JPH01168287A

JPH01168287A - 耐熱性ザルコシン・オキシダーゼｎ遺伝子

Info

Publication number: JPH01168287A
Application number: JP62327484A
Authority: JP
Inventors: Taiji Koyama; 泰二小山; Eiichi Nakano; 中野　衛一; Masaru Suzuki; 勝鈴木
Original assignee: NODA SANGYO KAGAKU KENKYUSHO; Kikkoman Corp
Current assignee: NODA SANGYO KAGAKU KENKYUSHO; Kikkoman Corp
Priority date: 1987-12-25
Filing date: 1987-12-25
Publication date: 1989-07-03
Anticipated expiration: 2009-06-29
Also published as: DE3843729A1; JPH0648985B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮ遺伝子に
関する。

ザルコシン・オキシダーゼは、ザルコシン十〇ＺＯ＋Ｏ□→ グリシン士ホルムアルデヒド十８２０□の反応を触媒す
る酵素であり、例えば、特開昭５４−５２７８９号公報
、ジャーナル・オブ・ハイオケミス　　［トリー、第８
９巻、第５９９頁、１９８１年ジャパン（Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、８９，５９９（１９８４）ＪＡＰＡＮ
　）に記載され、公知である。

一方、クレアチニンあるいはクレアチンを酵素杓に定量
する方法が報告され〔臨床化学シンポジウム、第１９集
１第１９６頁（１９７９））　、該定量法にザｉレコシ
ン・オキシダーゼが使用されており、咳酵おは、有用な
酵素である。該定量法は、下記の通りであり、下記の式
中、括弧内は使用酵素である。

クレアチニン＋Ｈ２０＃クレアチニン（クレアチニン・アミドヒドロラーゼ）クレアチン＋１
１□０→ザルコシント尿素（クレアチン・アミジノヒド
ロラーゼ）ザルコシン＋）ＩｚＯ＋　Ｏｚ→ グリシン＋ホルムアルデヒド＋１（２０□（ザルコシン
・オキシダーゼ）〔従来の技術〕先に、本発明者等の内の１人が、新たに土壌より分離し
たバチルス属に属する菌株を培養したものより、微酸性
でも充分酵素活性を示し、耐熱性で、ザルコシンに対す
るに１値の低い新規なザルコシン・オキシダーゼが得ら
れることを知り、耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮ及
びその製造法の特許出願を行なった（特開昭６１−１６
２１７４号公報）。

〔発明が解決しようとする問題点］しかしながら、上記の耐熱性ザルコシン・オキシダーゼ
Ｎ製造法により、該酵素の収率を最大にするためには、
培地中に高価なタレアチニン、クレアチン及び／又はザ
ルコシンを添加することが必要であり、経済的に不利で
あり、また、製造操作も煩雑になる等の問題があった。

［問題点を解決するための手段］そこで、本発明者等は、上記の問題点を解決すべく種々
検討した結果、耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮをコ
ードする遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿
入した組み換え体ＤＮＡを得、この組み換え体をエフシ
ェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する菌株に
含ませた耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮ生産能を有
する菌株を培地に培養すると、培地中に、タレアチニン
、クレアチン及び／又はザルコシンを全く添加すること
なしに、効率よく耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮが
生産されること等を知り特許出願を行なった。（特願昭
６１−２０１２８９及び特願昭６１−２０１２９０号明
細書）。

その後、本発明者等は、バチルス属菌由来の耐熱性ザル
コシン・オキシダーゼＮ遺伝子について更に検討した結
果、バチルス属菌由来の耐熱性ザルコシン・オキシダー
ゼＮ遺伝子を初めて単離及び構造決定することに成功し
、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、第３図に示されるアミノ酸配列を
コードする耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮ遺伝子で
ある。

以下、本発明について詳細に説明する。

先ず、耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮ（以下、ＳＯ
Ｎと略称する。）をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ
の調製について述べる。

バチルス・エスピーＭＳ−１２９（微工研条寄第６７１
号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６７１）　）株を、特開昭６１−
１６２１７４号公報記載の方法と全く同様にして培養し
、培養物を得る。この培養物を、例えば３０００ｒ、　
ｐ、　ｍ、以上、好ましくは８０００〜１００００ｒ、
ｐ、ｍ、で５分以上、好ましくは１０〜１５分間遠心分
離してバチルス・エスピーＮＳ−１２９株の菌体を得る
。

この菌体より、例えば斎藤、三浦の方法〔バイオケム、
バイオフィズ、アクタ、　（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ。

胱むａ、）、第７２巻、第６１９頁（１９６３年））等
により染色体ＤＮＡを得ることができる。

ついで、この染色体ＤＮＡに、突出末端を生じさせる制
限酵素、例えばＳａｕ　３ＡＩ（東洋紡績社製）を温度
３０゛Ｃ以上、好ましくは３７°Ｃ１酵素濃度は１〜１
０ユニット／ｍ１で２０分以上、好ましくは０．５〜２
時間作用させて消化し、種々の染色体ＤＮＡ断片混合物
を得る。

このようにして得たＤＮＡ断片混合物から、例えば通常
のアガロースゲル電気泳動法によりＤＮＡ断片混合物を
得、更に例えばフェノール抽出等の精製手段により精製
し、また更に例えばエタノール沈澱法等の濃縮手段によ
り濃縮し、純化されたＤＮＡ断片混合物（この中にＳＯ
Ｎをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片が含まれる
）を得る。

一方、本発明において用いることのできるベクターＤＮ
Ａとしては、如何なるものでもよ（、例えばプラスミド
ベクターＤＮＡ、バクテリオファージベクターＤＮＡ等
が挙げられるが、具体的には例えばプラスミドｐＢＲ３
２２Ｄ　Ｎ　Ａ　（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリー
ズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ）社製］などが好ましい。

上記ベクターＤＮＡに、突出末端を生じさせる制限酵素
、例えばＲａｍ　ｆｉｒ　（全酒造社製）を、温度３０
°Ｃ以上、好ましくは３７°Ｃ１酵素濃度１０〜１００
０ユニット／ｒｒｉで１時間以上、好ましくは２〜３時
間作用させて消化し、切断されたベクターＤＮＡを得る
。

ついで、上記のようにして得たバチルス・エスピーＮＳ
−１２９由来で、ＳＯＮをコードする遺伝子を含有する
ＤＮＡ断片混合物と、切断されたベクターＤＮＡを混合
し、これに例えば大腸菌ＤＮＡリガーゼにュー・イング
ランド・バイオ・ラプス社製）　、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
（ベーリンガー・マンハイム社製）など、好ましくはＴ
４ＤＮＡリガーセを、温度４〜３７″Ｃ１好ましくは４
〜１６°Ｃ１酵素濃度１〜１００ユニット／　ｒｒｄｌ
で１時間以上、好ましくは６〜２４時間作用させて組み
換え体ＤＮＡを得る。

この組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば大腸菌に−１２
、好ましくは大腸菌ＨＢ　１０１（Ａ　Ｔ　ＣＣ３３６
９４）、大腸菌Ｄ　ＨＩ（Ａ　Ｔ　ＣＣ３３８４９）、
大腸菌Ｘ−１７７６（ＡＴ　ＣＣ３１２４４）、などを
形質転換あるいは形質導入してそれぞれの菌株を得る。

この形質転換はデイ−・エム・モーリソン（ＤｏＭ、Ｍ
ｏｒｒｉｓｏｎ）の方法〔メソヅ・イン・エンザイモロ
ジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ−ｍｏｌｏｇｙ
）　、第６８巻、第３２６〜３３１頁（１９７９年））
により行なうことができる。また形質導入はビ・ホーン
（Ｂ、ｔｌｏｈｎ）の方法〔メソヅ・イン・エンザイモ
ロジー第６８巻、第２９９〜３０９頁（１９７９年）］
によって行なうことができる。

そして、上記菌株よりＳＯＮ生産能を有する菌株をスク
リーニングすることにより、ＳＯＮをコードする遺伝子
を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え
体ＤＮＡを含み、ＳＯＮ生産能を有するエツジエリシア
属に属する菌株を得ることができる。

このようにして得られた菌株より純化された組み換え体
ＤＮＡを得るには、例えばピー・グーリ（Ｐ’、　Ｇｕ
ｅｒｒｙ）等の方法〔ジェイ、ハクテリオロジー（Ｊ、
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第１１６巻、第１０６４〜
１０６６頁（１９７３年）］、デー・ビー・フレウェル
（Ｄ、Ｂ。

Ｃｌｗｅｌｌ）の方法（ジェー・バクテリオロジー第１
１０巻、第６６７〜６７６頁（１９７２年）］などによ
り得ることができる。

そして、以上の如くして得られ、かつ純化された組み換
え体ＤＮＡ中のＳＯＮをコードする遺伝子を含有するＤ
ＮＡには、ＳＯＮをコードする遺伝子以外に不用なりＮ
Ａが存在するため、以下の操作により該不用なりＮＡを
除去するのである。

次いで、このようにして得られ、かつ純化された組み換
え体ＤＮＡに、制限酵素、例えば肛虹■及びＩＩＩ　　
（夫々、宝酒造社製）を、温度３０’Ｃ以上、好ましく
は３７°Ｃ１酵素濃度ｌＯ〜１０００ユニット／ｍｌで
２０分以上、好ましくは１〜６時間作用させて消化し、
ＤＮＡ断片混合物を得る。

このようにして得たＤＮＡ断片混合物から、例えば通常
のアガロースゲル電気泳動法によりＤＮＡ断片混合物を
得、更に例えばフェノール抽出等の精製手段により精製
し、また更に例えばエタノール沈澱法等の濃縮手段によ
り濃縮し、純化されたＤＮＡ断片混合物（この′中にＳ
ＯＮをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片が含まれ
る）を得る。

一方、本発明において用いることのできるベクターＤＮ
Ａとしては、如何なるものでもよく、例えばプラスミド
ベクターＤＮＡ、バクテリオファージベクターＤＮＡ等
が挙げられるが、具体的には例えばプラスミドｐＵｃ１
８、ｐＵｃ１２、ｐＵｃ８ＤＮＡ〔ファルマシア社製〕
などが好ましい。

上記ベクターＤＮＡに、制限酵素、例えばＢａｍｌ１ｌ
及び肛匹■　（夫々、宝酒造社製）を、温度３０°Ｃ以
上、好ましくは３７°Ｃ１酵素濃度夫々ｌＯ〜１０００
ユニッｌ−／ｍ！で１時間以上、好ましくは１〜３時間
作用させて消化し、切断されたベクターＤＮＡを得る。

ついで、上記のようにして得たバチルス・エスピーＮＳ
−１２９山来で、ＳＯＮをコードする遺伝子を含有する
ＤＮＡ断片混合物と、切断されたベクターＤＮＡを混合
し、これに例えば大腸菌ＤＮＡリガーゼにュー・イング
ランド・バイオ・ラプス社製）　、Ｔ４　ＤＮＡリガー
ゼ（ベーリンガー・マンハイ・ム社製）など、好ましく
はＴ４ＤＮＡリガーゼを、温度４〜３７°Ｃ１好ましく
は４〜１６°Ｃ１酵素濃度１〜１００ユニットで１時間
以上、好ましくは６〜２４時間作用させて組み換え体Ｄ
ＮＡを得る。

この組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば大腸菌に−１２
、好ましくは大腸菌Ｊ　ＭＩＯＩ（Ａ　Ｔ　ＣＣ３３８
７６）、大腸菌ＨＢ　１０１（Ａ　Ｔ　ＣＣ３３６９４
）、大腸菌ＤＨｒ（ＡＴ　ＣＣ３３８４９）、大腸菌Ｘ
−１７７６（Ａ　Ｔ　ＣＣ３１２４４）、などを形質転
換あるいは形質導入してそれぞれの菌株を得る。この形
質転換はデイ−・エム・モーリソン（ＤｏＭ、Ｍｏｒｒ
ｉｓｏｎ）の方法〔メソヅ・イン・エンザイモロジー（
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　、第
６８巻、第３２６〜３３１頁（１９７９年）］により行
なうことができる。また形質導入はビ・ホーン（Ｂ、Ｈ
ｏｈｎ）の方法〔メソヅ・イン・エンザイモロジー第６
８巻、第２９９〜３０９頁（１９７９年）］によって行
なうことができる。

このようにして得られた菌株より純化された新規な組み
換え体ＤＮＡを得るには、例えばビー・グーリー（ｆ’
、Ｇｕｅｒｒｙ）等の方法〔ジエイ、バクテリオロジ−
（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第１１６巻、第１０
６４〜１０６６＠（１９７３年））、デー・ビー・フレ
ウェル（Ｄ、Ｂ、Ｃ１ｅ讐ｅｌｆ）の方法〔ジエー・バ
タテリオロジー第１１０巻、第６６７〜６７６頁（１９
７２年）］などにより得ることができる。

次いで、上記の純化された新規な組み換え体ＤＮＡに、
例えば、制限酵素Ｅｃｏ　Ｒ１及びＰｓｔ　Ｉ（いずれ
も宝酒造社製）を温度３０°Ｃ以上、好ましくは３７°
Ｃ１酵素濃度５〜２０ユニット／−で０．５〜２時間、
好ましくは約１時間作用させて消化し、ＤＮＡ断片混合
物を得る。

上記ＤＮＡ断片混合物よりＳＯＮをコードする遺伝子を
含有するＤＮＡを単離するには、ティー・マニアティス
（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ）等の方法〔モレキュラー・ク
ローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　
、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃ
ｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｆｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ）　、第１７３頁〜第１７８ｉｎ９ａ２年））
により得ることができる。

上記のようにして得られたＳＯＮをコードする遺伝子を
含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え体
ＤＮＡを含み、ＳＯＮ生産能を有するエツジエリシア属
に属する菌株を用いてＳＯＮを生産するには、この菌株
を通常の固体培養法で培養してもよいが、なるべく液体
培養法を採用して培養するのが好ましい。

また、上記菌株を培養する培地としては、例えば酵母エ
キス、ペプトン、肉エキス、コーンステイープリカーあ
るいは大豆もしくは小麦数の浸出液等の１種以上の窒素
源に、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸
マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第
２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添
加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加
したものが用いられる。

なお、培地の初発ｐＨは、７〜９に調整するのが適当で
ある。また培養は３０〜４２°Ｃ１好ましくは３７°Ｃ
前後で４〜２４時間、好ましくは６〜８時間、通気撹拌
深部培養、振盪培養、静置培養等により実施するのが好
ましい。

培養終了後、該培養物よりＳＯＳを採取するには、通常
の酵素採取手段を用いて得ることができる。

例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理
などするか、または、リゾチーム等の溶菌酵素を用いて
本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪
もしくは放置して自己消化を行なわせ本酵素を菌体外に
排出させる。この溶液を濾過、遠心分離などして固形部
分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プ
ロタミン硫酸塩あるいは硫酸マンガンにより除核酸した
のち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して
分画し、沈澱物を採取し、これを水に対し透析したのち
真空乾燥して粗酵素標品を得る。

そして本酵素は、必要により酵素の単離精製の常法に従
って、例えば、（１）ＤＥＡＥ−セルロースのカラムク
ロマトグラフィー、（２）硫安分画、（３）ＱＡＥ−セ
ファデックスのカラムクロマトグラフィー、（４）ＴＳ
Ｋ−ＧＥＬブチルート−ヨーパール６５０Ｃ〔東洋ソー
ダ■製〕の疎水クロマトグラフィー、（５）セスアデッ
クスによるゲル濾過等の方法、又はその他の方法を必要
に応じて組み合わせて用いることにより高度に精製され
たＳＯＮ標品を得ることができる。

上記精製手段により得られる精製ＳＯＮの理化学的性質
は、特開昭６１−１６２１７４号公報記載のＳＯＮの理
化学的性質と全く同様である。

〔発明の効果〕

上述したことから明らかな如く、本発明のＳＯＮ遺伝子
の組み込まれた新規な組み換え体ＤＮＡを含むエツジエ
リシア属に属する菌株を培地に培養すると、クレアチン
、タレアチニン、ザルコシン等を添加使用することなく
、ＳＯＮを効率よく得ることができるので、本発明は産
業上極めて有用なものである。

（実施例〕以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。

実施例（１）バチルス・エスピーＮＳ−１２９株の染色体ＤＮ
Ａの調整バチルス・エスピーＭＳ−１２９（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６
７１）株を、Ｔ−Ｙ培地〔１％（Ｗ／Ｖ）バクトートリ
プトン（Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎ　（デイフコ（Ｄ
ｉｒｃｏ）社製）、０．５％（Ｗ／Ｖ）バクトーイース
ト・エキストラクト（Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ　ｅｘｔ
ｒａｃｔ）　［デイフコ（Ｄｉｒｃｏ）社製］、０．５
％（Ｗ　／　Ｖ）ＮａＣ１（ｐｌ＋７．２）　］　２２
００ｍに接種し、温度３０°Ｃで１６時間振盪培養し、
培養物を得た。

この培養物を１０００Ｏｒ、ｐ、ｍ、で１０分間常法に
より遠心分離処理し、湿潤菌体０．５ｇを得たのち、該
菌体から斎藤、三浦の方法〔バイオケム、バイオフィズ
、アクタ、　（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、八ｃ
ｔａ、）、第７２巻、第６１９頁（１９６３年）〕によ
り染色体ＤＭＡを得た。

ついで、この染色体ＤＮＡ０．１■及び制限酵素Ｓａｕ
　３ＡＩ（東洋紡績社製）２ユニツトを、１０ｍＭ　ト
リス塩酸緩衝液（５０ｍＭ　ＮａＣ＋、１０ｍＭ　Ｍｇ
５Ｏ，及び１ｍＭジチオスレイトール含有）　（ｐＨ７
，４）にそれぞれ混合し、温度３７°Ｃで４５分間反応
させた。反応終了液を常法により０．７％（Ｗ／Ｖ）ア
ガロースゲル（宝酒造社製）電気泳動処理したものより
、４〜８Ｋｂ（キロヘースベアー）の大きさのＤＮＡ断
片をアール・シー・エイ・ヤング（Ｒ，Ｃ，＾、Ｙａｎ
ｇ）等の方法〔メソズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第６８巻、
第１７６〜１８２頁（１９７９年）］により溶出して溶
出物を得、これから常法によりフェノール抽出処理し、
更にエタノール沈澱処理してＳａｕ　３ＡＩで消化され
たバチルス・エスピーＮＳ−１２９株の染色体ＤＮＡ断
片１０μｇを得た。

（２）組み換え体プラスミドｐＫＬｓ６０１　ＤＮＡの
作製プラスミドｐＢＲ３２２Ｄ　Ｎ　Ａ　（ヘセスダ・リサ
ーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏ−ｒｉｅｓ）社製）１０μｇ
と制限酵素匡旧（宝酒造社製）１００ユニツトを５０ｍ
Ｍ　トリス塩酸緩衝液（１００ｍＭＮａＣ１、及びｌｏ
ｍＭ　Ｍｇ５Ｏｎ含有）　（ｐＨ７，４）に混合し、温
度３７゛Ｃで２時間反応させて消化液を得、該液を常法
によりフェノール抽出及びエタノール沈澱処理して、匡
旧で消化されたプラスミドρＢＲ３２２ＤＮＡを得た。

ついで、このＢａｍ　ＩＩＩで消化されたプラスミドｐ
ＢＲ３２２Ｄ　Ｎ　Ａ　１０μｇ、上記（１）で得られ
た鎖Ｌ３八■で消化されたバチルス・エスピーＮ５−１
２９株の染色体ＤＮＡ断片１０μｇ及び５ユニツトのＴ
４ＤＮＡリガーゼ〔ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅ
ｈｒ　ｉｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）社製〕を６．６　ｍ
Ｍ　ＭｇＣＩｚ、１０ｍＭジチオスレイトール及び１０
ｍＭＡ　Ｔ　Ｐを含有する６６ｍＭ　トリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７，５）に添加し、温度１６°Ｃで１６時間反応
し、ＤＮＡを連結させた。

ついで、デイ−・エム・モーリソン（Ｄ、Ｍ、Ｍｏ−ｒ
ｒｉｓｏｎ）の方法〔メソヅ・イン・エンザイモロジ−
（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　、
第６８巻＼第３２６ゞ３３ｔＢｔ　（１９７９年）〕で
、塩化カルシウム処理した大腸菌ＤＨＩ株（Ａ　Ｔ　Ｃ
Ｃ３３８４９）を、上記のように連結させたＤＮＡで形
質転換し、アンピシリン耐性及びテトラサイタリン感受
性の形質転換株１０００株を得た。

このようにして得られた形質転換株がＳＯＮ活性を有す
るか否かを以下のようにして試験した。

各菌株を、０．５％（Ｗ／Ｖ）ザルコシン（東京化成工
業社製）及び５０μｇ／ｌｄアンピシリンを含有するＴ
−Ｙ培地５ｍ／に接種し、温度３０°Ｃで２４時間培養
して培養液を得た。これを３５００ｒ、ｐ、ｍ、で１０
分間遠心分離処理して湿潤菌体を得、該菌体を１％（Ｗ
／Ｖ）ザルコシンを含有する１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
　Ｈ７，０）　１　ｍｌに懸濁し、これに、２０μｆト
ルエンを添加し、温度３７°Ｃで１時間反応させた液を
常法により３５００ｒ、ｐ、ｍ、で１０分間遠心分離処
理して反応液を得、この反応液に１％（Ｗ／Ｖ）４−ア
ミノ−３−ヒドラジノ−５−メルカプト−１，２，４−
トリアゾール、２３％（Ｗ／Ｖ）水酸化カリウム及び０
．０８％（Ｗ／Ｖ）　メタ過ヨウ素ナトリウムを夫々０
．１５ｍ１ずつ添加し、反応液が紫色に変化したものが
ＳＯＮ活性を有する形質転換株であり、ＳＯＮ活性を有
する形質転換株である大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｄ　Ｈｌ
　（ｐＫＬＳ　６０１）株を得た。

（３）組み換え体プラスミドｐＫＬｓ６０１　Ｄ　Ｎ　
Ａの単離トリプトン１％（Ｗ／■）、酵母エキス０．５％（Ｗ／
Ｖ）　、及びＮａＣｌ　０．５％（Ｗ／Ｖ）からなる培
地１１に、該培地を用い温度３７°Ｃで１６〜２４時間
前培養して得た大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｄ　ＨＩ　（
ｐ［、Ｓ　６０１）の培養液２０−を接種し、温度３７
°Ｃで３時間振盪培養したのち、培養液にクロラムフェ
ニコール０．２ｇを添加し、更に同一温度で２０時間培
養し、培養；夜を得た。

ついで、この培養液を、常法により１０００’Ｏｒ、ｐ
、ｍ。

で１０分間遠心分離処理して湿潤菌体を得、これを２０
−の２５％（Ｗ／Ｖ）　　ショ糖を含有する５０ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に懸濁したのち、更に、
これに、リソ゛チーム１０ｍｇ、０．２５Ｍ　ＥＤＴＡ
溶ン（１（ｐＨ８，０）　８−及び２０％（Ｗ／Ｖ）　
　ドデシル硫酸ナトリウム溶液８ｍｌをそれぞれ添加し
、温度６０’Ｃで３０分間保温して溶菌し、溶菌液を得
た。

この溶菌液に、５ＭＮａＣｌ溶液１３ｍｆを添加し、温
度４°Ｃで１６時間処理したものを常法により１５００
０ｒ、ｐ、ｍ、で３０分間遠心分離して抽出液を得、常
法によりフェノール抽出処理したのち、常法によりエタ
ノール沈澱処理し、沈澱物を得た。

ついで、この沈澱物を通常の減圧乾燥処理したものを、
１ｍＭＥＤＴＡを含有する１０＋ｎＭ　トリス塩酸緩衝
液６ｍＺ（ｐＨ７，５）に溶解し、更に、これに塩化セ
シウム６ｇ及び１０ｍｇ／−エチジウムブロマイド０．
２ｍｌを添加したものを、常法により３９０００ｒ、ｐ
、ｍ。

で４２時間超遠心分離機を用いて平衡密度勾配遠心処理
を行ない組み換え体プラスミドｐＫＬｓ６０１　Ｄ　Ｎ
Ａを単離し、また、更に、ノルマルブタノールを使用し
てエチジウムブロマイドを除去したのち、１ｍＭＥＤＴ
Ａを含有する１０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，
５）に対して透析を行ない純化された組み換え体プラス
ミドｐＫＬｓ６０１　ＤＮＡ　（大きさは、９．１Ｋｂ
である）　２７００μｇを得た。

（４）新規な組み換え体ｐＫＬｓ６１２　ＤＮＡの作製
プラスミドｐＵｃ１８　ＤＮＡ　（ファルマシア社製）
０．２μｇ並びに制限酵素…匹■　（全酒造社製）及び
Ｒａｍ　ＩＩＩ　（全酒造社製）を夫々ＩＯユニットず
つを１０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液（５０ｍＭ　ＮａＣ１
，１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４及び１ｍＭジチオスレイトール
含有）（ｐＨ７，４）に混合し、温度３７°Ｃで１時間
反応させて消化液を得、該液を常法によりフェノール抽
出及びエタノール沈澱処理して、■ｎｃｌｌ及びＲａｍ
　ＩＩＩで消化されたプラスミドｐＵｃ１８　ＤＮＡを
得た。

次いで、上記（３）で得られた組み換え体ｐＫＬＳ　６
０１ＤＮＡ１２μｇ並びに、ＨＪ２ＬＩ（全酒造社製）
１２ユニツト及びＩＩＩ（全酒造社製）３０ユニツトを
１０ｍ門ｌ・リス塩酸緩衝液（５０ｍＭ　ＮａＣｌ、　
１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４及び１ｍＭジチオスレイトール含
有）　（ｐＨ７，４）に混合し、温度３７°Ｃで５時間
反応させて消化液を得た。

該消化液を０．７％（、Ｗ／Ｖ）アガロースゲル電気泳
動したものより１．７ＫｂのＤＮＡ断片を、アール・シ
ー・エイ・ヤング（Ｉｌ、Ｃ，Ａ、Ｙａｎｇ）等の方法
〔メソズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　
ｉｎＣｎｚｙｍｏ　ｌｏｇｙ）、第０８巻、第１７６〜
１８２頁（１９７９年））により溶出して溶出物を得、
常法によりフェノール抽出及びエタノール沈澱処理して
ＤＮＡ断片１，３μｇを得た。

なお、該断片は、ＳＯＮをコードする遺伝子を含有する
ＤＮＡ断片である。

そして、上記ＤＮＡ断片を、ガｌ　　ＩＩ、展Ｉ、ＰＶ
ＬＩＩＩ、…ｎｄＩ［［、当り−Ｉ　〔いずれも全酒造
社製、制限酵素）、ＡｓｕＩＩ（プロメガ　バイオチク
社製、制限酵素）及びＢｓｔＥＩＩにッポンジーン社製
、制限酵素）を夫々用い単一消化及び２重消化して得ら
れたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動法により移動
度パターンを分析し、得られた移動度パターンと、λＤ
ＮＡを、前記１１ｉｎｄ［により消化して得られたＤＮ
Ａ断片の標卓移動度パターンと対比することにより得ら
れた分子里は、１　、７００ｂｐ　（ベースペアー）で
あり〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ旧ｏｌｏ
ｇｙ）第９８巻、５５１〜５６４頁、１９７５年参照］
、上記ＤＮＡ断片の制限酵素による切断地図は、第１図
に示すとおりであった。

このようにして得たＤＮＡ断片０．１５Ｍｇ、１ｌｉｎ
ｃ■及びＢａｍ　ＩＩＩで消化されたプラスミドｐＵｃ
１８　ＤＮＡ　０．２ｇｇ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベ
ーリンガーマンハイム社製）１ユニツトヲ、６６ｍＭト
リス塩酸緩衝液（６，６ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、１０ｍＭジ
チオスレイトール及び１０ｍＭＡ　Ｔ　Ｐ含有）（ｐＨ
７，５）に混和し、温度４°Ｃで１６時間反応させてＤ
ＮＡを連結させた。

次いで、前述のデイ−・エム・モーリソン（Ｄ、Ｍ。

Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）の方法により塩化カルシウム処理し
た大腸菌Ｊ　Ｍ　１０１　（Ａ　Ｔ　ＣＣ３３８７６）
を、上記のように連結させたＤＮＡで形質転換し、得ら
れた形質転換株を５０Ｍｇ／−アンピシリン、０．５１
イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド及び０．００
４％（Ｗ／■）５−プロ、モー４−クロロ−３−インド
リル−β−Ｄ−ガラクトシドを、夫々含有するＴ−Ｙ寒
天平板培地を用いて温度３７°Ｃで２４時間培養し、白
色のコロニーを形成するものがＳＯＮを生産する株であ
るので、白色のコロニーを形成する大腸菌Ｊ　ＭＩＯＩ
（ｐＫＬＳ　６１２）を得た。

このようにして得られたＳＯＮ生産能を有する形質転換
株である大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｊ　ＭＩＯＩ　（ｐ
ＫＬＳ６１２）は、工業技術院微生物工業技術研究所に
微工研条寄第１１４６号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１１４６）
として寄託されている。

（５）組み換え体プラスミドｐＫＬｓ６１２　ＤＮＡの
単離トリプトン１％（Ｗ／Ｖ）　、酵母エキス０．５％
（Ｗ／Ｖ）　、及びＮａＣ１０，５％（Ｗ／Ｖ）からな
る培地１１に、該培地を用い温度３７°Ｃで１６〜２４
時間前培養して得た大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｊ　ＭＩ
ＯＩ（ｐＫＬＳ　６１２）の培養液２０ｄを接種し、温
度３７°Ｃで３時間振盪培養したのち、培養液にクロラ
ムフェニコール０．２ｇを添加し、更に同一温度で２０
時間培養し、培養液を得た。

ついで、この培養液を、常法により１００００ｒ、ｐ、
ｍ。

で１０分間遠心分離処理して湿潤菌体を得、これを２０
ｍ／の２５％（Ｗ／Ｖ）　　ショ糖を含有する５０ｍＭ
　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に懸濁したのち、更
に、これに、リゾチーム１０ｍｇ、０．２５Ｍ　Ｅ　Ｄ
　Ｔ　Ａ溶液（ｐＨ８，０）　８−及び２０％（Ｗ／Ｖ
）　　ドデシル硫酸ナトリウム溶液８ｍ７をそれぞれ添
加し、温度６０°Ｃで３０分間保温して溶菌し、溶菌液
を得た。

この溶菌液に、５ＭＮａＣ１溶液１３−を添加し、温度
４°Ｃで１６時間処理したものを常法により１５０００
ｒ、ｐ、ｍ、で３０分間遠心分離して抽出液を得、常法
によりフェノール抽出処理したのち、常法によりエタノ
ール沈澱処理し、沈澱物を得た。

ついで、この沈澱物を通常の減圧乾燥処理したものを、
１ｍＭＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ　）リス塩酸緩衝液
６　ｍｌ　（ｐ　Ｈ７，５）に溶解し、更に、これに塩
化セシウム６ｇ及び１０ｍｇ／ｒｒ！エチジウムブロマ
イドＱ　、　２　＋ｎｌを添加したものを、常法により
３９０００ｒ　、ｐ　、　ｍ　。

で４２時間超遠心分離機を用いて平衡密度勾配遠心処理
を行ない組み換え体プラスミＩ”　ｐＫＬｓ６１２　Ｄ
　ＮＡを単離し、また、更に、ノルマルブタノールを使
用してエチジウムブロマイドを除去したのち、１ｍＭＥ
ＤＴＡを含有する１０ｍＭ　）リス塩酸ｆｆｔ　ＩＩＩ
液（ｐ　Ｈ７，５）に対して透析を行ない純化された組
み換え体プラスミドｐＫＬｓ６１２　ＤＮＡ　　（大き
さは、４．４Ｋｂである。）　２３００μｇを得た。

（６）大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｊ　ＭＩＯＩ（ｐＫＬ
Ｓ　６１２）によるＳＯＮの生産及び該酵素の分離、精
製トリプトン１％（Ｗ／■）、酵母エキス０．５％（Ｗ／
Ｖ）　、インプロピル−β−Ｄ−チオガラチトシドｌ　
ｍＭ、及び食塩０．５％（Ｗ／Ｖ）からなる培地２１を
撹拌式小型培養装置（いわしや社製）の培養槽に分注し
、常法により高圧滅菌処理したものに、上記と同一組成
の培地で予め温度３７°Ｃで２４時間振盪培養した大腸
菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｊ　ＭＩＯＩ（ｐＫＬＳ６１２）
の培養液２０ｍ１を接種し、温度３７°Ｃで８時間通気
撹拌培養する操作を５回繰り返して湿潤菌体３５ｇを得
た。

この菌体を０．ＯＦ　リン酸緩衝液（ｐ　Ｈ８，０）１
００ｎ４に懸濁し、常法により超音波破壊処理したのち
、１５０００ｒ、ｐ、ｍ、で３０分間通常の遠心分離処
理し、５ＯＮＯ粗酵素液１２０ｍ１（２９０ニー’−７
ト／ｍｌ）を得た。

このようにして得た粗酵素液に硫酸ストレプトマイシン
を用いて除核酸処理を施したものを、温度５０°Ｃで１
時間加温処理を行なったのち、不溶性物質を１００００
ｒ、ｐ、ｍ、で１０分間遠心分離処理して除去した。

０．０１Ｍリン酸緩衝液で平衡化済みのＱＡＥ−セファ
デックスＡ−５０カラム（１，４Ｘ４０ｃｍ）に吸着さ
せたのち、０．２７Ｍ塩化カリウムを含有する０、０１
Ｍリン酸緩衝液で洗浄したち、０．３７Ｍ塩化カリウム
を含有する０、０１Ｍ　リン酸緩衝液を用いて溶出し、
ＳＯＮ含有溶出液を得た。

このＳＯＮ含有溶出液を、常法により濃縮したのち、凍
結乾燥することにより純化されたＳＯＮ粉末２０　、８
００単位を得た。なお、収率は、６０％であった。

（７）ＳＯＮ遺伝子を含有するＤＮＡの塩基配列の解析項目（５）で得られた組み換え体プラスミドｐＫＬｓ６
１２ＤＮＡ１５μｇを、制限酵素に虹ＲＩ及びＰｓｔｌ
（いずれも宝酒造社製）で切断し、ＳＯＮ遺伝子を含有
する１、８Ｋｂ　ＤＮＡ断片３．５μｇを得、このＤＮ
Ａ断片を、プラスミドｐＵｃ１１８及びｐＵｃ１１９　
Ｄ　Ｎ　Ａ　（いずれも宝酒造社製）のＥｃｏ　Ｒ１及
びハｔＩ部位にクローニングし、得られた組み換え体プ
ラスミドＤＮＡを用いて大腸菌Ｊ　Ｍ　１０１　（Ａ　
Ｔ　ＣＣ３３８７６）を形質転換し、形質転換株、大腸
菌Ｊ　ＭＩＯＩ（ｐＵ５０８Ｂ）及びＪＭＩＯＩ（ρＵ
ＳＯ９Ｈ）を夫々得た。

なお、ＤＮＡの制限酵素による切断、Ｔ４ＤＮＡ　ＩＪ
ガーゼによる連結及び形質転換方法は、前記項目（２）
に記載の方法に、また、ＤＮＡ断片のアガロースゲル電
気泳動による単離は、前記項目（１）に記載の方法に準
拠した。

このようにして得られた形質転換株に、ヘルパーファー
ジＭ１３ＫＯ７（宝酒造社製）を感染させメツシック（
Ｍｅｓｓ　ｉ　ｎｇ）の方法〔メンゾ・イン・エンザイ
モロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ）　、第１０１巻、第２０〜７８頁（１９８３）　）
に従い１木鎖ＤＮＡを調製した。

得られた１本ｔｉ　Ｄ　Ｎ　Ａによるシークエンジング
は、７−ＤＥＡＺＡシークエンスキット　（宝酒造社製
）を用い上記メツシックの方法に従って行なった。また
、プライマーは、システム１プラスＤＮＡ合成機（ベッ
クマン社製）を用いて合成した。

更に、塩基配列の解析のためのゲル電気泳動は、８％（
Ｗ／Ｖ）ポリアクリルアミドゲル（富士写真フィルム社
製）を用いて行なった。

得られたＳＯＮ遺伝子のみの全塩基配列を第２図に、ま
た、該遺伝子から翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配
列を第３図に夫々示した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＳＯＮをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ
断片の制限酵素による切断地図を示す図であり、また、
第２図は、本発明ＳＯＮ遺伝子のみの全塩基配列を示す
図であり、更に、第３図は、本発明５ＯＮｉｉ伝子から
翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を示す図である
。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）下記に示されるアミノ酸配列をコードする耐熱性
ザルコシン・オキシダーゼＮ遺伝子。【遺伝子配列があります】
（２）下記に示される塩基配列で表わされる特許請求の
範囲第１項記載の耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮ遺
伝子。【遺伝子配列があります】