JPS62205786A

JPS62205786A - 新規な組み換え体ｄｎａ

Info

Publication number: JPS62205786A
Application number: JP61048246A
Authority: JP
Inventors: Taiji Koyama; 泰二小山; Eiichi Nakano; 中野　衛一; Satoru Kitao; 北尾　悟; Hideko Yamamoto; 秀子山本; Masaru Suzuki; 勝鈴木; Yasuhiko Nakajima; 中嶋　康彦
Original assignee: NODA SANGYO KAGAKU KENKYUSHO; Kikkoman Corp
Current assignee: NODA SANGYO KAGAKU KENKYUSHO; Kikkoman Corp
Priority date: 1986-03-07
Filing date: 1986-03-07
Publication date: 1987-09-10

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、クレアチナーゼの製造に有用な新規な組み換
え体ＤＮＡに関する。

クレアチナーゼ（ｃｒｅａｔｉｎａｓｅ）　　［クレア
チン・アミジノヒドロラーゼ（ｃｒｅａｔｉｎｅ　ａｍ
ｉｄｉｎｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ　）とも呼ばれている〕
は、クレアチンに作用して尿素とザルコンン（５ａｒｃ
ｏｓｉｎｅ　）に加水分解する酵素であ、す、その反応
式は次のとおりである。

クレアチナーゼクレアチン＋Ｈ２０尿素＋ザルコシンそしてこのクレアチナーゼは、血清、尿中等のクレアチ
ン含有物中のクレアチン定量用酵素として極めて有用な
ものである。

〔従来の技術〕

従来、クレアチナーゼは、例えばフラボバクテリウム（
Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）属に属し、クレアチ
ナーゼ生産能を有する菌株を、クレアチニン、クレアチ
ン、またはこれらの混合物の存在下で培養し、培養物よ
りクレアチナーゼを採取することにより製造されている
（特公昭５２−８３９５号公報）。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかし、上記のクレアチナーゼの製造法によるときには
、培地中に高価なりレアチニン、クレアチン等を添加す
ることが必須要件であるため、上記のクレアチナーゼ製
造法は、経済的に不利であり、また製造操作も煩雑にな
る等の問題があった。

〔問題点を解決するための手段〕

そこで、本発明者等は、上記の問題点を解決すべく種々
検討した結果、クレアチナーゼをコードする遺伝子を含
有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え体Ｄ
ＮＡを得、この組み換え体をエッシェリンア（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ）属に属する菌株に含ませたクレアチナ
ーゼ生産能を有する菌株を培地に培養すると、培地中に
、クレアチニン、クレアチン、またはこれらの混合物を
全く添加することなしに、効率よくクレアチナーゼが生
産されること等の知見を得、本発明を完成した。

即ち、本発明はクレアチナーゼをコードする遺伝子を含
有するＤ　Ｎ　ＡをベクターＤＮＡに挿入したことを特
徴とする新規な組み換え体ＤＮＡである０以下、本発明について詳細に説明する。

先ず、クレアチナーゼをフードする遺伝子を含有するＤ
ＮＡの調製について述べる。

フラボバクテリウムＵ−１８８［微工研菌寄第２９２２
号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−鬼２９２２）］株を、特公昭５２
−８３９５号公報記載の方法と全く同様にして培養し、
培養物を得る。この培養物を、例えば３０００　ｒ、ｐ
、ｍ、以上、好ましくは８０００〜１００００　ｒ、ｐ
、ｍ、で５分以上、好ましくは１０〜１５分間遠心分離
してフラボバクテリウムＵ−１８８株の菌体な得る。

この菌体より、例えば斎藤、三浦の方法［バイオケム、
バイオフィズ、アクタ、　（Ｂｉ６ｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐ
ｂｙｓ。

Ａｃｔａ、　）　、第７２巻、第６１９頁（１９６３年
）］、］ケーー、ｚスカービー（Ｋ、Ｓ、Ｋｉｒｂｙ　
）の方法ロバイオケム、ジェイ、　　（Ｂｉｏｃｈｅｍ
、Ｊ、）　、第６４巻、第４０５頁（１９５６年）コ等
の方法により染色体ＤＮＡを得ることができる。

ついで、この染色体ＤＮＡに、突出末端を生じさせる制
限酵素、３例えば−５ａｕ　３Ａ　Ｉ　　（東洋紡績社
製）を、温度３０°Ｃ以上、好ましくは３７°Ｃ１酵素
濃度１〜１０ユニット／　ａｔで２０分以上、好ましく
は１〜２時間作用させて消化し、種々の染色体ＤＮＡ断
片混合物を得る。

このようにして得たＤＮＡ断片混合物から、例えば通常
のアガロースゲル電気泳動法によりＤＮＡ断片８合物を
得、更に例えばフェノール抽出等の精製手段により精製
し、また更に例えばエタノール沈殿法等の濃縮手段によ
り濃縮し、純化されたＤ　Ｎ　Ａ　１ｔＪｉ　片混合物
（この中にクレアチナーゼをコードする遺伝子を含有す
るＤＮＡ断片が含まれる）を得る。

一方、本発明において用いることのできるベクターＤＮ
Ａとしては、如何なるものでもよく、例えばプラスミド
ベクターＤＮＡ、バクテリオファージベクターＤＮＡ等
が挙げられるが、具体的には例えばプラスミドｐＢＲ３
２２ＤＮＡ　［ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（
Ｂ６ｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ　）社製］などが好ましい。

上記ベクターＤＮＡに、突出末端を生じさせる制限酵素
、例えばＢａｍ　　Ｈｌ　　（宝酒造社製）を、温度３
０゛Ｃ以上、好ましくは３７°Ｃ１酵素濃度１０〜１ｏ
ｏｏユニツ）　／　ｍｅで１時間以上、好ましくは２〜
３時間作用させて消化し、切断されたベクターＤＮＡを
得る。

ついで、上記のよ°うにして得たフラボバクテリウムＵ
−１８８由来で、クレアチナーゼをコードする遺伝子を
含有するＤＮＡ断片混合物と、切断されたベクターＤＮ
Ａを混合し、こ、れに例えば大ＢＦｈ　ＶＪ　Ｄ　Ｎ　
Ａリガーゼ（二ニー・イングランド・バイオ・ラプス社
製）　、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ぺ一リンガー・マンハイ
ム社製）など、好ましくはＴ４ＤＮＡリガーゼを、温度
４〜３７°Ｃ１好ましくは４〜１６°Ｃ１酵素濃度１〜
１００ユニットで１時間以上、好ましくは６〜２４時間
作用させて組み換え体ＤＮＡを得る。

この組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば大腸菌に−１２
、好ましくは大腸菌ＨＢＩＯＩ　（ＡＴＣＣ３３６９４
）　、大腸菌ＤＨＩ　（ＡＴＣＣ３３８４９）　、大腸
菌χ−１７７６（ＡＴＣＣ３１２４４）　、などを形質
転換あるいは形質導入してそれぞれの菌株を得る。この
形質転換はディー・エム・モーリソ７　（Ｄ、Ｍ、Ｍｏ
ｒｒｉｓｏｎ）の方法［メソヅ・イア　−！　７ザイモ
１ｌｆｆジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ　）　、第６８巻、第３２６〜３３１頁（１９
７９年）］により行なうことができる。また形質導入は
ビー・ホーン（Ｂ、Ｈｏｈｎ　）の方法［メソノ゛・イ
ン・エンザイモロジー第６８巻、第２９９〜３０９頁（
１９７９年）］によってｔ行なうことができる。

そして、上記菌株よりクレアチナーゼ生産能を有する菌
株をスクリーニングすることにより、クレアチナーゼを
コードする遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに
挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、クレアチナーゼ生産
能を有するエランエリシア属に属する菌株を得ることが
できる。

このようにして得られた菌株より純化された新規な組み
換え体ＤＮＡを得るには、例えばビー・グーリー（Ｐ、
Ｇｕｅｒｒｙ　）等の方法［ジエイ、バクテリオロジ−
（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　）第１１６巻、第１
０６４〜１０６６頁（１−９７３年）］、デー・ビー・
フレウェル（Ｄ、Ｂ、Ｃｌｅｗｅｌｌ　）の方法［ジェ
ー、バクテリオロジー第１１．Ｏ巻、第６６７〜６７６
頁（１９７２年）］などにより得ることができる。

上記のようにして得られたクレアチナーゼをコードする
遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組
み換え体ＤＮＡを含み、クレアチナーゼ生産能を有する
エッシェリンア属に属スる菌株を用いてクレアチナーゼ
を生産するには、この菌株を通常の固体培養法で〜培養
してもよいが、なるべく液体培養法を採用して培養する
のが好ましい。

また、上記菌株を培養する培地としては、例えハ酵母エ
キス、ベフトン、肉エキス、コーンステイープリカーあ
るいは大豆もしくは小麦域の浸出液等の１種以上の窒素
源に、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸
マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第
２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添
加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加
したものが用いられる。

なお、培地の初発ｐＨは、７〜９に調整するのが適当で
ある。また培養は３０〜４２°Ｃ１好ましくは３７°Ｃ
前後で４〜２４時間、好ましくは６〜８時間、通気撹拌
深部培養、振盪培養、静置培養等により実施するのが好
ましい。

培養終了後、該培養物よりクレアチナーゼを採取するに
は、通常の酵素採取手段を用いて得ることができる。

例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理
などするか、または、リゾチーム等の溶菌酵素を用いて
本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪
もしくは放置して自己消化を行なわせ本酵素を菌体外に
排出させる。この溶液を濾過、遠心分離などして固形部
分を除去し、必要によりストレプトマイノン硫酸塩、プ
ロタミン硫酸塩あるいは硫酸マンガンにより除核酸した
のち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して
分画し、沈殿物を採取し、これを水に対し透析したのち
真空乾燥して粗酵素標品を得る。

更に、クレアチナーゼの精製品を得るには、例エバＤ　
Ｅ　Ａ　Ｅ−セルロース（ジ・エチル・アミン・エチル
・セルロース、米国ブラウン社製）、ＤＥＡＥ−セファ
デックス（ジ・エチル・アミノ・エチル・セファデック
ス、スウェーデン国ファルマシア社製）、ＱＡＥ−セフ
ァデックス（スウェーデン国、ファルマン７社製）等の
イオン交換物質を用いる吸着溶出法にて精製するか、ま
たセファデックスＧ−２００（スウェーデン国、ファル
マンア社製）、セファロース６Ｂ（スウェーデン国、フ
ァルマン７社製）等を用いるゲル濾過法、ハイトロキシ
ルアパタイト（米国バイオランド社製、バイオゲルＨＴ
）を用いる吸着溶出法、ポリアクリルアミドゲル等を用
いる電気泳動等を適宜選択、組み合わせて実施すること
により、高度に精製されたクレアチナーゼ標品を得るこ
とができる。

上記精製手段により得られる精製クレアチナーゼの理化
学的性質は、特公昭５２−８３９５号公報記載のクレア
チナーゼの理化学的性質と全く同様である。

〔発明の効果〕

上述しことから明らかな如く、本発明の新規な組み換え
体ＤＫＡを含むエッンエリンア属に属する菌株を培地に
培養すると、クンアチン、クレアチニン等を添加使用す
ることなく、クレアチナーゼを効率よく得ることができ
るので、本発明は産業上極めて有用なものである。

〔実施例〕

以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。

実施例（１）フラボバクテリウムロー１８８株の染色体ＤＮＡ
の調製フラボバクテリウムＵ−１８８（ＦＥＲＭ　　ＰＮｏ、
　２９２２　）株を、Ｔ−Ｙ培地（１％（Ｗ／Ｖ）バク
トートリブトン（Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎ　　［デ
ィフコ（Ｄｔｆｃｏ）社製コ、０．５％（Ｗ／Ｖ）バク
トーイースト＋ｚキストラクト（Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓ
ｔ　ｅｘｔｒａｃｔ）［ディフ’　（Ｄｉｒｃｏ）社製
コ、０．５％（Ｗ／Ｖ）ＮａＣＬ　（ｐＨ７，２）　１
１００　ｍｌに接０１シ、温度３０°Ｃで８時間振盪培
養し、培養物を得た。

この培養物を１００００　ｒ、ｐ、ｍ、で１Ｏ分間常法
により遠心分離処理し、湿潤菌体０．５ｇを得たのち、
該菌体から斎藤、三浦の方法ロバイオヶム、バイオフィ
ズ、アクタ、　（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａ
ｃｔａ、　）　、第７２巻、第６１９頁（１９６３年）
］により染色体ＤＮ　Ａを得た。

ついで、この染色体Ｄ　Ｎ　Ａ　０．２　ｍｇ及び制限
酵素−ジ巴３Ａ１　（東洋紡績社製）１．４５ユニツト
を、１０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液（５０ｍＭ　ＮａＣ１
，１０ｍＭＭｇｓｏ４及び１　ｍＭジチオスレイトール
含有）　　（ｐＨ７，４）にそれぞれ混合し、温度３７
゛Ｃで１時間反応させた。反応終了液を常法により０．
７％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲル（宝酒造社製）電気泳動
処理したものより、４〜８Ｋｂ（キロベースペアー）の
犬ぎさのＤＮＡ断片を７−ル・ン一・エイ・ヤング（Ｒ
，Ｃ，Ａ、Ｙａｎｇ　）　等の方法［メンズ・イン・エ
ンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ　）　、第６８巻、第１７６〜１８２頁（１９
７９年）］により溶出して溶出物を得、これから常法に
よりフェノール抽出処理し、更にエタノール沈殿処理し
て５ａｕ３ＡＩで消化されたフラボバクテリウムロー１
８８株の染色体ＤＮＡ断片１０μｙを得た。

（２）新規な組み換え体プラスミドｐＫＬｓ５１１ＤＮ
Ａの作製プラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡ　［ベセスダ・リサーチ
゛ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）社製１１０μ、５＋
と制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）〜４０ユニットを
５０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液（１００ｍＭ　ＮａＣ１、
及び１０　ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ４含有）　　（ｐＨ７，４）
に混合し、温度３７°Ｃで２時間反応させて消化液を得
、膣液を常法によりフェノール抽出及びエタノール沈殿
処理して、ＢａｍＨＩで１肖化されたプラスミドｐＢＲ
３２２ＤＮＡＩＩた。

ついで、二〇ＢａｍＨＩで消化されたプラスミドｐＢＲ
３２２ＤＮＡｌＯμｙ１上記（１）で得られたＳａｕ　
３　Ａ　Ｉで消化されたフラボバクテリウムロー１８８
株の染色体ＤＮＡ断片１０μＪ及び２ユニツトのＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ［ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　Ｌ製コを６．６ｍＭ
ＭｇＣｈ　、１０　ｍＭジチオスレイトール及び１０　
ｍＭＡＴＰを含有する６６ｍＭ　）　！Ｊス塩酸緩衝液
（ｐＨ７，５）に添加し、温度１６°Ｃで１０時間反応
し、ＤＮＡを連結させた。

ついで、ディー・エム・モーリソン（Ｄ、Ｍ。

Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　）の方法［メンヅ・イン・エンザイ
モロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ）　、第６８巻、第３２６〜３３１頁＜１９７９年）
］で、塩塩化カル／ラム理した大腸菌Ｈ８１０１株（Ａ
ＴＣＣ３３６９４）を、上記のように連結させたＤＮＡ
て形質転換し、アンピシリン耐性及びテトラサイクリン
感受性の形質転換株３２００株を得た。

このようにして得られた形質転換株がクレアチナーゼ活
性を有する′か否かを以下のようにして試験した。

各菌株を、０．２％（Ｗ／Ｖ）クレアチ７（シグマ社製
）及び５０μｆ　／　ｍ！アンピシリンを含有スるＴ−
Ｙ培地５　ｍｌに接種し、温度３０°Ｃで２４時間培養
して培養液を得た。これを３５０Ｏｒ、ｐ、ｍ、で１０
分間遠心分離処理して湿潤菌体を得、該菌体を１％ｌ／
Ｖ）クレアチンを含有する１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７，０）　Ｌ　ｍｌニ懸濁し、これに、２０ｐｌトルエ
ンを添加し、温度３７°Ｃで１時間反応させたのち、温
度１００°Ｃで５分間加熱処理して反応停＋ｈ液を得た
。

ついで、この液を常法により３５００　ｒ、ｐ、ｍ、で
１０分間遠心分離処理して反応液を得、この反応液に０
．３ユニツト／　ｍｅザルコシンオキシターセ（盛進製
薬社製）　、０．０７％（Ｗ／Ｖ）４−アミノアンチピ
ｌ）７．０．２％（Ｗ／Ｖ）２．４−ジクｑａフェノー
ルスルホン化溶液及び７０ユニツト／コパーオキンダー
ゼ（東洋紡績社製）をそれぞれ０．１ｍ１ｊずつ添加し
、反応液が赤色に変化したものがクレアチナーゼ活、性
を有する形質転換株である。

このようにして得られたクレアチナーゼ活性を有する形
質転換株である大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ　）　ＨＢ１０１
　（ｐＫＬｓ５１１）は、工業技術院微生物工業技術研
究所に微工研条寄第９９２号（ＦＥＲＭＢＰ−９９２）
として寄託されている。

（３）組み換え体プラスミドｐＫＬｓ５１１ＤＮＡの単
離トリプト７１％（Ｗ／Ｖ）　、酵母エキス０．５％（Ｗ
／ｖ）、及びＮａＣ１Ｏ，５％（Ｗ／Ｖ）からなる培地
ＩＥに、該培地を用い温度３７°Ｃで１６〜２４時間前
培養して得た大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＨＢ　１０１（
ｐＫＬｓ５１１）の培養液２０ｍ１を接種し、温度３７
°Ｃで３時間振盪培養したのち、培養液にクロラムフェ
ニコール０．２１を添加し、更に同一温度で２０時間培
養し、培養液を得た◎ ついで、この培養液を、常法により１００００　ｒ、ｐ
、ｍ。

で１０分間遠心分離処理して湿潤菌体な得、これを２０
コの２５％（Ｗ／Ｖ）ンゴ糖を含有する５０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に懸濁したのち、更に、これ
に、リゾチーム１０ＩＩＩｇ、０．２５ＭＥＤＴＡ溶液
（ｐＨ８，０）　８　ｍｌ及び２０％（Ｗ／Ｖ）ドデ／
ル硫酸ナトリウム溶液８　ｎＩｔをそれぞれ添加し、温
度６０°Ｃで３０分間保温して溶菌し、溶菌液を得た。

この溶菌液に、５Ｍ　ＮａＣ１溶液１３ｍ１を添加し、
温度４°Ｃで１６時間処理したものを常法により１５０
００　ｒ、ｐ、ｍ、で３０分間遠心分離して抽出液を得
、常法によりフェノール抽出処理したのち、常法により
エタノール沈殿処理し、沈殿物を得た。

ついで、この沈殿物を通常の減圧乾燥処理したものを、
１’ｍＭＥＤＴＡを含有する１０　ｍＭ　）リス塩酸緩
衝液５　ｍｌ　（ｐＨ７，５）に溶解し、更に、これに
塩化センラム６Ｉ及び１０　ｍｇ　／　ｍｅエチジウム
ブロマイド０．２ｍｇを添加したものを、常法により３
９０００　ｒ、ｐ、ｍ、で４２時間超遠心分離機を用い
て平衡密度勾配遠心処理を行ない組み換え体プラスミド
ｐＫＬｓ５１１ＤＮＡを単離し、また、更に、ノルマル
ブタノールを使用してエチジウムブロマイドを除去した
のち、１ｍＭＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ　）　！Ｉス
塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に対して透析を行ない純化さ
れた組み換え体プラスミドｐＫＬＳ５１１ＤＮＡ（３５
０μＩを得た。

（４）大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＨＢＩＯＩ　（ｐＫＬｓ
５１１）によるクレアチナーゼの生産及び該酵素の分離
、精製トリプトン１％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス０．５％（Ｗ／
Ｖ）、及び食塩０．５％（Ｗ／Ｖ）からなる培地２ｊを
撹拌式小型培養装置（いわしや社製）の培養槽に分注し
、常法により高圧滅菌処理したものに、上記と同一組成
の培地で予め温・度３７°Ｃで２４時間振盪培養した大
腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＨＢ　１０１　（ｐＫＬｓ５１
１）の培養液２０　ｍｌを接種し、温度３７°Ｃで８時
間通気撹拌培養する操作を５回繰り返して湿潤菌体３０
　／を得た。

この菌体な、１ｍＭ２−メルカプトエタノールを含有す
る０、０５　Ｍ　ＩＪ　７ｒ！ｊｊ、緩衝液（ｐＨ８，
０）　１００ｄに懸濁し、常法により超音波破壊処理し
たのち、１５０００　ｒ、ｐ、ｍ、で３０分間通常の遠
心分離処理し、クレアチナーゼの粗酵素液１２０　ｍｌ
　（０，８ユニット／　ｍｅ　）を得た。

このようにして得た粗酵素液に硫酸ストレフトマイノン
を用いて除核酸処理を施したものを、ＤＥＡＥ−セルロ
ースカラム（予め１　ｍＭ　２−メルカプトエタノール
を含有する０、０５　Ｍ　！Ｊン酸緩衝液で平衡化済み
のもの）　　（２Ｘ３０　ｃｍ）を通過させて非吸着区
分を得た。これを上記緩衝液で平衡化済みのＤＥＡＥ−
セファデックスＡ−５０カラム（１，４Ｘ４０　ｃｍ）
に吸着させたのち、Ｏ〜１．５モルの食塩濃度勾配溶出
法で溶出することにより０．１〜０．３モルの食塩濃度
範囲でクレアチナーゼ含有溶出液を得た。

このクレアチナーゼ含有溶出液を、上記緩衝液で予め平
衡化済みのセファロース６Ｂカラム（２Ｘ　１０８　ｃ
ｍ　）を通過させてクレアチナーゼ活性区分を分取し、
更に常法により濃縮したのち、凍結乾燥することにより
純化されたクレアチナーゼ粉末４３単位を得た。なお、
収率は４５％であった。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）クレアチナーゼをコードする遺伝子を含有するＤ
ＮＡをベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする新規
な組み換え体ＤＮＡ。
（２）クレアチナーゼをコードする遺伝子を含有するＤ
ＮＡが、フラボバクテリウムＵ−１８８株由来のＤＮＡ
である特許請求の範囲第１項記載の新規な組み換え体Ｄ
ＮＡ。
（３）ベクターＤＮＡが、プラスミドｐＢＲ３２２ＤＮ
Ａである特許請求の範囲第１項記載の新規な組み換え体
ＤＮＡ。