JPS63102681A - クレアチナ−ゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、フラボバクテリウム属菌由来のクレアチナー
ゼ遺伝子に関する。

クレアチナーゼ（ｃｒｅａｔｉｎａｓｅ）　　（クレア
チン・アミジノヒドロラーゼ（ｃｒｅａｔｉｎｅ　ａｍ
ｉｄｉｎｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ　）とも呼ばれている〕
は、クレアチンに作用して尿素とザルコシン（５ａｒｃ
ｏｓｉｎｅ　）に加水分解する酵素であり、その反応式
は次のとおりである。

クレアチナーゼ クレアチン十Ｈ２０ 尿素＋ザルコシン そしてこのクレアチナーゼは、血清、尿中等のクレアチ
ン含有物中のクレアチン定量用酵素として極めて有用な
ものである。

〔従来の技術〕

従来、クレアチナーゼは、例えばフラボバクテリウム（
Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）属に属し、クレアチ
ナーセ生産能ヲ有する菌株を、クレアチニン、クレアチ
ン、またはこれらの混合物の存在下で培養し、培養物よ
りクレアチナーゼを採取することにより製造されている
（特公昭５２−８３９５号公報）。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかし、上記のクレアチナーゼの製造法によるトキニは
、培地中に高価なりレアチニン、クレアチン等を添加す
ることが必須要件であるため、上記のクレアチナーゼ製
造法は、経済的に不利であり、また製造操作も煩雑にな
る等の問題があった。

〔問題点を解決するための手段〕

そこで、本発明者等は、上記の問題点を解決すへく種々
検討した結果、クレアチナーゼをコードする遺伝子を含
有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え体Ｄ
ＮＡを得、この組み換え体をエツジエリシア（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ）属に属する菌株に含ませたクレアチナ
ーゼ生産能を有する菌株を培地に培養スると、培地中に
、クレアチニン、クレアチン、またはこれらの混合物を
全く添加することなしに、効率よくクレアチナーゼが生
産されることを知り、特許出願を行なった（特願昭６１
−４８２４６及び特願昭６１−４８２４７号明細書）。

その後、本発明者等は、フラボバクテリウム属菌由来の
クレアチナーゼ遺伝子について更に検討した結果、フラ
ボバクテリウム属菌由来のクレアチナーゼ遺伝子を初め
て単離及び構造決定することに成功し、本発明を完成し
た。

即ち本発明は、第２図に示される塩基配列で表わされる
クレアチナーゼ遺伝子である。

以下、本発明について詳細に説明する。

先ず、クレアチナーゼをフードする遺伝子を含有スるＤ
　Ｎ　Ａの調製について述べる。

フラボバクテリウムＵ−１８８［：ｅ工研菌寄第２９２
２号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−＼２９２２）］株を、特公昭５
２−８３９５号公報記載の方法と全く同様にして培養し
、培養物を得る。この培養物を、例えば３０００　ｒ、
ｐ、ｍ、以上、好ましくは８０００〜１００００　ｒ、
ｐ、ｍ、で５分以上、好ましくは１０〜１５分間遠心分
離してフラボバクテリウムＵ−１８８株の菌体な得る。

この菌体より、例えば斎藤、三浦の方法［バイオケム、
パイオフィズ、アクタ、　（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ。

Ａｃｔａ、　）　、第７２巻、第６１９頁（１９６３年
）コ、ケー・ニス・カービー（Ｋ、Ｓ、Ｋｉｒｂｙ　）
の方法［バイオケム、ジェイ、　　（Ｂｉｏｃｈｅｍ、
Ｊ、）　、第６４巻、第４０５頁（１９５６年）］等の
方法により染色体ＤＮＡを得ることができる。

ついで、この染色体ＤＮＡに、突出末端を生じさせる制
限酵素、例えばＳａｕ　３Ａ　Ｉ　（東洋紡績社製）を
、温度３０゛Ｃ以上、好ましくは３７　”Ｃ、酵素濃度
１〜１０ユニツト／　ｍｅで２０分以上、好ましくは１
〜２時間作用させて消化し、種々の染色体ＤＮＡ断片混
合物を得る。

このようにして得たＤＮＡ断片混合物から、例えば通常
の７ガロースゲル電気泳動法によりＤＮＡ断片混合物を
得、更に例えばフェノール抽出等の精製手段により精製
し、また更に例えばエタノール沈殿法等の濃縮手段によ
り濃縮し、純化されたＤＮＡ断片混合物（この中にクレ
アチナーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片が
含まれる）を得る。

一方、ベクターＤＮＡとしては、如何なるものでもよく
、例えばプラスミドベクターＤＮＡ、バクテリオファー
ジベクターＤＮＡ等が挙げられるが、具体的には例えば
プラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡ［ペセスダ・リサーチ・
ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製コなどが好ましい
。

上記ベクターＤＮＡに、突出末端を生じさせる制限酵素
、例えばシュＨ１（宝酒造社製）を、温度３０°Ｃ以上
、好ましくは３７°Ｃ１酵素濃度１０〜１０００ユニッ
ｈ　／　ｗｌｔで１時間以上、好ましくは２〜３時間作
用させて消化し、切断されたベクターＤＮＡを得る。

ついで、上記のようにして得たフラボバクテリウムビー
１８８由来で、クレアチナーゼ遺伝子ト’する遺伝子を
含有するＤＮＡ断片混合物と、切断されたベクターＤＮ
Ａを混合し、これに例えば大腸菌ＤＮＡリガーゼにニー
・イングランド・バイオ・ラプス社製）　、Ｔ４ＤＮＡ
！Ｊガーゼ（べ−リンガ−・マンハイム社製）など、好
ましくけＴ４ＤＮＡリガーゼを、温度４〜３７°Ｃ１好
ましくは４〜１６”Ｃ，酵素濃度１〜１００ユニツトで
１時間以上、好ましくは６〜２４時間作用させて組み換
え体ＤＮＡを得る。

この組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば大腸菌に−１２
、好ましくは大腸菌ＨＢＩＯＩ　（ＡＴＣＣ３３６９４
）　、大腸菌ＤＨＩ　（ＡＴＣＣ３３８４９）　、大腸
菌χ−１７７６（ＡＴＣＣ３１２４４）　、などを形質
転換あるいは形質導入してそれぞ、ｈの菌株を得る。こ
の形質転換はディー・エム・モーリソン（Ｄ、Ｍ、Ｍｏ
ｒｒｉｓｏｎ　）の方法［メソヅ・イア　−エフ　サイ
モｑ　＞　−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ　）　、第６８巻、第３２６〜３３１頁（１９
７９年）コにより行なうことができる。また形質導入は
ビー・ホーン（Ｂ、Ｈｏｈｎ　）の方法［メソヅ・イン
・エンザイモロジー第６８巻、第２９９〜３０９頁（１
９７９年）コによって行なうことができる。

そして、上記菌株よりクレアチナーゼ生産能を有する菌
株なスクリーニングすることにより、クレアチナーゼを
コードする遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤ　Ｎ　
Ａに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、クレアチナーゼ
生産能を有するエノンエリシア属に属する菌株を得るこ
とができる。

このようにして得られた菌株より純化された新規な組み
換え体ＤＮＡを得るには、例えばビー・グーリー（Ｐ、
Ｇｕｅｒｒｙ　）等の方法［ジエイ、バクテリオロジー
（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　）第１１６巻、第１
０６４〜１０６６頁（１９７３年）］、デー・ビー・フ
レウェル（Ｄ、Ｂ、Ｃｌｅｗｅｌｌ　）の方法［ジエー
、バクテリオロジー第１１０巻、第６６７〜６７６頁（
１９７２年）コなどにより得ることができる。

次いで、上記の純化された新規な組み換え体ＤＮＡに、
例えば、制限酵素Ｓａｔ　Ｉ　（宝酒造社製）を温度３
０°Ｃ以上、好ましくは３７°Ｃ１酵素濃度５〜２０ユ
ニット／コで０．５〜２時間、好ましくは約１時間作用
させて消化し、ＤＮＡ断片混合物を得る。

上記ＤＮＡ断片混合物よりクレアチナーゼをコードする
遺伝子を含有するＤＮＡを単離するには、ティア、’？
ニアティス（Ｔ、　　Ｍａｎｉａｔｉｓ　）等の方法［
モレキユラー・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌ
ｏｎｉｎｇ　）　、コールド・スプリング・ハーバ−・
ラボラトリ−（Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ
ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　、第１７３頁〜第１７８
頁（１９８２年）］により得ることができる。

上記のようにして得られたクレアチナーゼをコードする
遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組
み換え体ＤＮＡを含み、クレアチナーゼ生産能を有する
エツジエリシア属に属スる菌株を用いてクレアチナーゼ
を生産するには、この菌株を通常の固体培養法で培養し
てもよいが、なるべく液体培養法を採用して培養するの
が好ましい。

また、上記菌株を培養する培地としては、例えば酵母エ
キス、ヘフトン、肉エキス、コーンステイープリカーあ
るいは大豆もしくは小麦酸の浸出液等の１種以上の窒素
源に、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸
マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第
２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添
加ツ＼ し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加し
たものが用いられる。

なお、培地の初発ｐＨは、７〜９に調整するのが適当で
ある。また培養は３０〜４２°Ｃ３好ましくは３７°Ｃ
前後で４〜２４時間、好ましくは６〜８時間、通気撹拌
深部培養、振盪培養、静置培養等により実施するのが好
ましい。

培養終了後、該培養物よりクレアチナーゼを採取するに
は、通常の酵素採取手段を用いて得ることができる。

例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理
などするか、または、リゾチーム等の溶菌酵素を用いて
本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪
もしくは放置して自己消化を行なわせ本酵素を菌体外に
排出させる。この溶液を濾過、遠心分離などして固形部
分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プ
ロタミン硫酸塩あるいは硫酸マンガンにより除核酸した
のち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して
分画し、沈殿物を採取し、これを水に対し透析したのち
真空乾燥して粗酵素標品を得る。

更に、クレアチナーゼの精製品を得るには、例えばＤＥ
ＡＥ−セルロース（ジ・エチル・アミン・エチル・セル
ロース、米国ブラウン社製）、ＤＥＡＥ−セファデック
ス（ジ・エチル・アミノ・エチル・セファデックス、ス
ウェーデン国ファルマシア社製）、ＱＡＥ−セファデッ
クス（スウェーデン国、ファルマシア社製）等のイオン
交換物質を用いる吸着溶出法にて精製するか、またセフ
ァデックスＧ−２００（スウェーデン国、ファルマン７
社製）、セファロース６Ｂ（スウェーデン国、ファルマ
シア社製）等を用いるゲル濾過法、ハイトロキシルアパ
タイト（米国バイオラッド社製、バイオゲルＨＴ）を用
いる吸着溶出法、ポリアクリルアミドゲル等を用いる電
気泳動等を適宜選択、組み合わせて実施することにより
、高度に精製されたクレアチナーゼ標品讐得ることがで
きる。

上記精製手段により得られる精製クレアチナーゼの理化
学的性質は、特公昭５２−８３９５号公報記載のクレア
チナーゼの理化学的性質と全く同様である。

〔発明の効果〕

上述したことから明らかな如く、本発明クレアチナーゼ
遺伝子の組み込まれた組み換え体ＤＮＡを含むエツジエ
リシア属に属する菌株を培地に培養すると、クレアチン
、クレアチニン等を添加使用することなく、クレアチナ
ーゼを効率よく得ることができるので、本発明は産業上
極めて有用なものである。

〔実施例〕

以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。

実施例 （１）フラボバクテリウムＵ　−１８，８株の染色体Ｄ
ＮＡの調製 フラボバクテリウムＵ−１８８（ＦＥＲｈｉ　　Ｐ−＼
２９２２）株を、Ｔ−Ｙ培地（１％（Ｗ／Ｖ）バクトー
トリプトン（Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎ　［デイフ’
　（Ｄｉｆｃｏ）社製］　、０．５％（Ｗ／Ｖ）バクト
ロイースト・エキストラクト（Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ
　ｅｘｔｒａｃｔ）［ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）社製］　
、０．５％（Ｗ／Ｖ）ＮａＣ１（ｐＨ７，２）　）　１
００　ｘｒｌに接種し、温度３０°Ｃで８時間振盪培養
し、培養物を得た。

この培養物を１０００ｏ　ｒ、ｐ、ｍ、で１０分間常法
により遠心分離処理し、湿潤菌体０．５ｙを得たのち、
該菌体から斎藤、三浦の方法［バイオケム、バイオ７４
ズ、アクタ、　（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａ
ｃｔａ、　）　、第７２巻、第６１９頁（１９６３年）
コにより染色体ＤＮ　Ａを得た。

ついで、この染色体Ｄ　Ｎ　Ａ　０．２　ｍｇ及び制限
酵素錘３Ａ！（東洋紡績社製）１．４５ユニツトを、１
０ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（５０ｍＭ　ＮａＣ１、１０
ｍＭＭｇｓＯ４及びｌ　ｍＭジチオスレイトール含有）
　　（ｐＨ７，４）にそれぞれ混合し、温度３７°Ｃで
１時間反応させた。反応終了液を常法により０．７％（
Ｗ／Ｖ）アガロースゲル（宝酒造社製）電気泳動処理し
たものより、４〜８Ｋｂ（キロペースペアー）の大きさ
のＤＮＡ断片を７−ル・シー・エイ・ヤング（Ｒ，Ｃ，
Ａ、Ｙａｎｇ　）等の方法［メンズ・イン・エンザイモ
ロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
　）　、第６８巻、第１７６〜１８２頁（１９７９年）
］により溶出して溶出物を得、これから常法によりフェ
ノール抽出処理し、更にエタノール沈殿処理してＳａｕ
　３　Ａ　Ｉで消化されたフラボバクテリウムＵ−１８
８株の染色体ＤＮＡ断片１０μｙを得た。

（２）　　新規な組み換え体プラスミドｐＫＬＳ５１１
ＤＮＡの作製 ・　プラスミドｐ　Ｂ　Ｒ３２２Ｄ　Ｎ　Ａ　［ベセス
ダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）社製］
１０μ、７と制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）４０ユ
ニツトを５０ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（ｌｏｏｍＭ　Ｎ
ａＣＬ及び１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４含有）（ｐＨ７，４）
に混合し、温度３７°Ｃで２時間反応させて消化液を得
、該液を常法によりフェノール抽出及びエタノール沈殿
処理して、Ｂａｍ　Ｈｌで消化されたプラスミドｐ　Ｂ
　Ｒ３２２Ｄ　Ｎ　Ａ　’ｋ　’４　ｆ：。

ついで、このＢａｍＨＩで消化されたプラスミドｐ　Ｂ
Ｒ３２２ＤＮＡＩＯｐ夕、上記（１１で得られた５ａｕ
３ＡＩで消化されたフラボバクテリウムＵ−１８８株の
染色体ＤＮＡ断片１０μｙ及び２ユニツトの７４ＤＮＡ
リガーゼ［ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）社製］を６．６ｍＭＭｇＣ
ｌ。、１０　ｍＭジチオスレイトール及び１０　ｍＭＡ
ＴＰを含有する６６ｍＭ　ト！Ｊス塩酸緩衝液（ｐＨ７
，５）に添加し、温度１６°Ｃで１０時間反応し、ＤＮ
Ａを連結させた。

ついで、ディー・エム・モーリソン（Ｄ、Ｍ。

Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　）の方法［メソヅ・イン・エンザイ
モロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ）　、第６８巻、第３２６〜３３１頁（１９７９年）
コで、塩化カルシウム処理した大腸菌ＨＢ　１０１株（
ＡＴＣＣ３３６９４）を、上記のように連結させたＤＮ
Ａで形質転換し、アンピシリン耐性及びテトラサイクリ
ン感受性の形質転換株３２００株を得た。

このようにして得られた形質転換株がクレアチナーゼ活
性を有するか否かを以下のようにして試験した。

各菌株を、０．２％（Ｗ／Ｖ）クレアチン（シグマ社製
）及び５０μｇ　／　ａｔアンピシリンを含有スるＴ−
Ｙ培地５ゴに接種し、温度３０°Ｃで２４時間培養して
培養液を得た。これを３５０Ｏｒ、ｐ、ｍ、で１０分間
遠心分離処理して湿潤菌体を得、該菌体を１％（Ｗ／Ｖ
　）クレアチンを含有する１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７，０）　ｌ　ｍｌに懸濁し、これに、２０μｌトルエ
ンを添加し、温度３７°Ｃで１時間反応させたのち、温
度１００°Ｃで５分間加熱処理して反応停止液を得た。

ついで、この液を常法により３５００　ｒ、ｐ、ｍ、で
１０分間遠心分離処理して反応液を得、この反応液に０
．３ユニツト／ｄザルフシンオキシタ−セ（盛運製薬社
製）　、０．０７％（Ｗ／Ｖ）４−アミノアンチピリン
、０．２％（Ｗ／Ｖ）２．４−ジクロロフェノールスル
ホン化溶液及び７０ユニツト／　ｒｔｒｔパーオキシダ
ーゼ（東洋紡績社製）をそれぞれ０．１ｇ＋／ずつ添加
し、反応液が赤色に変化したものがクレアチナーゼ活性
を有する形質転換株である。

このようにして得られたクレアチナーゼ活性を有する形
質転換株である大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ　）　ＨＢ１０１
　（ｐＫＬｓ５１１）は、工業技術院微生物工業技術研
究所に微工研条寄第９９２号（ＦＥＲＭＢＰ−９９２）
として寄託されている。

（３）組み換え体プラスミドｐ　Ｋ　Ｌ　Ｓ　５１１　
Ｄ　ＮＡの単離 トリプトン１％（Ｗ／Ｖ）　、酵母エキス０．５％（Ｗ
／ｖ）、及びＮａＣ１０，５％（Ｗ／Ｖ）からなる培地
ＩＥに、該培地を用い温度３７℃で１６〜２４時間前培
養して得た大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＨＢ　１０１（ｐ
ＫＬｓ５１１）の培養液２０　ｍｌを接種し、温度３７
°Ｃで３時間振盪培養したのち、培養液にクロラムフェ
ニコールｏ、ｚｙを添加し、更に同一温度で２０時間培
養し、培養液を得た。

ついで、この培養液を、常法により１００００　ｒ、ｐ
、ｍ。

で１０分間遠心分離処理して湿潤菌体を得、これを２０
コの２５％（Ｗ／Ｖ）ショ糖を含有する５０ｍＭ　）　
！Ｊス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に懸濁したのち、更に
、これに、リゾチーム１０８９．０．２５　ＭＥＤＴＡ
溶液（ｐＨ８，０）　８　ｍｌ及び２０％（Ｗ／Ｖ）ド
デシル硫酸ナトリウム溶液８　ｍｌをそれぞれ添加し、
温度６０°Ｃで３０分間保温して溶菌し、溶菌液を得た
。

この溶菌液に、５Ｍ　ＮａＣ１溶液１３ｍ／を添加し、
温度４°Ｃで１６時間処理したものを常法により１５０
００　ｒ、ｐ、ｍ、で３０分間遠心分離して抽出液を得
、常法によりフェノール抽出処理したのち、常法により
エタノール沈殿処理し、沈殿物を、得た。

ついで、この沈殿物を通常の減圧乾燥処理したものを、
１ｍＭＥＤＴＡを含有する１０　ｍＭ　）リス塩酸緩衝
液６　ｍｌ　（ｐＨ７，５）に溶解し、更に、これに塩
化セシウム６ｇ及び１０　ｍｇ　／　ＩＩ／エチジウム
ブロマイド０．２ｍｌを添加したものを、常法により３
９０００　ｒ、ｐ、ｍ、で４２時間超遠心分離機を用い
て平衡密度勾配遠心処理を行ない組み換え体プラスミド
ｐＫＬｓ５１１ＤＮＡを単離し、また、更に、ノルマル
ブタノールを使用してエチジウムブロマイドを除去した
のち、１ｍＭＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ　）　！Ｉス
塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に対して透析を行ない純化さ
れた組み換え体プラスミドｐＫＬＳ５１１ＤＮＡ９５０
μｙを得た。

（４）組み換え体プラスミドｐＫＬｓ５１１ＤＮＡの制
限酵素切断地図の作成 項目（３）で単離した組み換え体プラスミドｐＫＬＳ５
１１ＤＮＡに、制限酵素、シンＲ１，呈１１ＩＩＩ及び
Ｘｈｏ　Ｉ　　（いずれも宝酒造社製）を夫々作用させ
て切断し、制限酵素切断地図を作成した。

なお、上記の制限酵素のうち、例えばＳａｔ　　Ｉを用
いて切断方法を説明すると、単離した組み換え体プラス
ミドｐＫＬｓ５１１ＤＮＡ２μｇ及び５吐１１０ユニツ
トを５０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液　［１００ｍＭ　Ｎａ
Ｃ１及び１０　ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ４含有（ｐＨ７，４）　
］に混合し、温度３７°Ｃで２時間反応させて消化し、
ＤＮＡを、エチジウムブロマイド水溶液２μｙ／ゴで染
色し、紫外線照射によって消化パターンの解析を行ない
制限酵素切断部位を決定し、得られた結果を第１図に示
した。

なお、第１図中、　−一　は、フラボバクテリウムＵ−
１８８株由来のクレアチナーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ
断片を、また　□　は、ｐＢＲ３２２由来のＤＮＡ断片
を夫々示し、更に、ＥＳＳＸＢｇ及びＸは、夫々制限酵
素−用膜Ｒ１゜Ｓａｌ　　Ｉ　、、温風ＩＩ及びＸｈｏ
　Ｉを示すものである。

（５）クレアチナーゼ遺伝子を含むＤＮＡの単離プラス
ミドｐＫＬｓ５１１ＤＮＡ１０μｙ及びＳａｌ　　Ｉ　
１０ユニツトを５０ｍＭ　）　’Ｊス塩酸緩衝液［１０
０ｍＭ　ＮａＣ１及び１０　ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ４含有　（
ｐＨ７，４）　］に況合し、温度３７°Ｃで３０分間反
応させて消化し、この反応液から項目（４）で得られた
制限酵素地図を基にし、５％（Ｗ／Ｖ）ポリアクリルア
ミド電気泳動法により分離し、更に、前述したティー、
マニアティス等の方法により１．７ＫｂのＤＮＡ断片を
ポリアクリルアミドゲルより溶出し、クレアチナーゼ遺
伝子を含むＤＮＡ断片５μｙを得た。

（６）クレアチナーゼ遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列解
析 項目（５）で得られたＤＮＡを、同−又は同一ののりし
ろの制限酵素により切断したＭ１３ファージベクターｍ
ｐ　１８及びｍｐ　１９　ＤＮＡ　（アマジャム・ジャ
パン社製）にクローニングした。シーフェンシングは、
Ｍ１３シークエンスキット（宝酒造社製）を用いて、ジ
デオキシ・チェーン・ターミネーション法で行なった。

その概略は、次の通りである。上記ＤＮＡ断片をクロー
ニングしたＭ１３ファージベクターＤＮＡを、大腸菌に
１２株由来のＪＭＩＯＩ株（ＡＴＣＣ３３８７６）に感
染させ、ファージ粒子として成熟させる。このファージ
よりクレアチナーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片（二重
鎖）の一方のＤＮＡ鎖を組み込んだ単鎖のファージＤＮ
Ａを抽出、精製し、これを鋳型に組み込まれたＤＮＡ断
片に隣接する塩基配列と相補的な塩基配列をもつ極く短
い単鎖ＤＮＡをプライマーに、そしてｄＡＴＰ、ｄＴＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ及びＣα−３２Ｐ］ｄＣＴＰを基質として
ＤＮＡ合成を行なう。このとき適当な濃度のＤＮＡ合成
阻害剤である４種のｄｄＡＴＰＳｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴ
Ｐ又はｄ　ｄＣＴＰを夫々添加して反応させると、これ
らがＤＮＡにとり込まれた時点でＤＮＡ合成が停止する
。そこでＤＮＡ鎖を単鎖に分け、８％（Ｗ／Ｖ）ポリア
クリルアミド電気泳動法及びラジオオートグラフィーに
より分析すると、合成されたＤＮＡの長さによりその３
′末端の塩基が決定される。

このようにしてフラボバクテリウムＵ−１８８株由来の
ＤＮＡ塩基配列を決定し、唯一、１０００ｂｐ（ベース
ベアー）以上のオープンフレーム領域をクレアチナーゼ
遺伝子と断定し、この遺伝子から翻訳されるポリペプチ
ドの分子量は、約４４．０００であることを示している
。

得られたクレアチナーゼ遺伝子の塩基配列を第２図に、
また、該遺伝子から翻訳されるポリペプチドのアミノ酸
配列を第３図に夫々示した。

（７）大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＨＢ　１０１　（ｐＫ
Ｌ　Ｓ　５１１）によるクレアチナーゼの生産及び該酵
素の分離、精製 トリプトン１％（Ｗ／Ｖ）　、酵母エキス０．５％（Ｗ
／Ｖ）、及び食塩０．５％（Ｗ／Ｖ）からなる培地２１
を撹拌式小型培養装置（いわしゃ社製）の培養槽に分注
し、常法により高圧滅菌処理したものに、上記と同一組
成の培地で予め温度３７°Ｃで２４時間振盪培養した大
腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ　）　ＨＢ　１０１　（ｐＫＬｓ５
１１）の培養液２０　ｍｌを接種し、温度３７°Ｃで８
時間通気撹拌培養する操作を５回繰り返して湿潤菌体３
０　ｇを得た。

この菌体を、１　ｍＭ　２−メルカプトエタノールを含
有する０、０５　Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ８，０）　１
００ゴに懸濁し、常法により超音波破壊処理したのち、
１５０００　ｒ、ｐ、ｍ、で３０分間通常の遠心分離処
理し、クレアチナーゼの粗酵素液１２０　ｍｌ　（０，
８ユニット／屑ｔ）を得た。

このようにして得た粗酵素液に硫酸ストレプトマイシン
を用いて除核酸処理を施したものを、ＤＥＡＥ−セルロ
ースカラム（予めｌ　ｍＭ　２−メルカプトエタノール
を含有する０、０５Ｍリン酸緩衝液で平衡化済みのもの
）　　（２Ｘ３０　ｃｍ）を通過させて非吸着区分を得
た。これを上記緩衝液で平衡化済みのＤＥＡＥ−セファ
デックスＡ−５０カラム（１，４Ｘ４０備）に吸着させ
たのち、Ｏ〜１．５モルの食塩濃度勾配溶出法で溶出す
ることにより０．１〜０．３モルの食塩濃度範囲でクレ
アチナーゼ含有溶出液を得た。

このクレアチナーゼ含有溶出液を、上記緩衝液テ予め平
衡化済みのセファロース６Ｂカラム（２Ｘ　１０８　ｃ
ｍ　）を通過させてクレアチナーゼ活性区分を分取し、
更に常法により濃縮したのち、凍結乾燥することにより
純化されたクレアチナーゼ粉末４３単位を得た。なお、
収率は４５％であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、組み換え体プラスミドｐＫＬｓ５１１ＤＮＡ
の制限酵素切断地図を示す図であり、第２図は、本発明
クレアチナーゼ遺伝子の塩基配列を示す図であり、また
、第３図は、本発明クレアチナーゼ遺伝子から翻訳され
るポリペプチドのアミノ酸配列を示す図である。 特許出願人　キ　ノ　コ　−マン株式会社財団法人　野
田産業科学研究所 Ｍｅｔ　ＧＩＭ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ｌ４　Ｔｈｒ　Ｌｍ
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　ｌ’ｆａ　Ｇｕｙ　１４１ｓ　＃＠　１４１ｓ〜１ａ
ｙ　ＧｌｙＨｌｓ　Ａｌａ　Ａｌａ　〜−９〜１Ｓ−一
　５ｖＧ１ｙ〜１３１」

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）第２図に示される塩基配列で表わされるクレアチ
   ナーゼ遺伝子。
2. （２）第３図に示されるアミノ酸配列をコードする特許
   請求の範囲第１項記載のクレアチナーゼ遺伝子。
3. （３）クレアチナーゼ遺伝子が、フラボバクテリウム属
   菌由来である特許請求の範囲第１項又は第２項記載のク
   レアチナーゼ遺伝子。
4. （４）クレアチナーゼ遺伝子が、フラボバクテリウムＵ
   −１８８株由来である特許請求の範囲第１項又は第２項
   記載のクレアチナーゼ遺伝子。