165 170 175

Pro Tyr Cys Lys Ile Thr Asp Trp Asn Asn Phe Thr Asn Ala Gln Leu

180 185 190

Cys Gln Thr Gly Asp Asn Ile Val Ala Leu Pro Asp Leu Tyr Thr Glu

195 200 205

His Ala Glu Val Gln Glu Thr Leu Ser Asn Trp Ala Lys Glu Val Ile

210 215 220

Ser Thr Tyr Ser Ile Asp Gly Leu Arg Ile Asp Ala Ala Lys His Val

225 230 235 240

Asn Pro Gly Phe Leu Lys Asn Phe Gly Asp Ala Leu Asp Ile Phe Met

245 250 255

Thr Gly Glu Val Leu Gln Gln Glu Val Ser Thr Ile Cys Asp Tyr Gln

260 265 270

Asn Asn Tyr Ile Gly Ser Leu Pro Asn Tyr Pro Val Tyr Tyr Ala Met

275 280 285

Leu Lys Ala Phe Thr Leu Gly Asn Thr Ser Ala Leu Ala Thr Gln Val

290 295 300

Gln Ser Met Lys Asn Ser Cys Asn Asp Val Thr Ala Leu Ser Ser Phe

305 310 315 320

Ser Glu Asn His Asp Val Ala Arg Phe Ala Ser Met Thr His Asp Met

325 330 335

Ala Leu Ala Lys Asn Ile Leu Thr Phe Thr Leu Leu Phe Asp Gly Val

340 345 350

Pro Met Ile Tyr Gln Gly Gln Glu Gln His Leu Asp Gly Pro Gly Ser

355 360 365

Pro Glu Asn Arg Glu Ala Ile Trp Leu Ser Glu Tyr Asn Thr Asp Ala

370 375 380

Glu Leu Tyr Lys Leu Ile Gly Lys Leu Asn Ala Ile Arg Lys His Ala

385 390 395 400

Tyr Arg Leu Asp Asn His Tyr Pro Asp Val Glu Thr Tyr Pro Ile Phe

405 410 415

Glu Gly Gly Ser Glu Leu Gly Phe Arg Lys Gly Ile Glu Gly Arg Gln

420 425 430

Val Val Met Leu Leu Ser Thr Gln Gly Thr Asn Ser Ser Ala Tyr Asn

435 440 445

Leu Ser Met Pro Val Ser Phe Thr Gly Gly Thr Val Val Thr Glu Ile

450 455 460

Leu Asn Cys Val Asn Tyr Thr Val Asn Thr Gln Ser Glu Leu Val Val

465 470 475 480

Pro Met Asp Lys Gly Glu Pro Arg Val Phe Phe Pro Ala Asp Leu Met

485 490 495

Pro Gly Ser Gly Leu Cys Gly Leu Pro Val Ala Asn Val Thr Tyr Ala

500 505 510

Ala Leu Arg Thr Gln Gly Ala Ala Ala Ala Glu Ala Ala Leu Ser Leu

515 520 525

Gly Ile Lys Thr Asp Ala Ala Ser Ser Ala Leu Leu Ser Leu Gly Leu

530 535 540

Ser Val Val Ala Gly Leu Ile Val Gly Met Trp

545 550 555

<210> 8

<211> 1668

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atggtttcta tgtctgctct tcgtcatggc cttggcgttc tttaccttgc ttcttggctt 60

ggctcttctc ttgctgcttc tacagaacaa tggaaatctc gttctatcta ccaaacaatg 120

acagatcgtt tcgctcgtac agatggctct acaacatctc cttgcaacac aacagaaggc 180

ctttactgcg gcggcacatg gcgtggcatg atcaaccatc ttgattacat ccaaggcatg 240

ggcttcgatg ctgttatgat ctctcctatc atcgaaaacg ttgaaggccg tgttgaatac 300

ggcgaagctt accatggcta ctggcctgtt gatctttact ctcttaactc tcatttcggc 360

acacatcaag atcttcttga tctttctgat gctcttcatg ctcgtgatat gtaccttatg 420

atggatacag ttatcaacaa catggcttac atcacaaacg gctctgatcc tgctacacat 480

atcgattact ctacacttac acctttcaac tcttcttctt actaccatcc ttactgcaaa 540

atcacagatt ggaacaactt cacaaacgct caactttgcc aaacaggcga taacatcgtt 600

gctcttcctg atctttacac agaacatgct gaagttcaag aaacactttc taactgggct 660

aaagaagtta tctctacata ctctatcgat ggccttcgta tcgatgctgc taaacatgtt 720

aaccctggct tccttaaaaa cttcggcgat gctcttgata tcttcatgac aggcgaagtt 780

cttcaacaag aagtttctac aatctgcgat taccaaaaca actacatcgg ctctcttcct 840

aactaccctg tttactacgc tatgcttaaa gctttcacac ttggcaacac atctgctctt 900

gctacacaag ttcaatctat gaaaaactct tgcaacgatg ttacagctct ttcttctttc 960

tctgaaaacc atgatgttgc tcgtttcgct tctatgacac atgatatggc tcttgctaaa 1020

aacatcctta cattcacact tcttttcgat ggcgttccta tgatctacca aggccaagaa 1080

caacatcttg atggccctgg ctctcctgaa aaccgtgaag ctatctggct ttctgaatac 1140

aacacagatg ctgaacttta caaacttatc ggcaaactta acgctatccg taaacatgct 1200

taccgtcttg ataaccatta ccctgatgtt gaaacatacc ctatcttcga aggcggctct 1260

gaacttggct tccgtaaagg catcgaaggc cgtcaagttg ttatgcttct ttctacacaa 1320

ggcacaaact cttctgctta caacctttct atgcctgttt ctttcacagg cggcacagtt 1380

gttacagaaa tccttaactg cgttaactac acagttaaca cacaatctga acttgttgtt 1440

cctatggata aaggcgaacc tcgtgttttc ttccctgctg atcttatgcc tggctctggc 1500

ctttgcggcc ttcctgttgc taacgttaca tacgctgctc ttcgtacaca aggcgctgct 1560

gctgctgaag ctgctctttc tcttggcatc aaaacagatg ctgcttcttc tgctcttctt 1620

tctcttggcc tttctgttgt tgctggcctt atcgttggca tgtggtaa 1668

<210> 9

<211> 879

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgaaaaaaa tcgctatcgc tgctatcaca gctacatcta tccttgctct ttctgcttgc 60

tcttctggcg ataaagaagt tatcgctaaa acagatgctg gcgatgttaa aatgatggaa 120

ctttacacaa acatgaaaaa aacagctggc gcttctgttc ttacacaact tgttcaagaa 180

aaagttcttg ataaaaaata caaagtttct gataaagaaa tcgataacaa acttaaagaa 240

tacaaaacac aacttggcga tcaatacaca gctcttgaaa aacaatacgg caaagattac 300

cttaaagaac aagttaaata cgaacttctt acacaaaaag ctgctaaaga taacatcaaa 360

gttacagatg ctgatatcaa agaatactgg gaaggcctta aaggcaaaat ccgtgcttct 420

catatccttg ttgctgataa aaaaacagct gaagaagttg aaaaaaaact taaaaaaggc 480

gaaaaattcg aagatcttgc taaagaatac tctacagatt cttctgcttc taaaggcggc 540

gatcttggct ggttcgctaa agaaggccaa atggatgaaa cattctctaa agctgctttc 600

aaacttaaaa caggcgaagt ttctatgcct gttaaaacac aatacggcta ccatatcatc 660

aaaaaaacag aagaacgtgg caaatacgat gatatgaaaa aagaacttaa atctgaagtt 720

cttgaacaaa aacttaacga taacgctgct gttcaagaag ctgttcaaaa agttatgaaa 780

aaagctgata tcgaagttaa agataaagat cttaaagata cattcaacac atcttctaca 840

tctaactcta catcttcttc ttcttctaac tctaaataa 879

<210> 10

<211> 1161

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tttgataggt ggtatgtttt cgcttgaact tttaaataca gccattgaac atacggttga 60

tttaataact gacaaacatc accctcttgc taaagcggcc aaggacgctg ccgccggggc 120

tgtttgcgtt tttgccgtga tttcgtgtat cattggttta cttatttttt tgccaaagct 180

gtaatggctg aaaattctta catttatttt acatttttag aaatgggcgt gaaaaaaagc 240

gcgcgattat gtaaaatata aagtgatagc ggtaccatta taatgaaaaa aatcgctatc 300

gctgctatca cagctacatc tatccttgct ctttctgctt gctcttctgg cgataaagaa 360

gttatcgcta aaacagatgc tggcgatgtt acaaaaggcg aactttacac aaacatgaaa 420

aaaacagctg gcgcttctgt tcttacacaa cttgttcaag aaaaagttct tgataaaaaa 480

tacaaagttt ctgataaaga aatcgataac aaacttaaag aatacaaaac acaacttggc 540

gatcaataca cagctcttga aaaacaatac ggcaaagatt accttaaaga acaagttaaa 600

tacgaacttc ttacacaaaa agctgctaaa gataacatca aagttacaga tgctgatatc 660

aaagaatact gggaaggcct taaaggcaaa atccgtgctt ctcatatcct tgttgctgat 720

aaaaaaacag ctgaagaagt tgaaaaaaaa cttaaaaaag gcgaaaaatt cgaagatctt 780

gctaaagaat actctacaga ttcttctgct tctaaaggcg gcgatcttgg ctggttcgct 840

aaagaaggcc aaatggatga aacattctct aaagctgctt tcaaacttaa aacaggcgaa 900

gtttctgatc ctgttaaaac acaatacggc taccatatca tcaaaaaaac agaagaacgt 960

ggcaaatacg atgatatgaa aaaagaactt aaatctgaag ttcttgaaca aaaacttaac 1020

gataacgctg ctgttcaaga agctgttcaa aaagttatga aaaaagctga tatcgaagtt 1080

aaagataaag atcttaaaga tacattcaac acatcttcta catctaactc tacatcttct 1140

tcttcttcta actctaaata a 1161

<210> 11

<211> 1161

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tttgataggt ggtatgtttt cgcttgaact tttaaataca gccattgaac atacggttga 60

tttaataact gacaaacatc accctcttgc taaagcggcc aaggacgctg ccgccggggc 120

tgtttgcgtt tttgccgtga tttcgtgtat cattggttta cttatttttt tgccaaagct 180

gtaatggctg aaaattctta catttatttt acatttttag aaatgggcgt gaaaaaaagc 240

gcgcgattat gtaaaatata aagtgatagc ggtaccatta taatgaaaaa aatcgctatc 300

gctgctatca cagctacatc tatccttgct ctttctgctt gctcttctgg cgataaagaa 360

gttatcgcta aaacagatgc tggcgatgtt acaaaaggcg aactttacac aaacatgaaa 420

aaaacagctg gcgcttctgt tcttacacaa cttgttcaag aaaaagttct tgataaaaaa 480

tacaaagttt ctgataaaga aatcgataac aaacttaaag aatacaaaac acaacttggc 540

gatcaataca cagctcttga aaaacaatac ggcaaagatt accttaaaga acaagttaaa 600

tacgaacttc ttacacaaaa agctgctaaa gataacatca aagttacaga tgctgatatc 660

aaagaatact gggaaggcct taaaggcaaa atccgtgctt ctcatatcct tgttgctgat 720

aaaaaaacag ctgaagaagt tgaaaaaaaa cttaaaaaag gcgaaaaatt cgaagatctt 780

gctaaagaat actctacaga ttcttctgct tctaaaggcg gcgatcttgg ctggttcgct 840

aaagaaggcc aaatggatga aacattctct aaagctgctt tcaaacttaa aacaggcgaa 900

gtttctatgc ctgttaaaac acaatacggc taccatatca tcaaaaaaac agaagaacgt 960

ggcaaatacg atgatatgaa aaaagaactt aaatctgaag ttcttgaaca aaaacttaac 1020

gataacgctg ctgttcaaga agctgttcaa aaagttatga aaaaagctga tatcgaagtt 1080

aaagataaag atcttaaaga tacattcaac acatcttcta catctaactc tacatcttct 1140

tcttcttcta actctaaata a 1161

Claims

1.一种构建高效表达饲用低温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌用重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为pMA5-amy-prsA载体，所述载体由amy序列连接到表达载体pMA5上并进行优化，得到重组质粒pMA5-amy；同时，将pMA5-amy载体双酶切，在多克隆位点上重组分子伴侣基因得到。

2.权利要求1所述的重组表达载体在构建高效表达饲用低温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌菌株中的应用。

3.一种高效表达饲用低温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌菌株的构建方法，其特征在于，过程为：将amy序列连接到表达载体pMA5上并进行优化，得到重组质粒pMA5-amy；同时，将pMA5-amy载体双酶切，在另一个多克隆位点上重组分子伴侣基因，得到重组质粒pMA5-amy-prsA；将重组质粒转化至枯草芽孢杆菌的感受态细胞中，得到高效表达饲用低温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌菌株。

4.根据权利要求3所述的一种高效表达饲用低温α-淀粉酶的毕赤酵母的构建方法，其特征在于，重组质粒pMA5-amy的构建过程为：以SEQ ID NO.5为模板，SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.2所述序列为引物，扩增phod信号肽和低温酸性α-淀粉酶的目的基因amy，构建可分泌表达α-淀粉酶的pMA5-amy表达载体。

5.根据权利要求4所述的一种高效表达饲用低温α-淀粉酶的毕赤酵母的构建方法，其特征在于，重组质粒pMA5-amy-prsA的构建过程为：以SEQ ID NO.6为模板，SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4所述序列为引物，扩增p43启动子以及伴侣因子prsA的目的基因，构建表达载体pMA5-amy-prsA。

6.一种高效表达饲用低温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，所述菌株由权利要求3-5任一所述的构建方法构建得到。

7.权利要求3-5任一所述的构建方法构建得到的枯草芽孢杆菌菌株在产饲用低温α-淀粉酶中的应用。

8.一种发酵产饲用低温α-淀粉酶的方法，其特征在于，过程包括：

1)将权利要求6所述的枯草芽孢杆菌菌株于LB液体培养基中，37℃、200rpm培养12h；