CN110819609A - 一种热稳定性提高的突变脂肪酶及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种热稳定性提高的突变脂肪酶及其制备方法与应用。该突变脂肪酶，是在耶氏解脂酵母脂肪酶2中通过迭代组合的方法引入4对二硫键突变获得的突变脂肪酶；所述的引入的4对二硫键为二硫键S2‑210、S8‑214、S60‑69、S122‑196，获得的突变脂肪酶热稳定性强，pH反应区间增大，适合在工业上进行应用。本发明中还构建了一种用于提高该突变脂肪酶产量的表达菌株，与分子伴侣共表达，进一步提高该突变脂肪酶的表达水平，即本发明可以在大幅度提高中温脂肪酶的热稳定性的同时保证高表达量，为工业化生产提供了有力的理论依据。

Description

一种热稳定性提高的突变脂肪酶及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于酶工程领域，特别涉及一种热稳定性提高的突变脂肪酶及其制备方法与应用。
背景技术
传统化学反应通常需要在高温高压等相对复杂条件下进行，但由于催化剂价格昂贵，副反应较多，且不易回收等缺点，在工业领域通常采用生物酶制剂；与传统催化剂相比，生物催化剂有着以下几大优势：安全无毒；反应条件温和；产物较纯，副产物少；专一性高等，因此在食品加工、洗涤工业、皮革加工、造纸和饲料工业等多个领域得到广泛应用。作为一类重要的生物酶制剂，耶氏解脂酵母脂肪酶2是一种性能优良的脂肪酶，具备很高的酯化、水解和转酯化活性，在各个领域都广泛应用。但其耐热性差、产量有限是应用于饲料工业的主要瓶颈。因此，我国亟待开发出经济实惠、耐热性能高、成本低、产量高的高效脂肪酶。
二硫键是两个半胱氨酸在蛋白质多肽链上形成的共价键，其可以在同一亚基内形成，也可在不同亚基间形成。在天然二硫键的形成过程中，其两个硫原子间的距离须在
Figure BDA0002317353010000011
到之间且它们与各自连接的β-碳原子须保持90°夹角，同时二硫键与色氨酸的β-碳原子之间形成103°夹角。正是这些因素影响蛋白质分子结构稳定和功能性质。目前，已有大量研究表明二硫键的引入能增强蛋白酶的热稳定性。但与此同时，二硫键不仅在蛋白折叠过程中有着重要作用，同时也是蛋白折叠的重要限速步骤之一。
在人工引入二硫键后重组工程菌的热稳定性得到大幅度提升，但内质网中的外源蛋白质往往无法及时折叠加工。尤其是引入数对二硫键后，滞留于内质网的蛋白质将对宿主细胞内构成胁迫压力，严重地影响其表达水平。因此激发UPR(Unfolded proteinresponse)效应和ERAD(ER-associated protein degradation)效应，其中前者会使细胞存活率变低，严重影响表达水平。目前许多研究已经证明在蛋白酶合适位点引入新的二硫键是提高其稳定性很好的方法，但并非所有引入的二硫键都能达到理想的效果，部分新引入的二硫键会降低其稳定性甚至无法表达。因此在考虑到热稳定性以及表达水平双重影响因子下，找到特定区域理想二硫键位点显得尤为重要。
本实验室前期研究已筛选出能提高Lip2耐热性能的单对二硫键突变位点，且对其进行了简单的迭代组合并成功于毕赤酵母中表达(详见中国专利申请201711220144.8，一种耐热突变脂肪酶及制备方法与应用)，但未对多对二硫键引入后其位点和数量对突变体热稳定性及其产量两个因素同时进行深入分析及相关试验。目前，文献中对多对二硫键引入蛋白酶相关区域后表达量变化的研究相对较少，而且因过多引入二硫键后导致的表达水平下降常有发生。因此很有必要对其进行富含二硫键的突变体进行区域优化且提升其产量，为其工业化生产提供理论依据。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种热稳定性提高的突变脂肪酶。
本发明的另一目的在于提供所述的热稳定性提高的突变脂肪酶的制备方法。
本发明的再一目的在于提供所述的热稳定性提高的突变脂肪酶的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种热稳定性提高的突变脂肪酶，是在耶氏解脂酵母脂肪酶2(Lip2)中通过迭代组合的方法引入4对二硫键突变获得的突变脂肪酶；
所述的引入的4对二硫键为二硫键S2-210(将第2位和第210位氨基酸突变为半胱氨酸且成键，该二硫键在C端区域)、S8-214(将第8位和第214位氨基酸突变为半胱氨酸且成键，该二硫键在C端区域)、S60-69(将第60位和第69位氨基酸突变为半胱氨酸且成键，该二硫键在N端区域)、S122-196(将第122位和第196位氨基酸突变为半胱氨酸且成键，该二硫键在盖子1区域)。
所述的突变脂肪酶为突变脂肪酶4sEx，其氨基酸序列如下(SEQ ID NO.1)所示：
VCTSTETCHIDQESYNFFEKYARLANIGYCVGPGTKIFKPFNCGLQCAHFPNVELIEEFCDPRLIFDVCGYLAVDHASKQIYLVIRGTHSLEDVITDIRIMQAPLTNFDLAANISSTATCDCCLVHNGFIQSYNNTYNQIGPKLDSVIEQYPDYQIAVTGHSLGGAAALLFGINLKVNGHDPLVVTLGQPIVGNACFANWVDKLFFGQECPDVCKVSKDRKLYRITHRGDIVPQVPFWDGYQHCSGEVFIDWPLIHPPLSNVVMCQGQSNKQCSAGNTLLQQVNVIGNHLQYFVTEGVCGI。
编码所述突变脂肪酶的核苷酸序列如下(SEQ ID NO.2)所示：
gtgtgtacctctaccgagacctgtcacattgaccaggagtcctacaacttctttgagaagtacgcccgactcgcaaacattggatattgtgttggtcccggcactaagatcttcaagcccttcaactgtggcctgcaatgtgcccacttccccaacgttgagctcatcgaggagttctgtgacccccgtctcatctttgatgtttgtggttacctcgctgttgatcatgcctccaagcagatctaccttgttattcgaggaacccactctctggaggacgtcataaccgacatccgaatcatgcaggctcctctgacgaactttgatcttgctgctaacatctcttctactgctacttgtgattgttgtcttgtccacaatggcttcatccagtcctacaacaacacctacaatcagatcggccccaagctcgactctgtgattgagcagtatcccgactaccagattgctgtcaccggtcactctctcggaggagctgcagcccttctgttcggaatcaacctcaaggttaacggccacgatcccctcgttgttactcttggtcagcccattgtcggtaacgcttgttttgctaactgggtcgataaactcttctttggccaggagtgtcccgatgtctgtaaggtgtccaaagaccgaaagctctaccgaatcacccaccgaggagatatcgtccctcaagtgcccttctgggacggttaccagcactgctctggtgaggtctttattgactggcccctgatccaccctcctctctccaacgttgtcatgtgccagggccagagcaataaacagtgctctgccggtaacactctgctccagcaggtcaatgtgattggaaaccatctgcagtacttcgtcaccgagggtgtctgtggtatctaataa。
所述的热稳定性提高的突变脂肪酶的制备方法，包括如下步骤：
(1)以pPICZαA-Lip2为模板，通过反向PCR突变，将所选的氨基酸位点突变为半胱氨酸，并转入大肠杆菌中，进行扩增培养、质粒提取和测序，获得引入四对二硫键的突变脂肪酶重组质粒；
(2)将测序正确的重组质粒以PmeⅠ限制性内切酶线性化处理，并电击转化至感受态毕赤酵母X33中，进一步通过YPDS-Zeocin平板筛选，得到对应的突变工程菌；
(3)将突变工程菌在YPD液体培养基中进行扩繁培养后，转接至BMGY液体培养基进行去抑制培养，最后接种BMMY液体培养基进行发酵，将菌液离心获取上清粗酶液；
(4)利用超滤管将粗酶液进行超滤浓缩后，使用镍柱一步法纯化，分离出带组氨酸标签的脂肪酶蛋白，并以还原性SDS-PAGE检测蛋白纯度，获取纯化后的脂肪酶，即所述的热稳定性提高的突变脂肪酶。
步骤(1)中所述的大肠杆菌工程菌优选为大肠杆菌TOP10。
步骤(1)中所述的四对二硫键分别为二硫键S2-210、S8-214、S60-69、S122-196。
步骤(2)中所述的YPDS-Zeocin平板中Zeocin的浓度优选为100μg/mL。
步骤(3)中所述的发酵的时间为24～96h；优选为96h。
步骤(4)中所述的超滤管优选为10kDa超滤管。
步骤(4)中所述的突变脂肪酶为突变脂肪酶4sEx，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示；编码所述的突变脂肪酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述的热稳定性提高的突变脂肪酶的制备方法，在步骤(4)之后还包括如下步骤：
(5)通过DSF荧光检测测定脂肪酶的熔解温度(Tm)，p-NPP比色法测定15min半失活温度(T50)，55或70℃下的半衰期(t1/2)，最适反应温度(Topt)，最适反应pH(pHopt)。
所述的热稳定性提高的突变脂肪酶热稳定性强，pH反应区间增大，特别适合在工业上进行应用。
一种用于提高所述突变脂肪酶产量的表达菌株的构建方法，包括如下步骤：
(a)以PDI序列为目的片段，在其两端添加限制性酶切位点EcoR I后插入到pAO815载体上，得到分子伴侣表达载体pAO815-PDI；
(b)以pPICZαA-Lip2为模板，通过反向PCR突变，将所选的氨基酸位点突变为半胱氨酸，并转入大肠杆菌中，进行扩增培养、质粒提取和测序，获得引入四对二硫键的突变脂肪酶重组质粒；
(c)将测序正确的重组质粒以PmeⅠ限制性内切酶线性化处理，并电击转化至感受态毕赤酵母GS115中，进一步通过YPDS-Zeocin平板筛选，得到重组工程菌株GS115-4sEx；
(d)将分子伴侣表达载体pAO815-PDI以SalⅠ限制性内切酶线性化处理后，二次电击转化至重组工程菌株GS115-4sEx感受态细胞，利用MD平板进行筛选，得到重组工程菌株GS115-4sEx-PDI，即用于提高所述突变脂肪酶产量的表达菌株。
步骤(a)中所述的PDI序列可以为分子伴侣PDI序列(Genbank ID：EU805807.1)，为了方便线性化和后续研究多目的片段的串联。也可以将分子伴侣PDI序列第443位氨基酸碱基GTC替换为同义密码子GTT，第78位氨基酸碱基ATC替换为同义密码子ATT，第255位氨基酸碱基TCC替换为同义密码子TCT的序列。
步骤(a)中所述的大肠杆菌工程菌优选为大肠杆菌TOP10。
步骤(a)中所述的四对二硫键分别为二硫键S2-210、S8-214、S60-69、S122-196。
步骤(c)中所述的YPDS-Zeocin平板中Zeocin的浓度优选为100μg/mL。
所述的用于提高所述突变脂肪酶产量的表达菌株的构建方法，还包括将步骤(a)中得到的分子伴侣表达载体pAO815-PDI进行扩增的步骤，具体为：将其转入大肠杆菌中，扩增培养后再提取质粒。
一种用于提高突变脂肪酶产量的表达菌株，通过上述任一项所述的方法构建得到。
所述的用于提高所述突变脂肪酶产量的表达菌株在生产突变脂肪酶中的应用，该表达菌株产量较高，特别适合在工业上进行应用。
所述的突变脂肪酶为突变脂肪酶4sEx，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
编码所述突变脂肪酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
一种生产所述突变脂肪酶的方法，包括如下步骤：将上述用于提高突变脂肪酶产量的表达菌株(即重组工程菌株GS115-4sEx-PDI)在YPDS-Zeocin液体培养基中进行扩繁培养后，转接至BMGY液体培养基进行去抑制培养，最后接种至BMMY液体培养基进行发酵，得到所述的突变脂肪酶。
所述的突变脂肪酶为突变脂肪酶4sEx，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
编码所述突变脂肪酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述的YPDS-Zeocin平板中Zeocin的浓度优选为100μg/mL。
所述的发酵的时间为24～96h；优选为96h。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明通过采用在耶氏解脂酵母脂肪酶2特定区域迭代组合多对二硫键突变，在提高其稳定性的同时大幅提高了突变体表达量。在此基础上再次共表达分子伴侣，进一步提高该突变脂肪酶的表达水平。与本实验室之前仅考虑提高热稳定而引入的多对二硫键的策略相比，通过在特定区域引入二硫键的数目，大幅度提高了中温脂肪酶的热稳定性的同时也保证的高表达量，为工业化生产提供了有力的理论依据。
2、本发明通过在Lip2中特定区域组合四对二硫键获得的耐热高产脂肪酶4sEx相对于亲本脂肪酶(Lip2)，脂肪酶4sEx的Tm值提升了17.73℃，其T50值提升27.75℃；相对于此前突变脂肪酶(4s)，其96h摇瓶发酵上清液粗酶活提高26％。
3、本发明通过将脂肪酶4sEx、与分子伴侣PDI共表达于毕赤酵母GS115，获得工程菌株GS115-4sEx-PDI，该菌株96h摇瓶发酵表达上清中，脂肪酶粗酶活提高51％。即重组菌株GS115-4sEx-PDI在耐热性能和表达水平方面均得到了极大幅度地提高。
附图说明
图1是Lip2和突变脂肪酶4sEx的最适反应温度曲线图(图中：Y表示亲本脂肪酶Lip2；4sEx表示突变脂肪酶4sEx)。
图2是Lip2和突变脂肪酶4sEx的最适反应pH曲线图(图中：Y表示亲本脂肪酶Lip2；4sEx表示突变脂肪酶4sEx)。
图3是突变脂肪酶4s和4sEx摇瓶发酵96h粗酶活。
图4是原始菌株Y、重组菌株GS115-4sEx和重组菌株GS115-4sEx-PDI发酵上清液中粗酶活变化情况图(图中：Y表示原始菌株GS115毕赤酵母；4sEx表示重组菌株GS115-4sEx；GS115-4sEx-PDI表示重组菌株GS115-4sEx-PDI)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
材料与试剂：pPICZαA-Lip2毕赤酵母表达载体和pAO815载体由上海金斯瑞生物公司全基因合成与构建；质粒提取试剂盒购自Omega贸易有限公司，KOD-PLUS突变试剂盒购自东洋纺公司，Protein Thermal Shift筛选试剂盒购自Thermo公司；TOP10大肠杆菌感受态细胞购自天根生物公司，突变引物由上海生工生物工程公司合成；PmeⅠ和SalⅠ限制性内切酶购自New England Biolabs公司；PCR产物纯化回收试剂盒购自大连宝生物公司；电转仪购自Bio-Rad公司；LLB、LLB+Zeocin、MD、YPD、YPD+Zeocin、YPDS+Zeocin、BMGY、BMMY培养基均按照Invitrogen毕赤酵母表达试剂盒操作手册配制，镍柱纯化试剂盒购自上海生工生物工程公司，其余试剂均为国内外购买的分析纯级别。
实施例1：突变脂肪酶表达质粒的构建
以pPICZαA-Lip2(构建方法参考中国专利申请201610279266.3“一种热稳定的脂肪酶及制备方法与应用”)为模板进行反向PCR，每引入一对二硫键需要进行两次反向PCR。以表1的122C-F和122-R作为引物，得到脂肪酶4sEx第一次扩增引物。
表1 突变引物汇总
Figure BDA0002317353010000061
Figure BDA0002317353010000071
注：斜线加粗处为突变位点
PCR扩增条件为：94℃2min；94℃10s、66℃30s、68℃5min，10个循环。反应体系如下表2所示。
表2 PCR反应体系
上游引物(10μM) 1.5μL
下游引物(10μM) 1.5μL
KOD-Plus高保真酶 1μL
模板(50ng/μL) 1μL
双蒸水 35μL
5×SmartPCR buffer 5μL
5×dNTP(2M) 5μL
总体系 50μL
扩增产物以DnpⅠ酶消化模板，在琼脂糖凝胶电泳检测突变条带大小后，用T4连接酶连接环化过夜，随后使用热激法将突变质粒转入TOP10大肠杆菌感受态细胞，并涂布于LLB+Zeocin(Zeocin浓度为25μg/ml)平板37℃过夜培养，挑选阳性转化子进行质粒的测序。
将测序正确的阳性转化子于LLB+Zeocin(Zeocin浓度为25μg/ml)液体培养基过夜扩培后，提取质粒。以该质粒为模板，按照同样的方法，依次以表1的引物196C-F和196C-R，8C-F和8C-R，214C-F和214C-R，60C-F和60C-R，69C-F和69C-R，2C-F和2C-R，210C-F和210C-R进行7次突变，获得脂肪酶4sEx的重组质粒。
其中，脂肪酶4sEx的氨基酸序列如下(SEQ ID NO.1)：
VCTSTETCHIDQESYNFFEKYARLANIGYCVGPGTKIFKPFNCGLQCAHFPNVELIEEFCDPRLIFDVCGYLAVDHASKQIYLVIRGTHSLEDVITDIRIMQAPLTNFDLAANISSTATCDCCLVHNGFIQSYNNTYNQIGPKLDSVIEQYPDYQIAVTGHSLGGAAALLFGINLKVNGHDPLVVTLGQPIVGNACFANWVDKLFFGQECPDVCKVSKDRKLYRITHRGDIVPQVPFWDGYQHCSGEVFIDWPLIHPPLSNVVMCQGQSNKQCSAGNTLLQQVNVIGNHLQYFVTEGVCGI。
脂肪酶4sEx的核苷酸序列如下(SEQ ID NO.2)：
gtgtgtacctctaccgagacctgtcacattgaccaggagtcctacaacttctttgagaagtacgcccgactcgcaaacattggatattgtgttggtcccggcactaagatcttcaagcccttcaactgtggcctgcaatgtgcccacttccccaacgttgagctcatcgaggagttctgtgacccccgtctcatctttgatgtttgtggttacctcgctgttgatcatgcctccaagcagatctaccttgttattcgaggaacccactctctggaggacgtcataaccgacatccgaatcatgcaggctcctctgacgaactttgatcttgctgctaacatctcttctactgctacttgtgattgttgtcttgtccacaatggcttcatccagtcctacaacaacacctacaatcagatcggccccaagctcgactctgtgattgagcagtatcccgactaccagattgctgtcaccggtcactctctcggaggagctgcagcccttctgttcggaatcaacctcaaggttaacggccacgatcccctcgttgttactcttggtcagcccattgtcggtaacgcttgttttgctaactgggtcgataaactcttctttggccaggagtgtcccgatgtctgtaaggtgtccaaagaccgaaagctctaccgaatcacccaccgaggagatatcgtccctcaagtgcccttctgggacggttaccagcactgctctggtgaggtctttattgactggcccctgatccaccctcctctctccaacgttgtcatgtgccagggccagagcaataaacagtgctctgccggtaacactctgctccagcaggtcaatgtgattggaaaccatctgcagtacttcgtcaccgagggtgtctgtggtatctaataa。
实施例2：线性化质粒电转化毕赤酵母、转化子筛选与产酶筛选
将测序正确的阳性转化子于LLB+Zeocin(Zeocin浓度为25μg/ml)液体培养基过夜扩增培养后，提取质粒，以PmeⅠ线性化处理并纯化回收，以总量为5μg的质粒线性化产物与X33毕赤酵母感受态混合电击转化。毕赤酵母感受态制备参照Invitrogen公司操作手册。电转程序按照Bio-Rad公司推荐参数设置。
电转完毕立刻加入1mL 1mol/L山梨醇溶液，将菌液在30℃孵育复苏1小时后，均匀涂布于YPDS+Zeocin(Zeocin浓度为100μg/ml)抗性平板上筛选，挑选单菌落获得突变工程菌株。
实施例3：重组工程菌株的发酵
参考Invitrogen公司毕赤酵母表达试剂盒操作手册并稍作修改，修改内容如下：把突变工程菌株单菌落接种到2mL YPDS-Zeocin(Zeocin浓度为100μg/mL)液体培养基中进行纯化培养过夜，离心将细胞以BMGY液体培养基重悬并过夜培养，再接种至50mL BMMY液体培养基，以25℃、280r/min培养96h，每天补充甲醇至终浓度为体积百分比1％。
实施例4：脂肪酶的分离和纯化
1)超滤浓缩
将100mL发酵液于4℃、5000r/min离心5分钟后吸取上清液并用10kDa超滤管于5000r/min 4℃离心50min，收集浓缩酶液。
2)一步法镍柱纯化
①用5mL的含咪唑10mM的Binding Buffer平衡镍柱，充分除去残留的乙醇；
②浓缩酶液与含咪唑120mM的Binding Buffer按照1:1比例混合后添加至镍柱中结合；
③用15mL含咪唑60mM的Washing buffer充分洗脱杂蛋白；
④用15mL含咪唑300mM的Elution Buffer洗脱目标蛋白；
⑤纯化酶液按照上述条件超滤浓缩；
得到纯化的突变脂肪酶，最后以还原性SDS-PAGE垂直电泳检测酶纯度，纯度均在90％以上。
实施例5：脂肪酶的酶学性质测定
利用荧光定量PCR仪，按照Protein Thermal Shift试剂盒推荐反应程序测定突变脂肪酶的Tm值，结果如表3所示，引入的多对二硫键极大幅度提升了脂肪酶的Tm，突变脂肪酶4sEx的Tm值较亲本Lip2进一步提高。
表3 DSF测定结果
脂肪酶 T<sub>m</sub> ΔT<sub>m</sub>
Lip2 48.32±0.25 -
4sEx 66.05±0.26 17.73
T50测定方法：以0.1mg/mL的纯化蛋白溶液在PCR仪中分别以30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80℃精确保温15min，以50mM含40mM的p-NPP的Tris-Hcl缓冲液为反应体系(pH＝7.50)，精确反应10min后，添加20％(w/v)的三氯乙酸终止反应5min，在20％(w/v)的碳酸钠溶液显色，测定410nm处吸光值，计算不同温度保温后，脂肪酶残余的相对酶活。
t1/2测定方法：以0.1mg/mL的纯化蛋白溶液在PCR仪中55℃或70℃精确保温0、5、10、15、30、45、60min，以50mM含40mM的p-NPP的Tris-Hcl缓冲液为反应体系(pH＝7.50)，精确反应10min后，添加20％(w/v)的三氯乙酸终止反应，20％(w/v)碳酸钠溶液显色，测定410nm处吸光值，计算不同温度保温后，脂肪酶残余活性。
Topt测定方法：将0.15mg/mL的纯化蛋白溶液加入在30、35、40、45、50、55、60、65和70℃条件下预热的50mM含40mM的p-NPP的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.50)，精确反应10min后，添加20％(w/v)的三氯乙酸终止反应，20％(w/v)碳酸钠溶液显色，测定410nm处吸光值，计算不同温度下脂肪酶的相对酶活。
pHopt值的测定：把p-NPP标准母液加入到pH分别为3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0和8.0的磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液(表4)，将5μL纯化的0.1mg/mL酶液加入其中，以比色法在30℃精确反应10min测定残余活性，将最适反应pH下的酶活定义为100％，以pH对相对活性作图，得到其测定曲线。
表4 磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液(25℃)
Figure BDA0002317353010000101
注：Na2HPO4分子量＝141.98，0.2mol/L溶液为28.40g/L；Na2HPO4·2H2O分子量＝178.05，0.2mol/L溶液为35.61g/L；柠檬酸分子量＝210.14，0.1mol/L溶液为21.01g/L。
T50和t1/2如表5所示，pHopt和pH稳定性分别如图1和图2所示:
表5 热稳定性测定结果
Figure BDA0002317353010000102
注：Lip2测定温度为55℃，4sEx为70℃。
实施例6：分子伴侣和转录因子表达载体的构建
以PDI序列(Genbank ID：EU805807.1)为目的片段，把起始序列ATGCAA修改为Kozak序列ATGGAA。该序列具有1个Sal I酶切位点，1个Bgl II酶切位点，和1个BamH I酶切位点。在基因序列两端添加限制性酶切位点EcoR I，以pAO815为载体，以PDI片段为目的序列，委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行全基因合成和构建pAO815-PDI质粒，并转化至大肠杆菌TOP10中(同时构建含有pAO815空载体质粒的大肠杆菌工程菌)。
实施例7：脂肪酶4sEx与分子伴侣PDI的共表达
脂肪酶4sEx的重组质粒(实施例1构建)以PmeI将其线性化处理并纯化回收，将5μg的质粒线性化产物与GS115毕赤酵母感受态细胞混合后以电击法转化，涂布YPD+Zecion(Zeocin浓度为100μg/ml)平板进行筛选，获得重组工程菌株GS115-4sEx。
扩增含有pAO815空载体质粒和pAO815-PDI重组质粒的大肠杆菌工程菌(实施例6构建)，提取质粒并以Sal I线性化。将5μg的质粒线性化产物分别与GS115-4sEx毕赤酵母感受态细胞混合进行第二次电击转化，进一步在MD平板上进行筛选，获得共表达分子伴侣的重组工程菌株GS115-4sEx-pAO815、GS115-4sEx-PDI。
毕赤酵母感受态细胞的制备参照Invitrogen公司操作手册。电极法转化的步骤和程序设置按照Bio-Rad公司推荐参数设置。
实施例7：粗酶活测定
参照《GB/T 23535-2009脂肪酶制剂》并略做修改。
(1)取50ml小烧杯若干，空白组和样品组均加入橄榄油乳化剂4.00mL和pH＝7.5的磷酸缓冲液5.00mL，于空白组的小烧杯加入95％乙醇15.00mL；
(2)将所有小烧杯放进水浴锅于40℃预热10min后，于空白组和样品组各加入待测酶液1.00mL，立刻混匀并计时；
(3)精确反应15min后，空白组取出；样品组立刻补加入95％乙醇15.00mL，取出；
(4)于空白组和样品组加入15mL蒸馏水，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定，以酚酞为指示剂，记录其消耗体积，利用以下公式计算酶活。
Figure BDA0002317353010000121
其中:
U：样品中的酶活力，U/mL；
V1：滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；
V2：滴定空白时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；
M：氢氧化钠的标准液的浓度，mol/L；
N：样品的稀释倍数；
T：反应时间，min。
由上可见，脂肪酶4sEx的热稳定性均显著地提高，T50均大幅度提高。且该脂肪酶70℃下具有较长的半衰期，其pH反应区间得以拓宽且耐酸碱能力得以增强。
以突变脂肪酶4s(构建方法参考中国专利申请201711220144.8一种耐热突变脂肪酶及制备方法与应用)为对照，摇瓶发酵96h(每24h进行采样、补料和诱导)后测定其粗酶活(图3)。以原始菌株GS115毕赤酵母和未表达分子伴侣PDI的重组菌株GS115-4sEx为对照，重组菌株GS115-4sEx-PDI发酵上清液中粗酶活变化情况如图4所示。经共表达分子伴侣PDI后，重组菌株GS115-4sEx-PDI在发酵96h后上清液中粗酶活较未表达分子伴侣PDI菌株高51％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种热稳定性提高的突变脂肪酶及其制备方法与应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 突变脂肪酶4sEx
<400> 1
Val Cys Thr Ser Thr Glu Thr Cys His Ile Asp Gln Glu Ser Tyr Asn
1 5 10 15
Phe Phe Glu Lys Tyr Ala Arg Leu Ala Asn Ile Gly Tyr Cys Val Gly
20 25 30
Pro Gly Thr Lys Ile Phe Lys Pro Phe Asn Cys Gly Leu Gln Cys Ala
35 40 45
His Phe Pro Asn Val Glu Leu Ile Glu Glu Phe Cys Asp Pro Arg Leu
50 55 60
Ile Phe Asp Val Cys Gly Tyr Leu Ala Val Asp His Ala Ser Lys Gln
65 70 75 80
Ile Tyr Leu Val Ile Arg Gly Thr His Ser Leu Glu Asp Val Ile Thr
85 90 95
Asp Ile Arg Ile Met Gln Ala Pro Leu Thr Asn Phe Asp Leu Ala Ala
100 105 110
Asn Ile Ser Ser Thr Ala Thr Cys Asp Cys Cys Leu Val His Asn Gly
115 120 125
Phe Ile Gln Ser Tyr Asn Asn Thr Tyr Asn Gln Ile Gly Pro Lys Leu
130 135 140
Asp Ser Val Ile Glu Gln Tyr Pro Asp Tyr Gln Ile Ala Val Thr Gly
145 150 155 160
His Ser Leu Gly Gly Ala Ala Ala Leu Leu Phe Gly Ile Asn Leu Lys
165 170 175
Val Asn Gly His Asp Pro Leu Val Val Thr Leu Gly Gln Pro Ile Val
180 185 190
Gly Asn Ala Cys Phe Ala Asn Trp Val Asp Lys Leu Phe Phe Gly Gln
195 200 205
Glu Cys Pro Asp Val Cys Lys Val Ser Lys Asp Arg Lys Leu Tyr Arg
210 215 220
Ile Thr His Arg Gly Asp Ile Val Pro Gln Val Pro Phe Trp Asp Gly
225 230 235 240
Tyr Gln His Cys Ser Gly Glu Val Phe Ile Asp Trp Pro Leu Ile His
245 250 255
Pro Pro Leu Ser Asn Val Val Met Cys Gln Gly Gln Ser Asn Lys Gln
260 265 270
Cys Ser Ala Gly Asn Thr Leu Leu Gln Gln Val Asn Val Ile Gly Asn
275 280 285
His Leu Gln Tyr Phe Val Thr Glu Gly Val Cys Gly Ile
290 295 300
<210> 2
<211> 909
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 突变脂肪酶4sEx
<400> 2
gtgtgtacct ctaccgagac ctgtcacatt gaccaggagt cctacaactt ctttgagaag 60
tacgcccgac tcgcaaacat tggatattgt gttggtcccg gcactaagat cttcaagccc 120
ttcaactgtg gcctgcaatg tgcccacttc cccaacgttg agctcatcga ggagttctgt 180
gacccccgtc tcatctttga tgtttgtggt tacctcgctg ttgatcatgc ctccaagcag 240
atctaccttg ttattcgagg aacccactct ctggaggacg tcataaccga catccgaatc 300
atgcaggctc ctctgacgaa ctttgatctt gctgctaaca tctcttctac tgctacttgt 360
gattgttgtc ttgtccacaa tggcttcatc cagtcctaca acaacaccta caatcagatc 420
ggccccaagc tcgactctgt gattgagcag tatcccgact accagattgc tgtcaccggt 480
cactctctcg gaggagctgc agcccttctg ttcggaatca acctcaaggt taacggccac 540
gatcccctcg ttgttactct tggtcagccc attgtcggta acgcttgttt tgctaactgg 600
gtcgataaac tcttctttgg ccaggagtgt cccgatgtct gtaaggtgtc caaagaccga 660
aagctctacc gaatcaccca ccgaggagat atcgtccctc aagtgccctt ctgggacggt 720
taccagcact gctctggtga ggtctttatt gactggcccc tgatccaccc tcctctctcc 780
aacgttgtca tgtgccaggg ccagagcaat aaacagtgct ctgccggtaa cactctgctc 840
cagcaggtca atgtgattgg aaaccatctg cagtacttcg tcaccgaggg tgtctgtggt 900
atctaataa 909
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 122C-F
<400> 3
tgttgtcttg tccacaatgg cttcatc 27
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 122C-R
<400> 4
atcacaagta gcagtagaag agatgttagc agc 33
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 196C-F
<400> 5
acaagcgtta ccgacaatgg gctg 24
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 196C-R
<400> 6
tttgctaact gggtcgataa actcttcttt g 31
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 8C-F
<400> 7
tgtcacattg accaggagtc ctacaacttc 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 8C-R
<400> 8
ggtctcggta gaggtgtaca catggtgatg 30
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 214C-F
<400> 9
tgtaaggtgt ccaaagaccg aaagctcta 29
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 214C-R
<400> 10
gacatcgggg ttctcctggc ca 22
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 60C-F
<400> 11
tgtgaccccc gtctcatctt tgatgt 26
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 60C-R
<400> 12
gaactcctcg atgagctcaa cgttgg 26
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 69C-F
<400> 13
tgtggttacc tcgctgttga tcatgc 26
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 69C-R
<400> 14
aacatcaaag atgagacggg ggtcac 26
<210> 15
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 2C-F
<400> 15
tgtacctcta ccgagacctc tcacattgac c 31
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 2C-R
<400> 16
cacatggtga tggtgatggt ggaattc 27
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 210C-F
<400> 17
tgtcccgatg tctccaaggt gtcc 24
<210> 18
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ctcctggcca aagaagagtt tatcgacc 28

Claims (10)

1.一种热稳定性提高的突变脂肪酶，其特征在于：是在耶氏解脂酵母脂肪酶2中通过迭代组合的方法引入4对二硫键突变获得的突变脂肪酶；
所述的引入的4对二硫键为二硫键S2-210、S8-214、S60-69、S122-196。
2.根据权利要求1所述的热稳定性提高的突变脂肪酶，其特征在于：
所述的突变脂肪酶为突变脂肪酶4sEx，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.编码权利要求2所述的突变脂肪酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.权利要求1或2所述的热稳定性提高的突变脂肪酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以pPICZαA-Lip2为模板，通过反向PCR突变，将所选的氨基酸位点突变为半胱氨酸，并转入大肠杆菌中，进行扩增培养、质粒提取和测序，获得引入四对二硫键的突变脂肪酶重组质粒；
(2)将测序正确的重组质粒以PmeⅠ限制性内切酶线性化处理，并电击转化至感受态毕赤酵母X33中，进一步通过YPDS-Zeocin平板筛选，得到对应的突变工程菌；
(3)将突变工程菌在YPD液体培养基中进行扩繁培养后，转接至BMGY液体培养基进行去抑制培养，最后接种BMMY液体培养基进行发酵，将菌液离心获取上清粗酶液；
(4)利用超滤管将粗酶液进行超滤浓缩后，使用镍柱一步法纯化，分离出带组氨酸标签的脂肪酶蛋白，并以还原性SDS-PAGE检测蛋白纯度，获取纯化后的脂肪酶，即所述的热稳定性提高的突变脂肪酶；
步骤(1)中所述的大肠杆菌工程菌为大肠杆菌TOP10；
步骤(1)中所述的四对二硫键分别为二硫键S2-210、S8-214、S60-69、S122-196；
步骤(2)中所述的YPDS-Zeocin平板中Zeocin的浓度为100μg/mL；
步骤(3)中所述的发酵的时间为24～96h。
5.根据权利要求4所述的热稳定性提高的突变脂肪酶的制备方法，其特征在于，在步骤(4)之后还包括如下步骤：
(5)通过DSF荧光检测测定脂肪酶的熔解温度Tm，p-NPP比色法测定15min半失活温度T50，55或70℃下的半衰期t1/2，最适反应温度Topt，和/或最适反应pH。
6.权利要求1或2所述的热稳定性提高的突变脂肪酶在工业中的应用。
7.一种用于提高权利要求1或2所述的突变脂肪酶产量的表达菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)以PDI序列为目的片段，在其两端添加限制性酶切位点EcoRI后插入到pAO815载体上，得到分子伴侣表达载体pAO815-PDI；
(b)以pPICZαA-Lip2为模板，通过反向PCR突变，将所选的氨基酸位点突变为半胱氨酸，并转入大肠杆菌中，进行扩增培养、质粒提取和测序，获得引入四对二硫键的突变脂肪酶重组质粒；
(c)将测序正确的重组质粒以PmeⅠ限制性内切酶线性化处理，并电击转化至感受态毕赤酵母GS115中，进一步通过YPDS-Zeocin平板筛选，得到重组工程菌株GS115-4sEx；
(d)将分子伴侣表达载体pAO815-PDI以SalⅠ限制性内切酶线性化处理后，二次电击转化至重组工程菌株GS115-4sEx感受态细胞，利用MD平板进行筛选，得到重组工程菌株GS115-4sEx-PDI，即用于提高所述突变脂肪酶产量的表达菌株；
步骤(a)中所述的大肠杆菌工程菌为大肠杆菌TOP10；
步骤(a)中所述的四对二硫键分别为二硫键S2-210、S8-214、S60-69、S122-196；
步骤(c)中所述的YPDS-Zeocin平板中Zeocin的浓度为100μg/mL。
8.一种用于提高突变脂肪酶产量的表达菌株，其特征在于：通过权利要求7所述的方法构建得到。
9.权利要求8所述的用于提高突变脂肪酶产量的表达菌株在生产突变脂肪酶中的应用。
10.一种生产权利要求1或2所述的突变脂肪酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求8所述的用于提高突变脂肪酶产量的表达菌株在YPDS-Zeocin液体培养基中进行扩繁培养后，转接至BMGY液体培养基进行去抑制培养，最后接种至BMMY液体培养基进行发酵，得到所述的突变脂肪酶；
所述的YPDS-Zeocin平板中Zeocin的浓度为100μg/mL；
所述的发酵的时间为24～96h。
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