CN110527677B

CN110527677B - 玉米赤霉烯酮水解酶突变体zhdm2及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN110527677B
Application number: CN201910825318.6A
Authority: CN
Inventors: 姚斌; 罗会颖; 于心蕊; 涂涛; 柏映国; 黄火清; 苏小运; 王亚茹; 王苑; 张�杰
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2019-09-02
Filing date: 2019-09-02
Publication date: 2021-07-20
Anticipated expiration: 2039-09-02
Also published as: CN110527677A

Abstract

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM2及其编码基因和应用。玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM2通过将野生型玉米赤霉烯酮水解酶ZH607的160位碱基进行点突变得到。本发明提供了一种适用于能源、食品和饲料等领域的高酶活力玉米赤霉烯酮水解酶，突变体的酶活力是野生型的3.4倍，其具有广阔的应用前景。

Description

玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM2及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM2及其编码基因和应用。

背景技术

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)是谷物和农作物中常见的一种具有类雌激素样作用的非甾体类霉菌毒素，又被称为F-2毒素，主要由禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)、黄色镰刀菌(Fusarum culmorum)和克地镰刀菌(Fusarum crookwellense)等真菌产生，在生产实践中对畜牧业造成严重的危害。

目前，ZEN降解的常用方法主要有化学法、物理法和生物法。化学法和物理法主要是通过破坏ZEN苯环结构、修饰基团或吸附作用吸附毒素，以减少或去除毒素，但这些方法不仅成本高，效率低，还会造成营养物质流失，甚至造成二次污染。生物法主要是微生物吸附和微生物降解两种。微生物降解是通过微生物代谢所产生的一种或多种酶协作对毒素进行降解，条件温和，特异性强，不破坏原有营养成分且效率高，是一种环保、高效、实用性强的处理方法。但目前所发现的赤霉烯酮水解酶活性均较低，阻碍了赤霉烯酮水解酶的大规模工业化生产及应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM2。

本发明的再一目的在于提供上述突变体的编码基因。

本发明的再一目的在于提供含有上述编码基因的重组表达载体。

本发明的再一目的在于提供含有上述编码基因的重组菌株。

本发明的再一目的在于提供上述玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM2的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM2的应用。

根据本发明的具体实施方式，本发明的突变体ZHDM2由野生型玉米赤霉烯酮水解酶ZH607的160位碱基由异亮氨酸突变为酪氨酸得到，野生型玉米赤霉烯酮水解酶ZH607的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

MSTTRATKTVTTKDGIKWHVEQEGNGPDIVLVPDGLGECQMFDKPMSIIAASGFRVTTFDMPGMSRSRDAPPETYRDVTGHKLAGYVDTLLEELKIPIASVWGCSSGATTVLALCAAFPERVRNAMPHELPTVNPASVTGMEEKDPAVISQEMAAVSRSISGGTEAWDALGPEVHARLHDNYVRWARGYPVTIPPSAPTKSEVLHKRPVDWTVGGGTPTAMFFDNIVIAVKEGLNIGLLPGGHFPYVSHPEAFAEYVVETCRKYI

突变体ZHDM2具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，由265个氨基酸组成。

SEQ ID NO.2：

MSTTRATKTVTTKDGIKWHVEQEGNGPDIVLVPDGLGECQMFDKPMSIIAASGFRVTTFDMPGMSRSRDAPPETYRDVTGHKLAGYVDTLLEELKIPIASVWGCSSGATTVLALCAAFPERVRNAMPHELPTVNPASVTGMEEKDPAVISQEMAAVSRSYSGGTEAWDALGPEVHARLHDNYVRWARGYPVTIPPSAPTKSEVLHKRPVDWTVGGGTPTAMFFDNIVIAVKEGLNIGLLPGGHFPYVSHPEAFAEYVVETCRKYI

玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：ATGTCCACCACCAGAGCCACCAAGACTGTTACCACCAAGGATGGAATTAAGTGGCATGTTGAGCAAGAAGGAAACGGTCCAGACATTGTGTTGGTTCCAGATGGTTTGGGTGAGTGTCAAATGTTTGATAAGCCCATGTCCATTATTGCAGCCTCCGGTTTTAGAGTCACTACCTTTGATATGCCAGGTATGAGTAGATCCAGAGATGCTCCTCCAGAAACTTACAGAGATGTTACCGGTCATAAGCTGGCTGGTTACGTTGACACTTTGCTTGAGGAATTGAAGATTCCAATTGCTTCTGTTTGGGGTTGTTCCTCTGGTGCTACTACTGTTCTGGCCTTGTGTGCTGCTTTTCCAGAAAGAGTTAGAAATGCCATGCCACACGAGTTGCCAACTGTTAACCCAGCTTCTGTTACTGGTATGGAGGAGAAGGACCCTGCTGTTATTTCTCAAGAAATGGCTGCTGTTTCAAGATCATATAGTGGTGGTACTGAAGCCTGGGATGCTTTAGGACCAGAAGTTCATGCTAGACTTCATGATAATTACGTTAGATGGGCTAGAGGTTACCCAGTGACTATTCCACCATCTGCCCCAACCAAGTCTGAGGTTTTGCATAAGAGACCAGTTGATTGGACAGTTGGTGGTGGTACCCCAACTGCTATGTTTTTTGATAATATTGTCATCGCTGTCAAGGAAGGTTTGAACATTGGTTTGTTGCCAGGTGGTCATTTCCCATACGTTTCTCATCCTGAAGCTTTTGCTGAATACGTTGTTGAGACTTGTAGAAAGTACATTTAA

上述核苷酸序列包含终止子，共798bp。

本发明还提供包含上述编码基因的重组表达载体，优选为pPICZ(α)A-zh607-I160Y。

本发明还提供包含上述编码基因的重组菌株，优选为毕赤酵母X33(pPICZ(α)A-zh607-I160Y)。

根据本发明具体实施方式的玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM2的制备方法，包括以下步骤：

(1)用包含玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM2编码基因的重组表达载体转化宿主细胞，获得重组菌株；

(2)培养重组菌株，诱导表达玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM2；

(3)分离并纯化所表达的玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM2。

本发明还提供上述玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM2的应用，尤其是在能源、食品和饲料领域。

本发明的有益效果：

本发明的突变体的酶活力由野生型的4940U/mg提高到了16652U/mg，是野生型的3.4倍，因此，本发明提供了一种适用于能源、食品和饲料等领域的高酶活力玉米赤霉烯酮水解酶，其具有广阔的应用前景。

附图说明

图1显示赤霉烯酮水解酶野生型及突变体在毕赤酵母X33中表达后的SDS-PAGE电泳检测结果。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：本发明的表达宿主Pichia pastoris X33，表达质粒载体pPICZ(α)A。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrog公司。其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、大肠杆菌培养基LLB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl，pH自然)。毕赤酵母培养基YPD(Yeast Extract 1％,Trytone 2％，Glucose 2％pH自然)；BMGY(YeastExtract 1％,Trytone 2％,YNB10％,生物素0.1％,pH自然)；BMMY(Yeast Extract 1％，Trytone 2％，甲醇0.5％，YNB 10％，生物素0.1％，pH自然)。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1含野生型玉米赤霉赤霉烯酮水解酶基因的重组菌株X33(pPICZ(α)A-zh607)的制备

1.1扩增赤霉烯酮水解酶蛋白野生型ZH607的核酸序列zh607

经密码子优化后，得到赤霉烯酮水解酶ZH607的编码基因zh607。采用PCR的方法扩增zh607基因及载体pPICZ(α)A核酸片段，通过重组试剂盒将两者连接，获得重组质粒pPICZ(α)A-zh607，并转化毕赤酵母X33，获得重组毕赤酵母菌株X33(pPICZ(α)A-zh607)。

PCR所用引物如下：

表1野生型赤霉烯酮水解酶及载体扩增特异性引物

其中，zh607-pPICZ(α)A-F及zh607-pPICZ(α)A-R用于扩增赤霉烯酮水解酶野生型ZHD607的基因编码序列；pPICZ(α)A-zh607-F及pPICZ(α)A-zh607-R用于扩增可与zh607基因重组的pPICZ(α)A载体核酸片段。

扩增结束后，将PCR产物进行核酸电泳检测，zh607和pPICZ(α)A条带大小分别为835bp和3579bp(加引物)，分别回收纯化。

1.2构建重组菌株X33(pPICZ(α)A-zh607)

将回收的zh607与pPICZ(α)A基因片段通过试剂盒重组酶进行重组连接，然后将重组产物转化大肠杆菌TransⅠ感受态，并涂布于LLB(含100μg/mL zeocin)进行筛选。

待测序正确后，利用SacI限制性内切酶将重组质粒pPICZ(α)A-zh607进行酶切，回收产物电击转化毕赤酵母感受态细胞X33进行诱导表达，得到重组表达菌株X33(pPICZ(α)A-zh607)。

实施例2含突变型玉米赤霉烯酮水解酶基因的重组菌株X33(pPICZ(α)A-zh607-I160Y)的制备

2.1重组质粒pPICZ(α)A-zh607-I160Y的构建

经优化突变位点设计为将160位的异亮氨酸突变为酪氨酸，通过点突变试剂盒的方法引入突变位点，并对其进行测序验证，获得赤霉烯酮水解酶突变质粒pPICZ(α)A-zh607-I160Y。所用引物如表2所示：

表2突变体赤霉烯酮水解酶特异性引物

2.2构建重组菌株X33(pPICZ(α)A-zh607-I160Y)

利用SacI将重组质粒pPICZ(α)A-zh607-I160Y进行酶切，回收产物电击转化毕赤酵母感受态细胞X33进行诱导表达，得到重组表达菌株X33(pPICZ(α)A-zh607-I160Y)。

实施例3赤霉烯酮水解酶蛋白野生型ZH607及突变体ZHDM2的获得

3.1蛋白ZH607及ZHDM2的诱导表达

将得到的重组表达菌株X33(pPICZ(α)A-zh607)及X33(pPICZ(α)A-zh607-I160Y)接种至YPD培养基中进行种子培养，200rpm，30℃培养48h后，以1％接种量转接至BMGY培养基中，200rpm，30℃培养48h，富集足够的菌体后收集菌体并加入到含有1％甲醇的BMMY培养基中进行诱导表达。

3.2蛋白ZH607及ZHDM2的纯化

将诱导表达后的菌液12000rpm,10min离心，收集上清进行浓缩，再用10mM磷酸氢二钠溶液(柠檬酸调pH至7.6)进行透析，然后将透析后的酶液进行离子交换层析，A液为10mM磷酸氢二钠溶液(柠檬酸调pH至7.6)，B液为A液加1M Nacl，纯化蛋白，收集洗脱液，进行SDS-PAGE，蛋白ZH607及ZHDM2蛋白纯化结果见图1。

实施例4赤霉烯酮水解酶ZH607及突变体ZHDM2的活性检测

诱导表达后对玉米赤霉烯酮水解酶ZH607及突变体ZHDM2进行纯化及酶活的测定。

酶活的测定方法(ZEN由DMSO溶)：

37℃反应0.5h，加入800μL DMSO终止反应。

终止反应后通过HPLC检测对照组及实验组ZEN剩余峰面积。

酶活力单位(U)：在37℃，反应0.5h条件下，在1h内能转化1μg ZEN的酶量。

酶活计算(每毫升酶液所含酶活力单位)：反应体系中ZEN初始含量*(对照组峰面积-实验组峰面积)/对照组峰面积*2*稀释倍数*10。

在pH8.0,35℃的最适条件下对纯化的玉米赤霉烯酮水解酶ZH607和突变体ZHDM2进行比活性测定。经HPLC检测，ZH607的比活力为4940U/mg,突变体ZHDM2的比活力为16652U/mg，经定点突变，突变体ZHDM2的酶活力是野生型的3.4倍。

实施例5玉米赤霉烯酮水解酶ZH607及突变体ZHDM2的基本特性

诱导表达后对ZH607、ZHDM2粗酶液进行纯化并测定基本性质。

在pH 5.0-11.0，37℃的条件下测定ZH607、ZHDM2的最适pH,反应时间为30min,使用的缓冲液为：130mM的Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液(pH 5.0-7.0)、130mM的Tris-HCl(pH 8.0)和130mM的甘氨酸-NaOH(pH 9.0-11.0)。为测定pH稳定性，将纯化后的酶液在37℃,pH 5.0的条件下孵育1h,在标准条件下(pH 8.0，37℃，反应30min)测定其剩余活性。反应测定具体方法如实施例4所示。

在25℃-55℃的温度范围，pH 8.0的条件下反应30min测定温度对纯化ZH607、ZHDM2活性的影响。

结果显示，ZH607、ZHDM2的最适温度35℃，最适pH为8.0，而ZHDM2在pH 7.0、pH 8.0和pH 9.0的活性基本相同，显示了较宽的最适pH范围。

序列表

<110> 中国农业科学院饲料研究所

<120> 玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM2及其编码基因和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 265

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ser Thr Thr Arg Ala Thr Lys Thr Val Thr Thr Lys Asp Gly Ile

1 5 10 15

Lys Trp His Val Glu Gln Glu Gly Asn Gly Pro Asp Ile Val Leu Val

20 25 30

Pro Asp Gly Leu Gly Glu Cys Gln Met Phe Asp Lys Pro Met Ser Ile

35 40 45

Ile Ala Ala Ser Gly Phe Arg Val Thr Thr Phe Asp Met Pro Gly Met

50 55 60

Ser Arg Ser Arg Asp Ala Pro Pro Glu Thr Tyr Arg Asp Val Thr Gly

65 70 75 80

His Lys Leu Ala Gly Tyr Val Asp Thr Leu Leu Glu Glu Leu Lys Ile

85 90 95

Pro Ile Ala Ser Val Trp Gly Cys Ser Ser Gly Ala Thr Thr Val Leu

100 105 110

Ala Leu Cys Ala Ala Phe Pro Glu Arg Val Arg Asn Ala Met Pro His

115 120 125

Glu Leu Pro Thr Val Asn Pro Ala Ser Val Thr Gly Met Glu Glu Lys

130 135 140

Asp Pro Ala Val Ile Ser Gln Glu Met Ala Ala Val Ser Arg Ser Ile

145 150 155 160

Ser Gly Gly Thr Glu Ala Trp Asp Ala Leu Gly Pro Glu Val His Ala

165 170 175

Arg Leu His Asp Asn Tyr Val Arg Trp Ala Arg Gly Tyr Pro Val Thr

180 185 190

Ile Pro Pro Ser Ala Pro Thr Lys Ser Glu Val Leu His Lys Arg Pro

195 200 205

Val Asp Trp Thr Val Gly Gly Gly Thr Pro Thr Ala Met Phe Phe Asp

210 215 220

Asn Ile Val Ile Ala Val Lys Glu Gly Leu Asn Ile Gly Leu Leu Pro

225 230 235 240

Gly Gly His Phe Pro Tyr Val Ser His Pro Glu Ala Phe Ala Glu Tyr

245 250 255

Val Val Glu Thr Cys Arg Lys Tyr Ile

260 265

<210> 2

<211> 265

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ser Thr Thr Arg Ala Thr Lys Thr Val Thr Thr Lys Asp Gly Ile

1 5 10 15

Lys Trp His Val Glu Gln Glu Gly Asn Gly Pro Asp Ile Val Leu Val

20 25 30

Pro Asp Gly Leu Gly Glu Cys Gln Met Phe Asp Lys Pro Met Ser Ile

35 40 45

Ile Ala Ala Ser Gly Phe Arg Val Thr Thr Phe Asp Met Pro Gly Met

50 55 60

Ser Arg Ser Arg Asp Ala Pro Pro Glu Thr Tyr Arg Asp Val Thr Gly

65 70 75 80

His Lys Leu Ala Gly Tyr Val Asp Thr Leu Leu Glu Glu Leu Lys Ile

85 90 95

Pro Ile Ala Ser Val Trp Gly Cys Ser Ser Gly Ala Thr Thr Val Leu

100 105 110

Ala Leu Cys Ala Ala Phe Pro Glu Arg Val Arg Asn Ala Met Pro His

115 120 125

Glu Leu Pro Thr Val Asn Pro Ala Ser Val Thr Gly Met Glu Glu Lys

130 135 140

Asp Pro Ala Val Ile Ser Gln Glu Met Ala Ala Val Ser Arg Ser Tyr

145 150 155 160

Ser Gly Gly Thr Glu Ala Trp Asp Ala Leu Gly Pro Glu Val His Ala

165 170 175

Arg Leu His Asp Asn Tyr Val Arg Trp Ala Arg Gly Tyr Pro Val Thr

180 185 190

Ile Pro Pro Ser Ala Pro Thr Lys Ser Glu Val Leu His Lys Arg Pro

195 200 205

Val Asp Trp Thr Val Gly Gly Gly Thr Pro Thr Ala Met Phe Phe Asp

210 215 220

Asn Ile Val Ile Ala Val Lys Glu Gly Leu Asn Ile Gly Leu Leu Pro

225 230 235 240

Gly Gly His Phe Pro Tyr Val Ser His Pro Glu Ala Phe Ala Glu Tyr

245 250 255

Val Val Glu Thr Cys Arg Lys Tyr Ile

260 265

<210> 3

<211> 798

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtccacca ccagagccac caagactgtt accaccaagg atggaattaa gtggcatgtt 60

gagcaagaag gaaacggtcc agacattgtg ttggttccag atggtttggg tgagtgtcaa 120

atgtttgata agcccatgtc cattattgca gcctccggtt ttagagtcac tacctttgat 180

atgccaggta tgagtagatc cagagatgct cctccagaaa cttacagaga tgttaccggt 240

cataagctgg ctggttacgt tgacactttg cttgaggaat tgaagattcc aattgcttct 300

gtttggggtt gttcctctgg tgctactact gttctggcct tgtgtgctgc ttttccagaa 360

agagttagaa atgccatgcc acacgagttg ccaactgtta acccagcttc tgttactggt 420

atggaggaga aggaccctgc tgttatttct caagaaatgg ctgctgtttc aagatcatat 480

agtggtggta ctgaagcctg ggatgcttta ggaccagaag ttcatgctag acttcatgat 540

aattacgtta gatgggctag aggttaccca gtgactattc caccatctgc cccaaccaag 600

tctgaggttt tgcataagag accagttgat tggacagttg gtggtggtac cccaactgct 660

atgttttttg ataatattgt catcgctgtc aaggaaggtt tgaacattgg tttgttgcca 720

ggtggtcatt tcccatacgt ttctcatcct gaagcttttg ctgaatacgt tgttgagact 780

tgtagaaagt acatttaa 798

Claims

1.玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM2，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM2通过将野生型玉米赤霉烯酮水解酶ZH607的160位氨基酸由异亮氨酸突变为酪氨酸得到，其中，野生型玉米赤霉烯酮水解酶ZH607的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM2基因，其特征在于，编码权利要求1所述的玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM2。

3.根据权利要求2所述的玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM2基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.包含权利要求2所述的玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM2基因的重组表达载体。

5.包含权利要求2所述的玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM2基因的重组菌株。

6.制备权利要求1所述的玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM2的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）用包含玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM2编码基因的重组表达载体转化宿主细胞，获得重组菌株；

（2）培养重组菌株，诱导表达玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM2；

（3）分离并纯化所表达的玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM2。

7.权利要求1所述的玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM2用于水解玉米赤霉烯酮的应用。