JPH10201473A - フルクトシルアミンオキシダーゼを生産する実質上純粋な微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 フルクトシルアミンオキシダーゼを効率よく
生産する手段を得るものである。 【解決手段】 フルクトシルアミンオキシダーゼのアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子、フルク
トシルアミンオキシダーゼ遺伝子によって形質転換した
遺伝子組換え微生物、当該微生物を培養してなるフルク
トシルアミンオキシダーゼの製造法。 【効果】 フルクトシルアミンオキシダーゼ生産菌株に
由来する染色体ＤＮＡライブラリーからフルクトシルア
ミンオキシダーゼ遺伝子の全ＤＮＡ配列を明確とした新
規なフルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子を分離で
き、該フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子を導入し
た遺伝子組換え微生物を利用することにより、高効率な
フルクトシルアミンオキシダーゼの生産を可能とした。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はフルクトシルアミン
オキシダーゼを発現する実質上純粋なＤＮＡ、フルクト
シルアミンオキシダーゼを生産する実質上純粋な微生物
及びフルクトシルアミンオキシダーゼの製造法に関する
ものである。

【０００２】

【従来の技術】血液中のグルコースは遊離のアミノ基
（主にリジンのε−アミノ基）を持つ蛋白と結合し、シ
ッフ塩基を形成してアルジミンとなる。この反応は可逆
であり、生じた反応物は不安定であるが、それに続く不
可逆性のアマドリ転移によって、安定したケトアミンと
なる。このような糖化蛋白を総称してフルクトサミンと
呼ぶ。フルクトサミンの６０から７０％はグリケイテッ
ドアルブミンであると言われている。アルブミンの半減
期が約２週間であることから、フルクトサミンは約２週
間前の血糖値を反映すると言われている。

【０００３】糖尿病患者における血液中のグルコース濃
度は健常人と比較して高いことから、フルクトサミンの
濃度も高くなることが知られている。血糖値は食事の影
響を大きく受けることから、食事の影響を受けないフル
クトサミンは、糖尿病患者の血糖コントロール指標とし
て有用である。フルクトサミンの定量法としては、アフ
ィニティークロマトグラフィー法（Ｄａｉａｂｅｔｅ
ｓ，第２９巻、１０４４−１０４７ページ、１９８０
年）、ＨＰＬＣ法（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第１９巻、８１−８７ページ、
１９８１年）、（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，第７１巻、３
５６−３６０ページ、１９７６年）等があるが、いずれ
も操作が煩雑な上、精度に問題があった。

【０００４】上記の方法に代わって、最近多く用いられ
ているのがアルカリ溶液中でのフルクトサミンの還元能
を利用してＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）を還
元し、ホルマザン生成物の吸光度（５５０ｎｍ）を測定
するものである。この方法は迅速であり、臨床検査に用
いるために種々の分析機で自動化されている。しかし、
試料中の夾雑物質の影響を受けることから特異性が疑問
視されていた。そこで、簡便でかつ夾雑物質の影響を受
けないフルクトサミンを測定する方法が望まれていた。

【０００５】フルクトサミンを含むアマドリ化合物の定
量法としてコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ）属由来のフルクトシルアミノ酸オキシダー
ゼを用いた方法が報告されている（特開昭６１−２６８
１７８号公報）。しかしこの方法はα−アミノ酸のアマ
ドリ化合物に対しては作用するがε−アミノ酸に対して
は作用しない（特開平３−１５５７８０号公報）。フル
クトサミンは、タンパク質中のε−アミノ酸であるリジ
ン残基に糖が結合したものである（Ｄｉａｂｅｔｏｌｏ
ｇｉａ、第２６号、９３−９８ページ、１９８４年）こ
とから、この方法はフルクトサミンの定量には使用でき
なかった。

【０００６】フルクトサミンのようなε−アミノ酸のア
マドリ化合物にも作用する酵素として、アスペルギウス
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属由来のフルクトシルアミ
ンオキシダーゼ（特開平３−１５５７８０号公報）、フ
サリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、アクレモニウム（Ａ
ｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、およびデバリオマイセス（Ｄ
ｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属由来のケトアミンオキシダ
ーゼ（特開平５−１９２１９３号公報）が知られてい
る。しかし、いずれも培養に誘導物質としてフルクトシ
ルグリシンやフルクトシルバリンなどのような合成基質
を使用するにもかかわらず酵素生産能は非常に低い。加
えて、真菌類は液体培養を行うと菌体が培地の半分もの
体積になり、また細胞壁が非常に強固であることから、
微量の酵素を精製することは非常に困難である。さら
に、血液中に存在するような低濃度のフルクトサミンを
測定するには多量の酵素が必要であり、本酵素を供給す
る方法として現実的なものではあり得なかった。

【０００７】このような状況下、フルクトシルアミンオ
キシダーゼにおいてはε−アミノ酸に対する反応性や生
産菌株の酵素生産性が非常に低いことから、ε−アミノ
酸に対して反応性の高い酵素を効率よく生産し、容易に
抽出・精製できる微生物の開発が望まれていた。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
実情のもとで、フルクトサミンの定量に有用なε−アミ
ノ酸に反応性の高いフルクトシルアミンオキシダーゼを
検索し、この酵素を効率よく生産する微生物を開発し、
さらにこの微生物を用いて該酵素を量産する方法を提供
することを目的としてなされたものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは前記目的を
達成するために鋭意研究を重ね、自然界および公知の分
離株についてフルクトシルアミンオキシダーゼを産出す
る株を探索した結果、特に真菌類に広く存在することが
わかった。その中で特にフサリウム・オキシスポルム
（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）ＩＦＯ−９
９７２のフルクトシルアミンオキシダーゼ生産能が高い
ことがわかった。

【００１０】そこで、本菌株から該酵素を精製し、該酵
素の部分的アミノ酸配列を決定した。そして、該酵素を
生産する微生物由来の染色体ＤＮＡライブラリーの中か
ら、該酵素をコードする遺伝子ＤＮＡを決定した部分的
アミノ酸配列から設計・合成したＤＮＡプローブを用い
てスクリーニングし、得られたＤＮＡ断片から該酵素を
コードしない領域（５’および３’ノンコーディング領
域並びにイントロン）を部位特異的変異法を用いて除去
することで原核生物において遺伝子発現が可能でかつ容
易に発現する構造に変換した後、この遺伝子を用いて発
現ベクターを構築し、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に属する微生物に導入
して形質転換微生物を作出し、これを特に培地中で低温
にて培養することによって、該フルクトシルアミンオキ
シダーゼを効率よく量産することを見い出し、この知見
に基づいて本発明を完成するに至った。

【００１１】すなわち、本発明は、配列表１のアミノ酸
配列の１から４４０で表されるアミノ酸配列を有するフ
ルクトシルアミンオキシダーゼのアミノ酸配列をコード
する塩基配列を有するＤＮＡによって形質転換されたも
のであることを特徴とするフルクトシルアミンオキシダ
ーゼを生産する実質上純粋な微生物、配列表１のアミノ
酸配列の１から４４０で表されるアミノ酸配列を有する
フルクトシルアミンオキシダーゼのアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列を有することを特徴とするフルクトシル
アミンオキシダーゼを発現する実質上純粋なＤＮＡ、配
列表１のアミノ酸配列の１から４４０で表されるアミノ
酸配列を有するフルクトシルアミンオキシダーゼのアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡによって
形質転換されたフルクトシルアミンオキシダーゼを生産
する実質上純粋な微生物を培地に培養し、次いでその培
養物からフルクトシルアミンオキシダーゼを採取するこ
とを特徴とするフルクトシルアミンオキシダーゼの製造
法を提供するものである。

【００１２】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
おいて使用されるフルクトシルアミンオキシダーゼ生産
菌は、フサリウム・オキシスポルムＩＦＯ−９９７２株
であり、本菌の生産するフルクトシルアミンオキシダー
ゼの性状は以下の通りである。 ・フルクトシルアミンオキシダーゼの活性測定法 ・反応液組成 ５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５） ０．０３％の４−アミノアンチピリン ０．０２％のフェノール ４．５ｕ／ｍｌのパーオキシダーゼ １ｍＭのＺＦＬ（α−カルボベンズオキシ−ε−Ｄ−フ
ルクトシル−Ｌ−リジン） 上記の反応液１ｍｌを小試験管に入れ、３７℃で５分間
予備加温した後、適当に希釈した酵素液０．０２ｍｌを
添加して撹拌し、反応を開始する。正確に１０分間反応
の後に、０．５％のＳＤＳを２ｍｌ添加して反応を停止
し、波長５００ｎｍの吸光度を測定する（Ａｓ）。また
盲検として酵素液のかわりに蒸留水０．０２ｍｌを用い
て同一の操作を行って吸光度を測定する（Ａｂ）。この
酵素使用の吸光度（Ａｓ）と盲検の吸光度（Ａｂ）の吸
光度差（Ａｓ−Ａｂ）より酵素活性を求める。別にあら
かじめ過酸化水素の標準溶液を用いて吸光度と生成した
過酸化水素量との関係を調べておく。３７℃、１分間に
１μＭの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義し、
計算式は下記の通りである。 酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝（Ａｓ−Ａｂ）×１．１６×酵
素の希釈率 （１）基質特異性 ＺＦＬ １００％ Ｄ−フルクトシル−Ｌ−アラニン １０４％ ε−Ｄ−フルクトシル−Ｌ−リジン ８１％ Ｄ−フルクトシル−Ｌ−バリン １０％ （２）酵素作用 下記に示すように、少なくともα−アミノ酸、ε−アミ
ノ酸のアマドリ化合物を分解して、グルコソンと過酸化
水素および対応するα−アミノ酸、ε−アミノ酸を生成
する反応を触媒する。

【００１３】

【化１】

【００１４】（３）分子量 本酵素の分子量はＳｅｐｈａｄｅｘ・Ｇ−１００を用い
たカラムゲル濾過法で、０．２ＭのＮａＣｌ含有０．１
Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を溶出液として測定し
た結果、４８，０００±２，０００、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
では４７，０００±２，０００であった。 （４）等電点 キャリアアンフォライトを用いる焦点電気泳動法によっ
て４℃、７００Ｖの定電圧で４０時間通電した後、分画
し、各画分の酵素活性を測定した結果、ｐＨ４．３±
０．２であった。 （５）Ｋｍ値 ５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５） ０．０３％の４−アミノアンチピリン ０．０２％のフェノール ４．５ｕ／ｍｌのパーオキシダーゼ を含む反応液中で合成基質ＺＦＬの濃度を変化させて、
ＺＦＬに対するＫｍ値を測定した結果、０．１９４ｍＭ
の値を示した。 （６）至適ｐＨ 前記の酵素活性測定法に従い、反応液中の５０ｍＭのト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に代えて１００ｍＭの
酢酸緩衝液（ｐＨ４．４−５．４）、リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ５．６−７．９）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．３
−８．５）、およびグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液
（ｐＨ８．０−１０．３）の各緩衝液を用いて測定し
た。この結果、ｐＨ７．５で最大の活性を示した。 （７）ｐＨ安定性 本酵素０．５Ｕを含有する０．５Ｍの至適ｐＨを測定す
るときに用いた各種緩衝液０．５ｍｌを４０℃、１０分
間処理した後、その残存活性を後記の活性測定法に従っ
て測定した。この結果、ｐＨ７．０−９．０の範囲で８
０％以上の活性を保持していた。 （８）熱安定性 本酵素０．５Ｕを０．２Ｍのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）で調製し、１０分間加熱処理後、その残存活性
を活性測定法に従って測定した。この結果、４０℃まで
は残存活性として９５％以上を保持した。 （９）至適温度 ４０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用い、
活性測定法に従い、各温度で１０分間反応後、０．５％
のラウリル硫酸ナトリウム（以下ＳＤＳと略称する）溶
液２ｍｌで反応を停止し、波長５００ｎｍで吸光度を測
定した。この結果、５０℃で最大の活性を示した。

【００１５】

【表１】

【００１６】以上の本酵素の理化学的性質と公知の酵素
の性質を（表１）に示し比較した。その結果、分子量に
おいてはコリネバクテリウムｓｐ．由来酵素は８８，０
００、アスペルギルスｓｐ．由来酵素は８３，０００、
フザリウム・オキシスポルムＩＦＯ０５８８０由来酵素
は１０６，０００であるのに対し、本発明の酵素の分子
量は４８，０００であり明らかに違う分子量であった。
至適温度においてコリネバクテリウムｓｐ．由来酵素は
４０℃、アスペルギルスｓｐ．由来酵素は４０℃、フザ
リウム・オキシスポルムＳ−１Ｆ４由来酵素は４５℃、
フザリウム・オキシスポルムＩＦＯ０５８８０由来酵素
は３３℃であり、本発明の酵素の至適温度は５０℃であ
り、明らかに異なっていた。阻害剤においては本発明の
酵素がマンガンイオンやニッケルイオンによって阻害さ
れるの対してフザリウム・オキシスポルムＳ−１Ｆ４由
来酵素やフザリウム・オキシスポルムＩＦＯ０５８８０
由来酵素はマンガンイオンとニッケルイオン存在下に１
００％残存活性を示す阻害を受けない性質を有するもの
であった。基質特異性においては本発明酵素はフルクト
シルリジンとフルクトシルバリンに作用し、フルクトシ
ルグリシンには作用しなかった。コリネバクテリウムｓ
ｐ．由来酵素はフルクトシルリジンに作用しないことか
ら、明らかに本発明酵素とは異なるもので、また血中の
フルクトサミン（リジン残基のε位のアミノ基が糖化さ
れた蛋白）の測定には使用できない。フザリウム・オキ
シスポルムＳ−１Ｆ４由来酵素はフルクトシルバリンに
作用しないことから明らかに本発明酵素とは異なるもの
であり、また血中のヘモグロビンＡ_1C（ヘモグロビンＡ
_1Cは血糖コントロールマーカーで、Ｎ末のバリン残基が
糖化されている。）の測定には使用できない。以上の諸
性質における差異が認められ、本酵素は新規な性質のも
のと認められる。

【００１７】また、上記に示した本発明の新規な性質を
有するフルクトシルアミンオキシダーゼについて精製を
行い、得られた電気泳動的に均一なフルクトシルアミン
オキシダーゼを用い、Ｎ末端側アミノ酸配列、シアノゲ
ンブロミドなどを用いて化学的に切断した各ペプチド断
片、およびリシルエンドペプチダーゼやアスパラギニル
エンドペプチダーゼなどプロテアーゼを用いて消化した
各ペプチド断片についてアミノ酸配列を決定し、フルク
トシルアミンオキシダーゼの部分的なアミノ酸配列を決
定する。

【００１８】次に、フルクトシルアミンオキシダーゼを
発現する遺伝子ＤＮＡをクローニングし、遺伝子工学的
に該酵素を発現する形質転換微生物を作出する訳である
が、用いられるフルクトシルアミンオキシダーゼを発現
する遺伝子ＤＮＡは、例えば該酵素を生産する微生物由
来の染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーの中か
ら、スクリーニングすることによって得ることができ
る。

【００１９】本発明においては、前記のフルクトシルア
ミンオキシダーゼを生産する微生物として、フサリウム
・オキシスポルムＩＦＯ−９９７２が好ましく用いられ
る。このフサリウム・オキシスポルムＩＦＯ−９９７２
から該酵素を発現する遺伝子ＤＮＡをスクリーニングす
る方法について説明する。まず、本菌の遺伝子ライブラ
リーを作製するにあたり、染色体ＤＮＡライブラリーを
作製する場合、まず、該微生物の染色体ＤＮＡを通常用
いられている方法によって抽出した後、適当な制限酵素
で切断して、クローニング用ベクターに連結し、次いで
この組換えベクターを宿主微生物に導入して、１０⁴ 〜
１０⁵ 個の形質転換宿主微生物のコロニーからなる染色
体ＤＮＡライブラリーを作製する。

【００２０】また、ｃＤＮＡライブラリーを作製する場
合は、全ＲＮＡを通常用いられている方法に従って調製
した後、例えばオリゴｄＴカラムを用いてｍＲＮＡを精
製しても良いし、市販のキットを用いて直接ｍＲＮＡを
調製しても良い。調製したｍＲＮＡに適当な制限酵素部
位を有するリンカーやアダプターを付加した後適当なク
ローニング用ベクターに挿入し、上記と同様に宿主微生
物に導入してｃＤＮＡライブラリーを作製する。この際
用いられる宿主微生物としては、組換えＤＮＡが安定で
かつ自律的に増殖可能であるものであれば特に制限され
ず、通常の遺伝子組換えに用いられているもの、例えば
エシェリヒア属、バチルス属に属する微生物などが好ま
しく使用される。

【００２１】宿主微生物に組換えＤＮＡを導入する方法
としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する
微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下に組換え
ＤＮＡの導入を行ってもよいし、コンピテントセル法を
用いてもよく、またバチルス属に属する微生物の場合に
は、コンピテントセル法またはプロトプラスト法などを
用いることができるし、エレクトロポレーション法ある
いはマイクロインジェクション法を用いてもよい。宿主
微生物への所望組換えＤＮＡ導入の有無の選択について
は、組換えＤＮＡを構成するベクターの薬剤耐性マーカ
ーや栄養要求性マーカーに基づく選択培地で、該宿主微
生物を培養し、生育する宿主微生物を選択すればよい。

【００２２】一方、フルクトシルアミンオキシダーゼ精
製標品の部分的アミノ酸配列に基づいて種々のオリゴヌ
クレオチドを合成した後、例えばアイソトープで標識し
て標識オリゴヌクレオチドプローブを作製する。次い
で、これらの標識オリゴヌクレオチドプローブを用い、
従来慣用されている方法に従って、前記の染色体ＤＮＡ
またはｃＤＮＡライブラリーの中から、フルクトシルア
ミンオキシダーゼ遺伝子を含むものをスクリーニングす
る。

【００２３】次に、この目的の遺伝子ＤＮＡを含む形質
転換された宿主微生物から、例えばマニアティスらの方
法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｅｃｏｎ
ｄＥｄｉｔｉｏｎ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８９年）などに従
って、フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡを
含む組換えベクターを調製することができる。

【００２４】次に、以上のようにして得たフルクトシル
アミンオキシダーゼ遺伝子を発現用ベクターに組み込ん
で、発現ベクターを構築する。この発現用ベクターとし
ては、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージＤＮＡ
またはプラスミドＤＮＡから遺伝子組換え用として構築
されたものが適している。前者のファージベクターとし
ては、例えばエシェリヒア・コリを宿主微生物とする場
合には、λｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢなどが用いられ
る。また、プラスミドベクターとしては、エシェリヒア
・コリを宿主微生物とする場合は、例えばｐＢＲ３２
２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１２、ｐ
ＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、
ｐＴＶ１１９Ｎ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋、ｐＴ
ｒｃ９９Ａなどが用いられる。

【００２５】さらに、バチルス属を宿主微生物とする場
合は、例えばｐＨＹ３００ＰＬＫなどを用いればよく、
サッカロミセス属を宿主微生物とする場合は、例えばｐ
ＹＡＣ５などを用いればよい。また宿主微生物が原核生
物である場合、フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子
を組み込んだ際に効率よく働くプロモーターが上流に存
在するような構造の発現用ベクターが適しており、エシ
ェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、ｐＵＣ１
２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１
１９、ｐＴＶ１１９Ｎ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ
＋、ｐＴｒｃ９９Ａなどがこれに合致する。さらに、バ
チルス属を宿主微生物とする場合は、ｐＨＹ３００ＰＬ
Ｋなどが合致する。

【００２６】これらのベクターに、該フルクトシルアミ
ンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡを組み込む方法については
特に制限はなく、従来慣用されている方法を用いること
ができる。しかし、該酵素生産菌であるフサリウム・オ
キシスポルムＩＦＯ−９９７２は真核生物であることか
ら、該酵素遺伝子内にイントロンを保持している可能性
がある。イントロンが存在している場合、エシェリヒア
・コリなどの原核生物を宿主として活性発現させるため
にはこのイントロンを除去しなければならない。この場
合は、部位特異的変異法を応用して、イントロンを除去
した後に結合させたいエクソン（タンパクをコードして
いる遺伝子部分）両末端と同じ配列を有する合成ＤＮＡ
を用いてイントロンを除去すればよい。また、宿主微生
物での遺伝子の発現効率を上昇させるために、部位特異
変異法を用いて低頻度遺伝子コドンを高頻度コドンに変
換する作業が有効である。例えば宿主微生物がエシェリ
ヒア・コリであれば、アルギニンをコードするエシェリ
ヒア・コリでの低頻度遺伝子コドンＡＧＧを、同じくア
ルギニンをコードする高頻度コドンであるＣＧＧなどに
変換する操作が一般的に行われる。また、フルクトシル
アミンオキシダーゼ遺伝子を発現用ベクターに組み込む
に先だって、遺伝子の上流部と下流部に部位特異変異法
やＰＣＲ法を用いて、適当な制限酵素認識部位を作成し
ておくことも一般的な手法である。そして、適当な制限
酵素を用いて、前記のフルクトシルアミンオキシダーゼ
遺伝子ＤＮＡを含む組換えベクター及び発現用ベクター
を処理し、それぞれフルクトシルアミンオキシダーゼ遺
伝子を含むＤＮＡ断片及びベクター断片を得た後、それ
ぞれの接着末端をアニーリング後、適当なＤＮＡリガー
ゼを用いて結合させることによって、発現ベクターが得
られる。

【００２７】後述の実施例における発現ベクターは、前
記のフルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子ＤＮＡを含
む組換えプラスミドとして分離したｐＦＯＤ１とプラス
ミドベクターｐＴＶ１１９Ｎから得られ、ｐＦＯＤ７と
命名されたものであり、その構成の模式図は図１に示す
とおりである。このようにして、構築された発現ベクタ
ーをエシェリヒア・コリに属する微生物に導入し、該宿
主微生物を形質転換させればフルクトシルアミンオキシ
ダーゼを生産する実質上純粋な微生物が得られる。発現
ベクターの導入及び選択方法については前述した方法を
用いて行う。

【００２８】本発明においては、前記組換えプラスミド
ｐＦＯＤ７によって形質転換されたエシェリヒア・コリ
に属する微生物は、エシェリヒア・コリＤＨ１・ｐＦＯ
Ｄ７（微工研寄託、ＦＥＲＭ Ｐ−１５９４３）と命名
される。このようにして得られた形質転換微生物の培養
は、該微生物の生育に必要な炭素源や窒素源などの栄養
源や無機成分などを含む培地中において行うことができ
る。

【００２９】該炭素源としては、例えばグルコース、デ
ンプン、ショ糖、モラッセス、デキストリンなどが、窒
素源としては、例えばペプトン、肉エキス、カゼイン加
水分解物、コーンスチープリカー、硝酸塩、アンモニウ
ム塩などが、無機成分としては、例えばナトリウム、カ
リウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、亜鉛、
マンガン、鉄などの陽イオンや塩素、硫酸、リン酸など
の陰イオンを含む塩が挙げられる。

【００３０】培養方法については特に制限はなく公知の
方法、例えば通気撹拌培養、振盪培養、回転培養、静置
培養などの方法によって行うことができるが、本発明に
関しては、数々の検討を行った結果、エシェリヒア・コ
リの至適生育温度である３７℃よりも低い２８℃以下好
ましくは２５℃で、１２時間から６０時間程度培養する
方法が好ましく用いられる。

【００３１】このようにして培養を行ったのち、遠心分
離処理などの手段によって菌体を集め、次いで酵素処
理、自己消化、フレンチプレス、超音波処理などによっ
て細胞を破壊して目的とする酵素を含有する抽出液を得
る。この抽出液から、該酵素を分離、精製するには、例
えば、塩析、脱塩、イオン交換樹脂による吸脱着処理な
どを行ったのち、さらに吸着クロマトグラフィー、ゲル
濾過、電気泳動法などによって精製すればよけ、この精
製酵素について適宜、ショ糖、グリセロール、アミノ酸
等の安定化剤を０．１〜５％添加して凍結乾燥してもよ
い。

【００３２】この精製標品について、フルクトシルアミ
ンオキシダーゼの酵素活性及び物理化学的性質を調べる
ことによって、該形質転換微生物がフルクトシルアミン
オキシダーゼの産生能を有することが確認された。した
がって、本発明において用いたフルクトシルアミンオキ
シダーゼを発現する遺伝子ＤＮＡは、配列表１のアミノ
酸配列の１から４４０で表されるアミノ酸配列をコード
する塩基配列を有し、かつその塩基配列が配列表１の塩
基配列の１から１３２０で表される塩基配列であること
が明らかである。

【００３３】このようにして得られたフルクトシルアミ
ンオキシダーゼは、例えば血清中のフルクトサミン定量
などの臨床用酵素として有用である。なお、本発明明細
書に記載の塩基配列の記号及びアミノ酸配列の記号は、
当該分野における慣用略号に基づくもので、それらの例
を以下に列記する。また、すべてのアミノ酸はＬ体を示
すものとする。

【００３４】ＤＮＡ：デオキシリボ核酸 Ａ：アデニン Ｔ：チミン Ｇ：グアニン Ｃ：シトシン Ｎ：アデニン、チミン、グアニンまたはシトシン Ｒ：アデニンまたはグアニン Ｙ：チミンまたはシトシン Ａｌａ：アラニン Ａｒｇ：アルギニン Ａｓｎ：アスパラギン Ａｓｐ：アスパラギン酸 Ｃｙｓ：システイン Ｇｌｎ：グルタミン Ｇｌｕ：グルタミン酸 Ｈｉｓ：ヒスチジン Ｉｌｅ：イソロイシン Ｌｅｕ：ロイシン Ｌｙｓ：リジン Ｍｅｔ：メチオニン Ｐｈｅ：フェニルアラニン Ｐｒｏ：プロリン Ｓｅｒ：セリン Ｔｈｒ：スレオニン Ｔｒｐ：トリプトファン Ｔｙｒ：チロシン Ｖａｌ：バリン

【００３５】

【発明実施の形態】以下、実施例に基づいて本発明をよ
り詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定さ
れるものではない。なお、実施例中、常法に従い、と記
述した操作は、例えばマニアティスらの方法（Ｔ．ｍａ
ｎｉａｔｉｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ、１９８９年）や、市販の各種酵素、キット類に
添付された手順に従えば実施できるものである。また、
実験に使用した組換えＤＮＡ実験酵素試薬（制限酵素な
ど）、プラスミドＤＮＡ、キット類は特に指摘しない限
り宝酒造株式会社より購入したものである。

【００３６】

【実施例１】 ＜染色体ＤＮＡの分離＞フサリウム・オキシスポルムＩ
ＦＯ−９９７２菌株を２％のグルコース（和光純薬社
製）、２％の酵母エキス（極東製薬工業社製）から成
り、ｐＨ５．５に調整した培地１００ｍｌにて２８℃で
３日間振盪培養した後、この培養液を高速冷却遠心機
（トミーＣＸ−２５０型）を用い、６５００ｒｐｍ（７
６６０Ｇ）で１０分間遠心分離処理して、菌体を集菌し
た。

【００３７】次いで、この菌体を５０ｍＭの酢酸緩衝液
（ｐＨ５．５）、１００ｍＭのエチレンジアミン４酢酸
（以下ＥＤＴＡと略称する）（ｐＨ８．０）及び１５％
のシュクロースからなる溶液２０ｍｌ中に懸濁し、最終
濃度が２ｍｇ／ｍｌとなるようにノボザイム（ノボノル
ディスク社製）を加え、２５℃で３０分間処理して菌株
の細胞壁を破壊した。

【００３８】次に、これに１０の％のＳＤＳ（シグマ社
製）水溶液１ｍｌを加えて、３７℃で２０分間処理した
後、これに等量のフェノール：クロロホルム＝１：１混
合液を加え、１００００ｒｐｍ（１２０８０Ｇ）で１０
分間遠心分離処理して水相を回収した。この水相に２倍
量のエタノールを静かに重層し、ガラス棒でゆっくり撹
拌しながら、ＤＮＡをガラス棒にまきつかせて分離した
後、１０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ８．０）及び１ｍＭ
のＥＤＴＡからなる溶液２０ｍｌで溶解し、次いでこれ
に等量のフェノール：クロロホルム＝１：１混合液を加
え、前記と同様に処理して水相を分取した。

【００３９】次に、この水相に２倍量のエタノールを加
えて前記の方法でもう一度ＤＮＡを分離した後、１０ｍ
Ｍのトリス−塩酸（ｐＨ８．０）及び１ｍＭのＥＤＴＡ
からなる溶液２ｍｌに溶解した。

【００４０】

【実施例２】 ＜フサリウム・オキシスポルムＩＦＯ−９９７２遺伝子
ライブラリーの作製＞実施例１で得られたフサリウム・
オキシスポルムＩＦＯ−９９７２染色体５μｇを３０単
位の制限酵素ＢｇｌＩＩを用い、常法に従って３７℃で
２時間切断処理した。また、５μｇのプラスミドベクタ
ーｐＵＣ１１９を３０単位の制限酵素ＢａｍＨＩを用
い、常法に従って３７℃で２時間切断処理した。さらに
５’末端を脱リン酸化するために、反応液に１単位のア
ルカリ性ホスファターゼを加えて６５℃で２時間処理し
た。

【００４１】次に、前記のようにして得られた２種のＤ
ＮＡ溶液を混合し、この混合液に等量のフェノール：ク
ロロホルム＝１：１混合液を加えて処理した後、遠心分
離処理によって水相を分取した。次いで、この水相に１
／１０量の３Ｍの酢酸ナトリウム溶液を加え、さらに２
倍量のエタノールを加えて遠心分離処理することによっ
てＤＮＡを沈澱させた後、減圧乾燥した。

【００４２】このＤＮＡを１００単位のＴ４ＤＮＡライ
ゲースを用い、常法に従って１６℃で１６時間ライゲー
ションを行った。次に、これを常法に従いコンピテント
細胞としたエシェリヒア・コリＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８
４９）［Ｆ−、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９
６、ｔｈｉ−１、ｈｓｄＲ１７（ｒｋ−、ｍｋ＋）、Ｓ
ｕｐＥ４４、ｒｅｌＡ１、λ−］（Ｔ．ｍａｎｉａｔｉ
ｓ．，ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，５０４
−５０６ページ、１９８２年）にトランスフォーメーシ
ョンし、これをアンピシリン５０μｇ／ｍｌ含有３．７
％のＢＨＩ寒天培地（ＤＩＦＣＯ社製）にて、３７℃で
一昼夜培養し、約８０００株の形質転換微生物を得て、
フサリウム・オキシスポルムＩＦＯ−９９７２遺伝子ラ
イブラリーとした。

【００４３】

【実施例３】 ＜放射性オリゴヌクレオチドプローブの作製＞フルクト
シルアミンオキシダーゼ精製標品のリシルエンドペプチ
ダーゼ処理断片、及びアスパラギニルエンドペプチダー
ゼ処理断片のアミノ酸配列を調べたところ、配列表２か
ら７のアミノ酸配列で表される６領域のアミノ酸配列が
決定された。

【００４４】この情報をもとに遺伝子の５’末端側から
塩基配列を予想した。この予想された塩基配列には種々
の組合せが考えられるので、組合せの数が少ない部分の
オリゴヌクレオチドを設計した。すなわち、配列表２の
アミノ酸配列の５９番目のＰｈｅから６５番目のＡｓｐ
をコードする２０塩基のＤＮＡ配列を予想し、６４通り
の全ての塩基配列を有するＤＮＡが混在するオリゴヌク
レオチドＦＯＤ１を設計し、外部機関（ＢＥＸ社）に合
成依頼して作成した。ＦＯＤ１のＤＮＡ配列を配列表８
に示した。

【００４５】このようにして得られたオリゴヌクレオチ
ド５０ｎｇを３７０キロベクレルの［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ
（アマシャムジャパン社製）の存在下、８．５単位のＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼを用い、常法に従って３７
℃で３０分間反応させて、放射性同位元素³²Ｐを取り込
ませ、放射性オリゴヌクレオチドプローブを作製した。

【００４６】

【実施例４】 ＜フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子含有ＤＮＡの
スクリーニング＞実施例２で得たフサリウム・オキシス
ポルムＩＦＯ−９９７２遺伝子ライブラリー、すなわち
平板寒天培地上のアンピシリン耐性コロニーの上に、ナ
イロンメンブレンフィルター（アマシャムジャパン社
製、ハイボンド−Ｎ＋）を重ね、フィルター上に該コロ
ニー菌体の一部を移行させた後、このフィルターをアル
カリ変性溶液（１．５ＭのＮａＣｌ、０．５ＮのＮａＯ
Ｈ）中に５分間浸し、さらに中和溶液（０．５Ｍのトリ
ス−塩酸（ｐＨ７．０）、３ＭのＮａＣｌ）に５分間浸
漬後、乾燥させた。

【００４７】次に、このフィルターを８０℃で２時間加
熱し、菌体中にあったプラスミドＤＮＡをフィルターに
固定した。さらに、このフィルターをプレハイブリダイ
ゼーション溶液（１．８ＭのＮａＣｌ、０．１８Ｍのク
エン酸ナトリウム、０．０５％の二リン酸ナトリウム、
０．１％のＳＤＳ、０．１％のフィコール、０．１％の
ポリビニルピロリドン、０．１％のウシ胎児血清アルブ
ミン（以下ＢＳＡと略称する）（シグマ社製）、０．０
１％のサケ精子ＤＮＡ（ベーリンガー・マンハイム社
製））に浸し、３７℃で一昼夜プレハイブリダイゼーシ
ョンを行った。

【００４８】その後、フィルターをハイブリダイゼーシ
ョン溶液（１．８ＭのＮａＣｌ、０．１８Ｍのクエン酸
ナトリウム、０．０５％の二リン酸ナトリウム、０．１
％のＳＤＳ、０．１％のフィコール、０．１％のポリビ
ニルピロリドン、０．１％のＢＳＡ、０．００２％のエ
シェリヒア・コリ由来トランスファーＲＮＡ（ベーリン
ガー・マンハイム社製））に浸した後、実施例３で得ら
れた放射性オリゴヌクレオチドプローブを加え、３７℃
で２４時間ハイブリダイゼーションを行った。

【００４９】ハイブリダイゼーション後、洗浄液（１．
８ＭのＮａＣｌ、０．１８Ｍのクエン酸ナトリウム、
０．０５％の二リン酸ナトリウム）でフィルターを３回
洗浄した後、４２℃の洗浄液に１０分間浸し、余分なプ
ローブを洗い落とした。ついで、フィルターを風乾後、
Ｘ線フィルム（富士写真フィルム社製、ＮｅｗＲＸＯ−
Ｈ）に重ね、遮光下−８０℃で２４時間オートラジオグ
ラフィーを行った。

【００５０】その後、フィルムを現像したところ、ポジ
ティブシグナルを示すコロニーを確認した。該コロニー
をフルクトシルアミンオキシダーゼをコードするＤＮＡ
を含む形質転換体エシェリヒア・コリＤＨ１・ｐＦＯＤ
１と命名した。

【００５１】

【実施例５】 ＜組み換えプラスミドの抽出＞上記実施例４で取得した
エシェリヒア・コリＤＨ１・ｐＦＯＤ１を、３．７％の
ＢＨＩ培地にて３７℃で一昼夜培養した後、常法に従っ
てフルクトシルアミンオキシダーゼをコードするＤＮＡ
を含む組み換えプラスミドｐＦＯＤ１を抽出した。該プ
ラスミド中のフサリウム・オキシスポルムＩＦＯ−９９
７２染色体由来の部位のＤＮＡ配列をジデオキシ法（Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ、第２１４巻、１２０５−１２１０ペー
ジ、１９８１年）により決定し、フルクトシルアミンオ
キシダーゼをコードする全ＤＮＡが含まれていることを
確認すると共に、その全塩基配列を決定した。

【００５２】また、今回解析したフルクトシルアミンオ
キシダーゼ遺伝子がコードするアミノ酸配列は、実施例
３で決定したフルクトシルアミンオキシダーゼの６種の
部分アミノ酸配列とも完全に一致した。さらに配列表１
のＤＮＡ配列の７８番目のＴと７９番目のＣの間に、４
８ｂｐのイントロンが存在することが判明した。

【００５３】

【実施例６】 ＜エシェリヒア・コリ宿主フルクトシルアミンオキシダ
ーゼ発現用プラスミドの作製＞フルクトシルアミンオキ
シダーゼの遺伝子中のイントロンをクンケルの部位特異
変異法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．
Ｓ．Ａ．第８２巻、４８８ページ、１９８５年）により
除去するために、ＤＮＡ変異用オリゴヌクレオチドプラ
イマーＦＯＤ２を設計し、外部機関（ＢＥＸ社）に合成
依頼して作成した。ＦＯＤ２のＤＮＡ配列を配列表９に
示した。また、実施例５で得られたプラスミドｐＦＯＤ
１を部位特異変異用実験キットＭｕｔａｎ−Ｋ（宝酒造
社製）に添付されたエシェリヒア・コリＣＪ２３６株に
常法に従って導入し、添付のマニュアルに従って１本鎖
ＤＮＡ状のｐＦＯＤ１を調製した。この２μｇの一本鎖
ＤＮＡ状のｐＦＯＤ１を鋳型ＤＮＡとし、１μｇのＦＯ
Ｄ２を変異用プライマーとして、Ｍｕｔａｎ−Ｋを用
い、添付のマニュアルに従って部位特異変異を行い、イ
ントロンを除いたＤＮＡ鎖を含有するプラスミドを合成
した。

【００５４】このプラスミドをＭｕｔａｎ−Ｋに添付の
エシェリヒア・コリＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳ株に常法
に従って導入し、組換え菌体数コロニーから組換えプラ
スミドを抽出し、１０単位の制限酵素ＳａｌＩで、添付
のマニュアルに従って３７℃で２時間切断処理し、０．
７％アガロースゲル電気泳動で分析し、新たにＳａｌＩ
部位が導入されているプラスミドを確認、選択した。

【００５５】この組換えプラスミドを再びエシェリヒア
・コリＤＨ１株に形質転換し、組換えプラスミドを抽出
し、ＳａｌＩ部位が導入されていることを確認した。以
上により得たプラスミドをｐＦＯＤ２と命名した。次に
フルクトシルアミンオキシダーゼ構造遺伝子の上流と下
流に制限酵素認識部位をクンケルの部位特異変異法によ
り導入するために、オリゴヌクレオチドＦＯＤ３とＦＯ
Ｄ４を設計し、それぞれ外部機関（ＢＥＸ社）に合成依
頼して作成した。ＦＯＤ３のＤＮＡ配列を配列表１０
に、ＦＯＤ４のＤＮＡ配列を配列表１１に示した。ま
た、プラスミドｐＦＯＤ２を部位特異変異用実験キット
Ｍｕｔａｎ−Ｋに添付されたエシェリヒア・コリＣＪ２
３６株に常法に従って導入し、添付のマニュアルに従っ
て一本鎖ＤＮＡ状のｐＦＯＤ２を調製した。この２μｇ
の一本鎖ＤＮＡ状のｐＦＯＤ２を鋳型ＤＮＡとし、１μ
ｇのＦＯＤ３と１μｇのＦＯＤ４を変異用プライマーと
して、Ｍｕｔａｎ−Ｋを用い、添付のマニュアルに従っ
て部位特異変異を行い、ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩの認
識部位が追加されたＤＮＡ鎖を含有するプラスミドを合
成した。

【００５６】このプラスミドをＭｕｔａｎ−Ｋに添付の
エシェリヒア・コリＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳ株に常法
に従って導入し、組換え菌体数コロニーから組換えプラ
スミドを抽出し、１０単位の制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎ
ｄＩＩＩで、添付のマニュアルに従って３７℃で２時間
切断処理し、０．７％アガロースゲル電気泳動で分析
し、新たにＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩの認識部位が導入
されているプラスミドを確認、選択した。以上により得
たプラスミドをｐＦＯＤ３と命名した。

【００５７】さらに５μｇのｐＦＯＤ３を用い、制限酵
素ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩそれぞれ１０単位で添付
のマニュアルに従って３７℃で２時間切断処理し、０．
７％アガロースゲル電気泳動で約１．４ｋｂのＦＯＤ遺
伝子を含むＤＮＡ断片を分離回収した。一方、５μｇの
エシェリヒア・コリ宿主プラスミドベクターｐＴＶ１１
９Ｎを前記と同様に切断し、５０ｍＭのトリス−塩酸
（ｐＨ８．０）存在下に、１単位のアルカリ性フォスフ
ァターゼを加え、６５℃で２時間処理した。

【００５８】次いで、前記のＤＮＡ溶液を混合し、実施
例２と同様にライゲーション、トランスフォーメーショ
ンを行い、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する
３．７％のＢＨＩ寒天培地にまき、２５℃で一昼夜培養
した。このようにして、プラスミドベクターｐＴＶ１１
９ＮのＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位にフルクトシル
アミンオキシダーゼ遺伝子を含む約１．４ｋｂのＤＮＡ
断片が挿入されたプラスミドｐＦＯＤ７を保持する形質
転換微生物を取得し、実施例３の方法で組換えプラスミ
ドｐＦＯＤ７を得た。

【００５９】

【実施例７】 ＜エシェリヒア・コリ内でのフルクトシルアミンオキシ
ダーゼの活性発現＞実施例６で作製したプラスミドｐＦ
ＯＤ７を保持する形質転換微生物をアンピシリン５０μ
ｇ／ｍｌ及び１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ
−チオガラクトピラノシド）を含有する３．７％のＢＨ
Ｉ培地にて３７℃で一昼夜培養した後、培養液を１５０
００ｒｐｍで１分間遠心分離処理して沈澱を回収した。
この沈澱に、該培養液と同量の１０ｍＭのトリス−塩酸
（ｐＨ８．０）を加え、超音波破砕を行った。

【００６０】この破砕液を適宜希釈した後、２０μｌと
り、前記に示した酵素活性測定法にてフルクトシルアミ
ンオキシダーゼ活性を定量した。なお、比較のためにｐ
ＴＶ１１９Ｎのみをトランスフォーメーションしたエシ
ェリヒア・コリＤＨ１の破砕液についても前記と同様の
処理を行い、フルクトシルアミンオキシダーゼ活性を測
定した。その結果、プラスミドｐＦＯＤ７を保持した形
質転換微生物での活性は０．０８Ｕ／ｍｌであったが、
ｐＴＶ１１９Ｎを持つものの活性は検出できなかった。
これより、フルクトシルアミンオキシダーゼ活性をもつ
形質転換体が得られていることが確認された。この形質
転換体をエシェリヒア・コリＤＨ１・ｐＦＯＤ７（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ・ＤＨ１・ｐＦＯＤ７）
（微工研寄託、ＦＥＲＭ Ｐ−１５９４３）と命名し
た。

【００６１】このようにして得られたフルクトシルアミ
ンオキシダーゼを単離・精製し、発現蛋白の理化学的性
質を確認し、フサリウム・オキシスポルムＩＦＯ−９９
７２のフルクトシルアミンオキシダーゼと同一であるこ
とを確認した。

【００６２】

【発明の効果】本発明によるとフサリウム・オキシスポ
ルムＩＦＯ−９９７２由来の染色体ＤＮＡライブラリー
から、フルクトシルアミンオキシダーゼを発現する遺伝
子ＤＮＡをスクリーニングし、これを用いて構築された
発現ベクターを例えばエシェリヒア・コリに属する微生
物に導入することによって、得られた形質転換微生物は
効率よくフルクトシルアミンオキシダーゼを生産するこ
とができる。

【００６３】また、本発明によって、初めてフルクトシ
ルアミンオキシダーゼの全アミノ酸配列及びこのアミノ
酸をコードする遺伝子ＤＮＡの塩基配列が決定できたの
で、該酵素の基質及び補酵素特異性の変換や耐熱性の向
上などのプロテインエンジニアリングが可能となった。

【００６４】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１３２０ 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：フサリウム・オキシスポルム 株名：ＩＦＯ−９９７２ 配列の名称：フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子 配列の特徴 １−１３２０ Ｐ ＣＤＳ 配列 GCC TCA ACT CTC ACC AAA CAG TCC CAA ATT CTC ATC GTT GGT GGC GGA 48 Ala Ser Thr Leu Thr Lys Gln Ser Gln Ile Leu Ile Val Gly Gly Gly 1 5 10 15 ACT TGG GGA TGC TCA ACT GCC CTC CAT CTC GCC CGT CGG GGT TAC ACC 96 Thr Trp Gly Cys Ser Thr Ala Leu His Leu Ala Arg Arg Gly Tyr Thr 20 25 30 AAC GTC ACT GTT CTC GAT GTC AAT CGC ATC CCG TCA CCG ATA TCA GCC 144 Asn Val Thr Val Leu Asp Val Asn Arg Ile Pro Ser Pro Ile Ser Ala 35 40 45 GGG CAT GAT GTA AAC AAA CTT GCT GGC CGA CTG TCG ACT GCC GAT AGC 192 Gly His Asp Val Asn Lys Leu Ala Gly Arg Leu Ser Thr Ala Asp Ser 50 55 60 AAA GGT GAT GAT GAA GAC TCA ATC TGG AAA GCA CTT AGC TAC GCC GCA 240 Lys Gly Asp Asp Glu Asp Ser Ile Trp Lys Ala Leu Ser Tyr Ala Ala 65 70 75 80 GCT CAA GGA TGG CTC CAC GAC CCT GTC TTC CAA CCA TTC TGC CAC AAT 288 Ala Gln Gly Trp Leu His Asp Pro Val Phe Gln Pro Phe Cys His Asn 85 90 95 ACA GGC TCT GTC GTG GCT GGC TCA ACA CCA AAG TCT ATC AAG CAG CTG 336 Thr Gly Ser Val Val Ala Gly Ser Thr Pro Lys Ser Ile Lys Gln Leu 100 105 110 GTA GAA GAT GAG ATC GGT GAC GAC ATC GAC CAG TAT ACA CCT CTC AAC 384 Val Glu Asp Glu Ile Gly Asp Asp Ile Asp Gln Tyr Thr Pro Leu Asn 115 120 125 ACA GCA GAA GAT TTC AGA AAG ACC ATG CCT GAG GGT ATC CTG ACA GGT 432 Thr Ala Glu Asp Phe Arg Lys Thr Met Pro Glu Gly Ile Leu Thr Gly 130 135 140 AAC TTT CCA GGC TGG AAG GGC TTT TAC AAG CCC ACG GGT TCT GGT TGG 480 Asn Phe Pro Gly Trp Lys Gly Phe Tyr Lys Pro Thr Gly Ser Gly Trp 145 150 155 160 GTT CAT GCT CGA AAA GCT ATG AAA GCT GCT TTC GAA GAG AGC GAG AGG 528 Val His Ala Arg Lys Ala Met Lys Ala Ala Phe Glu Glu Ser Glu Arg 165 170 175 CTT GGT GTC AAA TTC ATC ACT GGC TCT CCC GAA GGA AAG GTG GAG AGT 576 Leu Gly Val Lys Phe Ile Thr Gly Ser Pro Glu Gly Lys Val Glu Ser 180 185 190 CTG ATC TTT GAA GAC GGC GAT GTT CGA GGT GCC AAG ACG GCA GAT GGT 624 Leu Ile Phe Glu Asp Gly Asp Val Arg Gly Ala Lys Thr Ala Asp Gly 195 200 205 AAG GAG CAC AGA GCG GAT CGA ACT ATT CTT TCC GCT GGT GCT TCA GCA 672 Lys Glu His Arg Ala Asp Arg Thr Ile Leu Ser Ala Gly Ala Ser Ala 210 215 220 GAG TTC TTC CTC GAT TTT GAG AAC CAG ATC CAG CCT ACG GCG TGG ACC 720 Glu Phe Phe Leu Asp Phe Glu Asn Gln Ile Gln Pro Thr Ala Trp Thr 225 230 235 240 CTG GGC CAT ATC CAG ATG ACA CCA GAA GAA ACC AAG CTG TAC AAG AAC 768 Leu Gly His Ile Gln Ile Thr Pro Glu Glu Thr Lys Leu Tyr Lys Asn 245 250 255 CTG CCA CCT CTT TTC AAC ATC AAC CAA GGT TTC TTC ATG GAA CCT GAT 816 Leu Pro Pro Leu Phe Asn Ile Asn Gln Gly Phe Phe Met Glu Pro Asp 260 265 270 GAG GAT CTT CAT CAA CTC AAG ATG TGC GAT GAA CAT CCG GGC TAC TGC 864 Glu Asp Leu His Gln Leu Lys Met Cys Asp Glu His Pro Gly Tyr Cys 275 280 285 AAC TGG GTT GAA AAG CCT GGT TCT AAG TAC CCC CAG TCC ATC CCC TTC 912 Asn Trp Val Glu Lys Pro Gly Ser Lys Tyr Pro Gln Ser Ile Pro Phe 290 295 300 GCA AAG CAT CAA GTG CCA ACC GAG GCT GAA CGA CGC ATG AAG CAG TTT 960 Ala Lys His Gln Val Pro Thr Glu Ala Glu Arg Arg Met Lys Gln Phe 305 310 315 320 CTG AAA GAT ATC ATG CCT CAG CTT GCA GAT CGG CCG CTT GTT CAT GCT 1008 Leu Lys Asp Ile Met Pro Gln Leu Ala Asp Arg Pro Leu Val His Ala 325 330 335 CGA ATC TGC TGG TGC GCT GAT ACA CAG GAT AGA ATG TTC CTG ATC ACC 1056 Arg Ile Cys Trp Cys Ala Asp Thr Gln Asp Arg Met Phe Leu Ile Thr 340 345 350 TAT CAT CCT CGA CAT CCC TCA CTT GTC ATT GCT TCA GGT GAT TGC GGC 1104 Tyr His Pro Arg His Pro Ser Leu Val Ile Ala Ser Gly Asp Cys Gly 355 360 365 ACG GGT TAC AAG CAT ATC ACA TCA ATT GGA AAG TTC ATC TCT GAC TGT 1152 Thr Gly Tyr Lys His Ile Thr Ser Ile Gly Lys Phe Ile Ser Asp Cys 370 375 380 ATG GAG GGT ACG CTT GAG GAA AGG TTT GCC AAG TTC TGG AGA TGG CGA 1200 Met Glu Gly Thr Leu Glu Glu Arg Phe Ala Lys Tyr Trp Arg Trp Arg 385 390 395 400 CCA GAG AAG TTT ACC GAG TTC TGG GGT AAA GAT CCT CTG GAT CGG TTT 1248 Pro Glu Lys Phe Thr Glu Phe Trp Gly Lys Asp Pro Leu Asp Arg Phe 405 410 415 GGA GCT GAC GAT AAG ATC ATG GAT TTG CCC AAG AGT GAT GTA GAG GGA 1296 Gly Ala Asp Asp Lys Ile Met Asp Leu Pro Lys Ser Asp Val Glu Gly 420 425 430 TGG ACA AAT ATC AAG AAT GAT ATC 1320 Trp Thr Asn Ile Lys Asn Asp Ile 435 440 配列番号：２ 配列の長さ：１０９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：フサリウム・オキシスポルム 株名：ＩＦＯ−９９７２ 配列 Glu His Arg Ala Asp Arg Thr Ile Leu Ser Ala Gly Ala Ser Ala Glu 1 5 10 15 Phe Phe Leu Asp Phe Glu Asn Gln Ile Arg Pro Thr Ala Trp Thr Leu 20 25 30 Gly His Ile Gln Met Thr Pro Glu Glu Thr Lys Leu Tyr Lys Asn Leu 35 40 45 Pro Pro Leu Phe Asn Ile Asn Gln Gly Phe Phe Met Glu Pro Asp Glu 50 55 60 Asp Leu His Gln Leu Lys Met Xaa Asp Glu His Pro Gly Tyr Xaa Asn 65 70 75 80 Trp Val Glu Lys Pro Gly Ser Lys Tyr Pro Gln Ser Ile Pro Phe Ala 85 90 95 Lys His Gln Val Pro Thr Glu Ala Glu Arg Arg Met Lys 100 105 配列番号：３ 配列の長さ：５６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：フサリウム・オキシスポルム 株名：ＩＦＯ−９９７２ 配列 Asp Xaa Gly Thr Gly Tyr Lys His Ile Thr Ser Ile Gly Lys Phe Ile 1 5 10 15 Ser Asp Xaa Met Glu Gly Thr Leu Glu Glu Arg Phe Ala Lys Phe Trp 20 25 30 Arg Trp Arg Pro Glu Lys Phe Thr Glu Phe Trp Gly Lys Asp Pro Leu 35 40 45 Asp Arg Phe Gly Ala Asp Asp Lys 50 55 配列番号：４ 配列の長さ：５８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：フサリウム・オキシスポルム 株名：ＩＦＯ−９９７２ 配列 Leu Ala Gly Arg Leu Ser Thr Ala Asp Ser Lys Gly Asp Asp Glu Asp 1 5 10 15 Ser Ile Trp Lys Ala Leu Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Gly Trp Leu His 20 25 30 Asp Pro Val Phe Gln Pro Phe Xaa His Asn Thr Gly Ser Val Val Ala 35 40 45 Gly Ser Thr Pro Lys Ser Ile Lys Leu Val 50 55 配列番号：５ 配列の長さ：４９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：フサリウム・オキシスポルム 株名：ＩＦＯ−９９７２ 配列 Asp Asp Ile Asp Gln Tyr Thr Pro Leu Asn Thr Ala Glu Asp Phe Arg 1 5 10 15 Lys Thr Met Pro Glu Gly Ile Leu Thr Gly Asn Phe Pro Gly Trp Lys 20 25 30 Gly Phe TYr Lys Pro Thr Gly Ser Gly Trp Val His Ala Arg Lys Ala 35 40 45 Met 配列番号：６ 配列の長さ：４３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：フサリウム・オキシスポルム 株名：ＩＦＯ−９９７２ 配列 Gln Ser Gln Ile Leu Ile Val Gly Gly Gly Thr Trp Gly Xaa Ser Thr 1 5 10 15 Ala Leu His Leu Ala Arg Arg Gly Tyr Thr Asn Val Thr Val Leu Asp 20 25 30 Val Asn Arg Ile Pro Xaa Pro Ile Xaa Ala Gly 35 40 配列番号：７ 配列の長さ：３１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：フサリウム・オキシスポルム 株名：ＩＦＯ−９９７２ 配列 Asp Ile Met Pro Gln Leu Ala Asp Arg Pro Leu Val His Ala Arg Ile 1 5 10 15 Xaa Trp Xaa Ala Asp Thr Gln Asp Arg Met Phe Leu Ile Thr Tyr 20 25 30 配列番号：８ 配列の長さ：２０ 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 TTY ATG GAR CCN GAY GAR GA 20 Phe Met Glu Pro Asp Glu Asp 1 5 配列番号：９ 配列の長さ：４８ 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 GTAAACAAAC TTGCTGGCCG ACTGTCGACT GCCGATAGCA AAGGTGAT 48 配列番号：１０ 配列の長さ：２４ 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 ACAATCACTA CCATGGCCTC AACT 24 配列番号：１１ 配列の長さ：２３ 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 GAAGAGAAGC TTAGAATAGA AAC 23

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はプラスミドｐＦＯＤ７の構造を示す模式
図である。図中の「ｆｏｄ」はフルクトシルアミンオキ
シダーゼ遺伝子を、「ａｐ」はアンピシリン耐性遺伝子
を、「ｌａｃ」はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子由来プロ
モーター配列を、「ｏｒｉ」はプラスミド複製起点を示
す。また、「ＮｃｏＩ」、「ＨｉｎｄＩＩＩ」は制限酵
素認識部位を、「ｐＴＶ１１９Ｎ」、「Ｆ．ｏｘｙｓｐ
ｏｒｕｍ ＤＮＡ」はプラスミドの各領域の由来を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/06 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表１のアミノ酸配列の１から４４０
   で表されるアミノ酸配列を有するフルクトシルアミンオ
   キシダーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有す
   るＤＮＡによって形質転換されたものであることを特徴
   とするフルクトシルアミンオキシダーゼを生産する実質
   上純粋な微生物。
2. 【請求項２】 形質転換された微生物が、エシェリヒア
   ・コリに属する微生物である請求項１記載の微生物。
3. 【請求項３】 形質転換されたエシェリヒア・コリに属
   する微生物が、プラスミドｐＦＯＤ７によって形質転換
   された微生物である請求項１記載の微生物。
4. 【請求項４】 形質転換されたエシェリヒア・コリに属
   する微生物が、エシェリヒア・コリＤＨ１・ｐＦＯＤ７
   （微工研寄託、ＦＥＲＭ Ｐ−１５９４３）である請求
   項１記載の微生物。
5. 【請求項５】 配列表１のアミノ酸配列の１から４４０
   で表されるアミノ酸配列を有するフルクトシルアミンオ
   キシダーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有す
   ることを特徴とするフルクトシルアミンオキシダーゼを
   発現する実質上純粋なＤＮＡ。
6. 【請求項６】 ＤＮＡが、配列表１の塩基配列の１から
   １３２０で表される塩基配列を有する請求項５記載のＤ
   ＮＡ。
7. 【請求項７】 配列表１のアミノ酸配列の１から４４０
   で表されるアミノ酸配列を有するフルクトシルアミンオ
   キシダーゼをコードする塩基配列を有するＤＮＡによっ
   て形質転換された微生物であるフルクトシルアミンオキ
   シダーゼを生産する実質上純粋な微生物を培地に培養
   し、次いでその培養物からフルクトシルアミンオキシダ
   ーゼを採取することを特徴とするフルクトシルアミンオ
   キシダーゼの製造法。
8. 【請求項８】 形質転換された微生物が、エシェリヒア
   属に属するフルクトシルアミンオキシダーゼを生産する
   実質上純粋な微生物である請求項７記載のフルクトシル
   アミンオキシダーゼの製造法。
9. 【請求項９】 形質転換された微生物が、エシェリヒア
   ・コリＤＨ１・ｐＦＯＤ７（微工研寄託、ＦＥＲＭ Ｐ
   −１５９４３）である請求項７記載のフルクトシルアミ
   ンオキシダーゼの製造法。
10. 【請求項１０】 培養において２８℃以下で培養する請
    求項７記載のフルクトシルアミンオキシダーゼの製造
    法。