JP3354757B2 - 環状プラスミド - Google Patents
環状プラスミドInfo
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- JP3354757B2 JP3354757B2 JP20506295A JP20506295A JP3354757B2 JP 3354757 B2 JP3354757 B2 JP 3354757B2 JP 20506295 A JP20506295 A JP 20506295A JP 20506295 A JP20506295 A JP 20506295A JP 3354757 B2 JP3354757 B2 JP 3354757B2
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- rhodococcus
- circular plasmid
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は新規なプラスミドに
関し、さらに詳しくはロドコッカス属に属する微生物に
由来する新規なプラスミドに関する。ロドコッカス属に
属する微生物は、ニトリル類の代謝に関与する酵素を生
産することやＰＣＢ（ポリ塩化ビフェニル）等の分解に
関与する酵素を生産すること、さらには、排水処理に用
いられるようなバイオサーファクタントを生産すること
などの非常に多様な性質を示すことから、工業的に極め
て有用な微生物であることが知られている。
関し、さらに詳しくはロドコッカス属に属する微生物に
由来する新規なプラスミドに関する。ロドコッカス属に
属する微生物は、ニトリル類の代謝に関与する酵素を生
産することやＰＣＢ（ポリ塩化ビフェニル）等の分解に
関与する酵素を生産すること、さらには、排水処理に用
いられるようなバイオサーファクタントを生産すること
などの非常に多様な性質を示すことから、工業的に極め
て有用な微生物であることが知られている。
【０００２】
【従来の技術】しかしながら、ロドコッカス属に属する
菌株については、これらの微生物を宿主とするに適した
ベクターの開発は遅れており、ロドコッカス属において
プラスミドの見い出された株は、ロドコッカス エスピ
ー(Rhodococcus sp.) H13-A 株(J. Bacteriol. 170, 63
8-645(1988))、本発明者らが先に見出したロドコッカス
ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous) ATCC 4276 株
等（特開平4-148685号公報参照）およびロドコッカス
ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous) ATCC4001 株
（特開平4-330287号公報参照）など、僅か数株にすぎな
い。
菌株については、これらの微生物を宿主とするに適した
ベクターの開発は遅れており、ロドコッカス属において
プラスミドの見い出された株は、ロドコッカス エスピ
ー(Rhodococcus sp.) H13-A 株(J. Bacteriol. 170, 63
8-645(1988))、本発明者らが先に見出したロドコッカス
ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous) ATCC 4276 株
等（特開平4-148685号公報参照）およびロドコッカス
ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous) ATCC4001 株
（特開平4-330287号公報参照）など、僅か数株にすぎな
い。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】特に、工業的にこれら
宿主−ベクター系を用いる場合には、組換えＤＮＡ微生
物の安全性の面でセルフクローニング系で用いることが
望ましいと考えられるが、現在のところ、このセルフク
ローニング系としては、ロドコッカス ロドクロウス(R
hodococcus rhodochrous) しか利用できないという問題
点があった。そのため、ロドクロウス種以外のロドコッ
カス属に属する菌株から、工業的に利用し得る微生物を
育種改良するための新しいベクターの開発が強く要望さ
れていた。
宿主−ベクター系を用いる場合には、組換えＤＮＡ微生
物の安全性の面でセルフクローニング系で用いることが
望ましいと考えられるが、現在のところ、このセルフク
ローニング系としては、ロドコッカス ロドクロウス(R
hodococcus rhodochrous) しか利用できないという問題
点があった。そのため、ロドクロウス種以外のロドコッ
カス属に属する菌株から、工業的に利用し得る微生物を
育種改良するための新しいベクターの開発が強く要望さ
れていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ロドコッ
カス属に属する菌株を用いて工業的に有用な宿主−ベク
ター系を開発すべく鋭意研究を行った結果、ロドコッカ
ス属に属する微生物から工業的に有用な宿主−ベクター
系におけるベクターとして利用可能な新規な環状プラス
ミドを見い出し、本発明を完成した。
カス属に属する菌株を用いて工業的に有用な宿主−ベク
ター系を開発すべく鋭意研究を行った結果、ロドコッカ
ス属に属する微生物から工業的に有用な宿主−ベクター
系におけるベクターとして利用可能な新規な環状プラス
ミドを見い出し、本発明を完成した。
【０００５】すなわち、本発明は、大きさが約3.6kb で
あり、制限酵素切断部位数が BamHI:1、BglII:1 、Cla
I:1、PstI:1、PvuII:2 、SacI:1であることを特徴とす
るロドコッカス属に属する微生物由来の環状プラスミ
ド、である。
あり、制限酵素切断部位数が BamHI:1、BglII:1 、Cla
I:1、PstI:1、PvuII:2 、SacI:1であることを特徴とす
るロドコッカス属に属する微生物由来の環状プラスミ
ド、である。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明のプラスミドは、具体的に
は、例えば、ロドコッカス エリスロポリス(Rhodococc
us erythropolis) IFO 12320株から得ることができ、大
きさが約3.6kb で、且つ表１に示す制限酵素に対する分
解特性を有する新規な環状プラスミドである。以下、こ
のプラスミドをｐＲＣ０２０と称する。
は、例えば、ロドコッカス エリスロポリス(Rhodococc
us erythropolis) IFO 12320株から得ることができ、大
きさが約3.6kb で、且つ表１に示す制限酵素に対する分
解特性を有する新規な環状プラスミドである。以下、こ
のプラスミドをｐＲＣ０２０と称する。
【０００７】表１ 制限酵素 切断部位数 生成断片のサイズ(kb) BamHI 1 3.6 BgIII 1 3.6 ClaI 1 3.6 PstI 1 3.6 PvuII 2 2.75, 0.85 SacI 1 3.6
【０００８】
【実施例】次に、実施例により本発明をさらに具体的に
説明するが、下記の実施例は本発明の技術的範囲を限定
するものではない。
説明するが、下記の実施例は本発明の技術的範囲を限定
するものではない。
【０００９】実施例１ プラスミドの分離精製 ロドコッカス エリスロポリス(Rhodococcus erythropo
lis) IFO 12320株を１００ｍｌのＭＹ培地（ポリペプト
ン０．５％、バクトイーストエキス０．３％、マルツエ
キス０．３％、グルコース１％）に植菌した。２４時間
培養した後に終濃度２％となるように滅菌した２０％グ
リシン溶液を添加し、さらに２４時間培養した。その
後、遠心分離により菌体を回収し、菌体を４０ｍｌＴＥ
Ｓ（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）−１０ｍＭＮ
ａＣｌ−１ｍＭＥＤＴＡ）緩衝液で洗浄後、１１ｍｌの
５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）−１２．５％シュ
ークロース−１００ｍＭＮａＣｌ−１ｍｇ／ｍｌリゾチ
ームに懸濁し、３７℃にて３時間振盪した。これに１ｍ
ｌの１０％ＳＤＳを加え室温で穏やかに１時間振盪し、
さらに１ｍｌの５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．
２）を添加し氷中で１時間静置した。その後、４℃にて
１０，０００ｘｇ、１時間遠心し上清を得た。これに５
倍量のエタノールを加え、−２０℃で３０分静置した
後、１０，０００ｘｇ、２０分間遠心した。沈澱物を３
０ｍｌの７０％エタノールで洗浄した後、１ｍｌのＴＥ
緩衝液に溶解しプラスミド画分を得た。これを０．７％
アガロースゲル電気泳動に供し、ゲルを臭化エチジュウ
ムで染色することによりプラスミドの存在を確認した。
lis) IFO 12320株を１００ｍｌのＭＹ培地（ポリペプト
ン０．５％、バクトイーストエキス０．３％、マルツエ
キス０．３％、グルコース１％）に植菌した。２４時間
培養した後に終濃度２％となるように滅菌した２０％グ
リシン溶液を添加し、さらに２４時間培養した。その
後、遠心分離により菌体を回収し、菌体を４０ｍｌＴＥ
Ｓ（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）−１０ｍＭＮ
ａＣｌ−１ｍＭＥＤＴＡ）緩衝液で洗浄後、１１ｍｌの
５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）−１２．５％シュ
ークロース−１００ｍＭＮａＣｌ−１ｍｇ／ｍｌリゾチ
ームに懸濁し、３７℃にて３時間振盪した。これに１ｍ
ｌの１０％ＳＤＳを加え室温で穏やかに１時間振盪し、
さらに１ｍｌの５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．
２）を添加し氷中で１時間静置した。その後、４℃にて
１０，０００ｘｇ、１時間遠心し上清を得た。これに５
倍量のエタノールを加え、−２０℃で３０分静置した
後、１０，０００ｘｇ、２０分間遠心した。沈澱物を３
０ｍｌの７０％エタノールで洗浄した後、１ｍｌのＴＥ
緩衝液に溶解しプラスミド画分を得た。これを０．７％
アガロースゲル電気泳動に供し、ゲルを臭化エチジュウ
ムで染色することによりプラスミドの存在を確認した。
【００１０】プラスミドの分子量測定 上記のように調製したプラスミドの一部を０．７％アガ
ロースゲル電気泳動に供した。この際、サイズマーカー
として大腸菌プラスミドｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１８、ｐ
Ｔｒｃ９９Ａ（各々２．６９ｋｂ、３．１６ｋｂ、４．
１７ｋｂ）を同時に泳動した。ロドコッカス エリスロ
ポリス(Rhodococcus erythropolis) IFO12320株から得
られたプラスミドはｐＲＣ０２０と命名され、アガロー
スゲル電気泳動から求められた大きさは約３．６ｋｂで
あった。
ロースゲル電気泳動に供した。この際、サイズマーカー
として大腸菌プラスミドｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１８、ｐ
Ｔｒｃ９９Ａ（各々２．６９ｋｂ、３．１６ｋｂ、４．
１７ｋｂ）を同時に泳動した。ロドコッカス エリスロ
ポリス(Rhodococcus erythropolis) IFO12320株から得
られたプラスミドはｐＲＣ０２０と命名され、アガロー
スゲル電気泳動から求められた大きさは約３．６ｋｂで
あった。
【００１１】各種制限酵素による切断特異性 上記のように調製したプラスミドの一部を各種制限酵素
と反応させ、反応終了後、反応液を０．７％アガロース
ゲル電気泳動および５％アクリルアミドゲル電気泳動に
より分析した。サイズマーカーとしてはラムダファージ
ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ消化物およびＰｓｔＩ消化物を
用い、プラスミドの各制限酵素断片のサイズを算出し
た。ｐＲＣ０２０は表２のような制限酵素切断特性を示
した。
と反応させ、反応終了後、反応液を０．７％アガロース
ゲル電気泳動および５％アクリルアミドゲル電気泳動に
より分析した。サイズマーカーとしてはラムダファージ
ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ消化物およびＰｓｔＩ消化物を
用い、プラスミドの各制限酵素断片のサイズを算出し
た。ｐＲＣ０２０は表２のような制限酵素切断特性を示
した。
【００１２】表２ 制限酵素 切断部位数 生成断片のサイズ(kb) BamHI 1 3.6 BgIII 1 3.6 ClaI 1 3.6 EcoRI 0 − HindIII 0 − PstI 1 3.6 PvuII 2 2.75, 0.85 SacI 1 3.6 ScaI 0 − SmaI 0 − SphI 0 − SpII 0 − XhoI 0 −
【００１３】
【発明の効果】本発明の環状プラスミドは工業的に有用
な宿主−ベクター系におけるベクターとして有用であ
る。
な宿主−ベクター系におけるベクターとして有用であ
る。
【００１４】
【図１】本発明のプラスミドｐＲＣ０２０の制限酵素切
断地図。
断地図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】 大きさが約3.6kb であり、制限酵素切断
部位数が BamHI:1、BglII:1 、ClaI:1、PstI:1、PvuII:
2 、SacI:1であることを特徴とするロドコッカス属に属
する微生物由来の環状プラスミド。 - 【請求項２】 微生物がロドコッカス エリスロポリス
(Rhodococcus erythropolis) IFO 12320 である請求項
１記載の環状プラスミド。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20506295A JP3354757B2 (ja) | 1995-07-20 | 1995-07-20 | 環状プラスミド |
| US08/678,650 US5705386A (en) | 1995-07-20 | 1996-07-11 | Circular plasmids |
| EP96305330A EP0757101B1 (en) | 1995-07-20 | 1996-07-19 | Circular plasmids from Rhodococcus |
| DE69633993T DE69633993T2 (de) | 1995-07-20 | 1996-07-19 | Zirkuläre Plasmide aus Rhodococcus |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20506295A JP3354757B2 (ja) | 1995-07-20 | 1995-07-20 | 環状プラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0928379A JPH0928379A (ja) | 1997-02-04 |
| JP3354757B2 true JP3354757B2 (ja) | 2002-12-09 |
Family
ID=16500808
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20506295A Expired - Lifetime JP3354757B2 (ja) | 1995-07-20 | 1995-07-20 | 環状プラスミド |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5705386A (ja) |
| EP (1) | EP0757101B1 (ja) |
| JP (1) | JP3354757B2 (ja) |
| DE (1) | DE69633993T2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6949362B2 (en) * | 2000-12-12 | 2005-09-27 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Rhodococcus cloning and expression vectors |
| US20040115661A1 (en) * | 2001-12-12 | 2004-06-17 | Bramucci Michael G. | Rhodococcus cloning and expression vectors |
| EP1688491B1 (en) | 2003-10-31 | 2010-09-15 | Daiichi Fine Chemical Co., Ltd. | Novel plasmids and utilization thereof |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2926354B2 (ja) * | 1990-06-08 | 1999-07-28 | 三菱レイヨン株式会社 | α―ヒドロキシイソ酪酸の生物学的製造法 |
| US5246857A (en) * | 1990-10-11 | 1993-09-21 | Nitto Chemical Industry Co., Ltd. | Circular plasmids derived from the genus rhodococcus |
| DE69231939T2 (de) * | 1991-03-04 | 2002-04-04 | Mitsubishi Rayon Co | Hybrid-Plasmid-Vektoren, die für Nitril-abbauende Enzyme kodierende Gene enthalten und Verfahren zur Herstellung von Amiden und Säuren |
-
1995
- 1995-07-20 JP JP20506295A patent/JP3354757B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-07-11 US US08/678,650 patent/US5705386A/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-19 EP EP96305330A patent/EP0757101B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-19 DE DE69633993T patent/DE69633993T2/de not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5705386A (en) | 1998-01-06 |
| DE69633993D1 (de) | 2005-01-13 |
| EP0757101A2 (en) | 1997-02-05 |
| EP0757101B1 (en) | 2004-12-08 |
| EP0757101A3 (en) | 1998-06-03 |
| JPH0928379A (ja) | 1997-02-04 |
| DE69633993T2 (de) | 2005-05-19 |
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