JP2002078490A - コリネ型細菌の呼吸鎖酵素遺伝子 - Google Patents

コリネ型細菌の呼吸鎖酵素遺伝子

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JP2002078490A JP2000270283A JP2000270283A JP2002078490A JP 2002078490 A JP2002078490 A JP 2002078490A JP 2000270283 A JP2000270283 A JP 2000270283A JP 2000270283 A JP2000270283 A JP 2000270283A JP 2002078490 A JP2002078490 A JP 2002078490A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 コリネ型細菌のシトクロムaa3型酸化酵
素、及びシトクロムbc1複合体、並びにこれらをコー
ドする遺伝子を提供する。 【解決手段】 ヘム−銅酸化酵素に広く共通な配列をも
とに作製したプローブを用いたハイブリダイゼーション
によってコリネバクテリウム・グルタミカム染色体DN
Aライブラリーから、aa3サブユニットIをコードする
遺伝子を取得し、精製シトクロムaa3を用いて決定した
サブユニットIIのN末端アミノ酸配列に基づいて作製し
たプライマーを用いてプローブを作製し、ハイブリダイ
ゼーションによりサブユニットIIをコードする遺伝子及
びサブユニットIIIをコードする遺伝子を取得し、さら
に、これらの下流に存在するシトクロムbc1複合体をコ
ードするオペロンを取得する。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、コリネ型細菌の呼
吸鎖酵素、詳しくはシトクロムcを介する電子伝達系を
構成する酵素とそれらをコードする遺伝子に関する。
【0002】
【従来の技術】多くの生物は、呼吸によって生命活動に
必要なエネルギーを獲得する。高等生物では、炭水化
物、タンパク質、脂肪酸は細胞質で解糖系やβ酸化によ
りアセチルCoAとなり、ミトコンドリアのクエン酸回
路に入って分解され、そのエネルギーはNADHやFA
DH2によって還元力の形で蓄えられ、それに連なるミ
トコンドリアの内膜上にある電子伝達系でNADHは最
終的に水にまで完全酸化され、これに共役して形成され
るプロトン濃度勾配がATP合成の駆動力となる。
【0003】細菌の呼吸鎖は一般に、種に応じて、ま
た、生育環境に応じて多様な酵素複合体が働いており、
エネルギー効率も様々である。例えば、エシェリヒア・
コリ(Escherichia coli)にはbo型とbd型の二種の
キノールオキシダーゼがその呼吸鎖末端で働いている
が、両者を持つ野生株、bo型のみを持つ変異株、及び
bd型のみを持つ変異株の好気的培養における生育収量
を比較すると、生育収量はbd型のみを持つ変異株が最
も低く、末端酸化酵素の種類とそのエネルギー獲得効率
に依存する(平成7年度日本生物工学会講演要旨集演題
番号357)。
【0004】グラム陽性菌であるブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentu
m)やブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium
flavum)等のコリネ型細菌は、アミノ酸発酵菌として工
業的に利用される好気性菌である。呼吸鎖の末端酸化酵
素の研究は、コリネ型細菌と系統分類上で大きく離れた
プロテオバクテリア(Proteobacteria)やコリネ型細菌
と同じグラム陽性菌に属するがやや系統が離れている枯
草菌や好熱性バチルス(Bacillus)では進んでいるが、
コリネ型細菌の呼吸鎖の電子伝達系は詳しく調べられて
いない。コリネ型細菌でエネルギー代謝の要である呼吸
鎖の電子伝達系を解明することは、有用物質の生産性の
改善等のための基礎データとしても重要であると考えら
れる。また、コリネ型細菌の呼吸鎖電子伝達系に関与す
る酵素、及びその遺伝子を同定すれば、よりエネルギー
効率のよい菌を作りだすことなどの応用が可能かもしれ
ない。
【0005】現在、ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムの呼吸がプロトン輸送と共役していることとシ
トクロムa、b、cを持つということが報告されており
(Kawahara, Y., et al.(1988) Agric. Biol. Chem., 5
2(8), 1979-1983)、さらに、シトクロムbd型キノー
ルオキシダーゼをコードする遺伝子が単離されている
(特開平11-346776号、欧州特許出願公開第0 967 282(A
2)号)。また、コリネバクテリウム・グルタミカム(Co
rynebacterium glutamicum)においては、シトクロムb
c1複合体が存在し、少なくとも2種類の末端酸化酵
素、SoxM型酸化酵素とシトクロムbd型酸化酵素の
存在が確認されている(平成11年度 代謝工学に関す
る第2回目のシンポジウム講演要旨集)。このことよ
り、キノンプールから酸素分子への電子伝達経路は、シ
トクロムbc1複合体を経由しSoxM型酸化酵素(Ca
stresana J,Saraste M.Trends in Biochem. Sci. 20, 4
43-448 (1995))を介する経路と、シトクロムbd型酸
化酵素だけを介する経路の2種類の経路が存在すること
がわかる。前者は1電子が伝達される際のプロトン輸送
比が高くエネルギー効率が高い電子伝達経路であり、後
者は1電子が伝達される際のプロトン輸送比が低くエネ
ルギー効率が低い経路であると考えられる。
【0006】ところで、シトクロムaa3型酸化酵素
は、構造的にヘム−銅酸化酵素であり、SoxM型酸化
酵素に分類される。SoxM型酸化酵素には、シトクロ
ムc酸化酵素とキノール酸化酵素の2種類が存在し、こ
れらは、プロトン輸送能が高いことが知られている。微
生物ですでに発見されているシトクロムaa3型酸化酵素
に相同性がある酸化酵素は、パラコッカス・デニトリフ
ィカンス(Paracoccus denitrificans)、ブラディゾビ
ウム(Bradyrhizobium japonicum)、ロドバクター・ス
フェロイデス(Rhodobacter sphaeroides)、シネココ
ッカス・ブルカヌス(Synechococcus vulcanus)、サー
マス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)、バチ
ルス・サブチリス(Bacillus subtilis)、バチルス・
ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilu
s)等で知られている(Trumpower,B.L. and Gennis, R,
B., Annu. Rev. Biochem. 63, 675-716(1994); Cao, J.
etal.. J. biol. chem., 267, 24273-24278 (1992); S
one, N. et al., Biochim.Biophys. Acta., 1183, 130-
138 (1993); Sakamoto, J. et al., J. Biochem.,122,
764-771 (1997))。
【0007】一方、シトクロムbc1複合体はミトコン
ドリアや微生物など様々な生物の呼吸鎖に広く存在し、
スーパーファミリーを形成している。これらの酵素はキ
ノールからシトクロムcへの電子の伝達を行なうと同時
に膜の内側から外側にプロトンをくみ出すことにより膜
内外にプロトン濃度勾配を形成し、生体が必要とするエ
ネルギーの生産において重要な役割を担っている。ま
た、これらのシトクロムc1還元酵素は、プロトンモー
ティブQサイクルという機構(Mitchell,P. (1976) J.,
Theoret. Biol., 62, 327-367; Croft, A.R., Meinhar
dt, S.W., Jones,K.R., and Snozzi, M. (1983) Biochi
m. Biophys. Acta, 723, 202-218; Trumpower, B.L. (1
990) J. Biol. Chem., 265, 11409-11412)によって膜
の内側から外側へのプロトンの移動を行なっていると考
えられている。シトクロムbc1複合体は、パラコッカ
ス・デニトリフィカンス、ロドバクター・スフェロイデ
ス、バチルス・ステアロサーモフィラス(Trumpower BL
and Gennis RB. Annu. Rev.Biochem. 63, 675-716(199
4), Sone et al. J Biol chem.271, 12457-12462(199
6))で知られている。
【0008】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、コリネ型細
菌のシトクロムaa3型酸化酵素、及びシトクロムbc
1複合体、並びにこれらをコードする遺伝子を提供する
ことを課題とする。
【0009】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために、コリネバクテリウム・グルタミカムの
シトクロムaa3遺伝子のクローニングを試みた。そし
て、ヘム−銅酸化酵素に広く共通な配列をもとに作製し
たプローブを用いたハイブリダイゼーションによって、
コリネバクテリウム・グルタミカム染色体DNAライブ
ラリーから、aa3サブユニットIをコードする遺伝子を
クローニングすることに成功した(以下、「ctaD」とも
いう)。しかし、他の多くの酸化酵素とは異なり、同遺
伝子の近傍に他のサブユニットの遺伝子は見られなかっ
た。
【0010】一方、本発明者は、コリネバクテリウム・
グルタミカムの膜標品から、シトクロムaa3を精製する
ことに成功し、同精製酵素からサブユニットIIタンパク
質を分離し、そのN末端部分ペプチド配列を決定した。
この配列を利用してプライマーを作製し、このプライマ
ーと、オキシダーゼサブユニットIIにあるCuA結合モチ
ーフの保存配列に基づいて作製したプライマーを用いて
PCRを行い、プローブを作製した。そして、このプロ
ーブを用いたハイブリダイゼーションにより、サブユニ
ットIIをコードする遺伝子(以下、「ctaC」ともいう)
を取得することに成功した。さらに、この遺伝子の下流
にサブユニットIIIをコードする遺伝子(以下、「cta
E」ともいう)が存在することを見い出した。
【0011】また、上記シトクロムaa3サブユニットIII
をコードする遺伝子(ctaE)の3'側下流に、ORFの一部
と推定される配列が見出された。そして、この配列を含
むクローンを取得して配列を解析し、さらにシトクロム
bc1複合体を構成するサブユニットのうち、シトクロム
cを含むサブユニットを精製し、そのアミノ酸配列を決
定した結果、前記クローンはシトクロムbc1複合体の3
つのサブユニットをコードするオペロン(qcrCAB)であ
ることが判明した。本発明は、こうして完成されるに至
ったものであり、その要旨は以下のとおりである。
【0012】(1)下記(A1)又は(A2)に示すポ
リペプチド。 (A1)配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド。 (A2)配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1
若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付
加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号4に記
載のアミノ酸配列を有するシトクロムaa3サブユニッ
トII、及び配列番号5に記載のアミノ酸配列を有するシ
トクロムaa3サブユニットIIIとともにシトクロムa
a3を構成し得るポリペプチド。 (2)下記(B1)又は(B2)に示すポリペプチド。 (B1)配列番号4に記載のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド。 (B2)配列番号4に記載のアミノ酸配列において、1
若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付
加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号2に記
載のアミノ酸配列を有するシトクロムaa3サブユニッ
トI、及び配列番号5に記載のアミノ酸配列を有するシ
トクロムaa3サブユニットIIIとともにシトクロムa
a3を構成し得るポリペプチド。 (3)下記(C1)又は(C1)に示すポリペプチド。 (C1)配列番号5に記載のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド。 (C2)配列番号5に記載のアミノ酸配列において、1
若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付
加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号2に記
載のアミノ酸配列を有するシトクロムaa3サブユニッ
トI、及び配列番号4に記載のアミノ酸配列を有するシ
トクロムaa3サブユニットIIとともにシトクロムaa
3を構成し得るポリペプチド。 (4)(1)、(2)及び(3)のポリペプチドからな
るシトクロムaa3。 (5)下記(D1)又は(D2)に示すポリペプチド。 (D1)配列番号7に記載のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド。 (D2)配列番号7に記載のアミノ酸配列において、1
若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付
加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号8に記
載のアミノ酸配列を有するQcrA、及び配列番号10
に記載のアミノ酸配列を有するQcrBとともにシトク
ロムbc1複合体を構成し得るポリペプチド。 (6)下記(E1)又は(E2)に示すポリペプチド。 (E1)配列番号8に記載のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド。 (E2)配列番号8に記載のアミノ酸配列において、1
若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付
加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号7に記
載のアミノ酸配列を有するQcrC、及び配列番号10
に記載のアミノ酸配列を有するQcrBとともにシトク
ロムbc1複合体を構成し得るポリペプチド。 (7)下記(F1)又は(F2)に示すポリペプチド。 (F1)配列番号10に記載のアミノ酸配列を有するポ
リペプチド。 (F2)配列番号10に記載のアミノ酸配列において、
1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は
付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号7に
記載のアミノ酸配列を有するQcrC、及び配列番号8
に記載のアミノ酸配列を有するQcrAとともにシトク
ロムbc1複合体を構成し得るポリペプチド。 (8)(5)、(6)及び(7)のポリペプチドからな
るシトクロムbc1複合体。 (9)下記(A1)又は(A2)に示すポリペプチドを
コードするDNA。 (A1)配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド。 (A2)配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1
若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付
加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号4に記
載のアミノ酸配列を有するシトクロムaa3サブユニッ
トII、及び配列番号5に記載のアミノ酸配列を有するシ
トクロムaa3サブユニットIIIとともにシトクロムa
a3を構成し得るポリペプチド。 (10)下記(B1)又は(B2)に示すポリペプチド
をコードするDNA。 (B1)配列番号4に記載のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド。 (B2)配列番号4に記載のアミノ酸配列において、1
若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付
加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号2に記
載のアミノ酸配列を有するシトクロムaa3サブユニッ
トI、及び配列番号5に記載のアミノ酸配列を有するシ
トクロムaa3サブユニットIIIとともにシトクロムa
a3を構成し得るポリペプチド。 (11)下記(C1)又は(C1)に示すポリペプチド
をコードするDNA。 (C1)配列番号5に記載のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド。 (C2)配列番号5に記載のアミノ酸配列において、1
若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付
加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号2に記
載のアミノ酸配列を有するシトクロムaa3サブユニッ
トI、及び配列番号4に記載のアミノ酸配列を有するシ
トクロムaa3サブユニットIIとともにシトクロムaa
3を構成し得るポリペプチド。 (12)下記(D1)又は(D2)に示すポリペプチド
をコードするDNA。 (D1)配列番号7に記載のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド。 (D2)配列番号7に記載のアミノ酸配列において、1
若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付
加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号8に記
載のアミノ酸配列を有するQcrA、及び配列番号10
に記載のアミノ酸配列を有するQcrBとともにシトク
ロムbc1複合体を構成し得るポリペプチド。 (13)下記(E1)又は(E2)に示すポリペプチド
をコードするDNA。 (E1)配列番号8に記載のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド。 (E2)配列番号8に記載のアミノ酸配列において、1
若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付
加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号7に記
載のアミノ酸配列を有するQcrC、及び配列番号10
に記載のアミノ酸配列を有するQcrBとともにシトク
ロムbc1複合体を構成し得るポリペプチド。 (14)下記(F1)又は(F2)に示すポリペプチド
をコードするDNA。 (F1)配列番号10に記載のアミノ酸配列を有するポ
リペプチド。 (F2)配列番号10に記載のアミノ酸配列において、
1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は
付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号7に
記載のアミノ酸配列を有するQcrC、及び配列番号8
に記載のアミノ酸配列を有するQcrAとともにシトク
ロムbc1複合体を構成し得るポリペプチド。
【0013】本発明において、ポリペプチドが「シトク
ロムaa3を構成し得る」とは、同ポリペプチドが、他
のサブユニットペプチドとともに、ヘムaの酸化還元ス
ペクトルとヘムa3のCO結合還元型マイナス還元型差
スペクトルを持ち、シトクロムcから電子を受け取り、
かつ酸素に電子を伝達して水分子に還元する活性を示す
タンパク質複合体を形成することができる性質をいう。
また、ポリペプチドが「シトクロムbc1複合体を構成
し得る」とは、同ポリペプチドが、他のサブユニットペ
プチドとともに、ヘムbとヘムcの酸化還元差吸収スペ
クトルを持ち、かつ還元型キノン化合物(キノール類)
から電子を受け取り、シトクロムcまたは末端酸化酵素
に電子を伝達する活性を示すタンパク質複合体を形成す
ることができる性質をいう。
【0014】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
【0015】<1>シトクロムaa3、そのサブユニッ
ト及びそれらをコードするDNA 本発明のシトクロムaa3をコードするDNAのうち、
サブユニットIをコードするDNAは、コリネ型細菌、
例えばコリネバクテリウム・グルタミカム染色体DNA
から、公知のヘム−銅酸化酵素、例えばブラディオゾビ
ウム・ジャポニカム(Bradyrhizobium japonicum)、ア
セトバクター・アセティ(Acetobacteraceti)、シネコ
コッカス・ブルカヌス(Synechococcus vulcanus)、バ
チルス・ステアロサームフィラス(Bacillus stearothe
rmophilus)のシトクロムcオキシダーゼIに高度に保存
されている領域のアミノ酸配列に基づいてプライマーを
作製し、コリネバクテリウム・グルタミカムの染色体D
NAを鋳型とするPCRによってプローブを調製し、こ
のプローブを用いたハイブリダイゼーションによって、
コリネバクテリウム・グルタミカム染色体DNAライブ
ラリーから取得することができる。
【0016】コリネバクテリウム・グルタミカムの染色
体DNAは、例えば斎藤、三浦の方法(Biochem.Biophy
s.Acta.,72,619,(1963))、K. S. Kirbyの方法(Bioche
m.J.,64,405,(1956))等の方法により調製することがで
きる。染色体DNAライブラリーは、染色体DNAを適
当な制限酵素で部分分解し、得られるDNA断片をエシ
ェリヒア・コリ細胞内で自律複製可能なベクターDNA
に連結し、組換えDNAを作製し、エシェリヒア・コリ
に導入することによって得られる。ベクターは、通常遺
伝子のクローニングに用いられるベクターであれば特に
制限されず、pUC19、pUC18、pUC118、puC119等のプラス
ミドベクター、λファージDNAなどのファージベクタ
ーが使用できる。
【0017】前記PCRに用いるプライマーとしては、
例えば、配列番号11及び配列番号12に示す塩基配列
を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。PCRで得
られたDNA断片をプローブとするコリネバクテリウム
・グルタミカムの染色体DNAライブラリーのスクリー
ニングは、ライブラリーの調製にプラスミドベクターを
用いた場合はコロニーハイブリダイゼーションによっ
て、ファージベクターを用いた場合はプラークハイブリ
ダイゼーションによって行うことができる。ハイブリダ
イゼーション陽性のクローンからDNAを調製し、塩基
配列を決定することにより、目的とするシトクロムaa
3サブユニットIをコードする遺伝子(ctaD)を含むこ
とを確認することができる。また、ハイブリダイゼーシ
ョン陽性のクローンについて、予め前記プローブを用い
てサザン解析を行ってもよい。
【0018】上記のようにして、実施例で得られたコリ
ネバクテリウム・グルタミカムKY9002株(ATCC13032)
のctaD遺伝子の塩基配列を配列番号1に示す。また、予
想されるコード領域及びそれによってコードされるタン
パク質のアミノ酸配列を、配列番号1に示す。
【0019】一方、シトクロムaa3サブユニットII、
IIIをコードする遺伝子(ctaC, ctaE)は、次のように
して取得することができる。コリネバクテリウム・グル
タミカムの膜標品から、シトクロムaa3を精製し、その
サブユニットのN末端部分ペプチド配列を決定し、その
配列を利用してプライマーを作製する。このプライマー
と、公知のオキシダーゼサブユニット間で高度に保存さ
れている配列、例えばサブユニットIIにあるCuA結合モ
チーフの保存配列に基づいて作製したプライマーを用い
てPCRを行い、プローブを作製する。次に、このプロ
ーブを用いたハイブリダイゼーションにより、サブユニ
ットIIをコードする遺伝子(ctaC)、及びサブユニット
IIIをコードする遺伝子(ctaE)を含むDNA断片を取
得する。
【0020】前記PCRに用いるプライマーとしては、
例えば、配列番号14及び配列番号15に示す塩基配列
を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。上記のよう
にして、実施例で得られたコリネバクテリウム・グルタ
ミカムKY9002株(ATCC13032)のctaC遺伝子及びctaE遺
伝子を含むDNA断片の塩基配列を配列番号3に示す。
また、予想されるコード領域及びそれによってコードさ
れるタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号4及び5に
示す。前記DNA断片において、ctaC遺伝子及びctaE遺
伝子は約1kb隔たっており、それらの間には別のORFが存
在していた。
【0021】シトクロムaa3のサブユニットI、II、III
の推定アミノ酸残基数は、それぞれ584、316、205残基
であり、また、分子量は、65.0、39.5、22.4kDaと計算
される。尚、サブユニットIIについては、ペプチド配列
分析の結果や他の種の酸化酵素(バチルス・サブチリ
ス、エシェリヒア・コリ:Santana, M. et al., J. bio
l.chem., 267, 10225-10231 (1992))との類推から、成
熟ポリペプチドではN末端の28残基目のグリシンまでは
切除され、29残基目のシステインは脂質で修飾されてい
ると考えられる。
【0022】配列番号4に示すサブユニットIIのアミノ
酸配列において、アミノ酸番号257〜268はCuA結
合モチーフの保存配列に相当する。尚、サブユニットII
及びIIIのN末端のアミノ酸残基のコドンはGTGであ
り、対応するアミノ酸が配列表ではValとなっている
が、実際はMetであり、これはGTGを開始メチオニ
ンとして認識しているためであると考えられる。このよ
うな例は他にも報告されている。
【0023】コード領域、オペロン構造の予想等の解析
は、GENETYX‐Homology Version2.2.2(ソフトウェア開
発株式会社製)を用いて解析することができる。また、
相同性解析は、LipmanとPeasonの方法(Science, 227,
1435-1441, 1985)にしたがって行うことができる。
【0024】本発明によりctaD、ctaC、ctaEの塩基配列
が明らかとなったので、配列番号1又は3に示す塩基配
列に基づいてプライマーを作製し、コリネバクテリウム
・グルタミカム染色体DNAを鋳型とするPCRを行う
ことによって、これらの遺伝子を直接取得することがで
きる。
【0025】本発明のDNAは、上記シトクロムaa3の
サブユニットI、II、IIIのいずれかをコードするもの
であってもよいし、これらの2種又は3種をともにコー
ドするものであってもよい。本発明のDNAを適当な宿
主細胞に導入し、得られる形質転換体を培養し、該DN
Aを発現させることによって、シトクロムaa3又はその
サブユニットを製造することができる。サブユニットI
をコードするDNAとしては配列番号1記載の塩基配列
において塩基番号1538〜3289からなる塩基配列を有する
DNAが、サブユニットIIをコードするDNAとしては
配列番号3に示す塩基配列において塩基番号604〜1680
からなる塩基配列を有するDNAが、サブユニットIII
をコードするDNAとしては配列番号3に示す塩基配列
において塩基番号2715〜3329からなる塩基配列を有する
DNAが挙げられる。
【0026】製造されたシトクロムaa3又はそのサブユ
ニットは、塩析、溶媒沈殿、ゲル濾過クロマトグラフィ
ー、イオン交換クロマトグラフィー等の通常タンパク質
の精製に用いられる方法で、培養物から採取、精製する
ことができる。
【0027】また、本発明のサブユニットIをコードす
るDNAは、配列番号2に記載のアミノ酸配列におい
て、1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入
又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、サブユニ
ットII及びサブユニットIIIとともにシトクロムaa3
を構成し得るポリペプチドをコードするものであっても
よい。
【0028】本発明のサブユニットIIをコードするDN
Aは、配列番号4に記載のアミノ酸配列において、1若
しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加
を含むアミノ酸配列からなり、かつ、サブユニットI及
びサブユニットIIIとともにシトクロムaa3を構成し
得るポリペプチドをコードするものであってもよい。
【0029】本発明のサブユニットIIIをコードするD
NAは、配列番号5に記載のアミノ酸配列において、1
若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付
加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、サブユニット
I、及びサブユニットIIとともにシトクロムaa3を構
成し得るポリペプチドをコードするものであってもよ
い。
【0030】さらに、サブユニットI、サブユニットII
もしくはサブユニットIII、又はこれらの2者又は3者
に変異を含むシトクロムaa3をコードするDNAも、本
発明のDNAに含まれる。
【0031】ここで「数個」とは、好ましくは1〜40
個、より好ましくは1〜10個である。あるいは、配列
番号2、4又は5に示すアミノ酸配列と相同性が80%
以上、好ましくは95%以上となるような個数であるこ
とが好ましい。
【0032】上記のようなサブユニットI、II又はIII
と実質的に同一のタンパク質をコードするDNAは、例
えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸
残基が置換、欠失、挿入又は付加を含むように塩基配列
を改変することによって得られる。また、上記のような
改変されたDNAは、従来知られている変異処理によっ
ても取得され得る。変異処理としては、サブユニット
I、II又はIIIをコードするDNAをヒドロキシルアミ
ン等でインビトロ処理する方法、及びサブユニットI及
び/又はサブユニットIIをコードするDNAを保持する
微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線照射また
はN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(NT
G)もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている
変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【0033】また、上記のような塩基の置換、欠失、挿
入、又は付加等には、シトクロムaa3を保持するコリネ
型細菌の個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然
に生じる変異(mutant又はvariant)も含まれる。
【0034】上記のような変異を有するDNAを、適当
な細胞で発現させ、発現産物のシトクロムaa3活性を
調べることにより、サブユニットI、II又はIIIと実質
的に同一のタンパク質をコードするDNAが得られる。
また、変異を有するサブユニットI、II又はIIIをコー
ドするDNAまたはこれを保持する細胞から、例えば配
列表の配列番号1に記載の塩基配列のうち、塩基番号15
38〜3289からなる塩基配列を有するDNA、配列番号3
に記載の塩基配列のうち、塩基番号604〜1680からなる
塩基配列、又は塩基番号2715〜3329からなる塩基配列を
有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズし、かつ、サブユニットI、II又はサブユニットII
Iの機能を有するタンパク質をコードするDNAを単離
することによっても、サブユニットI、II又はIIIと実
質的に同一のタンパク質をコードするDNAが得られ
る。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわ
ゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイ
ブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に
数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性
が高いDNA同士、例えば50%以上の相同性を有する
DNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い
DNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常
のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である6
0℃、1×SSC,0.1%SDS、好ましくは、0.
1×SSC、0.1%SDSに相当する塩濃度でハイブ
リダイズする条件が挙げられる。
【0035】このような条件でハイブリダイズする遺伝
子の中には途中にストップコドンが発生したものや、機
能を失ったものも含まれるが、それらについては、市販
の活性発現ベクターにつなぎ、発現産物の機能を調べる
ことによって容易に取り除くことができる。
【0036】本発明のDNAを発現させるための宿主と
しては、エシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・グ
ルタミカム、ブレビバクテリウム・フラバム等のコリネ
型細菌をはじめとする種々の細菌、サッカロマイセス・
セレビシエ(Saccharomycescerevisiae)等の真核細胞
が挙げられる。これらの宿主に本発明のDNAを導入す
るには、発現させようとする宿主の種類に応じたベクタ
ーに本発明のDNAを挿入して得られる組換えベクター
で、宿主細胞を形質転換すればよい。これらの操作は、
遺伝子組換え技術において当業者によく知られた方法で
実施することができる。
【0037】染色体DNAの調製、染色体DNAライブ
ラリーの作製、ハイブリダイゼーション、PCR、プラ
スミドDNAの調製、DNAの切断及び連結、形質転
換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定
等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採
用することができる。これらの方法は、Sambrook, J.,F
ritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Clonin
g A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されてい
る。
【0038】本発明のシトクロムaa3又はそのサブユニ
ット、及びそれらをコードするDNAは、コリネ型細菌
の電子伝達系の解明に有用であると考えられる。また、
同DNAは、エネルギー効率よく有用物質を生産するコ
リネ型細菌の育種に利用できる。
【0039】<2>シトクロムbc1複合体、そのサブ
ユニット及びそれらをコードするDNA シトクロムbc1複合体をコードするDNAの一部は、上
記のようにして得られたシトクロムaa3サブユニットII
及びIIIをコードする遺伝子(ctaC, ctaE)を含むDN
A断片の3'側下流に見出された。したがって、公知の方
法によってコリネバクテリウム・グルタミカム染色体D
NAのctaE遺伝子の隣接領域をクローニングすることに
よって、シトクロムbc1複合体をコードするDNAを取
得することができる。
【0040】具体的には、配列番号14及び15に示す
プライマーを用いて、コリネバクテリウム・グルタミカ
ム KY9002株(ATCC13032)の染色体DNAを鋳型とするPCR
(95℃ 60秒、52℃ 60秒、68℃ 60秒、35サイクル)を
行ない、得られるDNA断片をプローブに用いて染色体
DNAライブラリーをコロニーハイブリダイゼーションに
よりスクリーニングする。
【0041】上記のようにして、実施例で得られたコリ
ネバクテリウム・グルタミカムKY9002株(ATCC13032)
のシトクロムbc1複合体をコードするDNAの塩基配列
を、配列番号6に示す。この塩基配列中には6つのORF
が含まれており、それらのうちの3つのORF(塩基番号2
76〜1124、1172〜2347、2347〜3963)は、それぞれqcr
C、qcrA、qcrBであり、シトクロムbc1複合体を構成する
サブユニット(QcrC、QcrA、QcrB)をコードしている。
これらの遺伝子はオペロン構造をとっている(図2)。
各ORFがコードするアミノ酸配列を順に配列番号7、
8、10に示す。尚、qcrC、qcrAがコードするアミノ酸
配列を塩基配列とともに配列番号6に示す。また、qcrB
がコードするアミノ酸配列を塩基配列(配列番号6に示
す塩基配列と同じ)とともに配列番号9に示す。
【0042】本発明によりqcrC、qcrA、qcrBの塩基配列
が明らかとなったので、配列番号6に示す塩基配列に基
づいてプライマーを作製し、コリネバクテリウム・グル
タミカム染色体DNAを鋳型とするPCRを行うことに
よって、これらの遺伝子を直接取得することができる。
【0043】本発明のDNAは、上記シトクロムbc1複
合体の各サブユニットQcrC、QcrA、QcrBのいずれかをコ
ードするものであってもよいし、これらの2種又は3種
をともにコードするものであってもよい。本発明のDN
Aを適当な宿主細胞に導入し、得られる形質転換体を培
養し、該DNAを発現させることによって、シトクロム
bc1複合体又はそのサブユニットを製造することができ
る。QcrCをコードするDNAとしては配列番号6記載の
塩基配列において塩基番号276〜1124からなる塩基配列
を有するDNAが、QcrAをコードするDNAとしては配
列番号6に示す塩基配列において塩基番号1172〜2347か
らなる塩基配列を有するDNAが、サブユニットQcrBを
コードするDNAとしては配列番号6に示す塩基配列に
おいて塩基番号2347〜3963からなる塩基配列を有するD
NAが挙げられる。
【0044】製造されたシトクロムbc1複合体又はその
サブユニットは、塩析、溶媒沈殿、ゲル濾過クロマトグ
ラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等の通常タン
パク質の精製に用いられる方法で、培養物から採取、精
製することができる。また、本発明のQcrCをコードする
DNAは、配列番号7に記載のアミノ酸配列において、
1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は
付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、QcrA及びQcrB
とともにシトクロムbc1複合体を構成し得るポリペプチ
ドをコードするものであってもよい。
【0045】本発明のQcrAをコードするDNAは、配列
番号8に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個
のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミ
ノ酸配列からなり、かつ、QcrC及びQcrBとともにシトク
ロムbc1複合体を構成し得るポリペプチドをコードする
ものであってもよい。
【0046】本発明のQcrBをコードするDNAは、配列
番号10に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数
個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を含むア
ミノ酸配列からなり、かつ、QcrC及びQcrAとともにシト
クロムbc1複合体を構成し得るポリペプチドをコードす
るものであってもよい。
【0047】さらに、QcrC、QcrAもしくはQcrB、又はこ
れらの2者又は3者に変異を含むシトクロムbc1複合体
をコードするDNAも、本発明のDNAに含まれる。こ
こで「数個」とは、好ましくは1〜40個、より好まし
くは1〜10個である。あるいは、配列番号7、8又は
10に示すアミノ酸配列と相同性が80%以上、好まし
くは95%以上となるような個数であることが好まし
い。
【0048】上記のようなQcrC、QcrAもしくはQcrBと実
質的に同一のタンパク質をコードするDNAは、前記シ
トクロムaa3と実質的に同一のタンパク質をコードする
DNAと同様にして、部位特異的変異法又は変異処理に
よって取得され得る。
【0049】また、変異を有するqcrC、qcrAもしくはqc
rBまたはこれを保持する細胞から、例えば配列番号6に
記載の塩基配列のうち、塩基番号276〜1124からなる塩
基配列を有するDNA、塩基番号1172〜2347からなる塩
基配列、又は塩基番号2347〜3963からなる塩基配列を有
するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズし、かつ、QcrC、QcrA又はQcrBの機能を有するタンパ
ク質をコードするDNAを単離することによっても、Qc
rC、QcrA又はQcrBと実質的に同一のタンパク質をコード
するDNAが得られる。ストリンジェントな条件は、前
記と同様である。
【0050】本発明のDNAを発現させるための宿主と
しては、エシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・グ
ルタミカム、ブレビバクテリウム・フラバム等のコリネ
型細菌をはじめとする種々の細菌、サッカロマイセス・
セレビシエ(Saccharomycescerevisiae)等の真核細胞
が挙げられる。これらの宿主に本発明のDNAを導入す
るには、発現させようとする宿主の種類に応じたベクタ
ーに本発明のDNAを挿入して得られる組換えベクター
で、宿主細胞を形質転換すればよい。これらの操作は、
遺伝子組換え技術において当業者によく知られた方法で
実施することができる。
【0051】本発明のシトクロムbc1複合体又はそのサ
ブユニット、及びそれらをコードするDNAは、コリネ
型細菌の電子伝達系の解明に有用であると考えられる。
また、同DNAは、エネルギー効率よく有用物質を生産
するコリネ型細菌の育種に利用できる。
【0052】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。
【0053】
【実施例1】シトクロム aa3遺伝子のクローニング (1)コリネバクテリウム・グルタミカムのシトクロム
aa3サブユニットI遺伝子のクローニング ブラディオゾビウム・ジャポニカム(Bradyrhizobium j
aponicum)、アセトバクター・アセティ(Acetobacter
aceti)、シネココッカス・ブルカヌス(Synechococcus
vulcanus)、バチルス・ステアロサームフィラス(Bac
illus stearothermophilus)のシトクロムcオキシダー
ゼサブユニットIに高度に保存されている領域のアミノ
酸配列に基づいてプライマー(uni1 : TCATGGTNTGGGYNC
AYCAY(配列番号11)、uni2r : ATAACRTWRTGRAARTGNG
C(配列番号12))を合成し、このプライマーを用い
てコリネバクテリウム・グルタミカム KY9002株(ATCC1
3032)の染色体DNAを鋳型とするPCR(95℃ 45秒、52℃
60秒、62℃ 90秒、35サイクル)を行ない、0.3 kbの断
片を得た。
【0054】得られた0.3 kbの断片を用い上記方法と同
様にして標識プローブを作製した。このプローブを用い
て、PstI又はSphI処理したコリネバクテリウム・グルタ
ミカム染色体DNAに対してサザンハイブリダイゼーショ
ンを行なった。陽性シグナルが得られた位置に相当する
ゲルからDNAを抽出した。このDNAをPstIまたはSphI処理
したpUC119に連結して組換えDNAを作製し、エシェリヒ
ア・コリを形質転換した。形質転換体のコロニーに対し
て、上記のプローブを用いてコロニーハイブリダイゼー
ションを行なった。ハイブリダイゼーション陽性のコロ
ニーからプラスミドを調製し、クローンAA22、AA32を得
た。これらのクローンの塩基配列を決定した。これらの
クローンの塩基配列を連結した塩基配列を配列番号1に
示す。この塩基配列中には2つのORFが含まれていた
(図1B)。これらのORFについてデータベース検索を
行った結果、二番目のORF(塩基番号1538〜3289)はaa3
のサブユニットIをコードするctaD遺伝子であることが
判明した。
【0055】(2)コリネバクテリウム・グルタミカム
のシトクロムaa3の精製 コリネバクテリウム・グルタミカム KY9002株(ATCC130
32)を培養した菌体(湿重量120g)を、緩衝液(0.5%Na
Cl、10mMリン酸ナトリウム、pH7.4)200mlに懸濁した直
後、ガラスビーズ(D=0.5mm、350g)存在下でBiospec社
のビードビーターで高速攪拌して菌体を破砕した。この
菌体破砕液を8,000×gで10分遠心して破砕されていない
菌体を除去した後、上清を100,000×gで1時間遠心して
得られる沈殿を緩衝液(100mM NaCl、50mM リン酸カリ
ウム、pH6.5)に懸濁し、膜標品とした。
【0056】上記膜標品を緩衝液(5mg/ml、2% コール
酸ナトリウム、0.5M NaCl、10mM リン酸ナトリウム、pH
7.4)に懸濁して超音波破砕した後、100,000×gで30分
間遠心して得た沈殿を緩衝液(10mg/ml、2% n-オクチル
-D-グルコシド、0.5M NaCl、50mM リン酸カリウム、pH
6.5)に懸濁し、再度超音波破砕した。この破砕液を10
0,000×gで30分間遠心して得た上清を10mMリン酸ナトリ
ウム、pH7.4液に対して透析した後、DEAE-Toyopearlカ
ラム(1.4×10cm)を通してタンパク成分を吸着させた
後、1% n-オクチル-D-グルコシド、10mMリン酸ナトリウ
ム、pH7.4を溶媒として、NaCl濃度を上昇させることに
より溶出させた。酸化還元差スペクトルとCO結合還元
型マイナス還元型差スペクトルによりヘムaとヘムa3
のスペクトルを示す画分が、単一のピークとしてNaCl 2
00mMの条件で溶出された。さらにこの画分を、ハイドロ
キシアパタイトカラム(0.8×2cm)に通してタンパク成
分を吸着させ、1% n-octyl-D-glucosideを溶媒として徐
々にリン酸ナトリウム濃度を上昇させることにより溶出
させた。リン酸ナトリウム濃度200mMにて溶出された画
分が、同じく酸化還元差スペクトルとCO結合還元型マ
イナス還元型差スペクトルによりヘムaとヘムa3のス
ペクトルを示し、かつ、TMPDオキシダーゼ活性を示した
ことから、シトクロムaa3を含む画分であると結論した
(表1)。
【0057】
【表1】 表1 ──────────────────────────────────── シトクロムaa3 TMPDオキシタ゛ーセ゛活性 総タンハ゜ク質 総活性 比活性 TN ────────────────────── (mg) (mmol) (nmol/mg) (unit) (unit/mg) (s-1) ──────────────────────────────────── 膜 662 41.0 0.06 26.7 0.04 10.8 コール酸洗浄 583 42.7 0.07 19.4 0.033 7.51 オクチルク゛ルコシト゛抽出 47.8 44.2 0.93 1.82 0.038 0.68 DEAE-Toyopearl 6.19 13.2 2.13 1.51 0.242 1.91 ハイト゛ロキシアハ゜タイト 0.34 2.8 8.09 0.110 0.296 0.61 ────────────────────────────────────
【0058】(3)シトクロムaa3サブユニットIIタン
パク質のN末アミノ酸配列の決定 上記方法により得られたシトクロムaa3タンパクをSDS-P
AGEにより分離して、ポリビニリデン・ジフルオリド(p
olyvinylidene difluolide)膜にトランスファーした。
この膜のサブユニットIIに相当すると思われる位置を切
り出し、これを用いて(Pulse-liquid peptide sequenc
er model 477A(Applied Biosystems)にてアミノ酸配
列を決定した。決定されたN末端部分のアミノ酸配列を
配列番号13に示す。
【0059】(4)シトクロムaa3サブユニットII、III
遺伝子のクローニング 精製したaa3サブユニットIIのN末アミノ酸配列よりプラ
イマーcrg1(GGYGAYTTCYTBCGNATGGG)(配列番号14)
を合成した。また、Paracoccus denitrificans, Rhodob
acter sphaeroides, Synechococcus vulcanus, Thermus
thermophilus,Bacillus subtilis, Bacillus stearoth
ermophilusのオキシダーゼサブユニットII にあるCuA
結合モチーフの保存配列よりプライマーcrg2r(GGACCGC
ASARYTCNGMRCA)(配列番号15)を合成した。このcrg
1とcrg2rを用い、コリネバクテリウム・グルタミカム K
Y9002株(ATCC13032)の染色体DNAを鋳型とするPCR(95
℃ 60秒、52℃ 60秒、68℃ 60秒、35サイクル)を行な
い、0.8 kbの断片(AA1)を得た。コリネバクテリウム
・グルタミカムの染色体DNAは、斎藤、三浦の方法(Bio
chem. Biophys. Acta., 72, 619,(1963))によって調製
した。
【0060】得られた0.8 kbの断片を、DIG DNA Labeli
ng Kit(Bohringer Mannheim)を用いてラベルし、染色
体DNAライブラリーをスクリーニングする為のプローブ
とした。コリネバクテリウム・グルタミカムの染色体DN
Aライブラリーは、染色体DNAを制限酵素Sau3AIで部分分
解し、得られたDNA断片を制限酵素BamHI処理したpUC119
に連結することによって組換えDNAを作製し、同組換えD
NAでエシェリヒア・コリを形質転換したものを用いた。
【0061】形質転換体のコロニーに対して、上記のDI
Gラベルしたプローブを用いてコロニーハイブリダイゼ
ーション(47〜50℃、5×SSC、0.5% blocking reagent
(Bohringer Mannheim)、0.1% ラウリルザルコシン酸
ナトリウム(sodium lauroylsarcosinate)、0.02% SD
S)を行なった。プローブの検出は、アルカリフォスフ
ァターゼ標識した抗DIG抗体を用いたDIG Detection Kit
(Bohringer Mannheim)を使用して行なった。ハイブリ
ダイゼーション陽性のコロニーからプラスミドを調製
し、クローンAA41、AA51、AA61を得た。これらのクロー
ンの塩基配列を決定した。これらの塩基配列は相互に重
複し、全体としてaa3のサブユニットIIをコードするcta
C遺伝子とサブユニットIIIをコードするctaE遺伝子を含
んでいることが判明した(図1A)。前記3クローンの
塩基配列を連結した塩基配列を配列番号3に示す。この
塩基配列中には3つのオープンリーディングフレーム
(ORF)が含まれていた。これらのORFについてデータベ
ース検索を行った結果、最初のORF(塩基番号604〜168
0)はサブユニットIIをコードするctaC遺伝子であり、
三番目のORF(2715〜3329)はサブユニットIIIをコード
するctaE遺伝子であることが判明した。これらのアミノ
酸配列を、それぞれ配列番号4、5に示す。
【0062】各アミノ酸配列について、データベースに
対してホモロジー検索を行った結果を表2に示す。尚、
配列の解析は、GENETYX‐Homology Version2.2.2(ソフ
トウェア開発株式会社製)を用いて行った。また、相同
性解析は、LipmanとPeasonの方法(Science, 227, 1435
-1441, 1985)にしたがって行った。
【0063】
【表2】 表2 ──────────────────────────────────── 遺伝子 相同性(アミノ酸列レベル) ──────────────────────────────────── ctaD Mycobacterium tuberculosis ctaD産物 (70%) Bacillus stearothermohilus シトクロームオキシタ゛ーセ゛サフ゛ユニットI (47%) ──────────────────────────────────── ctaC Mycobacterium tuberculosis ctaC産物 (50%) Streptomyces coelicolor シトクロームオキシタ゛ーセ゛サフ゛ユニットIIと推定され るタンパク質(32%) ──────────────────────────────────── ctaE Mycobacterium tuberculosis ctaE産物 (60%) Streptomyces coelicolor シトクロームオキシタ゛ーセ゛サフ゛ユニットIIIと推定さ れ るタンパク質(57%) ────────────────────────────────────
【0064】
【実施例2】シトクロムbc1複合体遺伝子のクローニン
グ 実施例1で得られた配列番号3に示す塩基配列中、シト
クロムaa3サブユニットIIIをコードする遺伝子ctaEの3'
側下流に、ORFの一部と推定される配列が見出された。
この配列についてコードされ得るアミノ酸配列について
データベース検索を行ったところ、公知のシトクロムc1
サブユニットのアミノ酸配列と相同性が見い出された。
【0065】実施例1においてctaCをクローニングした
際に用いた約800bpの部分配列をPCRにより取得し、DIG
DNA Labeling Kit(Bohringer Mannheim)を用いてラベ
ルし、プローブAA1とした。このプローブAA1を用いて染
色体DNAライブラリーをコロニーハイブリダイゼーショ
ンによりスクリーニングした。用いた染色体DNAライブ
ラリーは、コリネバクテリウム・グルタミカムの染色体
DNAを制限酵素Sau3AIで部分分解し、得られたDNA断片を
制限酵素BamHI処理したpUC18に連結して組換えDNAを作
製し、この組換えDNAでエシェリヒア・コリを形質転換
したものを用いた。プローブの検出は、アルカリフォス
ファターゼ標識した抗DIG抗体を用いたDIG Detection K
it(Bohringer Mannheim)を使用して行なった。ハイブ
リダイゼーション陽性のコロニーからプラスミドを調製
し、クローンBLC1を得た。
【0066】前記クローンpBLC1の塩基配列を決定し、
その配列から新たに制限酵素EagIとSacIで切り出される
154bpの断片をプローブ1とした。このプローブ1を前
述の方法でラベルした後、再度染色体DNAライブラリー
をスクリーニングした。これにより得られたクローンB1
2の塩基配列を決定し、その配列から制限酵素StyIにて
切り出される約500bpの断片を用いてプローブ(プロー
ブ2)を作製した。このプローブ2を前述の方法でラベ
ルした後、染色体DNAライブラリーをコロニーハイブリ
ダイゼーションによりスクリーニングした。ただし、こ
こで用いた染色体DNAライブラリーは、コリネバクテリ
ウム・グルタミカムの染色体DNAを制限酵素BglIIとSmaI
で完全消化して得られた約2.8kbのDNA断片を回収し、制
限酵素BamHIとSmaI処理したpUC118に連結して組換えDNA
を作製し、この組換えDNAでエシェリヒア・コリを形質
転換したものを用いた。これによりクローンB13が得ら
れ、塩基配列を決定した。BLC1、B12、B13の塩基配列を
連結したものを、配列番号6に示す。この塩基配列中に
は6つのORFが含まれており、それらのうちの3つのORF
(塩基番号276〜1124、1172〜2347、2347〜3963)はオ
ペロン構造をとっていた(図2)。これらのORFについ
てデータベース検索を行い、それぞれqcrC、qcrA、qcrB
と名づけた。それぞれのORFがコードするアミノ酸配列
を順に配列番号7、8、10に示す。尚、qcrC、qcrAが
コードするアミノ酸配列を塩基配列とともに配列番号6
に示す。また、qcrBがコードするアミノ酸配列を塩基配
列(配列番号6に示す塩基配列と同じ)とともに配列番
号9に示す。
【0067】qcrC遺伝子産物は、ヘムc結合モチーフが
2個所あるという特徴を持ち、マイコバクテリウム・ツ
ベルクローシス(M. tuberculosis)、ストレプトマイ
セス・コエリカラー(S. coelicolor)等の高G+Cグラム
陽性菌の相同タンパク質に対し、アミノ酸レベルで34%
以上のホモロジーを示した。特に、M. tuberculosisの
相同タンパク質に対しては54%と高いホモロジーを示し
た。このqcrCが、シトクロムbc1複合体のシトクロムc1
サブユニットをコードする遺伝子であると結論した。
【0068】また、qcrA遺伝子産物には、保存度が低い
ながらもRieske鉄−硫黄モチーフ(Rieske iron-sulfur
motif)が存在し、高G+Cグラム陽性菌の中では、サー
モス・サーモフィラス(T. thermophilus)のRieske ir
on-sulfur proteinに最も相同性の高いものであった。
このqcrAが、シトクロムbc1複合体のRieske iron-sulfu
r proteinをコードする遺伝子であると結論した。
【0069】qcrB遺伝子産物は、高G+Cグラム陽性菌T.
thermophilusのシトクロムbや、バチルス・ステアロサ
ーモフィラス(B. stearothermopholus)のシトクロムb
6に相同性が認められ、ヘム結合部位であるHis残基や、
その周辺配列も高度に保存されていた。これらの遺伝子
産物は、真核生物ミトコンドリアや、プロテオバクテリ
アですでに知られているように、シトクロムc1、鉄−硫
黄プロテイン(Iron-sulfur protein)、シトクロムbと
で複合体を形成して機能していることが予測される。こ
のqcrBが、シトクロムbc1複合体のシトクロムbサブユニ
ットをコードする遺伝子であると結論した。
【0070】尚、配列の解析は、GENETYX‐Homology Ve
rsion2.2.2(ソフトウェア開発株式会社製)を用いて行
った。また、相同性解析は、LipmanとPeasonの方法(Sc
ience, 227, 1435-1441, 1985)にしたがって行った。
【0071】
【表3】 表3 ──────────────────────────────────── 遺伝子 相同性(アミノ酸列レベル) ──────────────────────────────────── qcrC 高G+Cグラム陽性菌 qcrC産物 (34%以上) M. tuberculosis qcrC産物 (54%) ──────────────────────────────────── qcrA T. thermophilus Rieske iron-sulfur protein (45%) ──────────────────────────────────── qcrB M. tuberculosis シトクロムb (61%) B. stearothermopholus シトクロムb6 (31%) ────────────────────────────────────
【0072】
【実施例3】コリネバクテリウム・グルタミカムのヘム
c含有タンパク質の精製 (1)ヘムc含有タンパク質の精製 シトクロムcは、ヘムcがタンパク質部分のシステイン残
基と共有結合しているため、タンパク質が変性した後も
ヘムcが結合している。ヘム鉄はパーオキシダーゼ活性
を持つ。したがって、シトクロムcを変性させて得られ
るポリペプチドのうち、共有結合ヘムを持つものの存在
を明らかにできる。変性させたシトクロムcをSDS-ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動した後にパーオキシダーゼ
活性を検出したところ、分子量約28kDaのポリペプチド
だけがパーオキシダーゼ活性を示し、c型ヘムを持って
いることがわかった。このことから、コリネバクテリウ
ム・グルタミカムはヘムcを含むタンパク質を1種類だ
け持つと考えられる。またこのタンパク質を精製してア
ミノ酸配列を決定すれば、シトクロムbc1複合体のサブ
ユニットを特定できると考えられる。
【0073】コリネバクテリウム・グルタミカム KY900
2株(ATCC13032)を培養した菌体を、10,000×gで10分
遠心して回収し、緩衝液(20mMリン酸カリウム、pH7.
5)で洗浄後、再度10,000×gで10分遠心して菌体を得
た。この洗浄操作を再度行ない、得た菌体を緩衝液(20
mMリン酸カリウム、pH7.5)に懸濁し、リゾチーム(Sig
ma)を終濃度0.5mg/mlとなるように添加し室温で30分間
処理した後、超音波破砕した。
【0074】この菌体破砕液を10,000×gで20分遠心し
て未破砕菌体を除去した後、上清を150,000×gで90分間
遠心して得られる沈殿を緩衝液(20mMリン酸カリウム、
pH7.5)に懸濁し、洗浄した。これを150,000×gで90分
間遠心して得られた沈殿を、200mlの緩衝液(1% コール
酸ナトリウム、0.5% デオキシコール酸ナトリウム、0.1
M NaCl、10mMリン酸ナトリウム、pH6.8)にタンパク質
濃度が10mg/mlとなるように懸濁して洗浄した後、100,0
00×gで45分間遠心して膜タンパク質を沈殿させた。
【0075】こうして得られた膜タンパク質を、穏やか
に超音波をかけて緩衝液(1%デシルグルコシド、0.05M
リン酸カリウム、pH6.5)に溶解し、100,000×gで30分
間遠心して得られた上清を、20mM Tris-HCl pH7.2緩衝
液に対して3時間透析した。透析した上清を、緩衝液(1
%デシルグルコシド 20mM Tris-HCl pH 7.2)で平衡化し
たDEAE-Toyopearlカラム(1.6×8.0cm)に供した。カラ
ムに吸着させたタンパク質を、緩衝液(1% n-オクチル-
D-グルコシド、20mM Tris-HCl pH 7.2)を溶媒として、
NaCl濃度を上昇させることにより溶出させた。NaCl濃度
60〜80mMにて溶出したヘムcを含む赤色の画分を回収
し、ハイドロキシアパタイトカラム(0.5×1.5cm)に通
してタンパク成分を吸着させ、緩衝液(1% n-オクチル-
D-グルコシド、20mM Tris-HCl pH 7.2)にてカラムを洗
浄後、緩衝液(1%デシルグルコシド、5mM リン酸ナトリ
ウム、pH6.8)にて溶出した。得られた画分をCentricon
30(Amersham)を通して約0.1mLに濃縮後、HPLCにより
緩衝液(0.05%デシルグルコシド、0.1M NaCl、10mM Tri
s-HCl pH 7.2)で平衡化したToso G3000SWカラム(トー
ソー)に流速0.8mL/minにて通すことによりゲルろ過
し、ヘムcを含有するタンパク質を含む画分を回収した
(表4)。
【0076】
【表4】
【0077】(2)ヘムc含有タンパク質のN末アミノ
酸配列の決定 上記方法により得られたヘムc含有タンパク質を含む画
分をSDS-PAGEにより分離して、ポリビニリデン・ジフル
オリド膜にトランスファーした。この膜のcc1に相当す
る位置を切り出し、スタフィロコッカス・アウレウス V
8プロテアーゼ(Staphylococcus aureus V8 protease)
を用い、以前に報告されている方法(Kuge, S. et al.,
Biochem. Mol. Biol. Int., 38, 181-188 (1996))で
タンパク質を分解した。この分解物を用いてPulse-liqu
id peptide sequencer model 477A(Applied Biosystem
s)にてアミノ酸配列を決定した。これにより2種類の
部分アミノ酸配列、QAERKAPRITEAQVLA(配列番号16)
とLRGENYDGQITSADVARGGDLFRL(配列番号17)が得られ
た。この部分アミノ酸配列は、前述のクローニングした
qcrC遺伝子から得られるアミノ酸配列とほぼ等しい配列
であった。
【0078】〔配列表の説明〕 配列番号1 ctaDの塩基配列、及びCtaDのアミノ酸配列 配列番号2 CtaDのアミノ酸配列 配列番号3 ctaC, ctaEの塩基配列、及びCtaC、CtaEの
アミノ酸配列 配列番号4 CtaCのアミノ酸配列 配列番号5 CtaEのアミノ酸配列 配列番号6 qcrCABの塩基配列、及びQcrC、QcrAのアミ
ノ酸配列 配列番号7 QcrCのアミノ酸配列 配列番号8 QcrAのアミノ酸配列 配列番号9 qcrCABの塩基配列、及びQcrBのアミノ酸配
列 配列番号10 QcrBのアミノ酸配列 配列番号11 プライマーuni1 配列番号12 プライマーuni1r 配列番号13 シトクロムaa3サブユニットIIタンパク質
のN末アミノ酸配列 配列番号14 プライマーcrg1 配列番号15 プライマーcrg2r 配列番号16 シトクロムcc1タンパク質の部分アミノ酸
配列 配列番号17 シトクロムcc1タンパク質の部分アミノ酸
配列
【0079】
【発明の効果】本発明により、シトクロムaa3を構成す
るサブユニット、及びそれらをコードするDNAが提供
される。また、シトクロムbc1複合体を構成するサブユ
ニット、及びそれらをコードするDNAが提供される。
これらのポリペプチド及びDNAは、コリネ型細菌の電
子伝達系の解明に有用である。また、本発明のDNA
は、エネルギー効率よく有用物質を生産するコリネ型細
菌の育種に利用できる。
【0080】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Ajinomoto Co., Inc <120> コリネ型細菌の呼吸鎖酵素遺伝子 <130> P-7718 <140> <141> 2000-09-06 <160> 17 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 3804 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (1538)..(3289) <400> 1 agagcgcacc taatggctgc tgattctgat ctcagtgttc acgatgctta cttaaaggag 60 catgttgcac ctgtaaaggc gatcaactgg aactccatcc cagattccaa agatcttgaa 120 gtctgggatc gtctgaccgg taacttctgg ctcccagaaa aggtcccagt atccaacgac 180 atcaagagct ggggaaccct caacgaggtt gaaaaagccg caaccatgcg cgtgttcacc 240 ggacttaccc tgctggacac cattcagggc actgtcggcg caatctccct gcttccagac 300 gcagattcac tgcacgaaga agcggtgcta accaacattg cgttcatgga atccgtgcac 360 gcaaagagtt actccaacat cttcatgact ctggcctcca ccgcggaaat caacgatgcg 420 ttccgttggt ctgaggaaaa tgaaaacctg cagcgcaagg caaagatcat cctgtcttac 480 tatgagggcg atgatccact aaagcgcaag atcgcctccg tgatcctgga gtccttcctg 540 ttctactccg gcttctacct cccaatgtat tggtccagcc actccaagct gaccaacacc 600 gccgacgtga tccgcctgat catccgcgat gaggcagtgc acggctacta cattggctac 660 aagtatcaaa aggctgtcgc gaaggagact ccagagcgtc aggaagagct gaaggagtac 720 accttcgatc tgctctacga tctttacgat aacgaaactc agtactccga agatctctac 780 gacgatcttg gatggaccga ggatgttaag cgattccttc gctacaacgc caacaaggcc 840 ctcaacaacc ttggctacga aggactcttc ccagcggatg aaaccaaggt gtccccaaac 900 atcttgtctg cgctgtcacc aaacgctgat gagaaccacg acttcttctc cggctccggt 960 tcctcttacg ttattggtaa ggcagaaaac accgaggatg atgactggga cttctaactt 1020 ttaaaaagct gaagcgctct acggctgtag ttaactgcaa ccgttagagc gtttttcgct 1080 ttctggtggg ggcttaaggt gcgggttttt ccgaagcgca tatcggggta ggggagcgcc 1140 aggcgccccg tggacccctc ggcggcacat cacgctttag aagaaaacgc ccctggaatg 1200 ggcgtctcaa ccattcgatt gaaccccggc ggggggaatt gtgaaatctg tggcaggggt 1260 taaccgtggg ggtagggctt cctggcgaaa tgtccgtcaa attgtgaacc ccttcacacc 1320 tttggttaaa agtcactgcc cacaagtgac tgaacctggc agcgacctca tgaattgttt 1380 gaaaaacatt ttttttgggc atgaaaaggg gatacagtta gctgcatacc ggcctttttg 1440 ggttggcatc ggatcctgcc tgtggcctaa gatcaggcag tgttgttaaa ggacgatcgg 1500 taatccgaat ggatcgtccc gtagtcagga ggaacct atg acc gct gtg gcg cct 1555 Met Thr Ala Val Ala Pro 1 5 agg gtc gac ggg cac gtc gcc cct cag agg ccc gag ccg aca ggc cat 1603 Arg Val Asp Gly His Val Ala Pro Gln Arg Pro Glu Pro Thr Gly His 10 15 20 gca cgc aag ggc agc aaa gca tgg tta atg atg acc acc acc gac cac 1651 Ala Arg Lys Gly Ser Lys Ala Trp Leu Met Met Thr Thr Thr Asp His 25 30 35 aag cag ctg ggc att atg tac atc att atg tcc ttc agc ttc ttc ttc 1699 Lys Gln Leu Gly Ile Met Tyr Ile Ile Met Ser Phe Ser Phe Phe Phe 40 45 50 ctc ggt ggc ttg atg gcc ctg ctt atc cga gcg gag ctt ttc acc cct 1747 Leu Gly Gly Leu Met Ala Leu Leu Ile Arg Ala Glu Leu Phe Thr Pro 55 60 65 70 ggt ctg cag ttc ctg tct aat gag cag ttc aac cag ctg ttc acc atg 1795 Gly Leu Gln Phe Leu Ser Asn Glu Gln Phe Asn Gln Leu Phe Thr Met 75 80 85 cac gga act gtc atg ctg ctg ctg tac gga act cca att gtt tgg ggt 1843 His Gly Thr Val Met Leu Leu Leu Tyr Gly Thr Pro Ile Val Trp Gly 90 95 100 ttt gct aac tac gtc ctg cca ctt cag atc ggt gcg cct gac gta gct 1891 Phe Ala Asn Tyr Val Leu Pro Leu Gln Ile Gly Ala Pro Asp Val Ala 105 110 115 ttc cca cgt ttg aat gct ttc ggc ttc tgg atc acc acc gtc ggt ggt 1939 Phe Pro Arg Leu Asn Ala Phe Gly Phe Trp Ile Thr Thr Val Gly Gly 120 125 130 gtc gcg atg ctg acc ggc ttc ctg acc ccg ggt ggt gct gcc gac ttc 1987 Val Ala Met Leu Thr Gly Phe Leu Thr Pro Gly Gly Ala Ala Asp Phe 135 140 145 150 ggt tgg acc atg tac tcc cca ctg tct gac gca att cac tcc cca ggc 2035 Gly Trp Thr Met Tyr Ser Pro Leu Ser Asp Ala Ile His Ser Pro Gly 155 160 165 ctt ggc tct gac atg tgg att gtc ggt gtc ggt gca act ggt att ggc 2083 Leu Gly Ser Asp Met Trp Ile Val Gly Val Gly Ala Thr Gly Ile Gly 170 175 180 tcc gtt gct tcc gca att aac atg ctc acc acc atc ctc tgc ctc cgc 2131 Ser Val Ala Ser Ala Ile Asn Met Leu Thr Thr Ile Leu Cys Leu Arg 185 190 195 gca cct ggt atg acc atg ttc cgt atg cct att ttc acc tgg aat atc 2179 Ala Pro Gly Met Thr Met Phe Arg Met Pro Ile Phe Thr Trp Asn Ile 200 205 210 ttc gtt gtt tcc gtt ctt gct ctg ctg atc ttc cca ctg ctg ctc gct 2227 Phe Val Val Ser Val Leu Ala Leu Leu Ile Phe Pro Leu Leu Leu Ala 215 220 225 230 gct gca ctg ggt gtt ctg tat gac cgc aag ctt ggt gga cac ctg tac 2275 Ala Ala Leu Gly Val Leu Tyr Asp Arg Lys Leu Gly Gly His Leu Tyr 235 240 245 gat cca gct aac ggc ggc tcc ctc ctg tgg cag cac ctg ttc tgg ttc 2323 Asp Pro Ala Asn Gly Gly Ser Leu Leu Trp Gln His Leu Phe Trp Phe 250 255 260 ttc gga cac cct gag gtt tac gtt ctg gcg ctg ccg ttc ttc ggc att 2371 Phe Gly His Pro Glu Val Tyr Val Leu Ala Leu Pro Phe Phe Gly Ile 265 270 275 gtt tct gag atc att cct gtg ttc tcc cgt aag cca atg ttc ggt tac 2419 Val Ser Glu Ile Ile Pro Val Phe Ser Arg Lys Pro Met Phe Gly Tyr 280 285 290 gtc ggc ctg atc ttc gca acc ttg tcc att ggt gca ctg tcc atg gct 2467 Val Gly Leu Ile Phe Ala Thr Leu Ser Ile Gly Ala Leu Ser Met Ala 295 300 305 310 gtg tgg gct cac cac atg ttc gtt act ggc gca gtt ttg ctt ccg ttc 2515 Val Trp Ala His His Met Phe Val Thr Gly Ala Val Leu Leu Pro Phe 315 320 325 ttc tcc ttc atg acg ttc ctg att tcg gtt cct acc ggc gtt aag ttc 2563 Phe Ser Phe Met Thr Phe Leu Ile Ser Val Pro Thr Gly Val Lys Phe 330 335 340 ttc aac tgg gtt gga acc atg tgg aag ggt cac atc act tgg gaa acc 2611 Phe Asn Trp Val Gly Thr Met Trp Lys Gly His Ile Thr Trp Glu Thr 345 350 355 cca atg atc tgg tct gtt ggc ttc atg gct acc ttc ctc ttc ggt ggt 2659 Pro Met Ile Trp Ser Val Gly Phe Met Ala Thr Phe Leu Phe Gly Gly 360 365 370 ctg acc ggc att atg ctg gcg tcc cca cca ctg gac ttc cac ttg gct 2707 Leu Thr Gly Ile Met Leu Ala Ser Pro Pro Leu Asp Phe His Leu Ala 375 380 385 390 gac tcc tac ttc ctg atc gcg cac ttc cac tac acc ctc ttc ggt acc 2755 Asp Ser Tyr Phe Leu Ile Ala His Phe His Tyr Thr Leu Phe Gly Thr 395 400 405 gtg gtg ttc gca tcg tgt gca ggc gtt tac ttc tgg ttc ccg aag atg 2803 Val Val Phe Ala Ser Cys Ala Gly Val Tyr Phe Trp Phe Pro Lys Met 410 415 420 act ggc cgc atg atg gac gag cgt ctt ggc aag atc cac ttc tgg ttg 2851 Thr Gly Arg Met Met Asp Glu Arg Leu Gly Lys Ile His Phe Trp Leu 425 430 435 acc ttc gtc ggt ttc cac gga acc ttc ctc atc cag cac tgg gtg ggc 2899 Thr Phe Val Gly Phe His Gly Thr Phe Leu Ile Gln His Trp Val Gly 440 445 450 aac atg ggt atg cca cgt cgt tac gct gac tac ctg gat tct gat ggt 2947 Asn Met Gly Met Pro Arg Arg Tyr Ala Asp Tyr Leu Asp Ser Asp Gly 455 460 465 470 ttc acc atc tac aac cag atc tcc acc gtg ttc tcc ttc ctg ctt ggc 2995 Phe Thr Ile Tyr Asn Gln Ile Ser Thr Val Phe Ser Phe Leu Leu Gly 475 480 485 ctg tct gtc att cca ttc atc tgg aac gtc ttc aag tcc tgg cgc tac 3043 Leu Ser Val Ile Pro Phe Ile Trp Asn Val Phe Lys Ser Trp Arg Tyr 490 495 500 ggt gag ctc gtt acc gtt gat gat cct tgg ggt tac ggc aac tcc ctg 3091 Gly Glu Leu Val Thr Val Asp Asp Pro Trp Gly Tyr Gly Asn Ser Leu 505 510 515 gag tgg gca acc tcc tgc cct cct cct cgc cac aac ttc gca tcc ttg 3139 Glu Trp Ala Thr Ser Cys Pro Pro Pro Arg His Asn Phe Ala Ser Leu 520 525 530 cct cgt atc cgc tcc gag cgc cct gcg ttc gag ctg cac tac ccg cac 3187 Pro Arg Ile Arg Ser Glu Arg Pro Ala Phe Glu Leu His Tyr Pro His 535 540 545 550 atg att gaa agc atg cgc gca gag gca cac act gga cat cac gat gat 3235 Met Ile Glu Ser Met Arg Ala Glu Ala His Thr Gly His His Asp Asp 555 560 565 att aat gct cca gaa ttg ggt acc gcc cca gcc ctt gca tct gac tcc 3283 Ile Asn Ala Pro Glu Leu Gly Thr Ala Pro Ala Leu Ala Ser Asp Ser 570 575 580 agc cgc taaaagcgtc tgatttaagt cggtacctga ctaaataagc accagcccca 3339 Ser Arg gcagagataa tctgccgggg ctggcgtttt catattccga cttggggcac cctgaataca 3399 tctcacccaa ttccccataa ctagacaatt gcccagcaac gactgataag tctccaatgt 3459 cgtgttccgc gctcagacat gagacaattg ttgccgtgac tgaactcatc cagaatgaat 3519 cccaagaaat cgctgagctg gaagccggcc agcaggttgc attgcgtgaa ggttatcttc 3579 ctgcggtgat cacagtgagc ggtaaagacc gcccaggtgt gactgccgcg ttctttaggg 3639 tcttgtccgc taatcaggtt caggtcttgg acgttgagca gtcaatgttc cgtggctttt 3699 tgaacttggc ggcgtttgtg ggtatcgcac ctgagcgtgt cgagaccgtc accacaggcc 3759 tgactgacac cctcaaggtg catggacagt ccgtggtggt ggagc 3804 <210> 2 <211> 584 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 Met Thr Ala Val Ala Pro Arg Val Asp Gly His Val Ala Pro Gln Arg 1 5 10 15 Pro Glu Pro Thr Gly His Ala Arg Lys Gly Ser Lys Ala Trp Leu Met 20 25 30 Met Thr Thr Thr Asp His Lys Gln Leu Gly Ile Met Tyr Ile Ile Met 35 40 45 Ser Phe Ser Phe Phe Phe Leu Gly Gly Leu Met Ala Leu Leu Ile Arg 50 55 60 Ala Glu Leu Phe Thr Pro Gly Leu Gln Phe Leu Ser Asn Glu Gln Phe 65 70 75 80 Asn Gln Leu Phe Thr Met His Gly Thr Val Met Leu Leu Leu Tyr Gly 85 90 95 Thr Pro Ile Val Trp Gly Phe Ala Asn Tyr Val Leu Pro Leu Gln Ile 100 105 110 Gly Ala Pro Asp Val Ala Phe Pro Arg Leu Asn Ala Phe Gly Phe Trp 115 120 125 Ile Thr Thr Val Gly Gly Val Ala Met Leu Thr Gly Phe Leu Thr Pro 130 135 140 Gly Gly Ala Ala Asp Phe Gly Trp Thr Met Tyr Ser Pro Leu Ser Asp 145 150 155 160 Ala Ile His Ser Pro Gly Leu Gly Ser Asp Met Trp Ile Val Gly Val 165 170 175 Gly Ala Thr Gly Ile Gly Ser Val Ala Ser Ala Ile Asn Met Leu Thr 180 185 190 Thr Ile Leu Cys Leu Arg Ala Pro Gly Met Thr Met Phe Arg Met Pro 195 200 205 Ile Phe Thr Trp Asn Ile Phe Val Val Ser Val Leu Ala Leu Leu Ile 210 215 220 Phe Pro Leu Leu Leu Ala Ala Ala Leu Gly Val Leu Tyr Asp Arg Lys 225 230 235 240 Leu Gly Gly His Leu Tyr Asp Pro Ala Asn Gly Gly Ser Leu Leu Trp 245 250 255 Gln His Leu Phe Trp Phe Phe Gly His Pro Glu Val Tyr Val Leu Ala 260 265 270 Leu Pro Phe Phe Gly Ile Val Ser Glu Ile Ile Pro Val Phe Ser Arg 275 280 285 Lys Pro Met Phe Gly Tyr Val Gly Leu Ile Phe Ala Thr Leu Ser Ile 290 295 300 Gly Ala Leu Ser Met Ala Val Trp Ala His His Met Phe Val Thr Gly 305 310 315 320 Ala Val Leu Leu Pro Phe Phe Ser Phe Met Thr Phe Leu Ile Ser Val 325 330 335 Pro Thr Gly Val Lys Phe Phe Asn Trp Val Gly Thr Met Trp Lys Gly 340 345 350 His Ile Thr Trp Glu Thr Pro Met Ile Trp Ser Val Gly Phe Met Ala 355 360 365 Thr Phe Leu Phe Gly Gly Leu Thr Gly Ile Met Leu Ala Ser Pro Pro 370 375 380 Leu Asp Phe His Leu Ala Asp Ser Tyr Phe Leu Ile Ala His Phe His 385 390 395 400 Tyr Thr Leu Phe Gly Thr Val Val Phe Ala Ser Cys Ala Gly Val Tyr 405 410 415 Phe Trp Phe Pro Lys Met Thr Gly Arg Met Met Asp Glu Arg Leu Gly 420 425 430 Lys Ile His Phe Trp Leu Thr Phe Val Gly Phe His Gly Thr Phe Leu 435 440 445 Ile Gln His Trp Val Gly Asn Met Gly Met Pro Arg Arg Tyr Ala Asp 450 455 460 Tyr Leu Asp Ser Asp Gly Phe Thr Ile Tyr Asn Gln Ile Ser Thr Val 465 470 475 480 Phe Ser Phe Leu Leu Gly Leu Ser Val Ile Pro Phe Ile Trp Asn Val 485 490 495 Phe Lys Ser Trp Arg Tyr Gly Glu Leu Val Thr Val Asp Asp Pro Trp 500 505 510 Gly Tyr Gly Asn Ser Leu Glu Trp Ala Thr Ser Cys Pro Pro Pro Arg 515 520 525 His Asn Phe Ala Ser Leu Pro Arg Ile Arg Ser Glu Arg Pro Ala Phe 530 535 540 Glu Leu His Tyr Pro His Met Ile Glu Ser Met Arg Ala Glu Ala His 545 550 555 560 Thr Gly His His Asp Asp Ile Asn Ala Pro Glu Leu Gly Thr Ala Pro 565 570 575 Ala Leu Ala Ser Asp Ser Ser Arg 580 <210> 3 <211> 4112 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (604)..(1680) <220> <221> CDS <222> (2715)..(3329) <220> <221> sig_peptide <222> (604)..(685) <220> 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gcctgtgaac cctttaacct 2550 gcaattatgt aactgtcgta aaagggctac gaaaagttcc cggaaggtcg attgaaaagt 2610 ttgcgaattg ggggaaaatt cgcatcaaaa gccgagttca aactttcaat tgaaacgggg 2670 ggcttgaagt gactttggcc aaccaaacag ccatactaga tagc gtg acg agc gca 2726 Val Thr Ser Ala 1 gtt gga aat aca ggt atg gca gca cca caa cgt gtt gcg gca ctg aac 2774 Val Gly Asn Thr Gly Met Ala Ala Pro Gln Arg Val Ala Ala Leu Asn 5 10 15 20 cgt ccg aat atg gtc agt gtc ggc acc att gtg ttc ctg tct cag gaa 2822 Arg Pro Asn Met Val Ser Val Gly Thr Ile Val Phe Leu Ser Gln Glu 25 30 35 tta atg ttc ttc gcc ggg cta ttc gcg atg tac ttc gtg tcc cgt gcg 2870 Leu Met Phe Phe Ala Gly Leu Phe Ala Met Tyr Phe Val Ser Arg Ala 40 45 50 aac gga ctg gca aat gga tca tgg gga gag cag aca gat cac ctc aac 2918 Asn Gly Leu Ala Asn Gly Ser Trp Gly Glu Gln Thr Asp His Leu Asn 55 60 65 gtg ccc tac gca ctg ttg att acg gtc att ctg gtg tct tcc tca gtg 2966 Val Pro Tyr Ala Leu Leu Ile Thr Val Ile Leu Val Ser Ser Ser Val 70 75 80 act tgc cag ttc gga gtt ttt gcg gct gaa agg ggt gac gtt tac ggc 3014 Thr Cys Gln Phe Gly Val Phe Ala Ala Glu Arg Gly Asp Val Tyr Gly 85 90 95 100 ctc cgc aag tgg ttc ttg gtc acg att atc ctc gga tca atc ttc gtg 3062 Leu Arg Lys Trp Phe Leu Val Thr Ile Ile Leu Gly Ser Ile Phe Val 105 110 115 atc gga cag ggc tac gag tac atc act ctc gta ggt cac gga ctt aca 3110 Ile Gly Gln Gly Tyr Glu Tyr Ile Thr Leu Val Gly His Gly Leu Thr 120 125 130 atc cag agc agt gtc tac gga tcg gca ttc ttt att aca acc ggt ttc 3158 Ile Gln Ser Ser Val Tyr Gly Ser Ala Phe Phe Ile Thr Thr Gly Phe 135 140 145 cac gca ctg cac gtg atc gcg ggt gtt atg gcc ttc gtt gtg gtt ctt 3206 His Ala Leu His Val Ile Ala Gly Val Met Ala Phe Val Val Val Leu 150 155 160 atg aga atc cat aag tcg aag ttc act ccg gca cag gca acc gca gca 3254 Met Arg Ile His Lys Ser Lys Phe Thr Pro Ala Gln Ala Thr Ala Ala 165 170 175 180 atg gtt gtg tct tat tac tgg cac ttc gtt gac gtg gtc tgg atc ggc 3302 Met Val Val Ser Tyr Tyr Trp His Phe Val Asp Val Val Trp Ile Gly 185 190 195 ctc ttc atc act att tac ttc att cag taggcagtaa ggaatcctca 3349 Leu Phe Ile Thr Ile Tyr Phe Ile Gln 200 205 acgttgttga ggttccctat gcccttcact tccacagtcg agattcaaag ggaaatgatg 3409 gaaaccaacc cgcagacccc agagggaaat agcatggcta aaccctctgc taagaaggtc 3469 aagaatcgcc gcaaggtccg gcgcaccgtc gcaggtgcat tggctctgac cattggactg 3529 agcggagcag gaatcctcgc aaccgcgatc actccagatg ctcaagttgc taccgctcag 3589 cgtgacgatc aggcacttat ctccgagggt aaagacctct acgatgtcgc ctgcatcacc 3649 tgccacggcg taaacctcca aggtgttgag gaccgcggtc cttccctcgt aggtgttggc 3709 gaaggcgcag tgtacttcca agttcactcc ggccgtatgc caatactgcg taacgaggct 3769 caggctgagc gcaaggctcc tcgttacacc gaggcacaga cccttgcgat cgctgcatat 3829 gttgcagcta atggcggtgg cccaggactc gtttacaacg aggacggcac cctcgccatg 3889 gaggagctcc gtggcgaaaa ctacgacgga cagattacct ccgccgacgt cgctcgcggc 3949 ggagatctgt tccgcctgaa ctgtgcatcc tgccacaact tcactggtcg tggtggcgca 4009 ctgtcctctg gtaagtacgc accaaacctg gatgctgcaa acgagcagga aatctaccag 4069 gctatgctta ccggtcctca gaacatgcct aagttctccg atc 4112 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Leu Ser Ser Gly Lys Tyr Ala Pro Asn 185 190 195 ctg gat gct gca aac gag cag gaa atc tac cag gct atg ctt acc ggt 917 Leu Asp Ala Ala Asn Glu Gln Glu Ile Tyr Gln Ala Met Leu Thr Gly 200 205 210 cct cag aac atg cct aag ttc tcc gat cgt cag ctc tcc gca gat gag 965 Pro Gln Asn Met Pro Lys Phe Ser Asp Arg Gln Leu Ser Ala Asp Glu 215 220 225 230 aag aag gac atc atc gcc ttc atc aag tcc acc aag gag act cca tca 1013 Lys Lys Asp Ile Ile Ala Phe Ile Lys Ser Thr Lys Glu Thr Pro Ser 235 240 245 cct ggt ggt tac tca ctc ggt agc ttg ggc cca gtg gct gag ggt ctg 1061 Pro Gly Gly Tyr Ser Leu Gly Ser Leu Gly Pro Val Ala Glu Gly Leu 250 255 260 ttc atg tgg gta ttc ggc atc ttg gtc ctc gtg gcc gcc gct atg tgg 1109 Phe Met Trp Val Phe Gly Ile Leu Val Leu Val Ala Ala Ala Met Trp 265 270 275 att gga tca cgt tca tgagtaacaa caacgacaag cagtacacaa cccaagaact 1164 Ile Gly Ser Arg Ser 280 caacgcg atg agc aat gag gat ctt gca cga ctt ggt aca gag ctg gac 1213 Met Ser Asn Glu Asp Leu Ala Arg Leu Gly Thr Glu Leu Asp 1 5 10 gac gtt acc att gca tac cgc aag gaa cgt ttc cca atc cct aat gac 1261 Asp Val Thr Ile Ala Tyr Arg Lys Glu Arg Phe Pro Ile Pro Asn Asp 15 20 25 30 cca gct gag aag cgc gct gca cgt tca gtt act ttc tgg cta gtc ctc 1309 Pro Ala Glu Lys Arg Ala Ala Arg Ser Val Thr Phe Trp Leu Val Leu 35 40 45 ggc atc att ggt gga ctt gga ttc ctg gct acc tac att ttc tgg cct 1357 Gly Ile Ile Gly Gly Leu Gly Phe Leu Ala Thr Tyr Ile Phe Trp Pro 50 55 60 tgg gag tac aag gca cac gga gat gaa ggt ctc ctg gcg tac acc ttg 1405 Trp Glu Tyr Lys Ala His Gly Asp Glu Gly Leu Leu Ala Tyr Thr Leu 65 70 75 tac acc cca atg ctg ggt att act tcc ggt ctt tgc atc ctg tcc ctg 1453 Tyr Thr Pro Met Leu Gly Ile Thr Ser Gly Leu Cys Ile Leu Ser Leu 80 85 90 gga ttt gca gtt gtc ctt tat gtc aag aag ttc att cca gag gaa atc 1501 Gly Phe Ala Val Val Leu Tyr Val Lys Lys Phe Ile Pro Glu Glu Ile 95 100 105 110 gca gta cag cgt cgc cac gac ggt cct tct gaa gaa gtt gac cgc cgc 1549 Ala Val Gln Arg Arg His Asp Gly Pro Ser Glu Glu Val Asp Arg Arg 115 120 125 acc atc gtt gca ctt ctc aat gac tct tgg cag acc tct act ctt ggt 1597 Thr Ile Val Ala Leu Leu Asn Asp Ser Trp Gln Thr Ser Thr Leu Gly 130 135 140 cgt cgc aag ctg atc atg gga ctt gca ggt ggc gga gca gta ctg gcc 1645 Arg Arg Lys Leu Ile Met Gly Leu Ala Gly Gly Gly Ala Val Leu Ala 145 150 155 ggc ctg acc atc atc gct cca atg ggc ggt atg atc aag aat cct tgg 1693 Gly Leu Thr Ile Ile Ala Pro Met Gly Gly Met Ile Lys Asn Pro Trp 160 165 170 aag cct aag gaa ggc cca atg gac gtt cag ggt gac ggc acc cta tgg 1741 Lys Pro Lys Glu Gly Pro Met Asp Val Gln Gly Asp Gly Thr Leu Trp 175 180 185 190 act tcc ggt tgg aca ctc att gag aac gac gtc aag gtt tac ctc ggc 1789 Thr Ser Gly Trp Thr Leu Ile Glu Asn Asp Val Lys Val Tyr Leu Gly 195 200 205 cgt gac act gca gca att gcg gag tca cac acc gat gca acc ggt gag 1837 Arg Asp Thr Ala Ala Ile Ala Glu Ser His Thr Asp Ala Thr Gly Glu 210 215 220 cac tgg tca acc act ggt gtt tcc cgc ctg gtt cgt atg cgc cca gaa 1885 His Trp Ser Thr Thr Gly Val Ser Arg Leu Val Arg Met Arg Pro Glu 225 230 235 gat ctg gca gca gca tcc atg gaa act gtc ttc cca ctt cca gct gaa 1933 Asp Leu Ala Ala Ala Ser Met Glu Thr Val Phe Pro Leu Pro Ala Glu 140 245 250 atg gtg aac gac ggt gct gaa tac gat cct gcg aag gac gtc tac gag 1981 Met Val Asn Asp Gly Ala Glu Tyr Asp Pro Ala Lys Asp Val Tyr Glu 255 260 265 270 cac caa atg cac tcg gtg cac ggc cca cgt aac gca gtt atg ttg atc 2029 His Gln Met His Ser Val His Gly Pro Arg Asn Ala Val Met Leu Ile 275 280 285 cgt ctc cgt acc gct gac gct gaa aag gtt atc gaa cgc gaa ggc cag 2077 Arg Leu Arg Thr Ala Asp Ala Glu Lys Val Ile Glu Arg Glu Gly Gln 290 295 300 gag tcc ttc cac tac ggt gac tac tac gct tac tcc aag att tgt aca 2125 Glu Ser Phe His Tyr Gly Asp Tyr Tyr Ala Tyr Ser Lys Ile Cys Thr 305 310 315 cac att ggt tgt cca acc tca ctg tac gag gct cag acc aac cgt att 2173 His Ile Gly Cys Pro Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Gln Thr Asn Arg Ile 320 325 330 ctg tgc cca tgt cac cag tcg cag ttt gac gca ttg cac tac gga aag 2221 Leu Cys Pro Cys His Gln Ser Gln Phe Asp Ala Leu His Tyr Gly Lys 335 340 345 350 cca gtc ttc gga cct gct gcc cgt gcg ctg cca cag ctg cca att acc 2269 Pro Val Phe Gly Pro Ala Ala Arg Ala Leu Pro Gln Leu Pro Ile Thr 355 360 365 gtt gat gaa gag ggc tac ctc atc gcc gct ggt aac ttc att gag cca 2317 Val Asp Glu Glu Gly Tyr Leu Ile Ala Ala Gly Asn Phe Ile Glu Pro 370 375 380 ctc ggc cct gca ttc tgg gag cgt aag tca tgagtctagc taccgtggga 2367 Leu Gly Pro Ala Phe Trp Glu Arg Lys Ser 385 390 aacaatcttg attcccgtta caccatggcg tcgggtatcc gtcgccagat caacaaggtc 2427 ttcccaactc actggtcctt catgctcggc gagattgcgc tttacagctt catcgtcttg 2487 ctgctgactg gtgtctacct gaccctgttc ttcgacccat caatcaccaa ggtcatttat 2547 gacggcggct acctcccact gaacggtgtg gagatgtccc gtgcatacgc aactgcgttg 2607 gatatttcct tcgaagttcg cggtggtctg ttcatccgcc agatgcacca ctgggcagcc 2667 ctgctgttcg ttgtatccat gctggttcac atgctccgta ttttcttcac cggtgcgttc 2727 cgtcgcccac gtgaagcaaa ctggatcatc ggtgttgttc tgatcatcct gggtatggct 2787 gaaggcttca tgggttactc cctgcctgat gacctgctct ctggtgttgg tcttcgaatc 2847 atgtccgcca tcatcgttgg tcttccgatc atcggtacct ggatgcactg gctgatcttc 2907 ggtggagact tcccatccga tctgatgctg gaccgcttct acatcgcaca cgttctaatc 2967 atcccagcta tcctgcttgg cttgatcgca gctcacctgg cacttgtttg gtaccagaag 3027 cacacccagt tcccaggcgc tggccgcact gagaacaacg tggtcggtat ccgaatcatg 3087 cctctgttcg cagttaaggc tgttgctttc ggcctcatcg tcttcggctt cctcgcactg 3147 cttgctggtg tcaccaccat taacgcaatt tggaatcttg gaccgtacaa cccttcacag 3207 gtgtctgctg gttcccagcc tgacgtttac atgctgtgga cagatggtgc tgctcgtgtc 3267 atgccggcat gggagctcta cctcggtaac tacaccatcc cagcagtctt ctgggttgct 3327 gtgatgctgg gtatcctcgt ggttctgctt gtgacttacc cattcattga gcgtaagttc 3387 actggcgacg atgcacacca caacttgctg cagcgtcctc gcgatgttcc agtccgcacc 3447 tcactcggtg tcatggcgct tgtcttctac atcctgctta ccgtttctgg tggtaacgat 3507 gtttacgcaa tgcagttcca tgtttcactg aacgcgatga cctggatcgg tcgtatcggc 3567 ctcatcgttg gaccagctat tgcatacttc atcacttacc gactgtgcat cggcttgcag 3627 cgctctgacc gcgaggtcct ggagcacggc atcgagaccg gtatcatcaa gcagatgcca 3687 aatggtgcct tcattgaagt tcaccagcca cttggcccag ttgatgacca tggtcaccca 3747 atcccactgc catacgctgg cgctgcggtt ccaaagcaga tgaaccagct tggttacgct 3807 gaggttgaaa cccgcggtgg attcttcgga cctgatccag aagacatccg tgcgaaggct 3867 aaggaaattg agcacgcaaa ccacattgag gaagcgaaca ctcttcgtgc actcaacgag 3927 gcaaacattg agcgtgacaa gaatgagggc aagaactagt ttctaggact tcatctctga 3987 aactccccgc tgtagggacc tgaatcgaaa ggtctccgca tcggggagtt tttctctatt 4047 cagacgaggc taaagataag ggagagggct ctttaacaca cgaggagtgg cgtagagcct 4107 gtagttgcct tatatgtagc ttgtggcggc gtgaagcaac gtgcaggcgc gtggaaagcg 4167 tagagttttc ttctccttat atataaggag tgttcttcgt cgtgagcatt acgccctagg 4227 tcgcctgggg tcggtgtcca acttcgctca aattccgctc aaaatccagc tcggtgtggc 4287 ttaagaattg ttgtcataac tccaaatctc aaagcataag ccgtcaatgg tgattaatgt 4347 cacatggtga gatcattgct gaaactggtg ccgatttttc ggctctgtga aaacgatttg 4407 actactggaa gtttcctgaa attgcaggtc atctagcttt ctcagggttc taggggagaa 4467 cccttagtgg ttggggtctg agtggaggac ttgcgtctcg gtcaaattaa tccgcgataa 4527 cggttcgata acgaccaatt ttttcgcttg ggctagacaa gtgttgttgc ggtttcgtaa 4587 ccttattgag acattgcggg acggacaccg aatttccgcc agcattacag aaacaaatag 4647 acgcttaatc gcaagcatag tttagagaaa ttcttt 4683 <210> 7 <211> 283 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 7 Met Ala Lys Pro Ser Ala Lys Lys Val Lys Asn Arg Arg Lys Val Arg 1 5 10 15 Arg Thr Val Ala Gly Ala Leu Ala Leu Thr Ile Gly Leu Ser Gly Ala 20 25 30 Gly Ile Leu Ala Thr Ala Ile Thr Pro Asp Ala Gln Val Ala Thr Ala 35 40 45 Gln Arg Asp Asp Gln Ala Leu Ile Ser Glu Gly Lys Asp Leu Tyr Ala 50 55 60 Val Ala Cys Ile Thr Cys His Gly Val Asn Leu Gln Gly Val Glu Asp 65 70 75 80 Arg Gly Pro Ser Leu Val Gly Val Gly Glu Gly Ala Val Tyr Phe Gln 85 90 95 Val His Ser Gly Arg Met Pro Met Leu Arg Asn Glu Ala Gln Ala Glu 100 105 110 Arg Lys Ala Pro Arg Tyr Thr Glu Ala Gln Thr Leu Ala Ile Ala Ala 115 120 125 Tyr Val Ala Ala Asn Gly Gly Gly Pro Gly Leu Val Tyr Asn Glu Asp 130 135 140 Gly Thr Leu Ala Met Glu Glu Leu Arg Gly Glu Asn Tyr Asp Gly Gln 145 150 155 160 Ile Thr Ser Ala Asp Val Ala Arg Gly Gly Asp Leu Phe Arg Leu Asn 165 170 175 Cys Ala Ser Cys His Asn Phe Thr Gly Arg Gly Gly Ala Leu Ser Ser 180 185 190 Gly Lys Tyr Ala Pro Asn Leu Asp Ala Ala Asn Glu Gln Glu Ile Tyr 195 200 205 Gln Ala Met Leu Thr Gly Pro Gln Asn Met Pro Lys Phe Ser Asp Arg 210 215 220 Gln Leu Ser Ala Asp Glu Lys Lys Asp Ile Ile Ala Phe Ile Lys Ser 225 230 235 240 Thr Lys Glu Thr Pro Ser Pro Gly Gly Tyr Ser Leu Gly Ser Leu Gly 245 250 255 Pro Val Ala Glu Gly Leu Phe Met Trp Val Phe Gly Ile Leu Val Leu 260 265 270 Val Ala Ala Ala Met Trp Ile Gly Ser Arg Ser 275 280 <210> 8 <211> 392 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 8 Met Ser Asn Glu Asp Leu Ala Arg Leu Gly Thr Glu Leu Asp Asp Val 1 5 10 15 Thr Ile Ala Tyr Arg Lys Glu Arg Phe Pro Ile Pro Asn Asp Pro Ala 20 25 30 Glu Lys Arg Ala Ala Arg Ser Val Thr Phe Trp Leu Val Leu Gly Ile 35 40 45 Ile Gly Gly Leu Gly Phe Leu Ala Thr Tyr Ile Phe Trp Pro Trp Glu 50 55 60 Tyr Lys Ala His Gly Asp Glu Gly Leu Leu Ala Tyr Thr Leu Tyr Thr 65 70 75 80 Pro Met Leu Gly Ile Thr Ser Gly Leu Cys Ile Leu Ser Leu Gly Phe 85 90 95 Ala Val Val Leu Tyr Val Lys Lys Phe Ile Pro Glu Glu Ile Ala Val 100 105 110 Gln Arg Arg His Asp Gly Pro Ser Glu Glu Val Asp Arg Arg Thr Ile 115 120 125 Val Ala Leu Leu Asn Asp Ser Trp Gln Thr Ser Thr Leu Gly Arg Arg 130 135 140 Lys Leu Ile Met Gly Leu Ala Gly Gly Gly Ala Val Leu Ala Gly Leu 145 150 155 160 Thr Ile Ile Ala Pro Met Gly Gly Met Ile Lys Asn Pro Trp Lys Pro 165 170 175 Lys Glu Gly Pro Met Asp Val Gln Gly Asp Gly Thr Leu Trp Thr Ser 180 185 190 Gly Trp Thr Leu Ile Glu Asn Asp Val Lys Val Tyr Leu Gly Arg Asp 195 200 205 Thr Ala Ala Ile Ala Glu Ser His Thr Asp Ala Thr Gly Glu His Trp 210 215 220 Ser Thr Thr Gly Val Ser Arg Leu Val Arg Met Arg Pro Glu Asp Leu 225 230 235 240 Ala Ala Ala Ser Met Glu Thr Val Phe Pro Leu Pro Ala Glu Met Val 245 250 255 Asn Asp Gly Ala Glu Tyr Asp Pro Ala Lys Asp Val Tyr Glu His Gln 260 265 270 Met His Ser Val His Gly Pro Arg Asn Ala Val Met Leu Ile Arg Leu 275 280 285 Arg Thr Ala Asp Ala Glu Lys Val Ile Glu Arg Glu Gly Gln Glu Ser 290 295 300 Phe His Tyr Gly Asp Tyr Tyr Ala Tyr Ser Lys Ile Cys Thr His Ile 305 310 315 320 Gly Cys Pro Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Gln Thr Asn Arg Ile Leu Cys 325 330 335 Pro Cys His Gln Ser Gln Phe Asp Ala Leu His Tyr Gly Lys Pro Val 340 345 350 Phe Gly Pro Ala Ala Arg Ala Leu Pro Gln Leu Pro Ile Thr Val Asp 355 360 365 Glu Glu Gly Tyr Leu Ile Ala Ala Gly Asn Phe Ile Glu Pro Leu Gly 370 375 380 Pro Ala Phe Trp Glu Arg Lys Ser 385 390 <210> 9 <211> 4683 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (2347)..(3963) <400> 9 cacgtgatcg cgggtgttat ggccttcgtt gtggttctta tgagaatcca taagtcgaag 60 ttcactccgg cacaggcaac cgcagcaatg gttgtgtctt attactggca cttcgttgac 120 gtggtctgga tcggcctctt catcactatt tacttcattc agtaggcagt aaggaatcct 180 caacgttgtt gaggttccct atgcccttca cttccacagt cgagattcaa agggaaatga 240 tggaaaccaa cccgcagacc ccagaggaaa atagcatggc taaaccctct gctaagaagg 300 tcaagaatcg ccgcaaggtc cggcgcaccg tcgcaggtgc attggctctg accattggac 360 tgagcggagc aggaatcctc gcaaccgcga tcactccaga tgctcaagtt gctaccgctc 420 agcgtgacga tcaggcactt atctccgagg gtaaagacct ctacgctgtc gcctgcatca 480 cctgtcacgg cgtaaacctc caaggtgttg aggaccgcgg tccttccctc gtaggtgttg 540 gcgaaggcgc agtgtacttc caagttcact ccggccgtat gccaatgctg cgtaacgagg 600 ctcaggctga gcgcaaggct cctcgttaca ccgaggcaca gacccttgcg atcgctgcat 660 atgttgcagc taatggcggt ggcccaggac tcgtttacaa cgaggacggc accctggcca 720 tggaggagct ccgtggcgaa aactacgacg gacagattac ctccgccgac gtcgctcgcg 780 gcggagatct gttccgcctg aactgtgcat cctgccacaa cttcactggt cgtggtggcg 840 cactgtcctc tggtaagtac gcaccaaacc tggatgctgc aaacgagcag gaaatctacc 900 aggctatgct taccggtcct cagaacatgc ctaagttctc cgatcgtcag ctctccgcag 960 atgagaagaa ggacatcatc gccttcatca agtccaccaa ggagactcca tcacctggtg 1020 gttactcact cggtagcttg ggcccagtgg ctgagggtct gttcatgtgg gtattcggca 1080 tcttggtcct cgtggccgcc gctatgtgga ttggatcacg ttcatgagta acaacaacga 1140 caagcagtac acaacccaag aactcaacgc gatgagcaat gaggatcttg cacgacttgg 1200 tacagagctg gacgacgtta ccattgcata ccgcaaggaa cgtttcccaa tccctaatga 1260 cccagctgag aagcgcgctg cacgttcagt tactttctgg ctagtcctcg gcatcattgg 1320 tggacttgga ttcctggcta cctacatttt ctggccttgg gagtacaagg cacacggaga 1380 tgaaggtctc ctggcgtaca ccttgtacac cccaatgctg ggtattactt ccggtctttg 1440 catcctgtcc ctgggatttg cagttgtcct ttatgtcaag aagttcattc cagaggaaat 1500 cgcagtacag cgtcgccacg acggtccttc tgaagaagtt gaccgccgca ccatcgttgc 1560 acttctcaat gactcttggc agacctctac tcttggtcgt cgcaagctga tcatgggact 1620 tgcaggtggc ggagcagtac tggccggcct gaccatcatc gctccaatgg gcggtatgat 1680 caagaatcct tggaagccta aggaaggccc aatggacgtt cagggtgacg gcaccctatg 1740 gacttccggt tggacactca ttgagaacga cgtcaaggtt tacctcggcc gtgacactgc 1800 agcaattgcg gagtcacaca ccgatgcaac cggtgagcac tggtcaacca ctggtgtttc 1860 ccgcctggtt cgtatgcgcc cagaagatct ggcagcagca tccatggaaa ctgtcttccc 1920 acttccagct gaaatggtga acgacggtgc tgaatacgat cctgcgaagg acgtctacga 1980 gcaccaaatg cactcggtgc acggcccacg taacgcagtt atgttgatcc gtctccgtac 2040 cgctgacgct gaaaaggtta tcgaacgcga aggccaggag tccttccact acggtgacta 2100 ctacgcttac tccaagattt gtacacacat tggttgtcca acctcactgt acgaggctca 2160 gaccaaccgt attctgtgcc catgtcacca gtcgcagttt gacgcattgc actacggaaa 2220 gccagtcttc ggacctgctg cccgtgcgct gccacagctg ccaattaccg ttgatgaaga 2280 gggctacctc atcgccgctg gtaacttcat tgagccactc ggccctgcat tctgggagcg 2340 taagtc atg agt cta gct acc gtg gga aac aat ctt gat tcc cgt tac 2388 Met Ser Leu Ala Thr Val Gly Asn Asn Leu Asp Ser Arg Tyr 1 5 10 acc atg gcg tcg ggt atc cgt cgc cag atc aac aag gtc ttc cca act 2436 Thr Met Ala Ser Gly Ile Arg Arg Gln Ile Asn Lys Val Phe Pro Thr 15 20 25 30 cac tgg tcc ttc atg ctc ggc gag att gcg ctt tac agc ttc atc gtc 2484 His Trp Ser Phe Met Leu Gly Glu Ile Ala Leu Tyr Ser Phe Ile Val 35 40 45 ttg ctg ctg act ggt gtc tac ctg acc ctg ttc ttc gac cca tca atc 2532 Leu Leu Leu Thr Gly Val Tyr Leu Thr Leu Phe Phe Asp Pro Ser Ile 50 55 60 acc aag gtc att tat gac ggc ggc tac ctc cca ctg aac ggt gtg gag 2580 Thr Lys Val Ile Tyr Asp Gly Gly Tyr Leu Pro Leu Asn Gly Val Glu 65 70 75 atg tcc cgt gca tac gca act gcg ttg gat att tcc ttc gaa gtt cgc 2628 Met Ser Arg Ala Tyr Ala Thr Ala Leu Asp Ile Ser Phe Glu Val Arg 80 85 90 ggt ggt ctg ttc atc cgc cag atg cac cac tgg gca gcc ctg ctg ttc 2676 Gly Gly Leu Phe Ile Arg Gln Met His His Trp Ala Ala Leu Leu Phe 95 100 105 110 gtt gta tcc atg ctg gtt cac atg ctc cgt att ttc ttc acc ggt gcg 2724 Val Val Ser Met Leu Val His Met Leu Arg Ile Phe Phe Thr Gly Ala 115 120 125 ttc cgt cgc cca cgt gaa gca aac tgg atc atc ggt gtt gtt ctg atc 2772 Phe Arg Arg Pro Arg Glu Ala Asn Trp Ile Ile Gly Val Val Leu Ile 130 135 140 atc ctg ggt atg gct gaa ggc ttc atg ggt tac tcc ctg cct gat gac 2820 Ile Leu Gly Met Ala Glu Gly Phe Met Gly Tyr Ser Leu Pro Asp Asp 145 150 155 ctg ctc tct ggt gtt ggt ctt cga atc atg tcc gcc atc atc gtt ggt 2868 Leu Leu Ser Gly Val Gly Leu Arg Ile Met Ser Ala Ile Ile Val Gly 160 165 170 ctt ccg atc atc ggt acc tgg atg cac tgg ctg atc ttc ggt gga gac 2916 Leu Pro Ile Ile Gly Thr Trp Met His Trp Leu Ile Phe Gly Gly Asp 175 180 185 190 ttc cca tcc gat ctg atg ctg gac cgc ttc tac atc gca cac gtt cta 2964 Phe Pro Ser Asp Leu Met Leu Asp Arg Phe Tyr Ile Ala His Val Leu 195 200 205 atc atc cca gct atc ctg ctt ggc ttg atc gca gct cac ctg gca ctt 3012 Ile Ile Pro Ala Ile Leu Leu Gly Leu Ile Ala Ala His Leu Ala Leu 210 215 220 gtt tgg tac cag aag cac acc cag ttc cca ggc gct ggc cgc act gag 3060 Val Trp Tyr Gln Lys His Thr Gln Phe Pro Gly Ala Gly Arg Thr Glu 225 230 235 aac aac gtg gtc ggt atc cga atc atg cct ctg ttc gca gtt aag gct 3108 Asn Asn Val Val Gly Ile Arg Ile Met Pro Leu Phe Ala Val Lys Ala 240 245 250 gtt gct ttc ggc ctc atc gtc ttc ggc ttc ctc gca ctg ctt gct ggt 3156 Val Ala Phe Gly Leu Ile Val Phe Gly Phe Leu Ala Leu Leu Ala Gly 255 260 265 270 gtc acc acc att aac gca att tgg aat ctt gga ccg tac aac cct tca 3204 Val Thr Thr Ile Asn Ala Ile Trp Asn Leu Gly Pro Tyr 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ataacggttc gataacgacc aattttttcg cttgggctag acaagtgttg 4573 ttgcggtttc gtaaccttat tgagacattg cgggacggac accgaatttc cgccagcatt 4633 acagaaacaa atagacgctt aatcgcaagc atagtttaga gaaattcttt 4683 <210> 10 <211> 539 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 10 Met Ser Leu Ala Thr Val Gly Asn Asn Leu Asp Ser Arg Tyr Thr Met 1 5 10 15 Ala Ser Gly Ile Arg Arg Gln Ile Asn Lys Val Phe Pro Thr His Trp 20 25 30 Ser Phe Met Leu Gly Glu Ile Ala Leu Tyr Ser Phe Ile Val Leu Leu 35 40 45 Leu Thr Gly Val Tyr Leu Thr Leu Phe Phe Asp Pro Ser Ile Thr Lys 50 55 60 Val Ile Tyr Asp Gly Gly Tyr Leu Pro Leu Asn Gly Val Glu Met Ser 65 70 75 80 Arg Ala Tyr Ala Thr Ala Leu Asp Ile Ser Phe Glu Val Arg Gly Gly 85 90 95 Leu Phe Ile Arg Gln Met His His Trp Ala Ala Leu Leu Phe Val Val 100 105 110 Ser Met Leu Val His Met Leu Arg Ile Phe Phe Thr Gly Ala Phe Arg 115 120 125 Arg Pro Arg Glu Ala Asn Trp Ile Ile Gly Val Val Leu Ile Ile Leu 130 135 140 Gly Met Ala Glu Gly Phe Met Gly Tyr Ser Leu Pro Asp Asp Leu Leu 145 150 155 160 Ser Gly Val Gly Leu Arg Ile Met Ser Ala Ile Ile Val Gly Leu Pro 165 170 175 Ile Ile Gly Thr Trp Met His Trp Leu Ile Phe Gly Gly Asp Phe Pro 180 185 190 Ser Asp Leu Met Leu Asp Arg Phe Tyr Ile Ala His Val Leu Ile Ile 195 200 205 Pro Ala Ile Leu Leu Gly Leu Ile Ala Ala His Leu Ala Leu Val Trp 210 215 220 Tyr Gln Lys His Thr Gln Phe Pro Gly Ala Gly Arg Thr Glu Asn Asn 225 230 235 240 Val Val Gly Ile Arg Ile Met Pro Leu Phe Ala Val Lys Ala Val Ala 245 250 255 Phe Gly Leu Ile Val Phe Gly Phe Leu Ala Leu Leu Ala Gly Val Thr 260 265 270 Thr Ile Asn Ala Ile Trp Asn Leu Gly Pro Tyr Asn Pro Ser Gln Val 275 280 285 Ser Ala Gly Ser Gln Pro Asp Val Tyr Met Leu Trp Thr Asp Gly Ala 290 295 300 Ala Arg Val Met Pro Ala Trp Glu Leu Tyr Leu Gly Asn Tyr Thr Ile 305 310 315 320 Pro Ala Val Phe Trp Val Ala Val Met Leu Gly Ile Leu Val Val Leu 325 330 335 Leu Val Thr Tyr Pro Phe Ile Glu Arg Lys Phe Thr Gly Asp Asp Ala 340 345 350 His His Asn Leu Leu Gln Arg Pro Arg Asp Val Pro Val Arg Thr Ser 355 360 365 Leu Gly Val Met Ala Leu Val Phe Tyr Ile Leu Leu Thr Val Ser Gly 370 375 380 Gly Asn Asp Val Tyr Ala Met Gln Phe His Val Ser Leu Asn Ala Met 385 390 395 400 Thr Trp Ile Gly Arg Ile Gly Leu Ile Val Gly Pro Ala Ile Ala Tyr 405 410 415 Phe Ile Thr Tyr Arg Leu Cys Ile Gly Leu Gln Arg Ser Asp Arg Glu 420 425 430 Val Leu Glu His Gly Ile Glu Thr Gly Ile Ile Lys Gln Met Pro Asn 435 440 445 Gly Ala Phe Ile Glu Val His Gln Pro Leu Gly Pro Val Asp Asp His 450 455 460 Gly His Pro Ile Pro Leu Pro Tyr Ala Gly Ala Ala Val Pro Lys Gln 465 470 475 480 Met Asn Gln Leu Gly Tyr Ala Glu Val Glu Thr Arg Gly Gly Phe Phe 485 490 495 Gly Pro Asp Pro Glu Asp Ile Arg Ala Lys Ala Lys Glu Ile Glu His 500 505 510 Ala Asn His Ile Glu Glu Ala Asn Thr Leu Arg Ala Leu Asn Glu Ala 515 520 525 Asn Ile Glu Arg Asp Lys Asn Glu Gly Lys Asn 530 535 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <220> <221> misc_feature <222> (8,14) <223> n=a or g or c or t <400> 11 tcatggtntg ggyncaycay 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> n=a or g or c or t <400> 12 ataacrtwrt graartgngc 20 <210> 13 <211> 21 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 13 Glu Val Ala Pro Pro Gly Gly Val Leu Gly Asp Phe Leu Arg Met Gly 1 5 10 15 Trp Pro Asp Gly Ile 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n=a or g or c or t <400> 14 ggygayttcy tbcgnatggg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n=a or g or c or t <400> 15 ggaccgcasa rytcngmrca 20 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> unsure <222> (1) <223> Xaa=unknown <400> 16 Gln Ala Glu Arg Lys Ala Pro Arg Ile Thr Glu Ala Gln Val Leu Ala 1 5 10 15 <210> 17 <211> 24 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 17 Leu Arg Gly Glu Asn Tyr Asp Gly Gln Ile Thr Ser Ala Asp Val Ala 1 5 10 15 Arg Gly Gly Asp Leu Phe Arg Leu 20
【図面の簡単な説明】
【図1】 シトクロムaa3の各サブユニットをコードす
る遺伝子の構造、及び同構造とクローンとの関係を示す
図。(A)はサブユニットIIをコードするctaC遺伝子と
サブユニットIIIをコードするctaE遺伝子を含むDNA
断片の構造を示す図。(B)はサブユニットIをコード
するctaDのを含むDNA断片の構造を示す図。
【図2】 シトクロムbc1複合体の各サブユニットをコ
ードする遺伝子(qcrC、qcrA、qcrB)の構造、及び同構
造とクローンとの関係を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) C12R 1:15) C12R 1:15) (C12N 9/04 (C12P 21/02 C C12R 1:15) C12R 1:15) (C12P 21/02 C12N 15/00 ZNAA C12R 1:15) C12R 1:15)

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 下記(A1)又は(A2)に示すポリペ
    プチド。 (A1)配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するポリ
    ペプチド。 (A2)配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1
    若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付
    加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号4に記
    載のアミノ酸配列を有するシトクロムaa3サブユニッ
    トII、及び配列番号5に記載のアミノ酸配列を有するシ
    トクロムaa3サブユニットIIIとともにシトクロムa
    a3を構成し得るポリペプチド。
  2. 【請求項2】 下記(B1)又は(B2)に示すポリペ
    プチド。 (B1)配列番号4に記載のアミノ酸配列を有するポリ
    ペプチド。 (B2)配列番号4に記載のアミノ酸配列において、1
    若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付
    加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号2に記
    載のアミノ酸配列を有するシトクロムaa3サブユニッ
    トI、及び配列番号5に記載のアミノ酸配列を有するシ
    トクロムaa3サブユニットIIIとともにシトクロムa
    a3を構成し得るポリペプチド。
  3. 【請求項3】 下記(C1)又は(C1)に示すポリペ
    プチド。 (C1)配列番号5に記載のアミノ酸配列を有するポリ
    ペプチド。 (C2)配列番号5に記載のアミノ酸配列において、1
    若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付
    加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号2に記
    載のアミノ酸配列を有するシトクロムaa3サブユニッ
    トI、及び配列番号4に記載のアミノ酸配列を有するシ
    トクロムaa3サブユニットIIとともにシトクロムaa
    3を構成し得るポリペプチド。
  4. 【請求項4】 請求項1、請求項2及び請求項3に記載
    のポリペプチドからなるシトクロムaa3。
  5. 【請求項5】 下記(D1)又は(D2)に示すポリペ
    プチド。 (D1)配列番号7に記載のアミノ酸配列を有するポリ
    ペプチド。 (D2)配列番号7に記載のアミノ酸配列において、1
    若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付
    加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号8に記
    載のアミノ酸配列を有するQcrA、及び配列番号10
    に記載のアミノ酸配列を有するQcrBとともにシトク
    ロムbc1複合体を構成し得るポリペプチド。
  6. 【請求項6】 下記(E1)又は(E2)に示すポリペ
    プチド。 (E1)配列番号8に記載のアミノ酸配列を有するポリ
    ペプチド。 (E2)配列番号8に記載のアミノ酸配列において、1
    若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付
    加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号7に記
    載のアミノ酸配列を有するQcrC、及び配列番号10
    に記載のアミノ酸配列を有するQcrBとともにシトク
    ロムbc1複合体を構成し得るポリペプチド。
  7. 【請求項7】 下記(F1)又は(F2)に示すポリペ
    プチド。 (F1)配列番号10に記載のアミノ酸配列を有するポ
    リペプチド。 (F2)配列番号10に記載のアミノ酸配列において、
    1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は
    付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号7に
    記載のアミノ酸配列を有するQcrC、及び配列番号8
    に記載のアミノ酸配列を有するQcrAとともにシトク
    ロムbc1複合体を構成し得るポリペプチド。
  8. 【請求項8】 請求項5、請求項6及び請求項7に記載
    のポリペプチドからなるシトクロムbc1複合体。
  9. 【請求項9】 下記(A1)又は(A2)に示すポリペ
    プチドをコードするDNA。 (A1)配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するポリ
    ペプチド。 (A2)配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1
    若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付
    加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号4に記
    載のアミノ酸配列を有するシトクロムaa3サブユニッ
    トII、及び配列番号5に記載のアミノ酸配列を有するシ
    トクロムaa3サブユニットIIIとともにシトクロムa
    a3を構成し得るポリペプチド。
  10. 【請求項10】 下記(B1)又は(B2)に示すポリ
    ペプチドをコードするDNA。 (B1)配列番号4に記載のアミノ酸配列を有するポリ
    ペプチド。 (B2)配列番号4に記載のアミノ酸配列において、1
    若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付
    加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号2に記
    載のアミノ酸配列を有するシトクロムaa3サブユニッ
    トI、及び配列番号5に記載のアミノ酸配列を有するシ
    トクロムaa3サブユニットIIIとともにシトクロムa
    a3を構成し得るポリペプチド。
  11. 【請求項11】 下記(C1)又は(C1)に示すポリ
    ペプチドをコードするDNA。 (C1)配列番号5に記載のアミノ酸配列を有するポリ
    ペプチド。 (C2)配列番号5に記載のアミノ酸配列において、1
    若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付
    加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号2に記
    載のアミノ酸配列を有するシトクロムaa3サブユニッ
    トI、及び配列番号4に記載のアミノ酸配列を有するシ
    トクロムaa3サブユニットIIとともにシトクロムaa
    3を構成し得るポリペプチド。
  12. 【請求項12】 下記(D1)又は(D2)に示すポリ
    ペプチドをコードするDNA。 (D1)配列番号7に記載のアミノ酸配列を有するポリ
    ペプチド。 (D2)配列番号7に記載のアミノ酸配列において、1
    若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付
    加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号8に記
    載のアミノ酸配列を有するQcrA、及び配列番号10
    に記載のアミノ酸配列を有するQcrBとともにシトク
    ロムbc1複合体を構成し得るポリペプチド。
  13. 【請求項13】 下記(E1)又は(E2)に示すポリ
    ペプチドをコードするDNA。 (E1)配列番号8に記載のアミノ酸配列を有するポリ
    ペプチド。 (E2)配列番号8に記載のアミノ酸配列において、1
    若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付
    加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号7に記
    載のアミノ酸配列を有するQcrC、及び配列番号10
    に記載のアミノ酸配列を有するQcrBとともにシトク
    ロムbc1複合体を構成し得るポリペプチド。
  14. 【請求項14】 下記(F1)又は(F2)に示すポリ
    ペプチドをコードするDNA。 (F1)配列番号10に記載のアミノ酸配列を有するポ
    リペプチド。 (F2)配列番号10に記載のアミノ酸配列において、
    1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は
    付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号7に
    記載のアミノ酸配列を有するQcrC、及び配列番号8
    に記載のアミノ酸配列を有するQcrAとともにシトク
    ロムbc1複合体を構成し得るポリペプチド。
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