JPS6359885A

JPS6359885A - 耐熱性ザルコシン・オキシダ−ゼｎの製造法

Info

Publication number: JPS6359885A
Application number: JP20129086A
Authority: JP
Inventors: Taiji Koyama; 泰二小山; Eiichi Nakano; 中野　衛一; Masaru Suzuki; 勝鈴木; Hideko Yamamoto; 秀子山本
Original assignee: NODA SANGYO KAGAKU KENKYUSHO; Kikkoman Corp
Current assignee: NODA SANGYO KAGAKU KENKYUSHO; Kikkoman Corp
Priority date: 1986-08-29
Filing date: 1986-08-29
Publication date: 1988-03-15
Anticipated expiration: 2009-05-02
Also published as: JPH0632608B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮの製造法
に関する。

ザルコシン・オキシダーゼは、ザルコシン＋）１２０＋０□→ グリシン＋ホルムアルデヒド＋ＨｚＯ□の反応を触媒す
る酵素であり、例えば、特開昭５４−５２７８９号公報
、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー、第８９巻、
第５９９頁、１９８１年ジャパン（Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、８９，５９９（１９８１）ＪＡＰＡＮ
　）に記載され、公知である。

一方、クレアチニンあるいはクレアチンを酵素的に定量
する方法が報告され〔臨床化学シンポジウム、第１９集
、第１９６頁（１９７９））　、該定量法にザルコシン
・オキシダーゼが使用されており、該酵素は、有用な酵
素である。該定量法は、下記の通りであり一１下記の式
中、括弧内は使用酵素である。

クレアチニン＋１１□０＃タレアチニン（クレアチニン
・アミドヒドロラーゼ）クレアチン＋１１□Ｏ→ザルコ
シン＋尿素（クレアチン・アミノヒドロラーゼ）ザルコシン＋１１□０＋０□→ グリシン＋ホルムアルデヒド＋Ｈ２０２（ザルコシン・
オキシダーゼ）〔従来の技術〕先に、本発明者等の内の１人が、新たに土壌より分離し
たバチルス属に属する菌株を培養したものより、微酸性
でも充分酵素活性を示し、耐熱性で、ザルコシンに対す
るｉ値の低い新規なザルコシン・オキシダーゼが得られ
ることを知り、耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮ及び
その製造法の特許出願を行なった（特開昭６１−１６２
１７４号公報）。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、上記の耐熱性ザルコシン・オキシダーゼ
Ｎ製造法により、該酵素の収率を最大にするためには、
培地中に高価なクレアチニン、クレアチン及び／又はザ
ルコシンを添加することが必要であり、経済的に不利で
あり、また、製造操作も煩雑になる等の問題があった。

〔問題点を解決するための手段〕

そこで、本発明者等は、上記の問題点を解決すべく種々
検討した結果、耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮをコ
ードする遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿
入した組み換え体Ｄ　Ｎ　Ａを得、この組み換え体をエ
ッシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉ−ｃｈｉａ）属に属する
微生物に含ませた耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮ生
産能を有する微生物を培地に培養すると、培地中に、ク
レアチニン、クレアチン及び／又はザルコシンを全く添
加することなしに、効率よく耐熱性ザルコシン・オキシ
ダーゼＮが生産されること等の知見を得、本発明を完成
した。

即ち、本発明は耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮをコ
ードする遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿
入した組み換え体ＤＮＡを含み、耐熱性ザルコシン・オ
キシダーゼＮ生産能を有するエッシェリシア属に属する
微生物を、培地に培養し、培養物より耐熱性ザルコシン
・オキシダーゼＮを採取することを特徴とする耐熱性ザ
ルコシン・オキシダーゼＮの製造法である。

以下、本発明について詳細に説明する。

先ず、耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮ（以下、ＳＯ
Ｎと略称する。）をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ
の調製について述べる。

バチルス・エスピーＮＳ−１２９（ａ工研菌寄第２９２
２号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６７１））株を、特開昭６１−
１６２１７４号公報記載の方法と全く同様にして培養し
、培養物を得る。この培養物を、例えば３０００ｒ、ｐ
、ｍ、以上、好ましくは８０００〜１００００ｒ、ｐ、
ｍ、で５分以上、好ましくは１０〜１５分間遠心分離し
てバチルス・エスピーＮＳ−１２９株の菌体を得る。

この菌体より、例えば斎胚、三浦の方法〔バイオケム、
バイオフィズ、アクタ、　（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ。

Ａｃｔａ）　、第７２巻、第６１９頁（１９６３年）〕
等により染色体ＤＮＡを得ることができる。

ついで、この染色体ＤＮＡに、突出末端を生じさせる制
限酵素、例えば５ａｕ３Ａｒ（東洋紡績社製）を温度３
０℃以上、好ましくは３７℃、酵素濃度は１〜１０ユニ
ット／−で２０分以上、好ましくは０．５〜２時間作用
させて消化し、種々の染色体Ｄ　Ｎ　Ａ断片混合物を得
る。

このようにして得たＤＮＡ断片混合物から、例えば通常
のアガロースゲル電気泳動法によりＤＮＡ断片混合物を
得、更に例えばフェノール抽出等の精製手段により精製
し、また更に例えばエタノール沈澱法等の濃縮手段によ
り濃縮し、純化されたＤＮＡ断片混合物（この中にＳＯ
Ｎをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片が含まれる
）を得る。

一方、本発明において用いることのできるベクターＤＮ
Ａとしては、如何なるものでもよく、例えばプラスミド
ベクターＤＮＡ、バクテリオファージベクターＤＮＡ等
が挙げられるが、具体的には例えばプラスミドｐＢＲ３
２２Ｄ　Ｎ　Ａ　（ヘセスダ・リサーチ・ラボラトリー
ズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａ−ｂｏ
ｒａ　ｔｏｒ　１ｅｓ）社製〕などが好ましい。

上記ベクターＤＮＡに、突出末端を生じさせる制限酵素
、例えばＢａｍ１ｌＩ（宝酒造社製）を、温度３０℃以
上、好ましくは３７°ｃ、ト￥素濃度１０〜１０００ユ
ニット／ｍｌで１時間以上、好ましくは２〜３時間作用
させて消化し、切断されたベクターＤＮＡを得る。

ついで、上記のようにして得たバチルス・エスピーＮＳ
−１２９由来で、ＳＯＮをコードする遺伝子を含有する
Ｄ　Ｎ　、Ａ断片混合物と、切断されたベクターＤＮＡ
を混合し、これに例えば大腸菌ＤＮＡリガーゼにュー・
イングランド・バイオ・ラプス社製）　、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製）など、好まし
くはＴ４ＤＮＡリガーゼを、温度４〜３７℃、好ましく
は４〜１６°Ｃ１酵素？農度１〜１００ユニット／ｍ１
で１時間以上、好ましくは６〜２４時間作用させて組み
換え体ＤＮＡを得る。

この組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば大腸菌に−１２
、好ましくは大腸菌ＨＢ　１０１（Ａ　Ｔ　ＣＣ３３６
９４）、大腸菌ＤＨＩ（ＡＴＣＣ３３８４９）、大腸菌
Ｘ−１７７６（Ａ　Ｔ　ＣＣ３１２４４）、などを形質
転換あるいは形質導入してそれぞれの菌株を得る。この
形質転換はディー・エム・モーリソン（Ｄ、　Ｍ、　Ｍ
ｏｒｒ　１ｓｏｎ）の方法〔メソヅ・イン・エンザイモ
ロジー（Ｍｅ　ｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
）、第６８巻、第３２６〜３３１頁（１９７９年）〕に
より行なうことができる。また形質五人はビ・ホーン（
Ｂ、Ｈｏｈｎ）の方法〔メソヅ・イン・エンザイモロジ
ー第６８巻、第２９９〜３０９頁（１９７９年）〕によ
って行なうことができる。

そして、上記菌株よりＳＯＮ生産能を有する微生物をス
クリーニングすることにより、ＳＯＮをコードする遺伝
子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換
え体ＤＮＡを含み、ＳＯＮ生産能を有するエッシェリシ
ア属に属する微生物を得ることができる。

このようにして得られた微生物より純化された組み換え
体ＤＮＡを得るには、例えばピー・グーリー（Ｐ、Ｇｕ
ｅｒｒｙ）等の方法〔ジェイ、バクテリオロジー（Ｊ、
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第１１６巻、第１０６４〜
１０６６頁（１９７３年）〕、デー・ビー・フレウェル
（Ｄ。

Ｂ、ＣＩｅｗｅｌｌ）の方法〔ジェー・バクテリオロジ
ー第１１０巻、第６６７〜６７６頁（１９７２年）〕な
どにより得ることができる。

そして、以上の如くして得られ、かつ純化された組み換
え体ＤＮＡ中のＳＯＮをコードする遺伝子を含有するＤ
　Ｎ　Ａには、ＳＯＮをコードする遺伝子以外に不用な
りＮＡが存在するため、以下の操作により該不用なりＮ
Ａを除去するのである。

次いで、このようにして得られ、かつ純化された組み換
え体ＤＮＡに、制限酵素、例えば」匣Ｉ及びＢｇｌｌｌ
（夫々、宝酒造社製）を、温度３０℃以上、好ましくは
３７℃、酵素濃度１０〜１０００ユニツト／ｍｌで２０
分以上、好ましくは１〜６時間作用させて消化し、ＤＮ
Ａ断片混合物を得る。

このようにして得たＤＮＡ断片混合物から、例えば通常
のアガロースゲル電気泳動法によりＤＮＡ断片混合物を
得、更に例えばフェノール抽出等の精製手段により精製
し、また更に例えばエタノール沈澱法等の濃縮手段によ
り濃縮し、純化されたＤＮＡＩＩ片混合物（この中にＳ
ＯＮをコードする遺伝子を含有するＤ　Ｎ　Ａ断片が含
まれる）を得る。

一方、本発明において用いることのできるベクターＤＮ
Ａとしては、如何なるものでもよく、例えばプラスミド
ベクターＤＮＡ、バクテリオファージベクターＤＮＡ等
が挙げられるが、具体的には例えばプラスミドｐＵＣ１
８、ｐＵＣ１２、ｐｕｃ　８　Ｄ　ＮＡ〔ファルマシア
社製〕などが好ましい。

上記ベクターＤＮＡに、制限酵素、例えばＢａｍＨｌ及
びｕ匹■（夫々、宝酒造社製）を、温度３０℃以上、好
ましくは３７℃、酵素濃度夫々１０〜１０００ユニツト
／−で１時間以上、好ましくは１〜３時間作用させて消
化し、切断されたベクターＤＮＡを得る。

ついで、上記のようにして得たバチルス・エスピーＮＳ
−１２９由来で、ＳＯＮをコードする遺伝子を含有する
ＤＮＡ断片混合物と、切断されたベクターＤＮＡを混合
し、これに例えば大腸菌Ｄ　Ｎ　Ａ　ＩＪガーゼにュー
・イングランド・バイオ・ラプス社製）　、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製）など、好ま
しくはＴ４ＤＮＡリガーゼを、温度４〜３７°Ｃ１好ま
しくは４〜１６℃、酵素濃度１〜１００ユニツトで１時
間以上、好ましくは６〜２４時間作用させて組み換え体
ＤＮＡを得る。

この組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば大腸菌に−１２
、好ましくは大腸菌Ｊ　ＭＩＯＨＡ　Ｔ　ＣＣ３３８７
６）、大腸菌ＨＢ　１０１（Ａ　Ｔ　ｃ　Ｃ３３６９４
）、大腸菌ＤＨ１（Ａ　Ｔ　ＣＣ３３８４９）、大腸菌
Ｘ　−１７７６（Ａ　Ｔ　ＣＣ３１２４４）、などを形
質転換あるいは形質導入してそれぞれの菌株を得る。こ
の形質転換はディー・エム・モーリソン（Ｄ、月、Ｍｏ
ｒｒｉｓｏｎ）の方法〔メソヅ・イン・エンザイモロジ
ー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、
第６８巻、第３２６〜３３１頁（１９７９年）〕により
行なうことができる。また形質導入はビ・ホーン（８゜
１１ｏｈｎ）の方法〔メソヅ・イン・エンザイモロジー
第６８巻、第２９９〜３０９頁（１９７９年）〕によっ
て行なうことができる。

このようにして得られた微生物より純化された新規な組
み換え体ＤＮＡを得るには、例えばビー・グーリー（ｐ
、Ｇｕｅｒｒｙ）等の方法〔ジエイ、バクテリオロジー
（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第１１６巻、第１０
６４〜１０６６頁（１９７３年）〕、デー・ビー・フレ
ウェル（Ｄ、Ｂ、Ｃ１ｅｅｏａｌｌ）の方法〔ジェー・
バクテリオロジー第１１０巻、第６６７〜６７６頁（１
９７２年）〕などにより得ることができる。

上記のようにして得られたＳＯＮをコードする遺伝子を
含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え体
ＤＮＡを含み、ＳＯＮ生産能を有するエフシェリシア属
に属する微生物を用いてＳＯＮを生産するには、この微
生物を通常の固体培養法で培養してもよいが、なるべく
液体培養法を採用して培養するのが好ましい。

また、上記微生物を培養する培地としては、例えば酵母
エキス、ペプトン、肉エキス、コーンステイープリカー
あるいは大豆もしくは小麦験の浸出液等の１種以上の窒
素源に、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫
酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸
第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を
添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添
加したものが用いられる。

なお、培地の初発ｐＨは、７〜９に調整するのが適当で
ある。また培養は３０〜４２℃、好ましくは３７°Ｃ前
後で４〜２４時間、好ましくは６〜８時間、通気攪拌深
部培養、振盪培養、静置培養等により実施するのが好ま
しい。

培養終了後、該培養物よりＳＯＳを採取するには、通常
の酵素採取手段を用いて得ることができる。

例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理
などするか、または、リゾチーム等の溶菌酵素を用いて
本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪
もしくは放置して自己消化を行なわせ本酵素を菌体外に
排出させる。この溶液を濾過、遠心分離などして固形部
分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プ
ロタミン硫酸塩あるいは硫酸マンガンにより除核酸した
のち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して
分画し、沈澱物を採取し、これを水に対し透析したのち
真空乾燥して粗酵素標品を得る。

そして本酵素は、必要により酵素の単離精製の常法に従
って、例えば、（１）　Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ−セルロースの
カラムクロマトグラフィー、（２）硫安分画、（３）Ｑ
ＡＥ−セファデックスのカラムクロマトグラフィー、（
４）　Ｔ　Ｓ　Ｋ　−Ｇ　Ｅ　Ｌブチルート−ヨーバー
ル６５０Ｃ〔東洋ソーダ■製〕の疎水クロマトグラフィ
ー、（５）セスアデフクスによるゲル濾過等の方法、又
はその他の方法を必要に応じて組み合わせて用いること
により高度に精製されたＳＯＮ標品を得ることができる
。

上記精製手段により得られる精製ＳＯＮの理化学的性質
は、特開昭６１−１６２１７４号公報記載のＳＯＮの理
化学的性質と全く同様である。

〔発明の効果〕

上述したことから明らかな如く、本発明の新規な組み換
え体ＤＮＡを含むエッシェリシア属に属する微生物を培
地に培養すると、クレアチン、りレアチニン、ザルコシ
ン等を添加使用することなく、Ｓ　ＯＮを効率よく得る
ことができるので、本発明は産業上究めて有用なもので
ある。

〔実施例〕

以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。

実施例（１）バチルス・エスピーＮ５−１２９株の染色体ＤＮ
Ａの調整バチルス・エスピーＮＮ５−１２９（ＦＥＲＢＰ−６７
１）株を、Ｔ−Ｙ培地〔１％（Ｗ／Ｖ）バタトートリプ
トン（Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎ　（ディフコ（Ｄｉ
ｒｃｏ）社製）、０．５％（Ｗ／Ｖ）バクトーイースト
・エキストラクト（Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒ
ａｃｔ）　（ディフコ（Ｄｉｒｃｏ）社製〕、０．５％
（Ｗ／　Ｖ）ＮａＣ１（ｐＨ７，２））　２００　ｍｌ
に接種し、温度３０°Ｃで１６時間振盪培養し、培養物
を得た。

この培養物を１０００Ｏｒ、ｐ、ｍ、で１０分間常法に
より遠心分離処理し、湿潤菌体０．５ｇを得たのち、該
菌体からＴｒ藤、三浦の方法〔バイオケム、バイオフィ
ズ、アクタ、（旧ｏｃｈｅｍ、旧ｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ
、）、第７２巻、第６１９頁（１９６３年）〕により染
色体ＤＮＡを得た。

ついで、この染色体Ｄ　Ｎ　Ａ　０．１　ｍｇ及び制限
酵素鎧ｕ３ＡＩ（東洋紡績社製）２ユニツトを、１０ｍ
ＦＩトリス塩酸緩衝液（５０ｍＭ　ＮａＣ１，１０ｍＭ
　Ｍｇ５Ｏ，及び１ｍＭジチオスレイトール含存）（ｐ
Ｈ７，４）にそれぞれ混合し、温度３７℃で４５分間反
応させた。反応終了液を常法により０．７％（Ｗ／Ｖ）
アガロースゲル（宝酒造社製）電気泳動処理したものよ
り、４〜８Ｋｂ（キロヘースペアー）の大きさのＤＮＡ
断片をアール・シー・エイ・ヤング（Ｒ，Ｃ，Ａ、Ｙａ
ｎｇ）等の方法〔メンズ・イン・エンザイモロジー（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第６８巻
、第１７６〜１８２頁（１９７９年）〕により溶出して
溶出物を得、これから常法によりフェノール抽出処理し
、更にエタノール沈澱処理して５ａｕ３ＡＩで消化され
たバチルス・エスピーＮＳ−１２９株の染色体ＤＮＡ断
片１０μｇを得た。

（２）組み換え体プラスミドｐＫＬｓ６０１　Ｄ　Ｎ　
Ａの作製プラスミドｐＢＲ３２２Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｃベセスダ・リサ
ーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏ−ｒｉｅｓ）社製）　１０μ
ｇと制限酵素勿）ＩＴ　　（宝酒造社製）１００ユニツ
トを５０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液（１００ｍＭＮａＣ１
，及び１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４含有）　（ｐＨ７，４）に
混合し、温度３７℃で２時間反応させて消化液を得、液
液を常法によりフェノール抽出及びエタノール沈澱処理
して、Ｂａｍ　ＩＩ　Ｉで消化されたプラスミドｐＢＲ
３２２ＤＮＡを得た。

ライで、このＢａｍＨＩで消化されたプラスミドｐＢＲ
３２２Ｄ　Ｎ　Ａ　１０μｇ、上記（１）で得られた珈
ｕ３Ａ■で消化されたバチルス・エスピーＮＳ−１２９
株の染色体ＤＮＡ断片１０μｇ及び５ユニツトの７４Ｄ
ＮＡリガーゼ〔ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒ
ｉ−ｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）社製〕を６．６　ｍＭ
　ＭｇＣ１ｚ、１０ｍＭジチオスレイトール及び１０ｍ
ＭＡ　Ｔ　Ｐを含有する６６ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（
ｐＨ７，５）に添加し、温度１６℃で１６時間反応し、
ＤＮＡを連結させた。

ついで、ディー・エム・モーリソン（Ｄ、Ｍ、Ｍｏ−ｒ
ｒｉｓｏｎ）の方法〔メソヅ・イン・エンザイモロジ−
（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　、
第６８巻、第３２６〜３３１頁（１９７９年）〕で、塩
化カルシウム処理した大腸菌ＤＨＩ株（Ａ　Ｔ　ＣＣ３
３８４９）を、上記のようニ連結すせたＤＮＡで形質転
換し、アンピシリン耐性及びテトラサイタリン感受性の
形質転換株１０００株を得た。

このようにして得られた形質転換株がＳＯＮ活性を有す
るか否かを以下のようにして試験した。

各菌株を、０．５％（Ｗ／Ｖ）ザルコシン（東京化成工
業社製）及び５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＴ
−Ｙ培地５ｒｎｌに接種し、温度３０”Ｃで２４時間培
養して培養液を得た。これを３５０Ｏｒ、ｐ、ｍ、で１
゜分間遠心分離処理して湿潤菌体を得、該菌体を１％（
Ｗ／Ｖ）ザルコシンを含有する１０ｍＭリン酸緩衝液（
ｐＨ７，０）１ｍ／に懸濁し、これに、２０μＪ）ルエ
ンを添加し、温度３７℃で１時間反応させた液を常法に
より３５００ｒ、ｐ、ｍ、で１Ｏ分間遠心分離処理して
反応液を得、この反応液に１％（Ｗ／Ｖ）４−アミノ−
３−ヒドラジノ−５−メルカプト−１，２゜４−トリア
ゾール、２３％（Ｗ／Ｖ）水酸化カリウム及び０．０８
％（Ｗ／Ｖ）メタ過ヨウ素ナトリウムを夫々０．１５−
ずつ添加し、反応液が紫色に変化したものがＳ　ＯＮ活
性を有する形質転換株であり、ＳＯＮ活性を有する形質
転換株である大腸菌（Ｅ。

ｃｏｌｉ）　Ｄ　ＨＩ　（ｐＫＬＳ　６０１）株を得た
。

（３）組み換え体プラスミドｐＫＬｓ６０１　Ｄ　Ｎ　
Ａの単離トリプトン１％（Ｗ／■）、酵母エキス０．５％（Ｗ／
■）、及びＮａＣ１０，５％（Ｗ／Ｖ）からなる培地１
１に、該培地を用い温度３７°Ｃで１６〜２４時間前培
養して得た大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｄ　ＨＩ　（ｐＫ
ＬＳ　６０１）の培養液２０ｒｎｌを接種し、温度３７
℃で３時間振盪培養したのち、培養液にクロラムフェニ
コール０．２ｇを添加し、更に同一温度で２０時間培養
し、培養液を得た。

ついで、この培養液を、常法により１００００ｒ、　ｐ
、　ｍ。

で１０分間遠心分離処理して湿潤菌体を得、これを２０
ｍ１の２５％（Ｗ／Ｖ）　　ショ糖を含有する５０ｍＭ
　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に懸濁したのち、更
に、これに、リゾチーム１０ｍｇ、０．２５Ｍ　ＥＤＴ
Ａ溶液（ｐＨ８，０）　８　ｍｌ及び２０％（Ｗ／Ｖ）
　　ドデシル硫酸ナトリウム溶液８ｍｌをそれぞれ添加
し、温度６０°Ｃで３０分間保温して溶菌し、溶菌液を
得た。

この溶菌液に、５ＭＮａＣ１溶液１３ｍ／を添加し、温
度４℃で１６時間処理したものを常法により１５０００
ｒ、ｐ、ｍ、で３０分間遠心分離して抽出液を得、常法
によりフェノール抽出処理したのち、常法によりエタノ
ール沈澱処理し、沈澱物を得た。

ついで、この沈澱物を通常の減圧乾燥処理したものを、
１ｍＭＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液
６　ｍｌ　（ｐ　Ｈ７，５）に溶解し、更に、これに塩
化セシウム６ｇ及び１０■／−エチジウムブロマイド０
、２　ｎ＋Ｚを添加したものを、常法により３９０００
ｒ、　ｐ、　ｍ。

で４２時間超遠心分離機を用いて平衡密度勾配遠心処理
を行ない組み換え体プラスミドｐＫＬｓ６０１　ＤＮＡ
を単離し、また、更に、ノルマルブタノールを使用して
エチジウムブロマイドを除去したのち、１ｍＭＥＤＴＡ
を含有する１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に
対して透析を行ない純化された組み換え体プラスミドｐ
ＫＬｓ６０１　ＤＮＡ　（大きさは、９．ＩＫｂである
”）　２７００μｇを得た。

（４）新規な組み換え体ｐＫＬｓ６１２　ＤＮＡの作製
プラスミドｐＵＣ１８　ＤＮＡ　　（ファルマシア社製
）０．２μｇ並びに制限酵素ｕ匹■　（宝酒造社製）及
びＢａｍＨＩ（宝酒造社製）を夫々１０ユニツトずつを
１０ｍＭ　トリス塩酸緩衝？＆（５０ｍＭ　ＮａＣ１，
１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４及び１ｍＭジチオスレイ′トール
含有）　（ｐＨ７，４）に混合し、温度３７℃で１時間
反応させて消化液を得、該液を常法によりフェノール抽
出及びエタノール沈澱処理して、Ｈｉｎｃ　ＩＩ及びＢ
ａｍ）ＩＩで消化されたプラスミドｐＵＣ１８　Ｄ　Ｎ
　Ａを得た。

次いで、上記（３）で得られた組み換え体ｐＫＬｓ６０
１ＤＮＡ１２μｇ並びに、ＨｐａＩ（宝酒造社製）１２
ユニ・７ト及びシ１■　（宝酒造社製）　３０ユニツト
を１０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（５０ｍＭ　ＮａＣ１，１
０ｍＭ　ｌ’１ｇ５Ｏａ及び１ｍＭジチオスレイトール
含有）　（ｐＨ７，４）に混合し、温度３７°Ｃで５時
間反応させて消化液を得た。

該消化液を０．７％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲル電気泳動
したものより１．７ＫｂのＤＮＡ断片を、アール・シー
・エイ・ヤング（Ｒ，Ｃ，Ａ、Ｙａｎｇ）等の方法〔メ
ソズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第０８巻、第１７６〜１８２
頁（１９７９年）〕により溶出して溶出物を得、常法に
よりフェノール抽出及びエタノール沈澱処理してＤ　Ｎ
　Ａ断片１．３μｇを得た。

なお、該断片は、ＳＯＮをコードする遺伝子を含有する
ＤＮＡ断片である。

そして、上記Ｄ　Ｎ　Ａ断片を、シｄｎ、ルーａ　Ｉ　
Ｘハ１■、ＨｉｎｄｌｌＩ、Ｈｐａｌ　　（いずれも宝
酒造社製、制限酵素〕、ＡｓｕＩ［（プロメガ　バイオ
チク社製、制限酵素）及びＢｓｔＥＩＩにソボンジーン
社製、制限酵素）を夫々用い単一消化及び２重消化して
得られたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動法により
移動度パターンを分析し、得られた移動度パターンと、
λＤＮＡを、前記Ｈｉｎｄｌ［Ｉにより消化して得られ
たＤＮＡ断片の標準移動度パターンと対比することによ
り得られた分子量は、１，７００　ｂｐ　（ベースベア
ー）であり〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　
　Ｂｉｏｌｏｇｙ）第９８巻、５５１〜５６４頁、１９
７５年参照〕、上記ＤＮＡ断片の制限酵素による切断地
図は、第１図に示すとおりであった。

このようにして得たＤＮＡ断片０．１５Ｍｇ、…匹■及
びＢａｍＨＩで消化されたプラスミドｐｔｌｃ１Ｂ　Ｄ
Ｎ　Ａ　０．２μｇ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリン
ガーマンハイム社製）１ユニツトを、６６ｍＭ　）リス
塩酸緩衝液（６，６ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、１０ｍＭジチオ
スレイトール及び１０ｍＭＡＴＰ含有）（ｐＨ７，５）
に混和し、温度４℃で１６時間反応させてＤＮＡを連結
させた。

次いで、前述のディー・エム・モーリソン（Ｄ、Ｍ。

Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）の方法により塩化カルシウム処理し
た大腸菌Ｊ　ＭＩＯＩ（Ａ　Ｔ　ＣＣ３３８７６）を、
上記のように連結させたＤＮＡで形質転換し、得られた
形質転換株を５０Ｍｇ／ｍｌアンピシリン、０．５ｍＭ
イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド及び０．００
４％（Ｗ／−）５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ
ル−β−Ｄ−ガラクトシドを、夫々含有するＴ−Ｙ寒天
平板培地を用いて温度３７℃で２４時間培養し、白色の
コロニーを形成するものがＳＯＮを生産する株であるの
で、白色のコロニーを形成する大腸菌Ｊ　Ｍ　１０１　
（ｐＫＬｓ６１２）を得た。

このようにして得られたＳＯＮ生卒能を有する形質転換
株である大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｊ　Ｍｌｏｌ　（ｐ
ＫＬｓ６１２）は、工業技術院微生物工業技術研究所に
微工研条寄第１１４６号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１１４６）
として寄託されている。

（５）組み換え体プラスミドｐＫＬｓ６１２　ＤＮＡの
単離トリプトン１％（Ｗ／Ｖ）　、酵母エキス０．５％
（Ｗ／Ｖ）　、及びＮａＣ１Ｏ，５％（Ｗ／Ｖ）からな
る培地１１に、該培地を用い温度３７℃で１６〜２４時
間前培養して得た大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｊ　ＭＩＯ
ｌ（ｐＫＬｓ６１２）の培養液２０−を接種し、温度３
７℃で３時間振盪培養したのち、培養液にクロラムフェ
ニコール０，２ｇを添加し、更に同一温度で２０時間培
養し、培養液を得た。

ついで、この培養液を、常法により１００００ｒ、ｐ、
ｍ。

で１０分間遠心分離処理して湿潤菌体を得、これを２０
ｍ／の２５％（Ｗ／Ｖ）　　ショ糖を含有する５０ｍＭ
　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に懸濁したのち、更
に、これに、リソ゛チーム１０ｍｇ、０．２５Ｍ　ＥＤ
ＴＡ？容？ｆｆ１（ｐＨ８，０）　８−及び２０％（Ｗ
／Ｖ）　　ドデシル硫酸ナトリウム溶液８−をそれぞれ
添加し、温度６０℃で３０分間保温して溶菌し、溶菌液
を得た。

この溶菌液に、５ＭＮａＣｌ溶液１：Ｍを添加し、温度
４℃で１６時間処理したものを常法により１５０００ｒ
。

ｐ、ｍ、で３０分間遠心分離して抽出液を得、常法によ
りフェノール抽出処理したのち、常法によりエタノール
沈澱処理し、沈澱物を得た。

ついで、この沈澱物を通常の減圧乾燥処理したものを、
１ｍＭＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液
６　ｍｌ　（ｐ　Ｈ７，５）に溶解し、更に、これに塩
化セシウム６ｇ及び１０ｍｒ／−エチジウムブロマイド
０．２ｍｌを添加したものを、常法により３９０００ｒ
、ｐ、ｍ。

で４２時間超遠心分離機を用いて平衡密度勾配遠心処理
を行ない組み換え体プラスミドｐＫＬｓ６１２　ＤＮＡ
を単離し、また、更に、ノルマルブタノールを使用して
エチジウムブロマイドを除去したのち、１ｍＭＥＤＴＡ
を含有する１０ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）
に対して透析を行ない純化された組み換え体プラスミド
ｐＫＬｓ６１２　Ｄ　Ｎ　Ａ　（大きさは、４．４Ｗｂ
である。）　２３００μｇを得た。

（６）大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｔ）　Ｊ　ＭＩＯＩ（ｐＫＬ
ｓ６１２）によるＳＯＮの生産及び該酵素の分離、精製トリプトン１％（Ｗ／Ｖ）　、酵母エキス０．５％（Ｗ
／Ｖ）、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクシド／ｍＭ
、及び食塩０．５％（Ｗ／Ｖ）からなる培地２Ｉ！を攪
拌式小型培養装置（いわしや社製）の培養槽に分注し、
常法により高圧滅菌処理したものに、上記と同一組成の
培地で予め温度３７℃で２４時間振盪培養した大腸菌（
Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｊ　Ｍ　１０１　（ｐＫＬｓ６１２）
の培養液２０ｍ１を接種し、温度３７℃で８時間通気攪
拌培養する操作を５回繰り返して湿潤菌体３５ｇを得た
。

この菌体を０．ＯＩＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ８，０）１
００　ｍｌに懸濁し、常法により超音波破壊処理したの
ち、１５０００ｒ、ｐ、ｍ、で３０分間通常の遠心分離
処理し、ＳＯＮの粗酵素液１２０　＋ｎ／（２９，０ユ
ニット／ｍｌ）を得た。

このようにして得た粗酵素液に硫酸ストレプトマイシン
を用いて除核酸処理を施したものを、温度５０℃で１時
間加温処理を行なったのち、不溶性物質を１００００ｒ
、９０ｍ、で１０分間遠心分離処理して除去した。

０．０１Ｍリン酸緩衝液で平衡化済みのＱＡＥ−セファ
デックスＡ−５０カラム（１，４Ｘ４０ｃｍ）に吸着さ
せたのち、０．２７塩化カリウムを含有する０、０１Ｍ
リン酸緩衝液で洗浄したち、０．３刊塩化カリウムを含
有する０、０１Ｍリン酸緩衝液を用いて溶出し、ＳＯＮ
含有溶出液を得た。

このＳＯＮ含有溶出液を、常法により濃縮したのち、凍
結乾燥することにより純化されたＳＯＮ粉末２０．８０
０単位を得た。なお、収率は、６０％であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＳＯＮをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ
断片の制限酵素による切断地図を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】１、耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮをコードする遺
伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み
換え体ＤＮＡを含み、耐熱性ザルコシン・オキシダーゼ
Ｎ生産能を有するエッシェリシア属に属する微生物を、
培地に培養し、培養物より耐熱性ザルコシン・オキシダ
ーゼＮを採取することを特徴とする耐熱性ザルコシン・
オキシダーゼＮの製造法。２、耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮをコードする遺
伝子を含有するＤＮＡが、バチルス・エスピーＮ５−１
２９株由来のＤＮＡである特許請求の範囲第１項記載の
耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮの製造法。３、ベクターＤＮＡが、プラスミドｐＵＣ１８ＤＮＡで
ある特許請求の範囲第１項記載の耐熱性ザルコシン・オ
キシダーゼＮの製造法。