JP3775873B2 - フルクトシルアミンオキシダーゼを生産する実質上純粋な微生物 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はフルクトシルアミンオキシダーゼを発現する実質上純粋なＤＮＡ、フルクトシルアミンオキシダーゼを生産する実質上純粋な微生物及びフルクトシルアミンオキシダーゼの製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
血液中のグルコースは遊離のアミノ基（主にリジンのε−アミノ基）を持つ蛋白と結合し、シッフ塩基を形成してアルジミンとなる。この反応は可逆であり、生じた反応物は不安定であるが、それに続く不可逆性のアマドリ転移によって、安定したケトアミンとなる。このような糖化蛋白を総称してフルクトサミンと呼ぶ。フルクトサミンの６０から７０％はグリケイテッドアルブミンであると言われている。アルブミンの半減期が約２週間であることから、フルクトサミンは約２週間前の血糖値を反映すると言われている。
【０００３】
糖尿病患者における血液中のグルコース濃度は健常人と比較して高いことから、フルクトサミンの濃度も高くなることが知られている。血糖値は食事の影響を大きく受けることから、食事の影響を受けないフルクトサミンは、糖尿病患者の血糖コントロール指標として有用である。
フルクトサミンの定量法としては、アフィニティークロマトグラフィー法（Ｄａｉａｂｅｔｅｓ，第２９巻、１０４４−１０４７ページ、１９８０年）、ＨＰＬＣ法（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第１９巻、８１−８７ページ、１９８１年）、（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，第７１巻、３５６−３６０ページ、１９７６年）等があるが、いずれも操作が煩雑な上、精度に問題があった。
【０００４】
上記の方法に代わって、最近多く用いられているのがアルカリ溶液中でのフルクトサミンの還元能を利用してＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）を還元し、ホルマザン生成物の吸光度（５５０ｎｍ）を測定するものである。この方法は迅速であり、臨床検査に用いるために種々の分析機で自動化されている。しかし、試料中の夾雑物質の影響を受けることから特異性が疑問視されていた。そこで、簡便でかつ夾雑物質の影響を受けないフルクトサミンを測定する方法が望まれていた。
【０００５】
フルクトサミンを含むアマドリ化合物の定量法としてコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを用いた方法が報告されている（特開昭６１−２６８１７８号公報）。しかしこの方法はα−アミノ酸のアマドリ化合物に対しては作用するがε−アミノ酸に対しては作用しない（特開平３−１５５７８０号公報）。フルクトサミンは、タンパク質中のε−アミノ酸であるリジン残基に糖が結合したものである（Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、第２６号、９３−９８ページ、１９８４年）ことから、この方法はフルクトサミンの定量には使用できなかった。
【０００６】
フルクトサミンのようなε−アミノ酸のアマドリ化合物にも作用する酵素として、アスペルギウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属由来のフルクトシルアミンオキシダーゼ（特開平３−１５５７８０号公報）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、およびデバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属由来のケトアミンオキシダーゼ（特開平５−１９２１９３号公報）が知られている。しかし、いずれも培養に誘導物質としてフルクトシルグリシンやフルクトシルバリンなどのような合成基質を使用するにもかかわらず酵素生産能は非常に低い。加えて、真菌類は液体培養を行うと菌体が培地の半分もの体積になり、また細胞壁が非常に強固であることから、微量の酵素を精製することは非常に困難である。さらに、血液中に存在するような低濃度のフルクトサミンを測定するには多量の酵素が必要であり、本酵素を供給する方法として現実的なものではあり得なかった。
【０００７】
このような状況下、フルクトシルアミンオキシダーゼにおいてはε−アミノ酸に対する反応性や生産菌株の酵素生産性が非常に低いことから、ε−アミノ酸に対して反応性の高い酵素を効率よく生産し、容易に抽出・精製できる微生物の開発が望まれていた。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような実情のもとで、フルクトサミンの定量に有用なε−アミノ酸に反応性の高いフルクトシルアミンオキシダーゼを検索し、この酵素を効率よく生産する微生物を開発し、さらにこの微生物を用いて該酵素を量産する方法を提供することを目的としてなされたものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは前記目的を達成するために鋭意研究を重ね、自然界および公知の分離株についてフルクトシルアミンオキシダーゼを産出する株を探索した結果、特に真菌類に広く存在することがわかった。その中で特にフサリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）ＩＦＯ−９９７２のフルクトシルアミンオキシダーゼ生産能が高いことがわかった。
【００１０】
そこで、本菌株から該酵素を精製し、該酵素の部分的アミノ酸配列を決定した。そして、該酵素を生産する微生物由来の染色体ＤＮＡライブラリーの中から、該酵素をコードする遺伝子ＤＮＡを決定した部分的アミノ酸配列から設計・合成したＤＮＡプローブを用いてスクリーニングし、得られたＤＮＡ断片から該酵素をコードしない領域（５’および３’ノンコーディング領域並びにイントロン）を部位特異的変異法を用いて除去することで原核生物において遺伝子発現が可能でかつ容易に発現する構造に変換した後、この遺伝子を用いて発現ベクターを構築し、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に属する微生物に導入して形質転換微生物を作出し、これを特に培地中で低温にて培養することによって、該フルクトシルアミンオキシダーゼを効率よく量産することを見い出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、配列表１のアミノ酸配列の１から４４０で表されるアミノ酸配列を有するフルクトシルアミンオキシダーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡによって形質転換されたものであることを特徴とするフルクトシルアミンオキシダーゼを生産する実質上純粋な微生物、配列表１のアミノ酸配列の１から４４０で表されるアミノ酸配列を有するフルクトシルアミンオキシダーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有することを特徴とするフルクトシルアミンオキシダーゼを発現する実質上純粋なＤＮＡ、配列表１のアミノ酸配列の１から４４０で表されるアミノ酸配列を有するフルクトシルアミンオキシダーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡによって形質転換されたフルクトシルアミンオキシダーゼを生産する実質上純粋な微生物を培地に培養し、次いでその培養物からフルクトシルアミンオキシダーゼを採取することを特徴とするフルクトシルアミンオキシダーゼの製造法を提供するものである。
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において使用されるフルクトシルアミンオキシダーゼ生産菌は、フサリウム・オキシスポルムＩＦＯ−９９７２株であり、本菌の生産するフルクトシルアミンオキシダーゼの性状は以下の通りである。
・フルクトシルアミンオキシダーゼの活性測定法
・反応液組成
５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
０．０３％の４−アミノアンチピリン
０．０２％のフェノール
４．５ｕ／ｍｌのパーオキシダーゼ
１ｍＭのＺＦＬ（α−カルボベンズオキシ−ε−Ｄ−フルクトシル−Ｌ−リジン）
上記の反応液１ｍｌを小試験管に入れ、３７℃で５分間予備加温した後、適当に希釈した酵素液０．０２ｍｌを添加して撹拌し、反応を開始する。正確に１０分間反応の後に、０．５％のＳＤＳを２ｍｌ添加して反応を停止し、波長５００ｎｍの吸光度を測定する（Ａｓ）。また盲検として酵素液のかわりに蒸留水０．０２ｍｌを用いて同一の操作を行って吸光度を測定する（Ａｂ）。この酵素使用の吸光度（Ａｓ）と盲検の吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）より酵素活性を求める。別にあらかじめ過酸化水素の標準溶液を用いて吸光度と生成した過酸化水素量との関係を調べておく。３７℃、１分間に１μＭの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義し、計算式は下記の通りである。
酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝（Ａｓ−Ａｂ）×１．１６×酵素の希釈率
（１）基質特異性
ＺＦＬ １００％
Ｄ−フルクトシル−Ｌ−アラニン １０４％
ε−Ｄ−フルクトシル−Ｌ−リジン ８１％
Ｄ−フルクトシル−Ｌ−バリン １０％
（２）酵素作用
下記に示すように、少なくともα−アミノ酸、ε−アミノ酸のアマドリ化合物を分解して、グルコソンと過酸化水素および対応するα−アミノ酸、ε−アミノ酸を生成する反応を触媒する。
【００１３】
【化１】
【００１４】
（３）分子量
本酵素の分子量はＳｅｐｈａｄｅｘ・Ｇ−１００を用いたカラムゲル濾過法で、０．２ＭのＮａＣｌ含有０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を溶出液として測定した結果、４８，０００±２，０００、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは４７，０００±２，０００であった。
（４）等電点
キャリアアンフォライトを用いる焦点電気泳動法によって４℃、７００Ｖの定電圧で４０時間通電した後、分画し、各画分の酵素活性を測定した結果、ｐＨ４．３±０．２であった。
（５）Ｋｍ値
５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
０．０３％の４−アミノアンチピリン
０．０２％のフェノール
４．５ｕ／ｍｌのパーオキシダーゼ
を含む反応液中で合成基質ＺＦＬの濃度を変化させて、ＺＦＬに対するＫｍ値を測定した結果、０．１９４ｍＭの値を示した。
（６）至適ｐＨ
前記の酵素活性測定法に従い、反応液中の５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に代えて１００ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．４−５．４）、リン酸緩衝液（ｐＨ５．６−７．９）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．３−８．５）、およびグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０−１０．３）の各緩衝液を用いて測定した。この結果、ｐＨ７．５で最大の活性を示した。
（７）ｐＨ安定性
本酵素０．５Ｕを含有する０．５Ｍの至適ｐＨを測定するときに用いた各種緩衝液０．５ｍｌを４０℃、１０分間処理した後、その残存活性を後記の活性測定法に従って測定した。この結果、ｐＨ７．０−９．０の範囲で８０％以上の活性を保持していた。
（８）熱安定性
本酵素０．５Ｕを０．２Ｍのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で調製し、１０分間加熱処理後、その残存活性を活性測定法に従って測定した。この結果、４０℃までは残存活性として９５％以上を保持した。
（９）至適温度
４０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用い、活性測定法に従い、各温度で１０分間反応後、０．５％のラウリル硫酸ナトリウム（以下ＳＤＳと略称する）溶液２ｍｌで反応を停止し、波長５００ｎｍで吸光度を測定した。この結果、５０℃で最大の活性を示した。
【００１５】
【表１】
【００１６】
以上の本酵素の理化学的性質と公知の酵素の性質を（表１）に示し比較した。その結果、分子量においてはコリネバクテリウムｓｐ．由来酵素は８８，０００、アスペルギルスｓｐ．由来酵素は８３，０００、フザリウム・オキシスポルムＩＦＯ０５８８０由来酵素は１０６，０００であるのに対し、本発明の酵素の分子量は４８，０００であり明らかに違う分子量であった。至適温度においてコリネバクテリウムｓｐ．由来酵素は４０℃、アスペルギルスｓｐ．由来酵素は４０℃、フザリウム・オキシスポルムＳ−１Ｆ４由来酵素は４５℃、フザリウム・オキシスポルムＩＦＯ０５８８０由来酵素は３３℃であり、本発明の酵素の至適温度は５０℃であり、明らかに異なっていた。阻害剤においては本発明の酵素がマンガンイオンやニッケルイオンによって阻害されるの対してフザリウム・オキシスポルムＳ−１Ｆ４由来酵素やフザリウム・オキシスポルムＩＦＯ０５８８０由来酵素はマンガンイオンとニッケルイオン存在下に１００％残存活性を示す阻害を受けない性質を有するものであった。基質特異性においては本発明酵素はフルクトシルリジンとフルクトシルバリンに作用し、フルクトシルグリシンには作用しなかった。コリネバクテリウムｓｐ．由来酵素はフルクトシルリジンに作用しないことから、明らかに本発明酵素とは異なるもので、また血中のフルクトサミン（リジン残基のε位のアミノ基が糖化された蛋白）の測定には使用できない。フザリウム・オキシスポルムＳ−１Ｆ４由来酵素はフルクトシルバリンに作用しないことから明らかに本発明酵素とは異なるものであり、また血中のヘモグロビンＡ1C（ヘモグロビンＡ1Cは血糖コントロールマーカーで、Ｎ末のバリン残基が糖化されている。）の測定には使用できない。以上の諸性質における差異が認められ、本酵素は新規な性質のものと認められる。
【００１７】
また、上記に示した本発明の新規な性質を有するフルクトシルアミンオキシダーゼについて精製を行い、得られた電気泳動的に均一なフルクトシルアミンオキシダーゼを用い、Ｎ末端側アミノ酸配列、シアノゲンブロミドなどを用いて化学的に切断した各ペプチド断片、およびリシルエンドペプチダーゼやアスパラギニルエンドペプチダーゼなどプロテアーゼを用いて消化した各ペプチド断片についてアミノ酸配列を決定し、フルクトシルアミンオキシダーゼの部分的なアミノ酸配列を決定する。
【００１８】
次に、フルクトシルアミンオキシダーゼを発現する遺伝子ＤＮＡをクローニングし、遺伝子工学的に該酵素を発現する形質転換微生物を作出する訳であるが、用いられるフルクトシルアミンオキシダーゼを発現する遺伝子ＤＮＡは、例えば該酵素を生産する微生物由来の染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーの中から、スクリーニングすることによって得ることができる。
【００１９】
本発明においては、前記のフルクトシルアミンオキシダーゼを生産する微生物として、フサリウム・オキシスポルムＩＦＯ−９９７２が好ましく用いられる。このフサリウム・オキシスポルムＩＦＯ−９９７２から該酵素を発現する遺伝子ＤＮＡをスクリーニングする方法について説明する。まず、本菌の遺伝子ライブラリーを作製するにあたり、染色体ＤＮＡライブラリーを作製する場合、まず、該微生物の染色体ＤＮＡを通常用いられている方法によって抽出した後、適当な制限酵素で切断して、クローニング用ベクターに連結し、次いでこの組換えベクターを宿主微生物に導入して、１０4 〜１０5 個の形質転換宿主微生物のコロニーからなる染色体ＤＮＡライブラリーを作製する。
【００２０】
また、ｃＤＮＡライブラリーを作製する場合は、全ＲＮＡを通常用いられている方法に従って調製した後、例えばオリゴｄＴカラムを用いてｍＲＮＡを精製しても良いし、市販のキットを用いて直接ｍＲＮＡを調製しても良い。調製したｍＲＮＡに適当な制限酵素部位を有するリンカーやアダプターを付加した後適当なクローニング用ベクターに挿入し、上記と同様に宿主微生物に導入してｃＤＮＡライブラリーを作製する。この際用いられる宿主微生物としては、組換えＤＮＡが安定でかつ自律的に増殖可能であるものであれば特に制限されず、通常の遺伝子組換えに用いられているもの、例えばエシェリヒア属、バチルス属に属する微生物などが好ましく使用される。
【００２１】
宿主微生物に組換えＤＮＡを導入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下に組換えＤＮＡの導入を行ってもよいし、コンピテントセル法を用いてもよく、またバチルス属に属する微生物の場合には、コンピテントセル法またはプロトプラスト法などを用いることができるし、エレクトロポレーション法あるいはマイクロインジェクション法を用いてもよい。宿主微生物への所望組換えＤＮＡ導入の有無の選択については、組換えＤＮＡを構成するベクターの薬剤耐性マーカーや栄養要求性マーカーに基づく選択培地で、該宿主微生物を培養し、生育する宿主微生物を選択すればよい。
【００２２】
一方、フルクトシルアミンオキシダーゼ精製標品の部分的アミノ酸配列に基づいて種々のオリゴヌクレオチドを合成した後、例えばアイソトープで標識して標識オリゴヌクレオチドプローブを作製する。
次いで、これらの標識オリゴヌクレオチドプローブを用い、従来慣用されている方法に従って、前記の染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーの中から、フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子を含むものをスクリーニングする。
【００２３】
次に、この目的の遺伝子ＤＮＡを含む形質転換された宿主微生物から、例えばマニアティスらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８９年）などに従って、フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡを含む組換えベクターを調製することができる。
【００２４】
次に、以上のようにして得たフルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子を発現用ベクターに組み込んで、発現ベクターを構築する。この発現用ベクターとしては、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。前者のファージベクターとしては、例えばエシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、λｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢなどが用いられる。また、プラスミドベクターとしては、エシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合は、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＴＶ１１９Ｎ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋、ｐＴｒｃ９９Ａなどが用いられる。
【００２５】
さらに、バチルス属を宿主微生物とする場合は、例えばｐＨＹ３００ＰＬＫなどを用いればよく、サッカロミセス属を宿主微生物とする場合は、例えばｐＹＡＣ５などを用いればよい。また宿主微生物が原核生物である場合、フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子を組み込んだ際に効率よく働くプロモーターが上流に存在するような構造の発現用ベクターが適しており、エシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＴＶ１１９Ｎ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋、ｐＴｒｃ９９Ａなどがこれに合致する。さらに、バチルス属を宿主微生物とする場合は、ｐＨＹ３００ＰＬＫなどが合致する。
【００２６】
これらのベクターに、該フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡを組み込む方法については特に制限はなく、従来慣用されている方法を用いることができる。しかし、該酵素生産菌であるフサリウム・オキシスポルムＩＦＯ−９９７２は真核生物であることから、該酵素遺伝子内にイントロンを保持している可能性がある。イントロンが存在している場合、エシェリヒア・コリなどの原核生物を宿主として活性発現させるためにはこのイントロンを除去しなければならない。この場合は、部位特異的変異法を応用して、イントロンを除去した後に結合させたいエクソン（タンパクをコードしている遺伝子部分）両末端と同じ配列を有する合成ＤＮＡを用いてイントロンを除去すればよい。また、宿主微生物での遺伝子の発現効率を上昇させるために、部位特異変異法を用いて低頻度遺伝子コドンを高頻度コドンに変換する作業が有効である。例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリであれば、アルギニンをコードするエシェリヒア・コリでの低頻度遺伝子コドンＡＧＧを、同じくアルギニンをコードする高頻度コドンであるＣＧＧなどに変換する操作が一般的に行われる。また、フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子を発現用ベクターに組み込むに先だって、遺伝子の上流部と下流部に部位特異変異法やＰＣＲ法を用いて、適当な制限酵素認識部位を作成しておくことも一般的な手法である。そして、適当な制限酵素を用いて、前記のフルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡを含む組換えベクター及び発現用ベクターを処理し、それぞれフルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片及びベクター断片を得た後、それぞれの接着末端をアニーリング後、適当なＤＮＡリガーゼを用いて結合させることによって、発現ベクターが得られる。
【００２７】
後述の実施例における発現ベクターは、前記のフルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡを含む組換えプラスミドとして分離したｐＦＯＤ１とプラスミドベクターｐＴＶ１１９Ｎから得られ、ｐＦＯＤ７と命名されたものであり、その構成の模式図は図１に示すとおりである。
このようにして、構築された発現ベクターをエシェリヒア・コリに属する微生物に導入し、該宿主微生物を形質転換させればフルクトシルアミンオキシダーゼを生産する実質上純粋な微生物が得られる。発現ベクターの導入及び選択方法については前述した方法を用いて行う。
【００２８】
本発明においては、前記組換えプラスミドｐＦＯＤ７によって形質転換されたエシェリヒア・コリに属する微生物は、エシェリヒア・コリＤＨ１・ｐＦＯＤ７（微工研寄託、ＦＥＲＭ Ｐ−１５９４３）と命名される。
このようにして得られた形質転換微生物の培養は、該微生物の生育に必要な炭素源や窒素源などの栄養源や無機成分などを含む培地中において行うことができる。
【００２９】
該炭素源としては、例えばグルコース、デンプン、ショ糖、モラッセス、デキストリンなどが、窒素源としては、例えばペプトン、肉エキス、カゼイン加水分解物、コーンスチープリカー、硝酸塩、アンモニウム塩などが、無機成分としては、例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、亜鉛、マンガン、鉄などの陽イオンや塩素、硫酸、リン酸などの陰イオンを含む塩が挙げられる。
【００３０】
培養方法については特に制限はなく公知の方法、例えば通気撹拌培養、振盪培養、回転培養、静置培養などの方法によって行うことができるが、本発明に関しては、数々の検討を行った結果、エシェリヒア・コリの至適生育温度である３７℃よりも低い２８℃以下好ましくは２５℃で、１２時間から６０時間程度培養する方法が好ましく用いられる。
【００３１】
このようにして培養を行ったのち、遠心分離処理などの手段によって菌体を集め、次いで酵素処理、自己消化、フレンチプレス、超音波処理などによって細胞を破壊して目的とする酵素を含有する抽出液を得る。この抽出液から、該酵素を分離、精製するには、例えば、塩析、脱塩、イオン交換樹脂による吸脱着処理などを行ったのち、さらに吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過、電気泳動法などによって精製すればよけ、この精製酵素について適宜、ショ糖、グリセロール、アミノ酸等の安定化剤を０．１〜５％添加して凍結乾燥してもよい。
【００３２】
この精製標品について、フルクトシルアミンオキシダーゼの酵素活性及び物理化学的性質を調べることによって、該形質転換微生物がフルクトシルアミンオキシダーゼの産生能を有することが確認された。
したがって、本発明において用いたフルクトシルアミンオキシダーゼを発現する遺伝子ＤＮＡは、配列表１のアミノ酸配列の１から４４０で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、かつその塩基配列が配列表１の塩基配列の１から１３２０で表される塩基配列であることが明らかである。
【００３３】
このようにして得られたフルクトシルアミンオキシダーゼは、例えば血清中のフルクトサミン定量などの臨床用酵素として有用である。
なお、本発明明細書に記載の塩基配列の記号及びアミノ酸配列の記号は、当該分野における慣用略号に基づくもので、それらの例を以下に列記する。また、すべてのアミノ酸はＬ体を示すものとする。
【００３４】
ＤＮＡ：デオキシリボ核酸
Ａ：アデニン
Ｔ：チミン
Ｇ：グアニン
Ｃ：シトシン
Ｎ：アデニン、チミン、グアニンまたはシトシン
Ｒ：アデニンまたはグアニン
Ｙ：チミンまたはシトシン
Ａｌａ：アラニン
Ａｒｇ：アルギニン
Ａｓｎ：アスパラギン
Ａｓｐ：アスパラギン酸
Ｃｙｓ：システイン
Ｇｌｎ：グルタミン
Ｇｌｕ：グルタミン酸
Ｈｉｓ：ヒスチジン
Ｉｌｅ：イソロイシン
Ｌｅｕ：ロイシン
Ｌｙｓ：リジン
Ｍｅｔ：メチオニン
Ｐｈｅ：フェニルアラニン
Ｐｒｏ：プロリン
Ｓｅｒ：セリン
Ｔｈｒ：スレオニン
Ｔｒｐ：トリプトファン
Ｔｙｒ：チロシン
Ｖａｌ：バリン
【００３５】
【発明実施の形態】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、実施例中、常法に従い、と記述した操作は、例えばマニアティスらの方法（Ｔ．ｍａｎｉａｔｉｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８９年）や、市販の各種酵素、キット類に添付された手順に従えば実施できるものである。また、実験に使用した組換えＤＮＡ実験酵素試薬（制限酵素など）、プラスミドＤＮＡ、キット類は特に指摘しない限り宝酒造株式会社より購入したものである。
【００３６】
【実施例１】
＜染色体ＤＮＡの分離＞
フサリウム・オキシスポルムＩＦＯ−９９７２菌株を２％のグルコース（和光純薬社製）、２％の酵母エキス（極東製薬工業社製）から成り、ｐＨ５．５に調整した培地１００ｍｌにて２８℃で３日間振盪培養した後、この培養液を高速冷却遠心機（トミーＣＸ−２５０型）を用い、６５００ｒｐｍ（７６６０Ｇ）で１０分間遠心分離処理して、菌体を集菌した。
【００３７】
次いで、この菌体を５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）、１００ｍＭのエチレンジアミン４酢酸（以下ＥＤＴＡと略称する）（ｐＨ８．０）及び１５％のシュクロースからなる溶液２０ｍｌ中に懸濁し、最終濃度が２ｍｇ／ｍｌとなるようにノボザイム（ノボノルディスク社製）を加え、２５℃で３０分間処理して菌株の細胞壁を破壊した。
【００３８】
次に、これに１０の％のＳＤＳ（シグマ社製）水溶液１ｍｌを加えて、３７℃で２０分間処理した後、これに等量のフェノール：クロロホルム＝１：１混合液を加え、１００００ｒｐｍ（１２０８０Ｇ）で１０分間遠心分離処理して水相を回収した。この水相に２倍量のエタノールを静かに重層し、ガラス棒でゆっくり撹拌しながら、ＤＮＡをガラス棒にまきつかせて分離した後、１０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ８．０）及び１ｍＭのＥＤＴＡからなる溶液２０ｍｌで溶解し、次いでこれに等量のフェノール：クロロホルム＝１：１混合液を加え、前記と同様に処理して水相を分取した。
【００３９】
次に、この水相に２倍量のエタノールを加えて前記の方法でもう一度ＤＮＡを分離した後、１０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ８．０）及び１ｍＭのＥＤＴＡからなる溶液２ｍｌに溶解した。
【００４０】
【実施例２】
＜フサリウム・オキシスポルムＩＦＯ−９９７２遺伝子ライブラリーの作製＞
実施例１で得られたフサリウム・オキシスポルムＩＦＯ−９９７２染色体５μｇを３０単位の制限酵素ＢｇｌＩＩを用い、常法に従って３７℃で２時間切断処理した。また、５μｇのプラスミドベクターｐＵＣ１１９を３０単位の制限酵素ＢａｍＨＩを用い、常法に従って３７℃で２時間切断処理した。さらに５’末端を脱リン酸化するために、反応液に１単位のアルカリ性ホスファターゼを加えて６５℃で２時間処理した。
【００４１】
次に、前記のようにして得られた２種のＤＮＡ溶液を混合し、この混合液に等量のフェノール：クロロホルム＝１：１混合液を加えて処理した後、遠心分離処理によって水相を分取した。次いで、この水相に１／１０量の３Ｍの酢酸ナトリウム溶液を加え、さらに２倍量のエタノールを加えて遠心分離処理することによってＤＮＡを沈澱させた後、減圧乾燥した。
【００４２】
このＤＮＡを１００単位のＴ４ＤＮＡライゲースを用い、常法に従って１６℃で１６時間ライゲーションを行った。
次に、これを常法に従いコンピテント細胞としたエシェリヒア・コリＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）［Ｆ−、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ−１、ｈｓｄＲ１７（ｒｋ−、ｍｋ＋）、ＳｕｐＥ４４、ｒｅｌＡ１、λ−］（Ｔ．ｍａｎｉａｔｉｓ．，ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，５０４−５０６ページ、１９８２年）にトランスフォーメーションし、これをアンピシリン５０μｇ／ｍｌ含有３．７％のＢＨＩ寒天培地（ＤＩＦＣＯ社製）にて、３７℃で一昼夜培養し、約８０００株の形質転換微生物を得て、フサリウム・オキシスポルムＩＦＯ−９９７２遺伝子ライブラリーとした。
【００４３】
【実施例３】
＜放射性オリゴヌクレオチドプローブの作製＞
フルクトシルアミンオキシダーゼ精製標品のリシルエンドペプチダーゼ処理断片、及びアスパラギニルエンドペプチダーゼ処理断片のアミノ酸配列を調べたところ、配列表２から７のアミノ酸配列で表される６領域のアミノ酸配列が決定された。
【００４４】
この情報をもとに遺伝子の５’末端側から塩基配列を予想した。この予想された塩基配列には種々の組合せが考えられるので、組合せの数が少ない部分のオリゴヌクレオチドを設計した。すなわち、配列表２のアミノ酸配列の５９番目のＰｈｅから６５番目のＡｓｐをコードする２０塩基のＤＮＡ配列を予想し、６４通りの全ての塩基配列を有するＤＮＡが混在するオリゴヌクレオチドＦＯＤ１を設計し、外部機関（ＢＥＸ社）に合成依頼して作成した。ＦＯＤ１のＤＮＡ配列を配列表８に示した。
【００４５】
このようにして得られたオリゴヌクレオチド５０ｎｇを３７０キロベクレルの［γ−32Ｐ］ＡＴＰ（アマシャムジャパン社製）の存在下、８．５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用い、常法に従って３７℃で３０分間反応させて、放射性同位元素32Ｐを取り込ませ、放射性オリゴヌクレオチドプローブを作製した。
【００４６】
【実施例４】
＜フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子含有ＤＮＡのスクリーニング＞
実施例２で得たフサリウム・オキシスポルムＩＦＯ−９９７２遺伝子ライブラリー、すなわち平板寒天培地上のアンピシリン耐性コロニーの上に、ナイロンメンブレンフィルター（アマシャムジャパン社製、ハイボンド−Ｎ＋）を重ね、フィルター上に該コロニー菌体の一部を移行させた後、このフィルターをアルカリ変性溶液（１．５ＭのＮａＣｌ、０．５ＮのＮａＯＨ）中に５分間浸し、さらに中和溶液（０．５Ｍのトリス−塩酸（ｐＨ７．０）、３ＭのＮａＣｌ）に５分間浸漬後、乾燥させた。
【００４７】
次に、このフィルターを８０℃で２時間加熱し、菌体中にあったプラスミドＤＮＡをフィルターに固定した。さらに、このフィルターをプレハイブリダイゼーション溶液（１．８ＭのＮａＣｌ、０．１８Ｍのクエン酸ナトリウム、０．０５％の二リン酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、０．１％のフィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、０．１％のウシ胎児血清アルブミン（以下ＢＳＡと略称する）（シグマ社製）、０．０１％のサケ精子ＤＮＡ（ベーリンガー・マンハイム社製））に浸し、３７℃で一昼夜プレハイブリダイゼーションを行った。
【００４８】
その後、フィルターをハイブリダイゼーション溶液（１．８ＭのＮａＣｌ、０．１８Ｍのクエン酸ナトリウム、０．０５％の二リン酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、０．１％のフィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、０．１％のＢＳＡ、０．００２％のエシェリヒア・コリ由来トランスファーＲＮＡ（ベーリンガー・マンハイム社製））に浸した後、実施例３で得られた放射性オリゴヌクレオチドプローブを加え、３７℃で２４時間ハイブリダイゼーションを行った。
【００４９】
ハイブリダイゼーション後、洗浄液（１．８ＭのＮａＣｌ、０．１８Ｍのクエン酸ナトリウム、０．０５％の二リン酸ナトリウム）でフィルターを３回洗浄した後、４２℃の洗浄液に１０分間浸し、余分なプローブを洗い落とした。ついで、フィルターを風乾後、Ｘ線フィルム（富士写真フィルム社製、ＮｅｗＲＸＯ−Ｈ）に重ね、遮光下−８０℃で２４時間オートラジオグラフィーを行った。
【００５０】
その後、フィルムを現像したところ、ポジティブシグナルを示すコロニーを確認した。
該コロニーをフルクトシルアミンオキシダーゼをコードするＤＮＡを含む形質転換体エシェリヒア・コリＤＨ１・ｐＦＯＤ１と命名した。
【００５１】
【実施例５】
＜組み換えプラスミドの抽出＞
上記実施例４で取得したエシェリヒア・コリＤＨ１・ｐＦＯＤ１を、３．７％のＢＨＩ培地にて３７℃で一昼夜培養した後、常法に従ってフルクトシルアミンオキシダーゼをコードするＤＮＡを含む組み換えプラスミドｐＦＯＤ１を抽出した。該プラスミド中のフサリウム・オキシスポルムＩＦＯ−９９７２染色体由来の部位のＤＮＡ配列をジデオキシ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２１４巻、１２０５−１２１０ページ、１９８１年）により決定し、フルクトシルアミンオキシダーゼをコードする全ＤＮＡが含まれていることを確認すると共に、その全塩基配列を決定した。
【００５２】
また、今回解析したフルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子がコードするアミノ酸配列は、実施例３で決定したフルクトシルアミンオキシダーゼの６種の部分アミノ酸配列とも完全に一致した。さらに配列表１のＤＮＡ配列の７８番目のＴと７９番目のＣの間に、４８ｂｐのイントロンが存在することが判明した。
【００５３】
【実施例６】
＜エシェリヒア・コリ宿主フルクトシルアミンオキシダーゼ発現用プラスミドの作製＞
フルクトシルアミンオキシダーゼの遺伝子中のイントロンをクンケルの部位特異変異法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第８２巻、４８８ページ、１９８５年）により除去するために、ＤＮＡ変異用オリゴヌクレオチドプライマーＦＯＤ２を設計し、外部機関（ＢＥＸ社）に合成依頼して作成した。ＦＯＤ２のＤＮＡ配列を配列表９に示した。また、実施例５で得られたプラスミドｐＦＯＤ１を部位特異変異用実験キットＭｕｔａｎ−Ｋ（宝酒造社製）に添付されたエシェリヒア・コリＣＪ２３６株に常法に従って導入し、添付のマニュアルに従って１本鎖ＤＮＡ状のｐＦＯＤ１を調製した。この２μｇの一本鎖ＤＮＡ状のｐＦＯＤ１を鋳型ＤＮＡとし、１μｇのＦＯＤ２を変異用プライマーとして、Ｍｕｔａｎ−Ｋを用い、添付のマニュアルに従って部位特異変異を行い、イントロンを除いたＤＮＡ鎖を含有するプラスミドを合成した。
【００５４】
このプラスミドをＭｕｔａｎ−Ｋに添付のエシェリヒア・コリＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳ株に常法に従って導入し、組換え菌体数コロニーから組換えプラスミドを抽出し、１０単位の制限酵素ＳａｌＩで、添付のマニュアルに従って３７℃で２時間切断処理し、０．７％アガロースゲル電気泳動で分析し、新たにＳａｌＩ部位が導入されているプラスミドを確認、選択した。
【００５５】
この組換えプラスミドを再びエシェリヒア・コリＤＨ１株に形質転換し、組換えプラスミドを抽出し、ＳａｌＩ部位が導入されていることを確認した。以上により得たプラスミドをｐＦＯＤ２と命名した。
次にフルクトシルアミンオキシダーゼ構造遺伝子の上流と下流に制限酵素認識部位をクンケルの部位特異変異法により導入するために、オリゴヌクレオチドＦＯＤ３とＦＯＤ４を設計し、それぞれ外部機関（ＢＥＸ社）に合成依頼して作成した。ＦＯＤ３のＤＮＡ配列を配列表１０に、ＦＯＤ４のＤＮＡ配列を配列表１１に示した。また、プラスミドｐＦＯＤ２を部位特異変異用実験キットＭｕｔａｎ−Ｋに添付されたエシェリヒア・コリＣＪ２３６株に常法に従って導入し、添付のマニュアルに従って一本鎖ＤＮＡ状のｐＦＯＤ２を調製した。この２μｇの一本鎖ＤＮＡ状のｐＦＯＤ２を鋳型ＤＮＡとし、１μｇのＦＯＤ３と１μｇのＦＯＤ４を変異用プライマーとして、Ｍｕｔａｎ−Ｋを用い、添付のマニュアルに従って部位特異変異を行い、ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩの認識部位が追加されたＤＮＡ鎖を含有するプラスミドを合成した。
【００５６】
このプラスミドをＭｕｔａｎ−Ｋに添付のエシェリヒア・コリＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳ株に常法に従って導入し、組換え菌体数コロニーから組換えプラスミドを抽出し、１０単位の制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで、添付のマニュアルに従って３７℃で２時間切断処理し、０．７％アガロースゲル電気泳動で分析し、新たにＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩの認識部位が導入されているプラスミドを確認、選択した。以上により得たプラスミドをｐＦＯＤ３と命名した。
【００５７】
さらに５μｇのｐＦＯＤ３を用い、制限酵素ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩそれぞれ１０単位で添付のマニュアルに従って３７℃で２時間切断処理し、０．７％アガロースゲル電気泳動で約１．４ｋｂのＦＯＤ遺伝子を含むＤＮＡ断片を分離回収した。一方、５μｇのエシェリヒア・コリ宿主プラスミドベクターｐＴＶ１１９Ｎを前記と同様に切断し、５０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ８．０）存在下に、１単位のアルカリ性フォスファターゼを加え、６５℃で２時間処理した。
【００５８】
次いで、前記のＤＮＡ溶液を混合し、実施例２と同様にライゲーション、トランスフォーメーションを行い、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する３．７％のＢＨＩ寒天培地にまき、２５℃で一昼夜培養した。このようにして、プラスミドベクターｐＴＶ１１９ＮのＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位にフルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子を含む約１．４ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＦＯＤ７を保持する形質転換微生物を取得し、実施例３の方法で組換えプラスミドｐＦＯＤ７を得た。
【００５９】
【実施例７】
＜エシェリヒア・コリ内でのフルクトシルアミンオキシダーゼの活性発現＞
実施例６で作製したプラスミドｐＦＯＤ７を保持する形質転換微生物をアンピシリン５０μｇ／ｍｌ及び１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を含有する３．７％のＢＨＩ培地にて３７℃で一昼夜培養した後、培養液を１５０００ｒｐｍで１分間遠心分離処理して沈澱を回収した。この沈澱に、該培養液と同量の１０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ８．０）を加え、超音波破砕を行った。
【００６０】
この破砕液を適宜希釈した後、２０μｌとり、前記に示した酵素活性測定法にてフルクトシルアミンオキシダーゼ活性を定量した。なお、比較のためにｐＴＶ１１９Ｎのみをトランスフォーメーションしたエシェリヒア・コリＤＨ１の破砕液についても前記と同様の処理を行い、フルクトシルアミンオキシダーゼ活性を測定した。その結果、プラスミドｐＦＯＤ７を保持した形質転換微生物での活性は０．０８Ｕ／ｍｌであったが、ｐＴＶ１１９Ｎを持つものの活性は検出できなかった。これより、フルクトシルアミンオキシダーゼ活性をもつ形質転換体が得られていることが確認された。この形質転換体をエシェリヒア・コリＤＨ１・ｐＦＯＤ７（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ・ＤＨ１・ｐＦＯＤ７）（微工研寄託、ＦＥＲＭ Ｐ−１５９４３）と命名した。
【００６１】
このようにして得られたフルクトシルアミンオキシダーゼを単離・精製し、発現蛋白の理化学的性質を確認し、フサリウム・オキシスポルムＩＦＯ−９９７２のフルクトシルアミンオキシダーゼと同一であることを確認した。
【００６２】
【発明の効果】
本発明によるとフサリウム・オキシスポルムＩＦＯ−９９７２由来の染色体ＤＮＡライブラリーから、フルクトシルアミンオキシダーゼを発現する遺伝子ＤＮＡをスクリーニングし、これを用いて構築された発現ベクターを例えばエシェリヒア・コリに属する微生物に導入することによって、得られた形質転換微生物は効率よくフルクトシルアミンオキシダーゼを生産することができる。
【００６３】
また、本発明によって、初めてフルクトシルアミンオキシダーゼの全アミノ酸配列及びこのアミノ酸をコードする遺伝子ＤＮＡの塩基配列が決定できたので、該酵素の基質及び補酵素特異性の変換や耐熱性の向上などのプロテインエンジニアリングが可能となった。
【００６４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はプラスミドｐＦＯＤ７の構造を示す模式図である。
図中の「ｆｏｄ」はフルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子を、「ａｐ」はアンピシリン耐性遺伝子を、「ｌａｃ」はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子由来プロモーター配列を、「ｏｒｉ」はプラスミド複製起点を示す。また、「ＮｃｏＩ」、「ＨｉｎｄＩＩＩ」は制限酵素認識部位を、「ｐＴＶ１１９Ｎ」、「Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ＤＮＡ」はプラスミドの各領域の由来を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明はフルクトシルアミンオキシダーゼを発現する実質上純粋なＤＮＡ、フルクトシルアミンオキシダーゼを生産する実質上純粋な微生物及びフルクトシルアミンオキシダーゼの製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
血液中のグルコースは遊離のアミノ基（主にリジンのε−アミノ基）を持つ蛋白と結合し、シッフ塩基を形成してアルジミンとなる。この反応は可逆であり、生じた反応物は不安定であるが、それに続く不可逆性のアマドリ転移によって、安定したケトアミンとなる。このような糖化蛋白を総称してフルクトサミンと呼ぶ。フルクトサミンの６０から７０％はグリケイテッドアルブミンであると言われている。アルブミンの半減期が約２週間であることから、フルクトサミンは約２週間前の血糖値を反映すると言われている。
【０００３】
糖尿病患者における血液中のグルコース濃度は健常人と比較して高いことから、フルクトサミンの濃度も高くなることが知られている。血糖値は食事の影響を大きく受けることから、食事の影響を受けないフルクトサミンは、糖尿病患者の血糖コントロール指標として有用である。
フルクトサミンの定量法としては、アフィニティークロマトグラフィー法（Ｄａｉａｂｅｔｅｓ，第２９巻、１０４４−１０４７ページ、１９８０年）、ＨＰＬＣ法（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第１９巻、８１−８７ページ、１９８１年）、（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，第７１巻、３５６−３６０ページ、１９７６年）等があるが、いずれも操作が煩雑な上、精度に問題があった。
【０００４】
上記の方法に代わって、最近多く用いられているのがアルカリ溶液中でのフルクトサミンの還元能を利用してＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）を還元し、ホルマザン生成物の吸光度（５５０ｎｍ）を測定するものである。この方法は迅速であり、臨床検査に用いるために種々の分析機で自動化されている。しかし、試料中の夾雑物質の影響を受けることから特異性が疑問視されていた。そこで、簡便でかつ夾雑物質の影響を受けないフルクトサミンを測定する方法が望まれていた。
【０００５】
フルクトサミンを含むアマドリ化合物の定量法としてコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを用いた方法が報告されている（特開昭６１−２６８１７８号公報）。しかしこの方法はα−アミノ酸のアマドリ化合物に対しては作用するがε−アミノ酸に対しては作用しない（特開平３−１５５７８０号公報）。フルクトサミンは、タンパク質中のε−アミノ酸であるリジン残基に糖が結合したものである（Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、第２６号、９３−９８ページ、１９８４年）ことから、この方法はフルクトサミンの定量には使用できなかった。
【０００６】
フルクトサミンのようなε−アミノ酸のアマドリ化合物にも作用する酵素として、アスペルギウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属由来のフルクトシルアミンオキシダーゼ（特開平３−１５５７８０号公報）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、およびデバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属由来のケトアミンオキシダーゼ（特開平５−１９２１９３号公報）が知られている。しかし、いずれも培養に誘導物質としてフルクトシルグリシンやフルクトシルバリンなどのような合成基質を使用するにもかかわらず酵素生産能は非常に低い。加えて、真菌類は液体培養を行うと菌体が培地の半分もの体積になり、また細胞壁が非常に強固であることから、微量の酵素を精製することは非常に困難である。さらに、血液中に存在するような低濃度のフルクトサミンを測定するには多量の酵素が必要であり、本酵素を供給する方法として現実的なものではあり得なかった。
【０００７】
このような状況下、フルクトシルアミンオキシダーゼにおいてはε−アミノ酸に対する反応性や生産菌株の酵素生産性が非常に低いことから、ε−アミノ酸に対して反応性の高い酵素を効率よく生産し、容易に抽出・精製できる微生物の開発が望まれていた。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような実情のもとで、フルクトサミンの定量に有用なε−アミノ酸に反応性の高いフルクトシルアミンオキシダーゼを検索し、この酵素を効率よく生産する微生物を開発し、さらにこの微生物を用いて該酵素を量産する方法を提供することを目的としてなされたものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは前記目的を達成するために鋭意研究を重ね、自然界および公知の分離株についてフルクトシルアミンオキシダーゼを産出する株を探索した結果、特に真菌類に広く存在することがわかった。その中で特にフサリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）ＩＦＯ−９９７２のフルクトシルアミンオキシダーゼ生産能が高いことがわかった。
【００１０】
そこで、本菌株から該酵素を精製し、該酵素の部分的アミノ酸配列を決定した。そして、該酵素を生産する微生物由来の染色体ＤＮＡライブラリーの中から、該酵素をコードする遺伝子ＤＮＡを決定した部分的アミノ酸配列から設計・合成したＤＮＡプローブを用いてスクリーニングし、得られたＤＮＡ断片から該酵素をコードしない領域（５’および３’ノンコーディング領域並びにイントロン）を部位特異的変異法を用いて除去することで原核生物において遺伝子発現が可能でかつ容易に発現する構造に変換した後、この遺伝子を用いて発現ベクターを構築し、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に属する微生物に導入して形質転換微生物を作出し、これを特に培地中で低温にて培養することによって、該フルクトシルアミンオキシダーゼを効率よく量産することを見い出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、配列表１のアミノ酸配列の１から４４０で表されるアミノ酸配列を有するフルクトシルアミンオキシダーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡによって形質転換されたものであることを特徴とするフルクトシルアミンオキシダーゼを生産する実質上純粋な微生物、配列表１のアミノ酸配列の１から４４０で表されるアミノ酸配列を有するフルクトシルアミンオキシダーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有することを特徴とするフルクトシルアミンオキシダーゼを発現する実質上純粋なＤＮＡ、配列表１のアミノ酸配列の１から４４０で表されるアミノ酸配列を有するフルクトシルアミンオキシダーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡによって形質転換されたフルクトシルアミンオキシダーゼを生産する実質上純粋な微生物を培地に培養し、次いでその培養物からフルクトシルアミンオキシダーゼを採取することを特徴とするフルクトシルアミンオキシダーゼの製造法を提供するものである。
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において使用されるフルクトシルアミンオキシダーゼ生産菌は、フサリウム・オキシスポルムＩＦＯ−９９７２株であり、本菌の生産するフルクトシルアミンオキシダーゼの性状は以下の通りである。
・フルクトシルアミンオキシダーゼの活性測定法
・反応液組成
５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
０．０３％の４−アミノアンチピリン
０．０２％のフェノール
４．５ｕ／ｍｌのパーオキシダーゼ
１ｍＭのＺＦＬ（α−カルボベンズオキシ−ε−Ｄ−フルクトシル−Ｌ−リジン）
上記の反応液１ｍｌを小試験管に入れ、３７℃で５分間予備加温した後、適当に希釈した酵素液０．０２ｍｌを添加して撹拌し、反応を開始する。正確に１０分間反応の後に、０．５％のＳＤＳを２ｍｌ添加して反応を停止し、波長５００ｎｍの吸光度を測定する（Ａｓ）。また盲検として酵素液のかわりに蒸留水０．０２ｍｌを用いて同一の操作を行って吸光度を測定する（Ａｂ）。この酵素使用の吸光度（Ａｓ）と盲検の吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）より酵素活性を求める。別にあらかじめ過酸化水素の標準溶液を用いて吸光度と生成した過酸化水素量との関係を調べておく。３７℃、１分間に１μＭの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義し、計算式は下記の通りである。
酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝（Ａｓ−Ａｂ）×１．１６×酵素の希釈率
（１）基質特異性
ＺＦＬ １００％
Ｄ−フルクトシル−Ｌ−アラニン １０４％
ε−Ｄ−フルクトシル−Ｌ−リジン ８１％
Ｄ−フルクトシル−Ｌ−バリン １０％
（２）酵素作用
下記に示すように、少なくともα−アミノ酸、ε−アミノ酸のアマドリ化合物を分解して、グルコソンと過酸化水素および対応するα−アミノ酸、ε−アミノ酸を生成する反応を触媒する。
【００１３】
【化１】
（３）分子量
本酵素の分子量はＳｅｐｈａｄｅｘ・Ｇ−１００を用いたカラムゲル濾過法で、０．２ＭのＮａＣｌ含有０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を溶出液として測定した結果、４８，０００±２，０００、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは４７，０００±２，０００であった。
（４）等電点
キャリアアンフォライトを用いる焦点電気泳動法によって４℃、７００Ｖの定電圧で４０時間通電した後、分画し、各画分の酵素活性を測定した結果、ｐＨ４．３±０．２であった。
（５）Ｋｍ値
５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
０．０３％の４−アミノアンチピリン
０．０２％のフェノール
４．５ｕ／ｍｌのパーオキシダーゼ
を含む反応液中で合成基質ＺＦＬの濃度を変化させて、ＺＦＬに対するＫｍ値を測定した結果、０．１９４ｍＭの値を示した。
（６）至適ｐＨ
前記の酵素活性測定法に従い、反応液中の５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に代えて１００ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．４−５．４）、リン酸緩衝液（ｐＨ５．６−７．９）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．３−８．５）、およびグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０−１０．３）の各緩衝液を用いて測定した。この結果、ｐＨ７．５で最大の活性を示した。
（７）ｐＨ安定性
本酵素０．５Ｕを含有する０．５Ｍの至適ｐＨを測定するときに用いた各種緩衝液０．５ｍｌを４０℃、１０分間処理した後、その残存活性を後記の活性測定法に従って測定した。この結果、ｐＨ７．０−９．０の範囲で８０％以上の活性を保持していた。
（８）熱安定性
本酵素０．５Ｕを０．２Ｍのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で調製し、１０分間加熱処理後、その残存活性を活性測定法に従って測定した。この結果、４０℃までは残存活性として９５％以上を保持した。
（９）至適温度
４０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用い、活性測定法に従い、各温度で１０分間反応後、０．５％のラウリル硫酸ナトリウム（以下ＳＤＳと略称する）溶液２ｍｌで反応を停止し、波長５００ｎｍで吸光度を測定した。この結果、５０℃で最大の活性を示した。
【００１５】
【表１】
以上の本酵素の理化学的性質と公知の酵素の性質を（表１）に示し比較した。その結果、分子量においてはコリネバクテリウムｓｐ．由来酵素は８８，０００、アスペルギルスｓｐ．由来酵素は８３，０００、フザリウム・オキシスポルムＩＦＯ０５８８０由来酵素は１０６，０００であるのに対し、本発明の酵素の分子量は４８，０００であり明らかに違う分子量であった。至適温度においてコリネバクテリウムｓｐ．由来酵素は４０℃、アスペルギルスｓｐ．由来酵素は４０℃、フザリウム・オキシスポルムＳ−１Ｆ４由来酵素は４５℃、フザリウム・オキシスポルムＩＦＯ０５８８０由来酵素は３３℃であり、本発明の酵素の至適温度は５０℃であり、明らかに異なっていた。阻害剤においては本発明の酵素がマンガンイオンやニッケルイオンによって阻害されるの対してフザリウム・オキシスポルムＳ−１Ｆ４由来酵素やフザリウム・オキシスポルムＩＦＯ０５８８０由来酵素はマンガンイオンとニッケルイオン存在下に１００％残存活性を示す阻害を受けない性質を有するものであった。基質特異性においては本発明酵素はフルクトシルリジンとフルクトシルバリンに作用し、フルクトシルグリシンには作用しなかった。コリネバクテリウムｓｐ．由来酵素はフルクトシルリジンに作用しないことから、明らかに本発明酵素とは異なるもので、また血中のフルクトサミン（リジン残基のε位のアミノ基が糖化された蛋白）の測定には使用できない。フザリウム・オキシスポルムＳ−１Ｆ４由来酵素はフルクトシルバリンに作用しないことから明らかに本発明酵素とは異なるものであり、また血中のヘモグロビンＡ1C（ヘモグロビンＡ1Cは血糖コントロールマーカーで、Ｎ末のバリン残基が糖化されている。）の測定には使用できない。以上の諸性質における差異が認められ、本酵素は新規な性質のものと認められる。
【００１７】
また、上記に示した本発明の新規な性質を有するフルクトシルアミンオキシダーゼについて精製を行い、得られた電気泳動的に均一なフルクトシルアミンオキシダーゼを用い、Ｎ末端側アミノ酸配列、シアノゲンブロミドなどを用いて化学的に切断した各ペプチド断片、およびリシルエンドペプチダーゼやアスパラギニルエンドペプチダーゼなどプロテアーゼを用いて消化した各ペプチド断片についてアミノ酸配列を決定し、フルクトシルアミンオキシダーゼの部分的なアミノ酸配列を決定する。
【００１８】
次に、フルクトシルアミンオキシダーゼを発現する遺伝子ＤＮＡをクローニングし、遺伝子工学的に該酵素を発現する形質転換微生物を作出する訳であるが、用いられるフルクトシルアミンオキシダーゼを発現する遺伝子ＤＮＡは、例えば該酵素を生産する微生物由来の染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーの中から、スクリーニングすることによって得ることができる。
【００１９】
本発明においては、前記のフルクトシルアミンオキシダーゼを生産する微生物として、フサリウム・オキシスポルムＩＦＯ−９９７２が好ましく用いられる。このフサリウム・オキシスポルムＩＦＯ−９９７２から該酵素を発現する遺伝子ＤＮＡをスクリーニングする方法について説明する。まず、本菌の遺伝子ライブラリーを作製するにあたり、染色体ＤＮＡライブラリーを作製する場合、まず、該微生物の染色体ＤＮＡを通常用いられている方法によって抽出した後、適当な制限酵素で切断して、クローニング用ベクターに連結し、次いでこの組換えベクターを宿主微生物に導入して、１０4 〜１０5 個の形質転換宿主微生物のコロニーからなる染色体ＤＮＡライブラリーを作製する。
【００２０】
また、ｃＤＮＡライブラリーを作製する場合は、全ＲＮＡを通常用いられている方法に従って調製した後、例えばオリゴｄＴカラムを用いてｍＲＮＡを精製しても良いし、市販のキットを用いて直接ｍＲＮＡを調製しても良い。調製したｍＲＮＡに適当な制限酵素部位を有するリンカーやアダプターを付加した後適当なクローニング用ベクターに挿入し、上記と同様に宿主微生物に導入してｃＤＮＡライブラリーを作製する。この際用いられる宿主微生物としては、組換えＤＮＡが安定でかつ自律的に増殖可能であるものであれば特に制限されず、通常の遺伝子組換えに用いられているもの、例えばエシェリヒア属、バチルス属に属する微生物などが好ましく使用される。
【００２１】
宿主微生物に組換えＤＮＡを導入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下に組換えＤＮＡの導入を行ってもよいし、コンピテントセル法を用いてもよく、またバチルス属に属する微生物の場合には、コンピテントセル法またはプロトプラスト法などを用いることができるし、エレクトロポレーション法あるいはマイクロインジェクション法を用いてもよい。宿主微生物への所望組換えＤＮＡ導入の有無の選択については、組換えＤＮＡを構成するベクターの薬剤耐性マーカーや栄養要求性マーカーに基づく選択培地で、該宿主微生物を培養し、生育する宿主微生物を選択すればよい。
【００２２】
一方、フルクトシルアミンオキシダーゼ精製標品の部分的アミノ酸配列に基づいて種々のオリゴヌクレオチドを合成した後、例えばアイソトープで標識して標識オリゴヌクレオチドプローブを作製する。
次いで、これらの標識オリゴヌクレオチドプローブを用い、従来慣用されている方法に従って、前記の染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーの中から、フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子を含むものをスクリーニングする。
【００２３】
次に、この目的の遺伝子ＤＮＡを含む形質転換された宿主微生物から、例えばマニアティスらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８９年）などに従って、フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡを含む組換えベクターを調製することができる。
【００２４】
次に、以上のようにして得たフルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子を発現用ベクターに組み込んで、発現ベクターを構築する。この発現用ベクターとしては、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。前者のファージベクターとしては、例えばエシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、λｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢなどが用いられる。また、プラスミドベクターとしては、エシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合は、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＴＶ１１９Ｎ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋、ｐＴｒｃ９９Ａなどが用いられる。
【００２５】
さらに、バチルス属を宿主微生物とする場合は、例えばｐＨＹ３００ＰＬＫなどを用いればよく、サッカロミセス属を宿主微生物とする場合は、例えばｐＹＡＣ５などを用いればよい。また宿主微生物が原核生物である場合、フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子を組み込んだ際に効率よく働くプロモーターが上流に存在するような構造の発現用ベクターが適しており、エシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＴＶ１１９Ｎ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋、ｐＴｒｃ９９Ａなどがこれに合致する。さらに、バチルス属を宿主微生物とする場合は、ｐＨＹ３００ＰＬＫなどが合致する。
【００２６】
これらのベクターに、該フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡを組み込む方法については特に制限はなく、従来慣用されている方法を用いることができる。しかし、該酵素生産菌であるフサリウム・オキシスポルムＩＦＯ−９９７２は真核生物であることから、該酵素遺伝子内にイントロンを保持している可能性がある。イントロンが存在している場合、エシェリヒア・コリなどの原核生物を宿主として活性発現させるためにはこのイントロンを除去しなければならない。この場合は、部位特異的変異法を応用して、イントロンを除去した後に結合させたいエクソン（タンパクをコードしている遺伝子部分）両末端と同じ配列を有する合成ＤＮＡを用いてイントロンを除去すればよい。また、宿主微生物での遺伝子の発現効率を上昇させるために、部位特異変異法を用いて低頻度遺伝子コドンを高頻度コドンに変換する作業が有効である。例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリであれば、アルギニンをコードするエシェリヒア・コリでの低頻度遺伝子コドンＡＧＧを、同じくアルギニンをコードする高頻度コドンであるＣＧＧなどに変換する操作が一般的に行われる。また、フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子を発現用ベクターに組み込むに先だって、遺伝子の上流部と下流部に部位特異変異法やＰＣＲ法を用いて、適当な制限酵素認識部位を作成しておくことも一般的な手法である。そして、適当な制限酵素を用いて、前記のフルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡを含む組換えベクター及び発現用ベクターを処理し、それぞれフルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片及びベクター断片を得た後、それぞれの接着末端をアニーリング後、適当なＤＮＡリガーゼを用いて結合させることによって、発現ベクターが得られる。
【００２７】
後述の実施例における発現ベクターは、前記のフルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡを含む組換えプラスミドとして分離したｐＦＯＤ１とプラスミドベクターｐＴＶ１１９Ｎから得られ、ｐＦＯＤ７と命名されたものであり、その構成の模式図は図１に示すとおりである。
このようにして、構築された発現ベクターをエシェリヒア・コリに属する微生物に導入し、該宿主微生物を形質転換させればフルクトシルアミンオキシダーゼを生産する実質上純粋な微生物が得られる。発現ベクターの導入及び選択方法については前述した方法を用いて行う。
【００２８】
本発明においては、前記組換えプラスミドｐＦＯＤ７によって形質転換されたエシェリヒア・コリに属する微生物は、エシェリヒア・コリＤＨ１・ｐＦＯＤ７（微工研寄託、ＦＥＲＭ Ｐ−１５９４３）と命名される。
このようにして得られた形質転換微生物の培養は、該微生物の生育に必要な炭素源や窒素源などの栄養源や無機成分などを含む培地中において行うことができる。
【００２９】
該炭素源としては、例えばグルコース、デンプン、ショ糖、モラッセス、デキストリンなどが、窒素源としては、例えばペプトン、肉エキス、カゼイン加水分解物、コーンスチープリカー、硝酸塩、アンモニウム塩などが、無機成分としては、例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、亜鉛、マンガン、鉄などの陽イオンや塩素、硫酸、リン酸などの陰イオンを含む塩が挙げられる。
【００３０】
培養方法については特に制限はなく公知の方法、例えば通気撹拌培養、振盪培養、回転培養、静置培養などの方法によって行うことができるが、本発明に関しては、数々の検討を行った結果、エシェリヒア・コリの至適生育温度である３７℃よりも低い２８℃以下好ましくは２５℃で、１２時間から６０時間程度培養する方法が好ましく用いられる。
【００３１】
このようにして培養を行ったのち、遠心分離処理などの手段によって菌体を集め、次いで酵素処理、自己消化、フレンチプレス、超音波処理などによって細胞を破壊して目的とする酵素を含有する抽出液を得る。この抽出液から、該酵素を分離、精製するには、例えば、塩析、脱塩、イオン交換樹脂による吸脱着処理などを行ったのち、さらに吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過、電気泳動法などによって精製すればよけ、この精製酵素について適宜、ショ糖、グリセロール、アミノ酸等の安定化剤を０．１〜５％添加して凍結乾燥してもよい。
【００３２】
この精製標品について、フルクトシルアミンオキシダーゼの酵素活性及び物理化学的性質を調べることによって、該形質転換微生物がフルクトシルアミンオキシダーゼの産生能を有することが確認された。
したがって、本発明において用いたフルクトシルアミンオキシダーゼを発現する遺伝子ＤＮＡは、配列表１のアミノ酸配列の１から４４０で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、かつその塩基配列が配列表１の塩基配列の１から１３２０で表される塩基配列であることが明らかである。
【００３３】
このようにして得られたフルクトシルアミンオキシダーゼは、例えば血清中のフルクトサミン定量などの臨床用酵素として有用である。
なお、本発明明細書に記載の塩基配列の記号及びアミノ酸配列の記号は、当該分野における慣用略号に基づくもので、それらの例を以下に列記する。また、すべてのアミノ酸はＬ体を示すものとする。
【００３４】
ＤＮＡ：デオキシリボ核酸
Ａ：アデニン
Ｔ：チミン
Ｇ：グアニン
Ｃ：シトシン
Ｎ：アデニン、チミン、グアニンまたはシトシン
Ｒ：アデニンまたはグアニン
Ｙ：チミンまたはシトシン
Ａｌａ：アラニン
Ａｒｇ：アルギニン
Ａｓｎ：アスパラギン
Ａｓｐ：アスパラギン酸
Ｃｙｓ：システイン
Ｇｌｎ：グルタミン
Ｇｌｕ：グルタミン酸
Ｈｉｓ：ヒスチジン
Ｉｌｅ：イソロイシン
Ｌｅｕ：ロイシン
Ｌｙｓ：リジン
Ｍｅｔ：メチオニン
Ｐｈｅ：フェニルアラニン
Ｐｒｏ：プロリン
Ｓｅｒ：セリン
Ｔｈｒ：スレオニン
Ｔｒｐ：トリプトファン
Ｔｙｒ：チロシン
Ｖａｌ：バリン
【００３５】
【発明実施の形態】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、実施例中、常法に従い、と記述した操作は、例えばマニアティスらの方法（Ｔ．ｍａｎｉａｔｉｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８９年）や、市販の各種酵素、キット類に添付された手順に従えば実施できるものである。また、実験に使用した組換えＤＮＡ実験酵素試薬（制限酵素など）、プラスミドＤＮＡ、キット類は特に指摘しない限り宝酒造株式会社より購入したものである。
【００３６】
【実施例１】
＜染色体ＤＮＡの分離＞
フサリウム・オキシスポルムＩＦＯ−９９７２菌株を２％のグルコース（和光純薬社製）、２％の酵母エキス（極東製薬工業社製）から成り、ｐＨ５．５に調整した培地１００ｍｌにて２８℃で３日間振盪培養した後、この培養液を高速冷却遠心機（トミーＣＸ−２５０型）を用い、６５００ｒｐｍ（７６６０Ｇ）で１０分間遠心分離処理して、菌体を集菌した。
【００３７】
次いで、この菌体を５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）、１００ｍＭのエチレンジアミン４酢酸（以下ＥＤＴＡと略称する）（ｐＨ８．０）及び１５％のシュクロースからなる溶液２０ｍｌ中に懸濁し、最終濃度が２ｍｇ／ｍｌとなるようにノボザイム（ノボノルディスク社製）を加え、２５℃で３０分間処理して菌株の細胞壁を破壊した。
【００３８】
次に、これに１０の％のＳＤＳ（シグマ社製）水溶液１ｍｌを加えて、３７℃で２０分間処理した後、これに等量のフェノール：クロロホルム＝１：１混合液を加え、１００００ｒｐｍ（１２０８０Ｇ）で１０分間遠心分離処理して水相を回収した。この水相に２倍量のエタノールを静かに重層し、ガラス棒でゆっくり撹拌しながら、ＤＮＡをガラス棒にまきつかせて分離した後、１０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ８．０）及び１ｍＭのＥＤＴＡからなる溶液２０ｍｌで溶解し、次いでこれに等量のフェノール：クロロホルム＝１：１混合液を加え、前記と同様に処理して水相を分取した。
【００３９】
次に、この水相に２倍量のエタノールを加えて前記の方法でもう一度ＤＮＡを分離した後、１０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ８．０）及び１ｍＭのＥＤＴＡからなる溶液２ｍｌに溶解した。
【００４０】
【実施例２】
＜フサリウム・オキシスポルムＩＦＯ−９９７２遺伝子ライブラリーの作製＞
実施例１で得られたフサリウム・オキシスポルムＩＦＯ−９９７２染色体５μｇを３０単位の制限酵素ＢｇｌＩＩを用い、常法に従って３７℃で２時間切断処理した。また、５μｇのプラスミドベクターｐＵＣ１１９を３０単位の制限酵素ＢａｍＨＩを用い、常法に従って３７℃で２時間切断処理した。さらに５’末端を脱リン酸化するために、反応液に１単位のアルカリ性ホスファターゼを加えて６５℃で２時間処理した。
【００４１】
次に、前記のようにして得られた２種のＤＮＡ溶液を混合し、この混合液に等量のフェノール：クロロホルム＝１：１混合液を加えて処理した後、遠心分離処理によって水相を分取した。次いで、この水相に１／１０量の３Ｍの酢酸ナトリウム溶液を加え、さらに２倍量のエタノールを加えて遠心分離処理することによってＤＮＡを沈澱させた後、減圧乾燥した。
【００４２】
このＤＮＡを１００単位のＴ４ＤＮＡライゲースを用い、常法に従って１６℃で１６時間ライゲーションを行った。
次に、これを常法に従いコンピテント細胞としたエシェリヒア・コリＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）［Ｆ−、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ−１、ｈｓｄＲ１７（ｒｋ−、ｍｋ＋）、ＳｕｐＥ４４、ｒｅｌＡ１、λ−］（Ｔ．ｍａｎｉａｔｉｓ．，ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，５０４−５０６ページ、１９８２年）にトランスフォーメーションし、これをアンピシリン５０μｇ／ｍｌ含有３．７％のＢＨＩ寒天培地（ＤＩＦＣＯ社製）にて、３７℃で一昼夜培養し、約８０００株の形質転換微生物を得て、フサリウム・オキシスポルムＩＦＯ−９９７２遺伝子ライブラリーとした。
【００４３】
【実施例３】
＜放射性オリゴヌクレオチドプローブの作製＞
フルクトシルアミンオキシダーゼ精製標品のリシルエンドペプチダーゼ処理断片、及びアスパラギニルエンドペプチダーゼ処理断片のアミノ酸配列を調べたところ、配列表２から７のアミノ酸配列で表される６領域のアミノ酸配列が決定された。
【００４４】
この情報をもとに遺伝子の５’末端側から塩基配列を予想した。この予想された塩基配列には種々の組合せが考えられるので、組合せの数が少ない部分のオリゴヌクレオチドを設計した。すなわち、配列表２のアミノ酸配列の５９番目のＰｈｅから６５番目のＡｓｐをコードする２０塩基のＤＮＡ配列を予想し、６４通りの全ての塩基配列を有するＤＮＡが混在するオリゴヌクレオチドＦＯＤ１を設計し、外部機関（ＢＥＸ社）に合成依頼して作成した。ＦＯＤ１のＤＮＡ配列を配列表８に示した。
【００４５】
このようにして得られたオリゴヌクレオチド５０ｎｇを３７０キロベクレルの［γ−32Ｐ］ＡＴＰ（アマシャムジャパン社製）の存在下、８．５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用い、常法に従って３７℃で３０分間反応させて、放射性同位元素32Ｐを取り込ませ、放射性オリゴヌクレオチドプローブを作製した。
【００４６】
【実施例４】
＜フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子含有ＤＮＡのスクリーニング＞
実施例２で得たフサリウム・オキシスポルムＩＦＯ−９９７２遺伝子ライブラリー、すなわち平板寒天培地上のアンピシリン耐性コロニーの上に、ナイロンメンブレンフィルター（アマシャムジャパン社製、ハイボンド−Ｎ＋）を重ね、フィルター上に該コロニー菌体の一部を移行させた後、このフィルターをアルカリ変性溶液（１．５ＭのＮａＣｌ、０．５ＮのＮａＯＨ）中に５分間浸し、さらに中和溶液（０．５Ｍのトリス−塩酸（ｐＨ７．０）、３ＭのＮａＣｌ）に５分間浸漬後、乾燥させた。
【００４７】
次に、このフィルターを８０℃で２時間加熱し、菌体中にあったプラスミドＤＮＡをフィルターに固定した。さらに、このフィルターをプレハイブリダイゼーション溶液（１．８ＭのＮａＣｌ、０．１８Ｍのクエン酸ナトリウム、０．０５％の二リン酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、０．１％のフィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、０．１％のウシ胎児血清アルブミン（以下ＢＳＡと略称する）（シグマ社製）、０．０１％のサケ精子ＤＮＡ（ベーリンガー・マンハイム社製））に浸し、３７℃で一昼夜プレハイブリダイゼーションを行った。
【００４８】
その後、フィルターをハイブリダイゼーション溶液（１．８ＭのＮａＣｌ、０．１８Ｍのクエン酸ナトリウム、０．０５％の二リン酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、０．１％のフィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、０．１％のＢＳＡ、０．００２％のエシェリヒア・コリ由来トランスファーＲＮＡ（ベーリンガー・マンハイム社製））に浸した後、実施例３で得られた放射性オリゴヌクレオチドプローブを加え、３７℃で２４時間ハイブリダイゼーションを行った。
【００４９】
ハイブリダイゼーション後、洗浄液（１．８ＭのＮａＣｌ、０．１８Ｍのクエン酸ナトリウム、０．０５％の二リン酸ナトリウム）でフィルターを３回洗浄した後、４２℃の洗浄液に１０分間浸し、余分なプローブを洗い落とした。ついで、フィルターを風乾後、Ｘ線フィルム（富士写真フィルム社製、ＮｅｗＲＸＯ−Ｈ）に重ね、遮光下−８０℃で２４時間オートラジオグラフィーを行った。
【００５０】
その後、フィルムを現像したところ、ポジティブシグナルを示すコロニーを確認した。
該コロニーをフルクトシルアミンオキシダーゼをコードするＤＮＡを含む形質転換体エシェリヒア・コリＤＨ１・ｐＦＯＤ１と命名した。
【００５１】
【実施例５】
＜組み換えプラスミドの抽出＞
上記実施例４で取得したエシェリヒア・コリＤＨ１・ｐＦＯＤ１を、３．７％のＢＨＩ培地にて３７℃で一昼夜培養した後、常法に従ってフルクトシルアミンオキシダーゼをコードするＤＮＡを含む組み換えプラスミドｐＦＯＤ１を抽出した。該プラスミド中のフサリウム・オキシスポルムＩＦＯ−９９７２染色体由来の部位のＤＮＡ配列をジデオキシ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２１４巻、１２０５−１２１０ページ、１９８１年）により決定し、フルクトシルアミンオキシダーゼをコードする全ＤＮＡが含まれていることを確認すると共に、その全塩基配列を決定した。
【００５２】
また、今回解析したフルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子がコードするアミノ酸配列は、実施例３で決定したフルクトシルアミンオキシダーゼの６種の部分アミノ酸配列とも完全に一致した。さらに配列表１のＤＮＡ配列の７８番目のＴと７９番目のＣの間に、４８ｂｐのイントロンが存在することが判明した。
【００５３】
【実施例６】
＜エシェリヒア・コリ宿主フルクトシルアミンオキシダーゼ発現用プラスミドの作製＞
フルクトシルアミンオキシダーゼの遺伝子中のイントロンをクンケルの部位特異変異法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第８２巻、４８８ページ、１９８５年）により除去するために、ＤＮＡ変異用オリゴヌクレオチドプライマーＦＯＤ２を設計し、外部機関（ＢＥＸ社）に合成依頼して作成した。ＦＯＤ２のＤＮＡ配列を配列表９に示した。また、実施例５で得られたプラスミドｐＦＯＤ１を部位特異変異用実験キットＭｕｔａｎ−Ｋ（宝酒造社製）に添付されたエシェリヒア・コリＣＪ２３６株に常法に従って導入し、添付のマニュアルに従って１本鎖ＤＮＡ状のｐＦＯＤ１を調製した。この２μｇの一本鎖ＤＮＡ状のｐＦＯＤ１を鋳型ＤＮＡとし、１μｇのＦＯＤ２を変異用プライマーとして、Ｍｕｔａｎ−Ｋを用い、添付のマニュアルに従って部位特異変異を行い、イントロンを除いたＤＮＡ鎖を含有するプラスミドを合成した。
【００５４】
このプラスミドをＭｕｔａｎ−Ｋに添付のエシェリヒア・コリＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳ株に常法に従って導入し、組換え菌体数コロニーから組換えプラスミドを抽出し、１０単位の制限酵素ＳａｌＩで、添付のマニュアルに従って３７℃で２時間切断処理し、０．７％アガロースゲル電気泳動で分析し、新たにＳａｌＩ部位が導入されているプラスミドを確認、選択した。
【００５５】
この組換えプラスミドを再びエシェリヒア・コリＤＨ１株に形質転換し、組換えプラスミドを抽出し、ＳａｌＩ部位が導入されていることを確認した。以上により得たプラスミドをｐＦＯＤ２と命名した。
次にフルクトシルアミンオキシダーゼ構造遺伝子の上流と下流に制限酵素認識部位をクンケルの部位特異変異法により導入するために、オリゴヌクレオチドＦＯＤ３とＦＯＤ４を設計し、それぞれ外部機関（ＢＥＸ社）に合成依頼して作成した。ＦＯＤ３のＤＮＡ配列を配列表１０に、ＦＯＤ４のＤＮＡ配列を配列表１１に示した。また、プラスミドｐＦＯＤ２を部位特異変異用実験キットＭｕｔａｎ−Ｋに添付されたエシェリヒア・コリＣＪ２３６株に常法に従って導入し、添付のマニュアルに従って一本鎖ＤＮＡ状のｐＦＯＤ２を調製した。この２μｇの一本鎖ＤＮＡ状のｐＦＯＤ２を鋳型ＤＮＡとし、１μｇのＦＯＤ３と１μｇのＦＯＤ４を変異用プライマーとして、Ｍｕｔａｎ−Ｋを用い、添付のマニュアルに従って部位特異変異を行い、ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩの認識部位が追加されたＤＮＡ鎖を含有するプラスミドを合成した。
【００５６】
このプラスミドをＭｕｔａｎ−Ｋに添付のエシェリヒア・コリＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳ株に常法に従って導入し、組換え菌体数コロニーから組換えプラスミドを抽出し、１０単位の制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで、添付のマニュアルに従って３７℃で２時間切断処理し、０．７％アガロースゲル電気泳動で分析し、新たにＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩの認識部位が導入されているプラスミドを確認、選択した。以上により得たプラスミドをｐＦＯＤ３と命名した。
【００５７】
さらに５μｇのｐＦＯＤ３を用い、制限酵素ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩそれぞれ１０単位で添付のマニュアルに従って３７℃で２時間切断処理し、０．７％アガロースゲル電気泳動で約１．４ｋｂのＦＯＤ遺伝子を含むＤＮＡ断片を分離回収した。一方、５μｇのエシェリヒア・コリ宿主プラスミドベクターｐＴＶ１１９Ｎを前記と同様に切断し、５０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ８．０）存在下に、１単位のアルカリ性フォスファターゼを加え、６５℃で２時間処理した。
【００５８】
次いで、前記のＤＮＡ溶液を混合し、実施例２と同様にライゲーション、トランスフォーメーションを行い、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する３．７％のＢＨＩ寒天培地にまき、２５℃で一昼夜培養した。このようにして、プラスミドベクターｐＴＶ１１９ＮのＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位にフルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子を含む約１．４ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＦＯＤ７を保持する形質転換微生物を取得し、実施例３の方法で組換えプラスミドｐＦＯＤ７を得た。
【００５９】
【実施例７】
＜エシェリヒア・コリ内でのフルクトシルアミンオキシダーゼの活性発現＞
実施例６で作製したプラスミドｐＦＯＤ７を保持する形質転換微生物をアンピシリン５０μｇ／ｍｌ及び１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を含有する３．７％のＢＨＩ培地にて３７℃で一昼夜培養した後、培養液を１５０００ｒｐｍで１分間遠心分離処理して沈澱を回収した。この沈澱に、該培養液と同量の１０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ８．０）を加え、超音波破砕を行った。
【００６０】
この破砕液を適宜希釈した後、２０μｌとり、前記に示した酵素活性測定法にてフルクトシルアミンオキシダーゼ活性を定量した。なお、比較のためにｐＴＶ１１９Ｎのみをトランスフォーメーションしたエシェリヒア・コリＤＨ１の破砕液についても前記と同様の処理を行い、フルクトシルアミンオキシダーゼ活性を測定した。その結果、プラスミドｐＦＯＤ７を保持した形質転換微生物での活性は０．０８Ｕ／ｍｌであったが、ｐＴＶ１１９Ｎを持つものの活性は検出できなかった。これより、フルクトシルアミンオキシダーゼ活性をもつ形質転換体が得られていることが確認された。この形質転換体をエシェリヒア・コリＤＨ１・ｐＦＯＤ７（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ・ＤＨ１・ｐＦＯＤ７）（微工研寄託、ＦＥＲＭ Ｐ−１５９４３）と命名した。
【００６１】
このようにして得られたフルクトシルアミンオキシダーゼを単離・精製し、発現蛋白の理化学的性質を確認し、フサリウム・オキシスポルムＩＦＯ−９９７２のフルクトシルアミンオキシダーゼと同一であることを確認した。
【００６２】
【発明の効果】
本発明によるとフサリウム・オキシスポルムＩＦＯ−９９７２由来の染色体ＤＮＡライブラリーから、フルクトシルアミンオキシダーゼを発現する遺伝子ＤＮＡをスクリーニングし、これを用いて構築された発現ベクターを例えばエシェリヒア・コリに属する微生物に導入することによって、得られた形質転換微生物は効率よくフルクトシルアミンオキシダーゼを生産することができる。
【００６３】
また、本発明によって、初めてフルクトシルアミンオキシダーゼの全アミノ酸配列及びこのアミノ酸をコードする遺伝子ＤＮＡの塩基配列が決定できたので、該酵素の基質及び補酵素特異性の変換や耐熱性の向上などのプロテインエンジニアリングが可能となった。
【００６４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はプラスミドｐＦＯＤ７の構造を示す模式図である。
図中の「ｆｏｄ」はフルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子を、「ａｐ」はアンピシリン耐性遺伝子を、「ｌａｃ」はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子由来プロモーター配列を、「ｏｒｉ」はプラスミド複製起点を示す。また、「ＮｃｏＩ」、「ＨｉｎｄＩＩＩ」は制限酵素認識部位を、「ｐＴＶ１１９Ｎ」、「Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ＤＮＡ」はプラスミドの各領域の由来を示す。
Claims (3)
- 配列表１の塩基配列の１から１３２０で表される塩基配列を有するＤＮＡによって形質転換された微生物であるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを生産する実質上純粋なエシェリヒア・コリＤＨ１・ｐＦＯＤ７（微工研寄託：ＦＥＲＭ Ｐ−１５９４３）を培地に培養し、次いでその培養物からフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを採取することを特徴とするフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの製造法。
- 培養において２８℃以下で培養する請求項１記載のフルクトシルアミンオキシダーゼの製造法。
- 請求項１又は２に記載の製造法によって得られたフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの臨床用酵素としての使用。
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