TWI609081B - 內酯酶的用途及利用內酯酶降解 α-玉米赤黴烯醇的方法 - Google Patents

Description

內酯酶的用途及利用內酯酶降解α-玉米赤黴烯醇的方法

本案係關於一種內酯酶，尤指一種可提高對α-玉米赤黴烯醇降解效率的內酯酶。

黴菌毒素是黴菌或其它真菌分泌的有毒有害的次級代謝產物。糧食飼料中黴菌的生長和黴菌毒素的產生可能發生在糧食的成熟、運輸、加工和儲存等各個不同的環節。被黴菌毒素污染的飼料可引起動物中毒，影響免疫機能，降低生產能力，甚至造成嚴重的公共衛生問題。黴菌毒素污染已成為限制飼料業和養殖業發展的重要因素之一，每年約有25%的農作物受到不同程度黴菌毒素污染，以美國和加拿大為例，黴菌毒素的污染使家畜業和飼料業每年損失約50億美元。中國每年因飼料黴變導致的直接經濟損失也高達100億元，而長江以南地區由於氣候較為潮濕，飼料黴變情況更為嚴重。

為防止黴菌毒素對畜牧業的損害，人們陸續開發出多種物理和化學手段來吸附或降解飼料中的黴菌毒素。目前市場上廣泛使用吸附法來去除飼料中的黴菌毒素，但吸附劑往往不能選擇性的吸附毒素，造成其它營養物質的流失，同時，排出體外的毒素也會造成二次污染。相對而言，生物脫毒法利用酶在溫和的條件下特異性的降解黴菌毒素，不使用有害的化學試劑，無營養物質的流失，被認為是最佳的脫毒方法。開發高效的黴菌毒素降解酶，是解決黴菌毒素污染問題，挽回飼料業和畜牧業巨大損失的重要手段。

玉米赤黴烯酮（zearalenone，ZEN）是一類由鐮刀菌屬真菌產生的類雌激素毒素，具有二羥基苯甲酸內酯結構（如第1圖所示），是目前全球污染最嚴重的三種黴菌毒素之一，最初由Baldwin等人從發黴玉米中分離得到。ZEN主要存在於玉米、小麥、大麥和黍等農作物及其製品中，能導致攝入者出現早熟、生殖週期紊亂等雌激素紊亂症，給種植業和養殖業帶來巨大損失。ZEN還具有強致癌性，能夠引起乳腺癌、食管癌等發病率增加。ZEN已知存在6種常見的天然衍生物，其中，玉米赤黴烯醇（zearalenol，ZOL，如第1圖所示）一般與ZEN共同污染作物。玉米赤黴烯醇可分為 α-玉米赤黴烯醇（α-zearalenol，α-ZOL）和 β-玉米赤黴烯醇（β-zearalenol，β-ZOL），主要存在形式是 α-ZOL，其毒性為ZEN的三十餘倍。

Naoko Takahashi-Ando 從粉紅粘帚菌（Gliocladium roseum ）中分離出的一種大環內酯水解酶（lactone hydrolase，簡稱內酯酶） ZHD101是目前研究最為廣泛的玉米赤黴烯酮降解酶。通過水解ZEN的二羥基苯甲酸內酯鍵，使其環形結構打開變成直鏈形結構（如第2圖所示），然後自發脫羧形成斷裂產物。水解產物不能與雌激素受體結合，從而消除毒性。ZHD101編碼基因已成功在異源宿主中實現表達，但經產物分析發現，由於ZHD101對ZOL的降解活性較低，當不足量的ZHD101存在時，並不能降解體系中共存的少量ZOL，而 α-ZOL仍具有很強的雌激素毒性。僅當大量的ZHD101存在時，才能完全降解ZOL，實現ZEN的完全脫毒。因此，提高ZHD101對高毒性 α-ZOL的降解活性，具有很高的應用價值。

因此，本案擬通過基因改造以提高ZHD101對 α-ZOL的活性，同時維持對特異性受質ZEN的活性，提升其對玉米赤黴烯酮及其衍生物的降解效率。

本案的目的在於改造現有的內酯酶ZHD101，利用結構分析及定點突變技術，有效提高ZHD101對ZEN的天然共生劇毒衍生物 α-ZOL的活性，提升ZHD101的脫毒效果，進而增加ZHD101之工業應用價值。

本案的另一目的在於提供一種降解 α-ZOL的方法，其係利用本案改造後之ZHD101突變體對 α-ZOL進行降解，以提高對 α-ZOL的降解效率。

為達上述目的，本案之一較廣義實施態樣為提供一種內酯酶，其胺基酸序列係為將序列編號5第167個胺基酸由纈氨酸（Valine）突變成組氨酸（Histidine）的序列。該序列編號5的胺基酸序列係於序列編號2的胺基酸序列N端增加一段包含14個胺基酸的pET46載體序列。編碼該序列編號2之基因係從粉紅粘帚菌（Gliocladium roseum ）所分離出來的ZHD101基因。該內酯酶之胺基酸序列係為序列編號8之胺基酸序列。該內酯酶係用於提高對 α-玉米赤黴烯醇的降解效率。

又，本案之另一較廣義實施態樣為提供一種降解 α-玉米赤黴烯醇的方法，其係利用一內酯酶對 α-玉米赤黴烯醇進行降解，其中該內酯酶之胺基酸序列係為將序列編號5第167個胺基酸由纈氨酸（Valine）突變成組氨酸（Histidine）的序列。該序列編號5的胺基酸序列係於序列編號2的胺基酸序列N端增加一段包含14個胺基酸的pET46載體序列。編碼該序列編號2之基因係從粉紅粘帚菌（Gliocladium roseum ）所分離出來的ZHD101基因。該內酯酶之胺基酸序列係為序列編號8之胺基酸序列。該內酯酶提高對 α-玉米赤黴烯醇的降解效率。

體現本案特徵與優點的一些典型實施例將在後段的說明中詳細敘述。應理解的是本案能夠在不同的態樣上具有各種的變化，其皆不脫離本案的範圍，且其中的說明及圖示在本質上係當作說明之用，而非用以限制本案。

為增加玉米赤黴烯酮降解酶的工業應用價值，本案係從粉紅粘帚菌（Gliocladium roseum ）中克隆出內酯酶（lactone hydrolase）ZHD101基因，其所表達的蛋白為一種大環內酯酶。通過研究此內酯酶結構後，針對其活性區參與受質相互作用的胺基酸進行突變，以增加酶對受質衍生物 α-玉米赤黴烯醇（α-zearalenol，α-ZOL）的活性。以下將詳述本案改造內酯酶的方法及其所得到的改良的內酯酶。

首先，將粉紅粘帚菌的內酯酶ZHD101作為目標基因，野生型的內酯酶基因全長為795個鹼基對（以序列編號1標示，如第3圖所示），編碼264個胺基酸（以序列編號2標示，如第4圖所示），利用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction, PCR）進行基因擴增，所用的引子為5’-GACGACGACAAGATGCGTACTCGTAGCACTATATCTA-3’（正向引子，序列編號3）和5’-GAGGAGAAGCCCGGTTAAAGGTGTTTCTGAGTAGTCTCA-3’（反向引子，序列編號4）。獲得的擴增產物，利用pET46EK/LIC試劑盒將基因插入pET46質粒載體中。誘導表達後編碼的胺基酸序列除了ZHD101的序列外，其N端還有一段包含14個胺基酸的載體序列，序列全長為278個胺基酸（以序列編號5標示，如第5圖所示）。

為提高該內酯酶對高毒性受質衍生物 α-ZOL的活性，本案利用定點突變技術（site-directed mutagenesis），以pET46-zhd101 質粒為範本進行PCR，其中使用的突變引子見第6圖，其中正向引子以序列編號6標示，反向引子以序列編號7標示。此一突變設計係將內酯酶ZHD101胺基酸序列（序列編號2）中的第153個胺基酸由纈氨酸（Valine）突變成組氨酸（Histidine），而由於利用pET46質粒載體誘導表達後的蛋白其N端同樣具有一段包含14個胺基酸的載體序列，因此，突變蛋白的胺基酸序列係為將序列編號5中的第167個胺基酸由纈氨酸（Valine）突變成組氨酸（Histidine）的序列，並以V167H表示本案之突變體內酯酶，其胺基酸序列以序列編號8標示，如第7圖所示。之後加入限制性內切酶Dpn I於37 ℃下反應以去除原始範本。將純化後的反應產物轉化大腸桿菌感受態細胞中，用抗生素進行初步篩選，進行DNA測序以確定成功突變的基因。

將構建好的野生型(WT)和突變體(V167H)內酯酶的重組質粒轉化入大腸桿菌BL21 (DE3)感受態細胞中，在含有100 mg/ml Ampicillin的LB培養皿中篩選菌株。把篩選出的菌株接種到5 ml LB內培養，再放大菌量至200 ml LB培養，最終放大到6 L的LB培養基中培養。在OD值到達0.6至0.8時，加入1 mM的IPTG誘導酶蛋白的大量表達。經過3小時的蛋白質誘導表達後，將菌液以 6000 rpm轉速離心10分鐘將細胞收集下來。加入裂解緩衝液(lysis buffer)，利用超聲波細胞破碎機(sonicator)破菌，再以16000 rpm轉速離心30分鐘，收集上清液用以準備下一步的純化。為了得到高純度的酶蛋白，本案用快速蛋白質液相層析儀(fast protein liquid chromatography; FPLC)依次利用鎳離子層析柱以及DEAE陰離子交換柱分離出蛋白純度達 95% 以上的野生型及突變體內酯酶蛋白，並以5 mg/ml濃度在25 mM Tris，150 mM NaCl，pH 7.5條件下保存於-80 ℃。

為驗證野生型(WT)和突變體(V167H)內酯酶的差異，本案進一步測定二者對ZEN和 α-ZOL的活性。內酯酶的活性測試方法下所述：

每個反應的混合物（210 mL）處於25 mM Tris, 150 mM NaCl, pH7.5的緩衝液中，包括5 mL受質（5 mg/mL ZEN或5 mg/mL α-ZOL）和5 mL酶（0.25 mg/mL 野生型或突變型內酯酶）。30℃反應10 min之後，通過加入50 mL 1N HCl和300 mL甲醇，反應終止。接著將反應混合物過濾，然後取20 mL用高效液相色譜儀進行分析。樣品被60%的乙腈以0.6 mL/min的流速洗脫下來，吸光度檢測在254 nm。剩餘受質的量在HPLC曲線下根據峰面積計算出來。對於野生型和突變型的酶活分別測定三次取平均值。

第8圖為野生型(WT)和突變體(V167H)內酯酶蛋白的活性比較圖。將Val167（V167）突變成His（H）後，突變體V167H對受質 α-ZOL的活性比野生型對 α-ZOL的活性提高了3.7倍，同時，突變體維持了野生型對ZEN的活性。此結果表明，突變體V167H在維持對ZEN的活性的同時，也提高了對 α-ZOL的活性。

綜上所述，為了增加內酯酶ZHD101的對玉米烯酮黴素的脫毒效果，本案深入研究了內酯酶ZHD101的結構，針對其活性區或具有關鍵性特性的胺基酸進行突變，以增進酶對 α-ZOL受質的活性。根據本發明，將胺基酸序列上第167個胺基酸由纈氨酸(Valine)突變為組氨酸(Histidine)後可以增加酶蛋白對 α-ZOL受質的活性，對 α-ZOL受質的活性為野生型的3.7倍，同時突變體對ZEN的活性保持與野生型相同。換言之，本案亦提供一種降解 α-ZOL的方法，係利用內酯酶ZHD101之突變體V167H對 α-ZOL進行降解，且此方法可大大提升 α-ZOL降解效率。因此，本案通過結構分析所進行的突變可明顯地增加內酯酶ZHD101對玉米烯酮黴素的脫毒效果，進而增進其在飼料工業中的應用價值。故本案所提出的內酯酶ZHD101突變體及利用ZHD101突變體降解 α-ZOL的方法極具產業價值，特依法提出申請。

縱使本發明已由上述實施例詳細敘述而可由熟悉本技藝人士任施匠思而為諸般修飾，然皆不脫如附申請專利範圍所欲保護者。

無

第1圖顯示玉米赤黴烯酮（ZEN）及玉米赤黴烯醇（ZOL）的結構。 第2圖顯示ZHD101對ZEN的水解反應。 第3圖顯示ZHD101的核苷酸序列。 第4圖顯示ZHD101的胺基酸序列。 第5圖顯示利用pET46載體表達的ZHD101的胺基酸序列。 第6圖顯示突變引子序列。 第7圖顯示ZHD101突變體的胺基酸序列。 第8圖顯示野生型和突變體內酯酶蛋白的活性比較圖。

Claims (10)

1. 一種內酯酶的用途，係用於提升對α-玉米赤黴烯醇的降解活性，其中該內酯酶的胺基酸序列係為將序列編號5第167個胺基酸由纈氨酸(Valine)突變成組氨酸(Histidine)的序列。
2. 如申請專利範圍第1項所述的內酯酶的用途，其中該序列編號5的胺基酸序列係於序列編號2的胺基酸序列N端增加一段包含14個胺基酸的pET46載體序列。
3. 如申請專利範圍第2項所述的內酯酶的用途，其中編碼該序列編號2之基因係從粉紅粘帚菌(Gliocladium roseum)所分離出來的ZHD101基因。
4. 如申請專利範圍第1項所述的內酯酶的用途，其中該內酯酶之胺基酸序列係為序列編號8之胺基酸序列。
5. 如申請專利範圍第1項所述的內酯酶的用途，其中該內酯酶係用於提高對α-玉米赤黴烯醇的降解效率。
6. 一種降解α-玉米赤黴烯醇的方法，其係利用一內酯酶對α-玉米赤黴烯醇進行降解，其中該內酯酶之胺基酸序列係為將序列編號5第167個胺基酸由纈氨酸(Valine)突變成組氨酸(Histidine)的序列。
7. 如申請專利範圍第6項所述的降解α-玉米赤黴烯醇的方法，其中該序列編號5的胺基酸序列係於序列編號2的胺基酸序列N端增加一段包含14個胺基酸的pET46載體序列。
8. 如申請專利範圍第7項所述的降解α-玉米赤黴烯醇的方法，其中編碼該序列編號2之基因係從粉紅粘帚菌(Gliocladium roseum)所分離出來的ZHD101基因。
9. 如申請專利範圍第6項所述的降解α-玉米赤黴烯醇的方法，其中該內酯酶之胺基酸序列係為序列編號8之胺基酸序列。
10. 如申請專利範圍第6項所述的降解α-玉米赤黴烯醇的方法，其中該內酯酶提高對α-玉米赤黴烯醇的降解效率。