JPH1033180A - 組換えフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ - Google Patents
組換えフルクトシルアミノ酸オキシダーゼInfo
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- JPH1033180A JPH1033180A JP8194557A JP19455796A JPH1033180A JP H1033180 A JPH1033180 A JP H1033180A JP 8194557 A JP8194557 A JP 8194557A JP 19455796 A JP19455796 A JP 19455796A JP H1033180 A JPH1033180 A JP H1033180A
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Abstract
酸オキシダーゼの製造。 【解決手段】 異種遺伝子を導入された真核細胞により
生産されたことを特徴とするフルクトシルアミノ酸オキ
シダーゼ。
Description
によるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ(以下、FA
OD−Lと称する)の真核細胞による製造に関し、より
詳しくは、アスペルギルス属(Aspergillu s)由来のF
AOD−Lをコードする遺伝子を含有し、真核細胞内で
機能的な発現ベクター、該発現ベクターにより形質転換
された真核細胞、得られた形質転換体を培養することに
よる組換えFAOD−Lの製造、そのようにして得られ
る組換えFAOD−L、該組換えFAOD−Lを用いる
アマドリ化合物の分析法及び該分析法に有用な試薬に関
する。
及びアミノ酸のようなアミノ基を有する物質と、アルド
ースのような還元性の糖が共存する場合、アミノ基とア
ルデヒド基が非酵素的かつ非可逆的に結合し、アマドリ
転移することにより生成される物質であり、醤油等の食
品、及び血液等の体液に含有されている。その生成速度
は、反応性物質の濃度、接触時間、温度などの関数であ
ることから、生成量を測定することにより、それら反応
性物質を含有する物質に関する様々な情報を得ることが
できる。例えば、生体内では、グルコースとアミノ酸が
結合したアマドリ化合物であるフルクトシルアミン誘導
体が生成しており、血液中のヘモグロビンが糖化された
フルクトシルアミン誘導体はグリコヘモグロビン、アル
ブミンが糖化された誘導体はグリコアルブミン、血液中
のタンパクが糖化された誘導体はフルクトサミンと呼ば
れる。これらの血中濃度は、過去の一定期間の平均血糖
値を反映しており、その測定値は、糖尿病の症状の重要
な指標となり得るために、測定手段の確立は臨床上、極
めて有用である。また、食品中のアマドリ化合物を定量
することにより、その食品の製造後の保存状況や期間を
知ることができ、品質管理に役立つと考えられる。この
ように、アマドリ化合物の定量分析は医学及び食品を含
む広範な分野で有用である。
化還元酵素を作用させ、酸素の消費量又は過酸化水素の
発生量を測定することにより、定量する分析法が提案さ
れている(例えば、特公平5−33997号公報、特開
昭61ー268178号公報、特開平2−195900
号公報、特開平3−155780号公報)。さらに、糖
尿病の診断のための糖化タンパクの定量法も開示されて
いる(特開平2−195899号公報、特開平2−19
5900号公報)。
反応は下記の一般式で表すことができる。
H2O→R1−CO−CHO + R2−NH2 + H2
O2 (式中、R1はアルドース残基、R2はアミノ酸、タンパ
ク質又はペプチド残基を表す) 本出願人は、上記の目的に適う酵素として、フサリウム
属(Fusa rium)由来のフルクトシルアミノ酸オキシダー
ゼ(FAOD−L及びFAOD−S)を精製し、その有
用性を明らかにした(特開平8−154672、特開平
7−289253)。また、アスペルギルス属(Asper
gillus)が、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ(FA
OD−L)を生産することも明らかにした。
し、培地から該酵素を抽出して製造する方法は、多くの
労力と時間を必要とし、非効率的である。また、精製法
で得られる酵素には、フサリウム属又はアスペルギルス
属の菌株固有のタンパク質等の不純物が付随する確立が
高く、そのような不純物には、FAOD−L活性に悪影
響を及ぼす物質が混在する可能性があり、測定の信頼性
が十分に確保できない恐れがあった。従って、フサリウ
ム属またはアスペルギルス属の菌に由来する不純物を伴
わないFAOD−Lを効率よく製造する方法の開発が求
められていた。そのためには、フサリウム属又はアスペ
ルギルス属由来のFAOD−LをコードするDNAをク
ローニングし、該DNAを含有する適当な発現ベクター
を構築し、該発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、該
形質転換体を適当な培地で培養することにより、解決す
ることができる。しかしながら、フサリウム属またはア
スペルギルス属由来のFAOD−LをコードするDNA
がクローニングされた例はなく、まず、そのようなDN
Aのクローニングが必要であった。
鋭意研究を行った結果、アスペルギルス・テレウス G
P1(Aspergillus terreus GP1:FERM−15
664)が産生するFAOD−LをコードするDNAを
クローニングし、該DNAを含有する発現ベクターを構
築し、該発現ベクターで大腸菌を形質転換し、得られた
大腸菌形質転換体(E.coli SOLR/pFAL2及
びE.coli JM109/pFAL2)を培養すること
により、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を有す
る組換えFAOD−Lを製造した。
ペルギルス・テレウス GP1(Aspergillus terreus
GP1:FERM−15664)が生産していたFA
OD−Lを原核生物に生産させると、インクルージョン
ボディ(封入体)を形成し、効率的な酵素の生産を確保
できない恐れがある。このような現象は当業者に公知で
あり、多くの文献に記載されている(例、ラボマニュア
ル遺伝子工学増補版、丸善株式会社、187頁参照)。
従って、FAOD−Lをコードする遺伝子(又はDN
A)を含有し、真核細胞を形質転換することが可能な発
現ベクターを構築し、該発現ベクターで真核細胞を形質
転換し、得られた形質転換体を培養して酵素を生産させ
る方法の開発が必要であった。
を解決するために鋭意研究を行った結果、FAOD−L
をコードする遺伝子(又はDNA)を適当な発現ベクタ
ーに挿入し、得られたベクターを用いて真核細胞を形質
転換し、FAOD−Lを生産させることに成功した。す
なわち、本発明はアスペルギルス属(Aspergillus)の
菌に由来するFAOD−Lをコードする異種遺伝子を導
入された真核細胞により生産されたことを特徴とするF
AOD−Lを提供するものである。異種遺伝子として
は、アスペルギルス属(Asper gillus)の菌に由来する
FAOD−Lをコードする遺伝子であることが好まし
く、アスペルギルス・テレウスGP1(As pergillus t
err eus GP1:FERM−15664)由来のFAO
D−Lをコードする遺伝子がより好ましい。本発明のF
AOD−Lは、例えば、後述する実施例に記載のごとく
原核性宿主を形質転換して得られる形質転換体(例、
E.col i SOLR/pFAL2又はE.coli JM10
9/pFAL2)から得られるFAOD−Lをコードす
るDNA断片を真核細胞に発現させることによって得る
ことができる。
コードする異種遺伝子を含有し、真核細胞内で機能的な
発現ベクターを提供するものである。該遺伝子は、好ま
しくはアスペルギルス属(Aspergillus)の菌、より好
ましくはアスペルギルス・テレウス GP1(Asp ergi
llus terre us GP1:FERM−15664)由来の
FAOD−Lをコードする遺伝子である。そのような発
現ベクターには、実施例に記載の原核性形質転換体であ
るE.coli SOLR/pFAL2又はE.c oli JM1
09/pFAL2から得られるFAOD−Lをコードす
るDNA断片を含有させてもよい。最も好ましい発現ベ
クターはプラスミドpNFL8である。本明細書中、発
現ベクターが真核細胞内で「機能的」であるとは、該ベ
クターを真核細胞に導入したとき、得られた形質転換体
が適当な培地で増殖し、該ベクターに含有されている異
種のFAOD−Lを生産しうることを意味する。「異種
遺伝子」とは、FAOD−Lを生産する真核細胞固有の
遺伝子以外の外来性遺伝子であることを意味する。な
お、本明細書中、「遺伝子」及び「DNA」なる語句
は、起源に関係なく、目的のFAOD−L活性を有する
ペプチドをコードすることを条件として、相互変換可能
に用いられる。
胞を形質転換して得られる形質転換体を提供するもので
ある。真核細胞は、好ましくは酵母、より好ましくはメ
タノール酵母である(メチロトロフ酵母またはメタノー
ル資化性酵母)。さらに、本発明は、これらの形質転換
体を培地に培養し、培養物からフルクトシルアミノ酸オ
キシダーゼを回収することを特徴とするフルクトシルア
ミノ酸オキシダーゼの製造方法を提供するものである。
また、本発明は、アマドリ化合物を含有する試料と、こ
れら形質転換体の培養物又はその処理物を接触させ、酸
素の消費量又は過酸化水素の発生量を測定することを特
徴とする、試料中のアマドリ化合物の分析法を提供する
ものである。本発明の分析法は、アマドリ化合物を含有
する試料の全てに適用可能であるが、生体成分であるこ
とが好ましい。また、その場合、該生体成分中の糖化タ
ンパクの量及び/又は糖化率の測定、あるいはフルクト
サミンの定量により行うことが好ましい。本発明はま
た、上記の形質転換体の培養物又はその処理物を含有す
るアマドリ化合物の分析のための試薬又はキットを提供
するものである。該試薬及びキットは、好ましくは生体
成分中の糖化タンパクの量及び/又は糖化率の測定、あ
るいはフルクトサミンの定量のために用いられるもので
ある。
ケトアルデヒド、アミン誘導体及び過酸化水素を生成す
る反応を触媒する酵素活性を有し; (2)SDS−PAGEにより測定したとき、分子量約
48,000ダルトンの同一サブユニット2個より成
り; (3)そのN末端に配列表の配列番号2で示されるアミ
ノ酸配列を、また、中間に配列番号3で示されるアミノ
酸配列を有し;かつ (4)アスペルギルス属(Aspergill us)の菌由来の他
のタンパク質を実質上含有しない;を有するペプチド又
はその酵素活性を有するフラグメントである。本発明の
FAOD−L又はそのフラグメントは、配列番号1記載
のアミノ酸配列又はその部分配列を含有することが好ま
しい。また、本発明の発現ベクターは、1つの実施態様
として、配列番号1記載の塩基配列又はその部分配列を
含有する。
から得られる物質であって、上記式(I)で示される反応
を触媒する酵素活性を高め、及び/又は酵素活性の利用
をより容易にするために、当該技術分野で通常の方法に
より処理された物質を指す。FAOD−L活性が形質転
換体細胞内に止まっている場合、処理物の例として以下
のものを挙げることができる。 (1)生の細胞:ろ過又は遠心等の通常の方法で培養物
から分離された細胞。 (2)乾燥細胞:(1)の生細胞を凍結乾燥又は真空乾
燥したもの。 (3)細胞抽出物:(1)又は(2)の細胞を通常の方
法(例えば有機溶媒中での自己溶菌、アルミナや海砂と
混合しての摩砕、又は超音波処理)して得られる。 (4)酵素溶液:細胞抽出物を常法通り精製するか部分
精製することにより得られる。 (5)精製酵素:(4)に記載の酵素溶液をさらに精製
し、不純物を含まないもの。 (6)酵素活性を有するフラグメント;精製酵素等を適
当な方法で断片化処理することにより得られるペプチド
フラグメント。 (7)固定化細胞又は酵素:細胞又は酵素を通常の方法
で固定化(例えばポリアクリルアミド、ガラスビーズ、
イオン交換樹脂等に固定化)したもの。培地に分泌され
る場合は、培養物そのもの及びそれから精製される酵素
(溶液、凍結乾燥品、断片化したフラグメント等)及び
固定化酵素が培養物又は処理物の例として挙げられる。
本発明の目的には、酵素活性を有するフラグメントも有
用であり、そのような「酵素活性を有するフラグメン
ト」は、(6)に記載のごとく、FAOD−L活性を有
し、本発明の目的に有用なペプチドフラグメントを指
す。それは、例えば、上記(5)の精製酵素を、適当な
方法で断片化処理することにより得ることができ、培養
物の処理物の1つである。なお、本明細書で、単にFA
OD−Lというときにも、上記の培養物の処理物の1つ
を表す場合がある。
のための発現ベクターの構築、形質転換及び形質転換体
の培養は、当該技術分野で既知の方法に従って行うこと
ができる。本発明のFAOD−Lの生産に適した真核細
胞としては、酵母、特にS a ccharomyces属に属する株
(例えば、S.cerevisiae)やCandida属に属する株
(例えば、C.boidinii)、動物細胞又は培養植物細
胞、例えば、マウスL929細胞、チャイニーズハムス
ター卵巣(CHO)細胞などが例示される。通常、発現
には菌体内発現と分泌発現の2種類があるが、各々につ
いて適当な発現系が存在する。例えば、酵母形質転換体
に、発現産物を細胞外に分泌させる必要があれば、FA
OD−LをコードするDNAのN末端に宿主酵母由来の
分泌蛋白質のシグナル配列の遺伝子を連結させて、発現
産物をペリプラスムに分泌させるよう、発現系を構築す
る。
ターは既知であり、それらから任意に選択することがで
きるが、酵母でのFAOD−Lの発現のための発現ベク
ターとしては、GALプロモーターやAODプロモータ
ー等のプロモーターを含有するものが好ましい。又、哺
乳動物細胞でのFAOD−L発現のための発現ベクター
としては、SV40プロモーター等のプロモーターを有
するものが挙げられる。また、発現効率を高めるため
に、当該技術分野で既知の多コピー型プラスミドを用い
て、多コピー型発現ベクターを構築することもできる。
FAOD−L発現ベクターの構築は、適当な方法で得ら
れるFAOD−Lをコードする遺伝子又はDNA、例え
ばmRNAの逆転写によって得られるcDNA、既にク
ローン化されたDNA、あるいは合成DNA等を、適当
な発現ベクターに挿入することにより行うことができ、
そのような方法は当該技術分野で既知である。
ーの構築方法を示すが、これは1例にすぎず、本発明は
以下の発現ベクターに限定されるものではない。酵母で
のFAOD−L遺伝子の発現のために、C.boidin iiの
染色体挿入型発現ベクターであるプラスミドpNOTel
(特開平5−344895)を用い、FAOD−L発現
ベクターを構築する。このプラスミドpNOTelは、A
ODプロモーターとURA3遺伝子を含んでおり、該プ
ラスミドで形質転換された形質転換体を、Ura要求を
指標として選抜する手段を与えることができる。まず、
クローン化FAOD−LcDNAを含む大腸菌発現ベク
ターpFAL2を、実施例の記載に従って得られるE.
coli SOLR/pFAL2又はE.coli JM109/
pFAL2から得、これを鋳型としてFAOD−LのN
末端とC末端に相当する2種のプライマー(配列番号4
及び5)を用いてPCRを行い、約1.3kbのFAO
D−LcDNA断片を得、精製した。他方、プラスミド
pNOTelを制限酵素NotIにより消化した後、ウシ腸ホ
スファターゼを用いて脱リン酸化処理し、上記の、FA
OD−LcDNA断片と共にDNA Blunting Kit(宝
酒造株式会社)を用いて平滑化した。これらをDNA l
igation Kit(宝酒造株式会社)を用いて連結し、プラ
スミドpNFLを得た。これを大腸菌にHanahan法(H
anahan,D,Techniques for Transformation of E.
coli. In:DNA Cloning, vol I, Glover, D.
M.(ed), pp109-136, IRL Press,1985)で形質転換
し、得られた形質転換体から任意に84株を選択してプ
ラスミドを調製した。プラスミドを制限酵素HindIIIで
処理して挿入片の方向性を確認し、FAOD−LcDN
A断片がAODプロモーターの下流に挿入されているプ
ラスミドpNFL8を得た。該プラスミドpNFL8の
制限地図は図5に示されている。
a要求性のC.boidiniiTK62株を形質転換し、形質転換
体をUraを含まないYNB培地で培養した。URA +
型形質転換体から任意に14株を選び、これらの株をメ
タノール含有基本培地で培養すると、その11株が後述
の表1に示すように、FAOD−Lを生産した。形質転
換体のサザン解析の結果、大多数の形質転換体がシング
ルコピーを有していることがわかった。
既知であり、Molecular Cloning:A LABOLATORY MANU
AL, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載
の方法で行うことができる。真核性宿主の場合は、コン
ピテントセル作製法、エレクトロポレーション法、リチ
ウム改変法、哺乳動物細胞の場合はトランスフェクショ
ン法、エレクトロポレーション法により行うことができ
る。形質転換体の培養に用いる培地は、炭素源(例えば
グルコース、メタノール、ガラクトース、フルクトース
等)及び無機また有機窒素源(例えば硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、ペプトン、カ
ザミノ酸等)を含有していてよい。所望により、培地に
他の栄養源(例えば無機塩類(塩化ナトリウム、塩化カ
リウム)、ビタミン類(例えばビタミンB1)、抗生物
質(例えばアンピシリン、テトラサイクリン、カナマイ
シン等))を加えてもよい。哺乳動物細胞の培養には、
イーグル培地が適当である。本発明のFAOD−Lの製
造に適した培地は、0.1〜5.0%、好ましくは0.5
〜2.0%のNH4Cl及び/又は0.1〜5.0%、好ま
しくは1%の酵母エキスを含有する、メタノール0.1
〜5.0%、好ましくは1.5%を含有する基本培地であ
る。例えば、後述の表2及び3には、宿主細胞がメタノ
ール酵母である場合の培地条件の比較が示されている。
表から、1.5%メタノール含有基本培地でも十分にF
AOD−Lが生産されるが、窒素源としてNH4Clを
含有することが好ましく、酵母エキスの濃度が約1%で
あることが好ましいことが分る。
8.0、好ましくはpH5.5〜6.0、25〜40℃(好
ましくは28℃)で16〜96時間行えばよい。生産さ
れたFAOD−Lが培養溶液、培養濾液(上澄み)中に
存在しているときは、培養物を濾過又は遠心分離する。
培養濾液から、FAOD−Lを天然又は合成のタンパク
質の精製、単離に一般的に用いられる常法(例えば透
析、ゲル濾過、抗FAOD−Lモノクロナール抗体を用
いてのアフィニティカラムクロマトグラフィー、適当な
吸着剤を用いてのカラムクロマトグラフィー、高速液体
クロマトグラフィー等)によって精製できる。生産され
たFAOD−Lが培養形質転換体のペリプラズム及び細
胞質中に存在するときは、濾過や遠心分離によって細胞
を集め、それらの細胞壁及び/又は細胞膜を、たとえば
超音波及び/又はリゾチーム処理によって、破壊して、
デブリス(細胞破砕物)を得る。デブリスを適当な水溶
液(例えばトリス−塩酸緩衝液)に溶解させる。この溶
液から、常法によって、FAOD−Lを精製することが
できる。
再生(リフォールディング)する必要があるときは、こ
れを常法によって行なうことができる。本発明方法で得
られる形質転換体を適当な培地で培養して得られる培養
物はFAOD−L活性を示すが、このものを上記のごと
く当業者既知の通常の方法でさらに処理して酵素溶液等
の処理物を調製することができる。また、所望により精
製してもよい。例えば、培養物を遠心してFAOD−L
産生−形質転換体を収穫し、りん酸緩衝液に懸濁し、音
波処理等によって細胞を破壊する。次いで、上清を遠心
分離することにより、酵素標品を得る。さらに、上清を
透折し、クロマトグラフィー等でさらに精製すれば精製
酵素が得られる。次いで、制限酵素処理やエキソヌクレ
アーゼ処理等により、酵素活性を有するフラグメントを
得ることができる。
及び酵素活性を有するフラグメントを含む)は、FAO
D−L酵素活性を有し、アマドリ化合物の定量分析に適
しており、例えば、糖尿病の診断に有用である。既述の
ごとく、本発明の形質転換体を培養して得られる培養物
及びその処理物は以下の反応式:
H2O→R1−CO−CHO + R2−NH2 + H2
O2 (式中、R1はアルドース残基、R2はアミノ酸、タンパ
ク質又はペプチド残基を表す)で示されるアマドリ化合
物の酸化還元反応を触媒する。上記式において、R1が
−OH、−(CH2)n−、又は−[CH(OH)]n−C
H2OH(式中、nは0−6の整数)であり、R2が−C
HR3−[CONHR3]mCOOH(式中、R3はα−ア
ミノ酸側鎖残基、mは1−480の整数を表す)で示さ
れるアマドリ化合物が基質として好ましい。中でも、R
3がリジン、ポリリジン、バリン、アスパラギンなどか
ら選択されるアミノ酸の側鎖残基であり、またnが5〜
6、mが55以下である化合物が好ましい。
物を含有すると考えられる試料と本発明のFAOD−L
を発現する形質転換体の培養物又はその処理物を、水又
は緩衝液中で接触させ、酸素の消費量又は過酸化水素の
発生量を測定することにより、試料中のアマドリ化合物
を分析する。本発明の分析法は、生体成分中の、糖化タ
ンパクの量及び/又は糖化率の測定、あるいはフルクト
サミンの定量に基づいて行われる。例えばアマドリ化合
物を含有する緩衝液中の試料に、培養物又はその処理物
の水又は緩衝液中懸濁液(溶液)を加える。pH、温度
及び反応時間等の反応条件は特に限定されるものでな
く、同様の酵素反応に通常用いられる条件から適宜選択
するとよい。しかしながら、約pH4.0〜12.0、好
ましくはpH7.0〜9.0であり、より好ましくはpH
約8.0、温度25〜50℃、好ましくは25〜40
℃、より好ましくは35℃で反応させる。
ドリ化合物を含有する任意の試料溶液を用いることがで
き、例えば、血液(全血、血漿又は血清)、尿等の生体
由来の試料の外、醤油等の食品が挙げられる。緩衝液と
してはトリス−塩酸緩衝液等を用いる。FAOD−L、
FAOD−Lを発現する形質転換体の培養物又はその処
理物の使用量は、終点分析法においては通常、0.1単
位/ml以上、好ましくは1〜100単位/mlである。本
発明の分析法では、下記のいずれかのアマドリ化合物の
定量法を用いる。 (1)過酸化水素発生量に基づく方法 当該技術分野で既知の過酸化水素の定量法、例えば、発
色法、過酸化水素電極を用いる方法等で測定し、過酸化
水素及びアマドリ化合物の量に関して作成した標準曲線
と比較することにより、試料中のアマドリ化合物を定量
する。具体的には、後述の力価の測定法に準じる。ただ
し、FAOD−L量は1ユニット/mlとし適当に希釈
した試料を添加し、生成する過酸化水素量を測定する。
過酸化水素発色系としては、4−アミノアンチピリン/
フェノール系のかわりに4−アミノアンチピリン/N−
エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)
−m−トルイジン,4−アミノアンチピリン/N,N−
ジメチルアニリン,4−アミノアンチピリン/N,N−
ジエチルアニリン,MBTH/N,N−ジメチルアニリ
ン,4−アミノアンチピリン/2,4−ジクロロフェノ
ール等の組み合わせが可能である。
た値(酸素消費量)を測定し、酸素消費量とアマドリ化
合物の量に関して作成した標準曲線と比較することによ
り、試料中のアマドリ化合物を定量する。具合的には、
後述の力価の測定法に準じて行う。但し用いるFAOD
−L量は1ユニット/mlとし、適当に希釈した試料を添
加し吸収される酸素量を求める。
うこともできるが、対象によっては、あらかじめ糖が結
合したリジン残基を遊離させてから行うことが好まし
い。そのような目的には、タンパク質分解酵素を用いる
場合(酵素法)と、塩酸等の化学物質を用いる場合(化
学法)があるが、前者が好ましい。本発明方法に用いる
ことができるタンパク質分解酵素は、当業者に既知であ
り、トリプシン、カルボキシペプチダーゼB、パパイ
ン、アミノペプチダーゼ、キモトリプシン、サーモリシ
ン、ズブシリシン、プロティナーゼK、プロナーゼ等を
挙げることができる。酵素処理の方法も既知であり、例
えばプロテアーゼ処理は、下記実施例に記載の方法で行
うことができる。
現する形質転換体の培養物又はその処理物は、糖化タン
パクに含まれるフルクトシルリジンに高い基質特異性を
有するものであることから、血液試料中の糖化タンパク
を測定することを含む、糖尿病の診断などに有用であ
る。また、フルクトシルバリンにも特異性を有すること
から、糖化ヘモグロビンの測定にも有用である。なお、
検体として血液試料(全血、血漿又は血清)を用いる場
合、採血した試料をそのまま、あるいは透折等の処理を
した後用いる。さらに、本発明方法に用いるFAOD−
Lを発現する形質転換体の培養物又はその処理物、ある
いはパーオキシダーゼ等の酵素は、溶液状態で用いても
よいが、適当な固体支持体に固定化してもよい。例え
ば、ビーズに固定化した酵素をカラムに充填し、自動化
装置に組み込むことにより、臨床検査など、多数の検体
の日常的な分析を効率的に行うことができる。しかも、
固定化酵素は再使用が可能であることから、経済効率の
点でも好ましい。さらには、酵素と発色色素とを適宜組
み合わせ、臨床分析のみならず、食品分析にも有用なア
マドリ化合物の分析のためのキットを得ることができ
る。
により行うことができる。例えば、担体結合法、架橋化
法、包括法、複合法等によって行う。担体としては、高
分子ゲル、マイクロカプセル、アガロース、アルギン
酸、カラギーナンなどがある。結合は共有結合、イオン
結合、物理吸着法、生化学的親和力を利用し、当業者既
知の方法で行う。固定化酵素を用いる場合、分析はカラ
ム又はバッチ方式のいずれでもよい。上記のごとく、固
定化酵素は、血液試料中の糖化タンパクの日常的な分析
(臨床検査)に特に有用である。臨床検査が糖尿病診断
を目的とする場合、診断の基準としては、結果を糖化タ
ンパク濃度として表すか、試料中の全タンパク質濃度に
対する糖化タンパク質の濃度の比率で表される。全タン
パク質濃度は、通常の方法(280nmの吸光度、Lowry
法あるいは、アルブミンの自然蛍光など)で測定するこ
とができる。
薬は、本発明のFAOD−Lを発現する形質転換体の培
養物又はその処理物、及び好ましくはpH7.0〜9.
0、より好ましくはpH8.0の緩衝液からなる。該培
養物又はその処理物が固定化されている場合、固体支持
体は高分子ゲルなどから選択され、好ましくはアルギン
酸である。試薬中の培養物又はその処理物の量は、終点
分析を行う場合、試料あたり、通常1〜100単位/m
l、バッファーはトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)が好
ましい。過酸化水素の生成量に基づいてアマドリ化合物
を定量する場合、発色系としては、上記の各種の組み合
わせを利用することが可能である。本発明のアマドリ化
合物の分析試薬と、適当な発色剤ならびに比較のための
色基準あるいは標準物質を組み合わせてキットとするこ
ともできる。そのようなキットは、予備的な診断、検査
に有用であると考えられる。
るが、これらは本発明を制限するものではない。以下の
実施例において用いたプラスミド類、様々な制限酵素等
の酵素類は、市販品から入手し、供給者の指示に従って
使用するか、文献記載の方法で製造することができる。
また、プラスミドの構築、宿主の形質転換、形質転換体
の培養及び培養物からの酵素の回収は、当業者既知の方
法、あるいは文献記載の方法に準じて行なった。また、
酵素活性は以下の力価の測定法に従って測定した。力価測定法 (1)生成する過酸化水素を比色法により測定する方
法。 A.速度法 100mM FZL溶液はあらかじめ得られたFZLを
蒸留水で溶解することによって調製した。45mM 4−
アミノアンチピリン、60ユニット/mlパーオキシダ
ーゼ溶液、及び60mM フェノール溶液それぞれ10
0μlと、0.1M トリス−塩酸緩衝液(pH8.0)
1ml、及び酵素溶液50μlを混合し、全量を蒸留水
で3.0mlとする。30℃で平衡化した後、100m
M FZL溶液50μlを添加し、505nmにおける
吸光度を経時的に測定した。生成するキノン色素の分子
吸光係数(5.16×103M-1cm-1)から、1分間に生
成する過酸化水素のマイクロモルを算出し、この数字を
酵素活性単位とする。
でインキュベートした後の505nmにおける吸光度を
測定し、別にあらかじめ標準過酸化水素溶液を用いて作
成した検量線から生成した過酸化水素量を算出すること
により、酵素活性を測定する。 (2)酵素反応による酸素吸収を測定する方法 0.1M トリス−塩酸緩衝液1mlと酵素溶液50μl
を混合し、蒸留水で全量を3.0mlとし、ランク ブラ
ザーズ社の酸素電極のセルに入れる。30℃で攪拌し、
溶存酸素と温度を平衡化した後、50mM FZL 10
0μlを添加し、酸素吸収を記録計で連続的に計測し、
初速度を得る。標準曲線から1分間に吸収された酸素量
を求め、これを酵素単位とする。
Aのクローニング 1.アスペルギルス・テレウスGP1(Asper gillus te
rreus GP1;FERMP−15664)のFAOD−
Lの部分アミノ酸配列の決定 1)A. terreus GP1の培養及びFAOD−Lの精製Aspergillus terreus GP1;P−15664)をF
ZL 0.5%、グルコース 1.0%、リン酸二カリウム
0.1%、リン酸一ナトリウム 0.1%、硫酸マグネシ
ウム 0.05%、塩化カルシウム 0.01%, イースト
エキス 0.2%を含有した培地(pH6.0)10Lに植
菌し、ジャーファーメンターを用いて通気量2L/分、
攪拌速度400rpmの条件で28℃、24時間攪拌培
養した。培養物は瀘過して集めた。菌糸体259g(湿
重量)を、2mMのDTTを含む、0.1Mトリス−塩
酸緩衝液(pH8.5)800mlに懸濁し、ダイノ・ミル
により菌糸体を破砕した。破砕液を9,500rpmで
20分間遠心分離し、得られた液を粗酵素液とし、以下
の方法で精製した。
ンモニウム(以下、硫安と略す)を加え、攪拌し、1
2,000rpmで10分間遠心分離した。得られた上
清に75%飽和になるように硫安を加え、撹拌し、1
2,000rpmで10分間遠心分離した。沈殿を2m
MのDTTを含有する50mM トリス−塩酸緩衝液
(pH8.5)(以下、緩衝液Aと略す)に溶解した。
その溶液に硫安40%を含む緩衝液Aを等量加え、次い
で、約200mlのブチル−トヨパール(butyl-TOYO
PEARL)樹脂を加え、穏やかに撹拌した。同緩衝液
で洗浄後、緩衝液Aを用い、バッチ法で溶出した。溶出
液を硫安濃縮し、25%飽和硫安を含む緩衝液Aで平衡
化したフェニル−トヨパール(phenyl-TOYOPEA
RL)カラムに吸着した。同緩衝液にて洗浄した後、硫
安濃度25−0%飽和の直線勾配で溶出した。活性画分
を集め、硫安濃縮後、40%飽和硫安を緩衝液Aで平衡
化したブチル−トヨパールカラムに吸着した。同緩衝液
にて洗浄した後、硫安濃度40−0%飽和の直線濃度勾
配にて溶出した。活性画分を統合し、緩衝液Aで平衡化
したDEAE−トヨパールカラムに供した。活性画分は
同緩衝液による洗浄画分に認められたので、これを集
め、硫安濃縮した。続いて得られた酵素溶液を0.1M
NaCl、2mM DTTを含む0.1Mトリス−塩酸緩衝
液(pH8.5)にて平衡化したセファクリルS−30
0カラムによりゲル瀘過を行い、70〜100ユニット
の精製酵素を得た。
(ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電
気泳動)において、標準タンパクとしてホスホリラーゼ
B、牛血清アルブミン、オボアルブミン、カルボニック
アンヒドラーゼ、大豆トリプシンインヒビターを用い、
デービスの方法に従って分子量を測定した。即ち、10
%ゲルを用いて、40mAで3時間泳動し、クーマシー
ブリリアントブルーG−250でタンパク染色を行っ
た。分子量既知の数種のタンパクについて同様に泳動
し、検量線から分子量を求めた結果、サブユニットの分
子量は約48,000ダルトンであることが示された
(図6)。また、スーパーデックス200pgによるゲ
ルろ過による分子量測定では、図7の検量線図から明ら
かなように、約94,000ダルトンであった。
グマ社製)により断片化し、クリーブランド法[D.W.Cl
eaveland, S.G.Fisher, M.W. Kirschner and U.K. Laem
mli, J.Biol.Chem., 252, 1102 (1977)]によりさらに
断片化した。次いで、PVDF(ポリビニリデン フル
オリド、ミリポア社製、商品名,イモピロン−PSQ)
膜にトランスファー(14Vで一晩(12時間))し、
プロテインシーケンサー476A(アプライドバイオシ
ステムズ社)を用い、エドマン分解法によりアミノ酸配
列を決定した。その結果、N−末端及び内部ペプチドの
2断片からそれぞれ、配列番号2及び3に示す17及び
16残基のアミノ酸配列が決定された。
の増幅 1)オリゴヌクレオチドプライマーの調製 上記1.2)で得たアミノ酸配列から推定される塩基配
列を基に、PCR(ポリメラーゼチェーン反応)に用い
るためのプライマーを、図1に示すように設計した。こ
のプライマーの設計に際して、アスペルギルス属のコド
ン使用率を考慮に入れ、またサブクローニングを容易に
するために、プライマーの端にBamHI認識配列を付加
した。これらプライマー1及び2の塩基配列をそれぞ
れ、配列番号4及び5に示す。なお、プライマー2は、
プライマー1が付着するDNAに相補なDNAに付着す
るよう、図1に記載の配列に基づき、そのC末端側から
合成されている。
菌糸体1gからグアニジン/フェノール/クロロホルム
法(Chomczynski,P. and Sacchi,N. (1987) Single-step
method of RNA isolation by acid guanidinium thioc
yanate-PhOH-chloroform extraction, Anal. Biochem.
162, 156-159)に従って、totalRNA5mgを得た。
したtotalRNAを用い、以下の手順で逆転写ポリメラ
ーゼチェーン反応(RT−PCR)を行った。 a)totalRNA(5μg/μl)2μlに滅菌水36μl
を加え、65℃、5分加温した後、氷上で急冷する。 b)a)の溶液に以下の溶液を加える。 5×buffer 20μl dNTPmix(各20mM) 5μl RNase inhibitor(115U/ml) 2μl Oligo dt (0.42μg/μl) 24μl RTase (MLV)(200U/μl) 1μl DTT(0.1M) 10μl c)a)+b)の溶液を25℃、10分放置した後、4
2℃で一夜反応させる。そして、95℃で5分加熱した
後、氷上で急冷するとcDNAが得られる。 d)c)で合成したcDNA2μlに以下の溶液を加え
る。 10×PCR buffer 2.5μl dNTP mix 1.8μl プライマー1 1 μl プライマー2 1 μl 減菌水 16.575μl e)d)の溶液を95℃で5分加熱した後、氷上で急冷
した後、Taq DNAPolymerase(5U/ml)を0.
125μl加える。 f)e)にミネラルオイルを重層して以下の条件でPC
R反応を行う。(94℃,1分;60℃,2分;72
℃,2分)からなる一連の処理を30サイクル行った
後、72℃で3分処理する。 g)次いで、アガロースゲル電気泳動にかける。その結
果、プライマー1と2を用いたとき、図3に示すように
約400bpの断片の増幅が確認できた。図3は、アガロ
ース電気泳動の結果を示す模写図である。図中、レーン
1はφX174/HincII(マーカー)、レーン2はプ
ライマー1及び2を用いた電気泳動パターンである。マ
ーカーはPCRにより増幅した断片のサイズを判断する
ために泳動を行った。
ルから切り出し、DNA回収用フィルター付遠心チュー
ブ(孔径0.22μm、宝酒造社製Code No.904
0)を用いて、10,000rpm.4℃、1時間の遠
心の後、エタノール沈殿を行うことで精製した。次い
で、PCR断片(1μl)、K buffer(1μl)、Bam
HI(1μl)及び減菌水(7μl)を混合し、37℃で
4時間の消化を行った。得られたBamHI消化断片を、
同じくBamHIで消化したpBluescreipt II SK+(STRAT
AGENE社製:lacプロモータ−を有する大腸菌用発現
ベクター)に、ライゲーション(16℃・30分)し、
得られたライゲーション混合物を用いて大腸菌JM10
9株を形質転換した。形質転換は、TaKaRa Liga
tion Kit Ver. 2.0(宝酒造)を使用し、Hanahan
法(Hanahan,D,Techniques for Transformation
of E.coli. In:DNA Cloning, vol I, Glover,
D.M.(ed), pp109-136, IRL Press, 1985)に従
って行った。その結果、図4に示すように、約400bp
のPCR断片がpBluescreipt II SK+のBamHIサイト
に挿入されたプラスミドpFLPを得た。図4におい
て、レーン1はλ/EcoT141(マーカー)を、レー
ン2はpFLP/BamHIを表す。その塩基配列をジデ
オキシ法により決定したところ、FAOD−LのcDN
Aの部分配列であることが確認された。
ークハイブリダイゼーション 上記の2.2)の方法で得たtotal RNAからmRNA
Purification Kit(ファルマシア社)を用いてmR
NAを得た。該mRNA 5μgから、ZAP-cDNA
Synthesis Kit(STRATAGENE社製)を用いてcDNA
ライブラリーを作成した。即ちmRNA5μgから逆転
写酵素を用いてcDNAを合成し、λZAP IIベク
ター(STRATAGENE社製)に連結し、Gigapack III Gold
(STRATAGENE社製)を用いてインビトロでパッケージン
グしてcDNAライブラリーを得た。(条件等はマニュ
アルに従った。) 次いで、cDNAのタイターを測定した結果、1.0×
105pfu/μgベクターであった。このファージライブラ
リーを大腸菌XLI−Blue MRF株に感染させ、3
7℃で12時間培養することによりプラークを形成させ
た。次いで、3.でサブクローニングしたPCR断片を
32Pで標識してプローブとして用い、プラークハイブリ
ダイゼーションによりスクリーニングした。即ち、得ら
れたプラークをニトロセルロースフィルターに転写し、
アルカリ変性後、42℃で32Pで標識したプローブと1
2時間ハイブリダイズさせた。洗浄後、X線フィルムに
12時間露光させた。その結果、約20,000プラー
クから7つの陽性プラークを得た。
サブクローニング FAOD−LをコードするDNAのプラスミドへのサブ
クローニングはインビトロ切除法で行った。7個の陽性
プラークからExAssistヘルパーファージ(STRATAGENE社
製)を用いて添付のマニュアルに従い、大腸菌JM10
9(E.coli JM109 Competent Cell.宝酒造株
式会社)に形質転換した。得られた形質転換体からプラ
スミドを抽出し塩基配列を決定した。その結果、FAO
D−LのN末端アミノ酸配列に相当する塩基配列を有す
る約1.5kbのDNA断片が挿入されたプラスミドp
FAL2を保持するクローンを1株得た(大腸菌形質転
換体(E.coli JM109/pFAL2))。このpFA
L2の制限地図を図2に示す。該クローンの塩基配列及
び推定のアミノ酸配列を配列番号1に示す。又、該プラ
スミドpFAL2を用いて大腸菌SOLR(STRATAGENE
社)を形質転換して大腸菌形質転換体(E.coli SOL
R/pFAL2)を得た。
reus GP1:FERM−15664)由来のクローン
化cDNAを含む大腸菌発現ベクターpFAL2を、
E.coli JM109/pFAL2(実施例1)から得
た。得られたpFAL2を鋳型としてFAOD−LのN
末端とC末端に相当する2種のプライマー(配列番号6
及び7)を用いて以下の条件でPCRを行って約1.3
kbのFAOD−LcDNA断片を得た。PCR条件:
[94℃,1分;60℃,1分;72℃,3分]を30サ
イクル+72℃,5分を1回。アガロース電気泳動後、
断片を常法通り精製し、FAOD−LcDNA断片を得
た。
895)を制限酵素NotIにより消化した後、ウシ腸ホ
スファターゼ(ベーリンガーマンハイム社)を用いて脱
リン酸化処理し、上記の、FAOD−LcDNA断片と
共にDNA Blunting Kit(宝酒造株式会社)を用いて
平滑化した。これらをDNA ligation Kit(宝酒造株
式会社)を用いて連結し、プラスミドpNFLを得た。
次いで、プラスミドpNFLを用い、Hanahan法(前
掲)でE.coli JM109株を形質転換した。得られた形質
転換体から任意に84株を選択してプラスミドを調製し
た。プラスミドを制限酵素HindIIIで処理して挿入片の
方向性を確認し、FAOD−LcDNA断片がAODプ
ロモーターの下流に挿入されているプラスミドpNFL
8を得た。該プラスミドpNFL8の制限地図を図5に
示す。
り直鎖状にした後、リチウム改変法を用いてC.boidin
iiTK62株に形質転換した。このTK62株はUra要求
性であり、プラスミドpNOTelにはURA3遺伝子が含ま
れているので、Ura要求を指標に形質転換体を選抜す
ることができる。形質転換体をUraを含まないYNB
培地に塗布することにより得られたURA +型の形質転
換体から任意に14株を選び、1.5%メタノール含有
基本培地に接種し、28℃で3日間震盪培養した。集菌
後、菌体内のFAOD−L活性を上記の力価測定法の
A.速度法により測定し、表1の結果を得た。なお、以
下の実施例におけるFAOD−Lの力価測定は同様の方
法で行った。
C.b oidiniiのFAOD−L活性
れ、その内、FLC14株が最大の活性を示した。
ミドのコピー数を決定するためにサザン解析を行った。
活性の異なる形質転換体3株より染色体DNAを抽出
し、制限酵素EcoRIで消化した後、アガロースゲル電
気泳動に供し、常法通りサザンブロッティングした。プ
ローブとしてURA3遺伝子を用い、プローブの標識は
DIG−ELISA法により行った。結果は図8に示す
ように、強い活性を示すC.boidi nii TK62/pNEL14株の
みにおいて8.8kbの断片が認められたので、2コピ
ー以上のFAOD−LcDNA断片が染色体DNAに挿
入されていることが予想された。それ以外のものは全て
シングルコピーであった。これは、挿入されているコピ
ーが1つの時はEcoRI処理により、C.boidiniiのE
coRI認識部位とpNFL8のEcoRI認識部位か
ら9.1kbの断片が切り出されるだけであるのに対し
て、2つ以上のコピーが挿入されていれば、2カ所のp
NFL8のEcoRI認識部位から切り出される断片が
生じ、この断片のサイズが8.8kbであることによる
ものである。
体の培養条件の検討 上記(3)で最も高活性を示した形質転換体C.boidi n
ii TK62/pNEP14株を用い、好適な培養条件を検討した。
1.5%メタノールを含有する基本培地を用い、無機窒
素源を種々変えて培養しFAOD−L活性を測定した。
その結果を表2に示す。表2 C.boidinii TK62/pNEP14株によるFAOD−L
生産に対する窒素源の影響
かる。その培地中の含有量は、0.1〜5.0%、より好
ましくは0.5〜2.0%である。
検討した結果、下記の表3に示すように、酵母エキス濃
度が高いほど、FAOD−L活性が上昇する。好ましい
酵母エキス濃度は0.1〜5.0%、より好ましくは約1
%である。表3 C.boidinii TK62/pNEP14株によるFAOD−L
生産に対する酵母エキス濃度の影響
ル、1.5%メタノール+3%グリセロール、3%グリ
セロールのいずれかを含有する培地でC.boidinii T
K62/pNEP14株を培養しFAOD−L生産のタ
イムコースをとったところ、図9に示すように、メタノ
ール培地でのみ、顕著な生産が認められ、培養40時間
で最大の生産性を示した。以上の実験の結果から、FA
OD−L生産能力を有する形質転換体の培養に適した培
地は、メタノール0.1〜5.0%、好ましくは1.5%
を含有する基本培地に、0.1〜5.0%、より好ましく
は0.5〜2.0%のNH4Cl及び/又は0.1〜5.0
%、より好ましくは1%の酵母エキスを含有するもので
あることが分かる。
ーファーメンターを用いた大量培養C .boidinii TK62/pNEP14株を15L容のジャーファーメ
ンターを用い、1Lの培地中で培養することにより、F
AOD−Lの大量生産を行った。培地は以下の方法で調
整した。1L中に(NH4Cl:5g,K2HPO4:1
g,NaH2PO4:1g,MgSO4・2H20:0.5
g,CaCl2・2H20:0.1g,酵母エキス:10
g)を含有する混合物を、pH6.0に調整し、120
℃,20分オートクレイブ処理した後、1.5%になる
ようにメタノールを加える。その結果、図10に示すよ
うに、培養40時間でFAOD−Lの生産は最大にな
り、40時間を過ぎると生産性の減少が認められた。次
いで、得られた培養物を、遠心分離(10,000rp
m、4℃、1分)により集菌し、ペレットを0.85%
KClで洗浄し、0.1M トリス−塩酸緩衝液 (pH 8.
0)に懸濁した。MINI-BEAT BEATER(ジャパンラムダ社)
で菌体を3,800rpm、30秒で氷冷をはさみなが
ら6回ビーズ破砕し、遠心分離(1,400rpm、4
℃、5分)して無細胞抽出液を調製した。このものを以
後、酵素液として用いた。
測定 糖化ヒト血清アルブミン(シグマ社)を0.9%塩化ナ
トリウム水溶液で溶解させ、0〜1.0%の範囲で濃度
の異なる糖化ヒト血清アルブミン溶液を調製した。これ
らの溶液を用いて以下の操作を行った。 1)プロテアーゼ処理 糖化アルブミン溶液 60μl 12.5mg/ml プロテアーゼXIV(シグマ社)溶液 60μl この混合液を37℃で30分間インキュベートし、その
後、約90℃で5分間、加熱して反応を停止させた。
−L溶液は、実施例1の方法で得たFAOD−Lを6ユ
ニット/mlになるよう、0.1Mトリス−塩酸緩衝液(p
H8.0)で希釈して調製した。FAOD反応液を30
℃で2分間インキュベートした後、上記の各プロテアー
ゼ処理溶液を100μl加え、30分後の555nmにお
ける吸光度を測定した。この方法で得られる糖化アルブ
ミンの濃度と吸光度との関係を図11に示す。図中の縦
軸は555nmの吸光度(過酸化水素の量に対応)、横軸
は糖化アルブミンの濃度を表す。図は、糖化アルブミン
の濃度と過酸化水素発生量が相関関係にあることを示し
ている。
測定 0.9%塩化ナトリウム水溶液3mlに、糖化ヒト血清ア
ルブミン(シグマ社)150mg、ヒト血清アルブミン
(シグマ社)150mgをそれぞれ溶解した。これらの溶
液を混合することにより、糖化率の異なる溶液を作製
し、自動グリコアルブミン測定装置(京都第一科学)を
用いて検定したところ、その糖化率は、24.6%〜6
1.1%であった。これらの溶液を用いて以下の操作を
行った。 1)プロテアーゼ処理 糖化アルブミン溶液 60μl 12.5mg/ml プロテアーゼXIV(シグマ社)溶液 60μl この溶液を37℃で30分間インキュベートし、その
後、約90℃で5分間加熱して反応を停止させた。
−L溶液は、実施例1の方法で得たFAOD−Lを6ユ
ニット/mlになるよう、0.1Mトリス−塩酸緩衝液(p
H8.0)で希釈して調製した。FAOD反応液を30
℃で2分間インキュベートした後、上記の各プロテアー
ゼ処理溶液を100μl加え、30分後の555nmにお
ける吸光度を測定した。この方法で得られるアルブミン
の糖化率と吸光度との関係を図12に示す。図中の縦軸
は555nmの吸光度(過酸化水素の量に対応)、横軸は
アルブミンの糖化率を表す。図は、アルブミンの糖化率
と過酸化水素発生量が相関関係にあることを示してい
る。
で溶解させ、0〜30%の範囲で濃度の異なる糖化ヘモ
グロビン溶液を調製した。これらの溶液を用いて以下の
操作を行った。 1)プロテアーゼ処理 糖化ヘモグロビン溶液 25μl 500ユニット/ml アミノペプチダーゼ溶液 5μl 0.1M トリス−塩酸緩衝液(pH8.0) 20μl この混合液を30℃で30分間インキュベートした。そ
の後、10%トリクロロ酢酸を50μl加えて撹拌し、
0℃で30分間静置した後12000回転で10分間遠
心分離を行った。得られた上清に2M NaOHを約5
0μl加え中性溶液にした。
−L溶液は、実施例1の方法で得たFAOD−Lを4ユ
ニット/mlになるよう、0.1Mトリス−塩酸緩衝液(p
H8.0)で希釈して調製した。FAOD反応液を30
℃で2分間インキュベートした後、上記の各プロテアー
ゼ処理溶液を80μl加え、30分後の727nmにおけ
る吸光度を測定した。この方法で得られる糖化ヘモグロ
ビンの濃度と吸光度との関係を図13に示す。図中の縦
軸は727nmの吸光度(過酸化水素の量に対応)、横軸
は糖化ヘモグロビンの濃度を表す。図は、糖化ヘモグロ
ビンの濃度と過酸化水素発生量が相関関係にあることを
示している。
Ile Ike Gly Ala Gly Thr Trp 1 5
10 15 Gly 17
26
21
24
D−Lの部分アミノ酸配列との関係を示す説明図。
スミドpFAL2の制限地図。
結果を示す模写図であって、図中、レーン1はφX17
4/HincII;レーン2はプライマー1及び2を用
いた電気泳動パターンを表す。
ニングにおける電気泳動の結果を示す模写図であって、
図中、レーン1はλ/EcoT141、レーン2はpFL
P/BamHIの泳動パターンを表す。
地図。
gillus terreus GP1;FERM P−15664)
由来の精製FAOD−LをSDS−PAGE(ドデシル
硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動)に
かけて得た移動パターンを示す写真。
クス200pgを用いたゲルろ過による分子量測定の結果
を示すグラフ。
形質転換体の染色体DNAのサザン解析の結果を示すア
ガロース電気泳動パターンの模写図。
ノール、1.5%メタノール+3%グリセロール又は3
%グリセロールを含有する培地でのFAOD−L活性産
生のタイムコースを示すグラフ。
メンター培養におけるFAOD−L活性産生のタイムコ
ースを示すグラフ。
作用により生成された過酸化水素量との関係を示すグラ
フ。
用により生成された過酸化水素量との関係を示すグラ
フ。
より生成された過酸化水素量との関係を示すグラフ。
Claims (15)
- 【請求項1】 アスペルギルス属(Aspergillus)の菌
に由来するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼをコード
する異種遺伝子を導入された真核細胞により生産された
ことを特徴とするフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。 - 【請求項2】 アスペルギルス属の菌がアスペルギルス
・テレウス GP1(Aspergillus te rreus GP1;
FERM−15664)である請求項1記載のフルクト
シルアミノ酸オキシダーゼ。 - 【請求項3】 異種遺伝子が、mRNAから逆転写酵素
により合成されたDNA又はその断片である請求項1記
載のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。 - 【請求項4】 異種遺伝子が、mRNAからRT−PC
Rにより合成されたDNA又はその断片である請求項1
記載のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。 - 【請求項5】 請求項1〜4のいずれかに記載のフルク
トシルアミノ酸オキシダーゼをコードする遺伝子を含有
し、真核細胞内で機能的な発現ベクター。 - 【請求項6】 プラスミドpNFL8である請求項5記
載の発現ベクター。 - 【請求項7】 請求項5又は6に記載の発現ベクターで
形質転換された形質転換体。 - 【請求項8】 酵母である請求項7記載の形質転換体。
- 【請求項9】 メタノール酵母である請求項8記載の形
質転換体。 - 【請求項10】 請求項8又は9に記載の形質転換体を
培地に培養し、培養物からフルクトシルアミノ酸オキシ
ダーゼを回収することを特徴とするフルクトシルアミノ
酸オキシダーゼの製造方法。 - 【請求項11】 培地が、メタノール0.1〜5.0%、
及び0.1〜5.0%のNH4Cl及び/又は0.1〜5.
0%の酵母エキスを含有するものである請求項10記載
の方法。 - 【請求項12】 アマドリ化合物を含有する試料と、請
求項7〜9のいずれかに記載の宿主細胞の培養物又はそ
の処理物を接触させ、酸素の消費量又は過酸化水素の発
生量を測定することを特徴とする、試料中のアマドリ化
合物の分析法。 - 【請求項13】 試料が生体成分であり、アマドリ化合
物の分析が、該生体成分中の糖化タンパクの量及び/又
は糖化率の測定、あるいはフルクトサミンの定量により
なされることを特徴とする請求項12記載の分析法。 - 【請求項14】 請求項7〜9のいずれかに記載の宿主
細胞の培養物またはその処理物を含有するアマドリ化合
物の分析のための試薬又はキット。 - 【請求項15】 生体成分中の糖化タンパクの量及び/
又は糖化率の測定、あるいはフルクトサミンの定量のた
めに用いられることを特徴とする請求項14記載の試薬
又はキット。
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JP19455796A JP3819969B2 (ja) | 1996-07-24 | 1996-07-24 | 組換えフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1614746A1 (en) * | 2003-03-17 | 2006-01-11 | Koji Sode | Fructosylamine oxidase |
EP2096173A1 (en) | 2003-05-21 | 2009-09-02 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Method of measuring glycolated hemoglobin A1C, enzyme to be used therefor and process for producing the same |
US7820404B2 (en) | 2005-05-06 | 2010-10-26 | Arkray, Inc. | Protein cleavage method and use thereof |
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JP2012026753A (ja) * | 2010-07-20 | 2012-02-09 | Arkray Inc | 糖化タンパク質の測定方法 |
-
1996
- 1996-07-24 JP JP19455796A patent/JP3819969B2/ja not_active Expired - Lifetime
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