WO2004029251A1

WO2004029251A1 - フルクトシルアミンオキシダーゼ

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Publication number: WO2004029251A1
Application number: PCT/JP2003/011766
Authority: WO
Inventors: Nobuyuki Yoshida; Yoshiki Tani; Satoshi Yonehara
Original assignee: Arkray, Inc.
Priority date: 2002-09-24
Filing date: 2003-09-16
Publication date: 2004-04-08
Also published as: ATE448308T1; EP1548115A4; US20060172367A1; DE60330033D1; AU2003264442A1; EP1548115A1; US7407783B2; EP1548115B1; JP4308768B2; JPWO2004029251A1

Abstract

本発明は、フサリウム・プロリフェラタム（Fusarium proliferatum）を培養し、培養生成物から得られる基質特異性の異なる２種類のフルクトシルアミンオキシダーゼ（ＦＡＯ）を精製することにより得ることができる酵素であって、アマドリ化合物の測定に有用なフルクトシルアミンオキシダーゼを提供する。　

Description

明細書フクトシノレアミンォキシダーゼ技術分野

本発明は、新規なフルクトシ /レアミンォキシダーゼに関し、さらに詳しくは、フサリウムプロリフェラタム由来のフルクトシルアミンォキシダーゼ、その製造方法、及びそれを用いるアマドリ化合物の測定方法に関する。

背景技術

アマドリ化合物は、血液^品中のタンパク質、ぺプチド及びァミノ酸のようなァミノ基を有する物質と、例えばグルコースのような還元性の糖が共存する場合、ァミノ基とアルデヒド基が非酵素的かつ不可逆的に結合し、アマドリ転移することにより生成される。アマドリ化合物の生成速度は、反応性物質の濃度、接触時間、温度などの関数で表される。従って、その生成量から、それら反応性物質を含有する物質に関する様々な情報を得ることができることから、アマドリ化合物の分析は、医療分野、食品分野等で有用である。特に医療分野で注目されているのは、糖尿病の診断及び管理の指標としての糖化タンパクである。糖尿病は、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害を初め様々な全身症状（合併症）を引き起こす疾患であり、失明や透析導入の最も主要な原因となっている。これらの合併症は、患者の生活や社会活動を制限するばかりか医療費の増加にもかかわつており、深刻な社会問題である。従って、糖尿病の早期発見と発見後の適切な血糖コントロールの重要性が指摘されている。糖尿病における血糖コントロールの指標として、通常、過去約；！〜 2ヶ月の平均血糖値を反映する糖化へモグロビン、過去約 2週間の平均血糖値を反映する糖化アルブミン、あるいは血清中の還元能を示す糖化タンパク質を意味するフルクトサミン等が測定される。糖化へモグ口ビン（HbAl c ) はへモグロビンの β鎖 Ν末端バリンの α—ァミノ基が糖化されたものであり、 H b A l cの測定は糖尿病患者の血糖コントロールにおいて重要な役割を占めている。アマドリ化合物の酵素法による分析は、アマドリ化合物に酸化還元酵素を作用させ、生成する過酸化水素量又は消費される酸素量に基づいて、その量を測定することで行われる。該酸化還元酵素の一つであるフルクトシルアミノ酸ォキシダーゼは、通常、微生物から精製されている [例えば特許文献 1〜6 (特公平 6- 65300号公報、特開平 3-155780号公報、特開平 7-289253号公報（[0031】、

[0037]) 、特開平 8-154672号公報（請求項 2、 [0027]) 、特籣平 11 - 243950号公報（[り 037]) 、特開平 5 - 192193号公報)参照]。

これらの文献に記載の酵素について簡単に説明すると、コリネパクテリゥム属 (0¾^eZ«cte 由来の酵素には α—ァミノ基糖化ァミノ酸に特異的であり、フルクトシルリジン（以下、「F L」と称することもある）には作用しないものがあるが、これは熱安定性が恶く（4 5 ⁹C、 1 0分の熱処理で 9 0 %以上失活）実用性に乏しい（特公平 6-65300号公報）。

の酵素には、 F Lに対する活性が、フルクトシルバリン（以下、「F V」と称することもある）に対する活性より低いものがあるが、その糖化タンパク又はその加水分解物に対する作用については不明である（特開平 3- 155780号公報参照）。ギべレラ属 (6»Z?ere//a)由来の酵素にはひァミノ基が保護された、フルクトシル Ν α— Z—リジン（以下、 F Z Lと称することもある）に対して高い特異性を有し、フルクトシルポリリジンに対して活性があるが、フルクトシルバリ：/には作用しないものがある（特開平 7-289253号公報（[0031]、 [0037]) 参照）。また、フサリウム属 Fusarium、が産生する酵素にはフルクトシノレリジンに対する活性がフルクトシルバリンに対する活性と同等かより高いものがある（特開平 8- 154672号公報（請求項 2、 [0027]) 参照）。また、他のフサリウム属

(Fusanum) ゃギペレラ属 ( %Aere // から産生される酵素にはフルクトシルパリンには作用せず、フルクトシルリジンに特異的なものもある（特開平 11 - 243950号公報（[0037]) ) 。

しかしながら、既存の酵素は、例えば糖化ヘモグロビンの測定における活性等に関して十分に満足できないことから、活性が高く、特異性に優れた酵素が望まれていた。すなわち、これら既存の酵素の場合、プロテア一ゼ処理等により断片化処理された糖化アミノ酸や糖化ポリリジンに対する活性は認められるが、 _α位が糖化された糖化ペプチドに対する活性は殆ど認められない。従って、例えば、 αーァミノ基が糖化されたアミノ酸残基を Ν-末端に有する糖化へモグロビンの場合は、 Ν—末端のフルクトシルバリンを確実に遊離させる必要がある。

—般に、従来のフルクトシルアミノ酸ォキシダーゼを用いて糖化タンパクを正確に測定するには、該酵素の基質となる糖ィ匕アミノ酸を確実に遊離させることが前提となる力実際には、目的の糖化アミノ酸を確実に遊離させる方法はなく、それを可能にするほど特異性の高いプロテアーゼも提供されていない。この問題を解決する一つの方法は、 N末端が糖化されたぺプチドそのものに反応し得るフルクトシルァミンォキシダ一ゼを使用することである。とりわけ糖尿病のコントロールに重要なヘモグロビン A 1 c (H b A 1 c ) を正確かつ効率良く測定するには断片化産物としての糖化べプチドにも活性なフルクトシルァミンォキシダーゼを使用する必要がある。

発明の開示

従って、本発明はアマドリ化合物、特に糖化タンパクを正確かつ効率良く測定するために、新規で有用なフルクトシルァミンォキシダーゼ（以下、「F AOj と呼称することもある）を提供することを目的するものである。

本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、フサリウム (Fusarium 属の菌株が基質特異性において優れた F A Oを生産することを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、フサリウムプロリフエラタム Fusarium proliferatum) 由来のフルクトシルァミンォキシダーゼを提供するものである。

図面の簡単な説明

図 1は、フサリウムプロリフェラタム Fusarium proliferatum) の培養物の、 Resource Qカラムクロマトグラフィーにおけるダンパク（OD = 2 8 0 n m) と活性の溶出パターンを示す図である。

図 2は、本発明の酵素の一つである F AO— Q 1の溶媒中での活'性と p Hとの関係を示すグラフである。

図 3は、本発明の酵素の一つである F AO— Q 2の溶媒中での活性と p Hとの関係を示すグラフである。図 4は、 F AO— Q 1の溶媒中での活性と愠度との関係を示すグラフである。図 5は、 FAO— Q2の溶媒中での活性と温度との関係を示すグラフである。図 6は、 FAO— 及び FAO— Q2のゲル濾過法による分子量の測定結果を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

本発明のフルクトシルァミンォキシダーゼは、以下の式（I) で示される反応における触媒活性を有する。

R¹— CO— CH„— NH— R² + 0₂ + H₂0 →

R¹— CO - CHO + R² - NH„ + H₂0₂

(式中、 R¹は一 [CH (OH) ] n-CH₂OH (nは 5又は 6である）、 R² はァミノ酸残基又はァミノ酸 2〜 10個のぺプチド残基を表す。 )

上記の式（I) において、 R²はアミノ酸残基又はアミノ酸 2~10個のぺプチド残基であり、好ましくは、アミノ酸残基又はアミノ酸 2〜6個のペプチド残基、より好ましくはァミノ酸残基又はァミノ酸 2〜 3個のぺプチド残基である。

R²を構成するァミノ酸は測定すべきアマドリ化合物により異なるが、例えば、バリン、リジン、ヒスチジン、ロイシン、セリンを挙げることができる。 R²がペプチド残基である場合は、バリン又はロイシンを N—末端に含む 2〜10個のアミノ酸からなるペプチド残基である。バリンを N末端に有するアミノ酸数 2〜 3個のペプチド残基がより好ましく、そのようなペプチドの具体例として、バリン一ヒスチジン、ノリン一ヒスチジン一口イシンが挙げられる。

本発明の FAOが HbAl cの測定に用いられるものである場合、上記のごとく、 α—ァミノ基が糖化されたバリン、即ちフルクトシルバリン（FV) 、又は

FVを Ν末端に有するペプチドに対して活性があることが好ましい。一方、糖化アルブミンの測定に用いられるものである場合、糖化アルブミン分子ではリジンの ε—ァミノ基が糖ィ匕されていることから、 Ε—ァミノ基が糖化されたフルクトシノレリジン（_£ FL) 又は _£ FLを含むペプチドに対して活性があることが好ましい。

本発明の F AOは、酵素作用を有する限りその起源は特に制限されない。例えば、特定の糖化ァミノ酸又は糖化べプチドのみを炭素源及び窒素源として含有する培地で成育する微生物により産生され、糖化ァミノ酸及び糖化べプチドを基質として酵素活性を発揮する FAOは本発明に有用である。上記の微生物のスクリーエングに用いる糖化ペプチドとしては、目的の糖化タンパクを断片化した場合に生成されるものが例示される。そのような糖化ペプチドのみを炭素源及び窒秦源とする培地で培養した菌体より酵素を精製し、その活性を確認することにより、目的の FAOを得ることができる。後述するように、本発明者らはフルクトシ /レバリン一ヒスチジン一ロイシン（FVHL) を用いて土壌中の微生物をスクリーニングし、 FVHL資化能を有する、フサリウム属 Fusariuni) の微生物を見出した。

なお、上記の FVHLは、ヘモグロビン鎖の N末端と同じ配列を有していることから、該ペプチドは HbAl cの測定に有用な FAOをクリーニングするのに好適である。そのような糖化ぺプチドは当該技術分野で既知の方法で製造することができる。

従って、本発明の FAOはフサリゥム属の菌株を用いて微生物学的に製造することができる。好ましい微生物はフサリウムプロリフエラタム (Fusarium prohferatum) 又はその変異体である。

フサリウムプロリフェラタム Fusazium proliferatu ) は、実施例 1に記載の方法により、本発明者らが ±壌中から新たに分離した菌株であり、本菌株は茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている（微生物の表示： ^sarz'zwnsp. GL 2 一 1株、受領日：受託日：平成 14年 9月 9日；受託番号 FERM P— 190 05) (国際寄託への移管日：平成 15年 8月 1 1日；受託番号： FERM B P- 8451 ) 。本発明のフサリゥムプロリフェラタム Fusariuoi proliferatum) を、以下、「GL2— 1株」とも表記する。

GL 2— 1株を元株として、変異体誘導や組換え遺伝子技術などにより、 FV

H Lや他の基質に対する活性が高められた派生菌株を得ることができる。そのような変異株も本発明の F AOの供給源である。そのような派生菌株は、人為的に突然変異を誘発されたものや、スクリーニングで得られたもの等を包含する。本発明の F AOは、グルコース一バリン褐変化培地（以下、 GV褐変化培地ど称する）で F AO産生能を有する微生物を培養すると、生産される。 GV褐変化培地は、グルコースとバリンを温度 120°Cにおいて 30分間、オートクレーブ処理することにより得られる。好ましい GV褐変化培地の例として、グルコース 1. 5%、 Lーバリン 0. 5%、 ₂HP0₄0. 1 %、 N a H₂ P0₄0. 1 %、 MgS 0₄ · 7 H₂ O 0. 05%、 CaCl₂ · 2 H₂ O 0.01%、酵母エキス 0.

2 %を含有する培地を挙げることができる。

培養は、通常、 25〜37°C、好ましくは 28°Cで行われる。培地の pHは 4. 0〜 8.0の範囲であり、好ましくは 5.5〜 6.0である。しかしながら、これらの条件は、それぞれの菌の状態に応じて適宜調整されものであり、上記に限定されない。

例えば、 GL 2— 1株をこのような条件下、 12〜36時間、好ましくは 24 時間培養すると、 F AOが菌糸体内に蓄積される。したがって、ろ過により回収した菌糸体を定法に従って遠心分離すれば無細胞抽出液を得ることができる。細胞の磨砕は、機械的手段又は溶媒を利用した自己消化、凍結、超音波処理、加圧などのいずれでもよい。

酵素の分離精製法も既知であり、硫安などを用いる塩析、エタノール等の有機溶媒による沈殿、イオン交換クロマトグラフィゃゲルろ過、ァフィ二ティーク口マトグラフィなどを、適宜組み合わせて行う。

例えば、培養物を、遠心又は吸引ろ過して菌糸体を集め、洗浄後、 ImM D 丁丁を含む0.11^ Tris— HCl 衝液 (pH8.0) に懸濁し、ミニビードビータ（ガラスビーズ 0. 5mm) で菌糸体を破砕し、遠心分離して得た上清（無細胞抽出液）を硫安分画し、透析した後、 Resource Q カラムクロマトグラフィー (アマシャムバイオシステムズ社製）で処理することにより精製する。

あるいは、 F AOが培地中に分泌又は蓄積される場合は、それ自体既知の方法に従い、例え、イオン交換樹脂処理法、活性炭吸着処理法、有機溶媒沈澱法、減圧濃縮法、凍結乾燥法、結晶化法等を適宜組み合わせて分離精製することができる。

以上に述べた方法で、 GL 2— 1株の培養物から、 Resource Q カラムクロマトグラフィ一で異なる保持時間を示す、少なくとも 2種類の、 G L 2— 1株由来の FAOを得た。 1つはフルクトシルバリン（FV) 及び N—ひフルクトシルリジン（FZL) の両方に活性な酵素（以下、「FAO— Ql」と称する）であり、他方は FVには活性があるが、 FZLには活性を示さない酵素（以下、「FAO — Q2」と称する）である。なお、本明細書では、 GL 2— 1株が産生する FA O-Ql, FAO— Q 2についてその製同定に関して記載しているが、本癸明は特定の起源に限定されず、本発明の目的に適う、下記の特性を有する全 FA Oを包含する。

本発明の G L 2- 1株由来の酵素について以下に詳細に説明する。

F AO— Q 1

① フルクトシ/レバリンに対する活性が、フルクトシルリジンに対する活性とほぼ同等力、若しくはそれよりも高い。

② 酵素反応における至適 pHが 7. 5である。

③ 酵素の安定性に好適なが約 30〜40でである。

④ SD S— PAGEによる分子量が約 39 kDaであって、ゲル濾過法による分子量が約 39. 4 kDaである。

FAO-Q 2

① フルクトシルリ ^ンに対して検出可能な活性がなく、フルクトシルバリンに対する活性がある。

② 酵素反応における至適 pHが 7である。

③ 酵素の安定性に好適な温度が約 30〜40でである。

④ SDS— PAGEによる分子量が約 49 kDaであって、ゲル濾過法による分子量が約 58 kDaである。

これら 2つの酵素の一般的な特性は以下の通りである。

1. 一般的な誘導特性

いずれも FVHLによって誘導される酵素であり、 FVHLを唯一の炭素源及び窒素源とする培地で誘導される。

2.反応特異性及び基質特異性

GL 2—1株の培養物から部分精製した酵素は、実施例 2 (1) に記載されているように、 Resource Q カラムクロマトグラフィーにおいて、異なる保持時間を示す活性な画分 Ql、 Q 2を含んでおり、各画分は、それぞれ、本明細書中で「FAO— Ql」及び（"FAO— Q2j と呼称する酵素を含有していた。上で述ベたように、 FAO— Q 1は FV及び FZLの両方に同程度の活性を有し、かつ FVUこも活性であり、他方、 FAO— Q2は FVには活性であり、 FVH、 F VHLという N—末端パリンが糖化されたペプチドにも活性を示したが、 FZL には活性を示さなかった。

3. p H及び温度の条件

至適 pHの検討

前記活性測定法方法に準じ、 pH3.5から 10.0の範囲の各 pH条件により酵素反応を行った。

ただし、使用したバッファ一は p H 3.5から 6.0の範囲では 100 mM齚酸バッファー、 pH6.0から 8.0の範囲では 10 OmMリン酸カリゥムバッファ

―、 ρΗ7·0から 9.0の範囲では 10 OmMトリス一塩酸バッファー、 pH9.

0から 10.0の範囲では 10 OmM グリシン一 N a OHバッファーであった。図 2及び図 3に示す通り、本発明の酵素 FA O-Qlの至適 pHは、 30°Cにおいて約 7. 5であることが、 FAO-Q 2の至適 pHは、 30°Cにおいて約 7. 0 であることが判明した。

酵素の安定性に好適な温度の検討

酵素の温度条件は、 0.1 M Tris-HC據衝液（pH8.0) 中で 30〜65°C の温度条件に FAO— Q1又は FAO— Q 2を加え、 10分間インキュベートした後、通常の条件で活性を測定し、判定した。測定結果を図 4及び図 5に示す。これらの図より、酵素の安定性に好適な温度範囲は 30°Cから 40でであることが判明した。

4 -カ価の測定

酵素の力価測定は、例えば、実施例 1 (3) に記載されている、当該技術分野で既知の方法（速度法）で行うことができる。この方法では、 F AOと糖化アミノ酸又は糖化べプチドとの反応によって生成する過酸化水素を、該過酸化水素の存在下で生成するキノン色素による吸光度（505 nm) に基づいて測定する。キノン色素の分子吸光係数 5. 16 X 1 O^^cm ¹) から、 1分間に生成する過酸化水素のマイクロモルを算出し、この数宇を酵素活性単位（ュニット： U) とする。

なお、活性の測定は上記の方法に限定されず、その他の方法（終末法、又は酸素吸収量を測定する方法等）を用いても同様に本発明の F A Oの酵素活性を測定することができる。

ミハエリス定数の測定

上記の力価測定法において、酵素濃度、 pH、温度などの条件を一定に保ち，基質の濃度だけを変化させながら反応の初速度を測定し、各基質に対するミハエリス定数を求めることができる。

本発明の FAOのうち、 FAO— Q 1は FV及び F Z Lにほぼ同程度の活性を示すことから、広くアマドリ化合物の分析に有用である。一方、 FAO— Q2は F Vには活性であるが F Z Lには活性を示さないことから、糖化へモグ口ビンを選択的に分析するのに有用である。しかも、 0— 02は、糖化ヘモグロビンの N—末端配列である FVH, FVHLにも活性を示すことから、該酵素を用いれば、糖化へモグロビン內部の糖化（ ε位）を測定することなく、 Ν末端の糖化のみを測定することができるため、より正確に Hb A 1 cの測定が行える。

本発明の F AOを用いて糖化タンパク等のアマドリ化合物を分析するには、既知の方法に従い、アマドリ化合物を含有する試料と、本発明の F AOとを接触させ、酸素の消費量又は過酸化水素の発生量を測定すればよい。任意の試料を用いることができ、例えば、血液（全血、血漿又は血清）、尿等に代表される生体由来の試料の他、醤油等の食品が挙げられる。特に好ましいのは血液である。

本発明の F AOの使用に際して、反応溶液の p H及び温度は、それぞれ、使用する酵素に適した条件とする。即ち、 FAO— Q 1の場合、 pH約 6. 5〜12、好ましくは約 7〜8、より好ましくは約 7. 5、？約 30〜40でで行う。また、 FAO— Q2の場合、 pH約 6〜： L 0、好ましくは約 6. 5〜8、より好ましくは約 7、温度約 30〜40°Cで行う。但し、基質や他の反応条件により適宜変更が可能であり、上記に限定されない。

F AOの使用量は、それぞれ、使用する測定法に応じて適宜選択することができるが、通常、 0.1ユニット Zml以上、好ましくは 1〜100ユニット /mlである。緩衝液としては Tris-HCl等を用いる。

本発明の F AOで糖化タンパクを分析するには、あらかじめ断片化処理し、糖が結合したアミノ酸残基又はペプチドを^!させてから行うことが好ましい。そのような方法は化学的な方法、酵素を用いる方法を含めて、当該技術分野で既知である。しかしながら、本発明の FAO、特に FAO— Q 2の場合は、糖化アミノ酸のみならず糖化タンパクの^^産物としての糖化べプチドにも活性があるため、上記の断片化処理が完璧でなくても良好な精度で測定することができる。従って、本発明はまた、上記の F AO (FAO— Q 1又は F AO— Q 2) を用いて、試料中に含まれるアマドリ化合物を測定する方法を # ^するものである。本発明の測定方法に用いる FAOは、該 F AOを産生するフサリウムプロリフェラタム FERM BP— 845 1を栄養培地で培養し、培養物から、産生された本発明の F AOを分離精製することにより製造することができる。このようにして得られる、いわゆる天然の F AOは、本発明の目的に適う限り、自然に起こりうる修飾や変異を有していてもよく、また測定の精度、信頼性に影響しないことを条件として、培養物からの分離、精製工程で混入しうる酵素以外の物質を伴っていてもよい。

また、本発明の F A Oは遺伝子組換え技術によつても製造することができる。即ち、配列番号 4又は配列番号 6に記載のァミノ酸配列をコードする DNAを用い、常法により、それぞれ、 FAO— Q 1及び FAO— Q 2に対応する組換タンパク質を得ることができる。

従って、本発明は、配列番号 4又は配列番号 6のァミノ酸配列を有する F A O を提供するものである。

なお本明細書中、「FAO (FAO— Ql、 FAO— Q 2を含む） J というときは、特記しない限り天然の微生物起源から分離した酵素と、組換型酵素の両方を包含するものとする。

また、本発明は、本発明の F AOをコードする DNAを提供するものである。本発明の D N Aは、好ましくは、配列番号 4又は配列番号 6のァミノ酸酉己列で表されるタンパク質をコードしており、より好ましくは、配列番号 3又は配列番号 5に記載のヌクレオチド配列を有する。遺伝子組換技術による組换タンパク質の製造方法は当該技術分野で既知であり、例えば、本発明の DN Aを適当な宿主に導入し、得られた形質転換体を培養し、ついで培養物から本発明の F AOを分離-精製することにより、所望の活性を有する組換えンパク質を得ることができる。なお、このような方法で得られる本発明の組換型 F AOは、配列番号 4及び配列番号 6に記載のァミノ酸配列に限定されず、上記の定義に従う限り、該配列から常法に従って導かれるアミノ酸配列を有するタンパク質、並びに配列番号 4及び配列番号 6に示したァミノ ¾®Ε列の、所望の酵素活性を有するそのフラグメントをも包含することは当業者ならば容易に理解しうることである。

組換え型 F AOの製造は既知の方法で行うことができ、例えば、 F AOをコ一ドする D NAを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に揷入して様々な宿主内で F AOを発現する発現ベクターを構築する。次いで、この発現べクタ一を用いて適当な宿主細胞を形質転換する。宿主細胞としては、微生物 [原核生物（細菌、例えば大腸菌や枯草菌等）、真核生物（例えば酵母） ] 、動物細胞又は培養植物細胞が挙げられる。それぞれの宿主に関して適当な宿主一ベクター系が知られており、文献 (例え iiMolecular Cloning： A LABOLATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press) 記載の方法や既知の方法で発現させることができる。

発現ベクターによる宿主細胞の形質転換も文献 (例えば、 Molecular Cloning, 前掲）記載か当業者既知の方法で行うことができる。

得られた形質転換体の培養も、それぞれの宿主に適した培地を選択する力新たに調製したして実施することができる。通常、培地には炭素源（例えばダルコース、メタノール、ガラクトース、フルクトース等）及び無機また有機窒素源 (例えば硫酸アンモニゥム、塩化アンモニゥム、硝酸ナトリウム、ペプトン、力ザミノ酸等）を含有していてよい。所望により、培地に他の栄養源（例えば無機塩類（塩化ナトリウム、塩化カリウム）、ビタミン類（例えばビタミン B 1) 、抗生物質（例えばアンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン等)）を加えてもよい。哺乳動物細胞の培養には、イーグル培地が適当である。

形質転換体の培養は、通常、 pH 6 . 0〜8 . 0、好ましくは pH 7 . 0、 2 5〜4 0°C (好ましくは 30〜37で）で 8〜48時間行えばよい。生産された FAO が培養溶液、培養濾液 (上澄み)中に存在しているときは、培養物を濾過又は遠心分離する。培養濾液から、 F AOを天然又は合成のタンパク質の精製、単離に一般的に用いられる常法（例えば透析、ゲル濾過、抗 F AOモノクロナール抗体を用いてのァフィュティカラムクロマトグラフィー、適当な吸着剤を用いてのカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等）によって精製できる。生産された F A Oが培養形質転換体のぺリプラズム及ぴ細胞質中に存在するときは、濾過や遠心分離によって細胞を集め、それらの細胞壁及びノ又は細胞膜を、たとえば超音波及び Z又はリゾチーム処理によって、破壌して、デブリス（細胞破砕物）を得る。デブリスを適当な水溶液（例えばトリスー塩酸緩衝液）に溶解させる。この溶液から、上記の方法に準じて F AOを精製することができる。酵素活' I·生を有するフラグメントが必要であれば、例えば制限酵素処理ゃェキソヌクレアーゼ処理等により断片を得る。このように、組换技術を利用することにより、任意の宿主細胞を用いて F AOを効率よく製造することが可能となる。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。

実施例 1 FAOを生産する微生物のスクリーニングと同定

(1) F AOを生産する微生物のスクリーニング

糖化へモグロビンの β鎖 Ν末端配列を持つフルクトシルバリン一ヒスチジン一ロイシン（FVHL) を、 VHLのグリコシル化により調製した。そのような方法は当業者に既知である。

この FVHLを単一の炭素源及び窒素源とする培地（FVHL培地）を用いて、土壌より FVHL資化性菌を分離した。試験管（16. 5 mm径）に FVHL培地 5 m 1を人れ、採取した土壌を添加して 3 CTCで 48時間、振盪（ 300 r p m) 培養した。

(FVHL 培地）

FVHL 5 g

2HP0₄ 1 g

NaH₂ P0₄ 1 g

Mg SQ₄ - 7H₂0 0.5 g CaC 1 2 H, O 0.1 g

ビタミン混合物 * 0.1% (v/v)

金属溶液 1.0% (vv)

蒸留水

,000 ml

(*ビタミン混合物)

チアミン HC 1 m g

リボフラビン 2

パントテン酸カルシウム 2

ピリドキシン HC 1 2

ピオチン 0.

P—ァミノ安息香酸

ニコチン酸 2

0

蒸留水

全量 00 m 1

(* *金属溶液）

Mn SO, 3H₂0 1.7 g

Z n S0₄ · 7H₂0 2.2

C u S 0₄ - 5H₂0 0.4

N a ₂MoO 2H₂0 0.26

K I 0.06

蒸留水 ϋ量

全量 1,000 m l

その結果、 FVHLを資化する 13株を得た。それらを下記の培養、活性確認に供し、 F AO活性を有する物質を産生する菌株をさらに選抜した。

(2) 培養及び無細胞抽出液の調製上記（1) で得た 1 3株をグルコース一パリン（GV) 褐変化培地で培養し、粗酵素液を調製した。

(GV褐変化培地)

グルコース 1. 5 %(w/v)

Lーバリン 0. 5

K₂HPO, 0. 1

N a H。 PO 0. 1

MgSO. · 7H₂0 0. 05

CaCl₂ 2H₂0 0. 0 1

酵母エキス 0. 2

試験管（1 6. 5 mm径）に G V褐変化培地 5 m 1を入れ、 30 で 24時間、振盪培養 (300 r pm) した。次いで、フィルターでろ過して菌糸体を回収し、ミニビードビータ（ガラスビーズ 0. 5 mm) で菌糸体を砕し、遠心分離

(4 、 1 0， 000 X g 10m i n) して無細胞抽出液を調製し、粗酵素液として使用した。

(3) F AO活性の測定

粗酵素液の F AO活性を前記の速度法で測定した。即ち、以下の混合物中で生成する過酸化水素を比色法で経時的に測定し、 F AO活性を確認した。

Tris-HCl緩衝液 (pH8.0) 00 μπιο 1

4一アミノアンチピリン 4.5 μ mo 丄

フノール 6 μ m o 1

F V 5 μτη o I

パーォキシダーゼ 6 u n i t s

粗酵素液し無細胞抽出液） 1 m 1

3 m】

酵素液以外の混合物（全量 3m l ) を 30でで平衡化した後、酵素液を添加し、 50 5 nmにおける吸光度を経時的に測定した。生成するキノン色素の分子吸光係数（5.1 6 X 1

¹) から、 1分間に生成する過酸化水素のマイク口モルを算出し、この数字を酵素活性単位（ユニット： U) とした。その結果、 F A Oを有する 1つの株を得た。

( 4 ) 株の同定

菌学的性質

ポテトデキストロース寒天（P D A) 、オートミール寒天（O A) 、及ぴ 2 % 麦芽寒天培地（ME A) の各プレートに播種後、 2 5でで最長 8週問培養し、菌学的特性を観察した。コロニ一の色調に関する記述は Komerup & Wanscher

(1978)に従った。

(コロニーの巨視的特徴の観察）

•全縁が滑らかで僅かに、凸状の盛り上がりを示した。

気中菌糸（aerial hypha) は綿毛状で、コロニー表面の色調は当初より、

White-reddish white (11A1-2)を示した。その後、 8週間経過後も明らかな呈色度合いの変化、及び分生子（conidia) の着生による表面色調の変化は観察されなかった。

'コロニー裏面の色調は表面とほぼ同等で、 P D A、 ME A培地における長期間の培養では、若干 pale red (11A3)呈色が観察された。また、 P DA、 OAプレートからは，僅かに透明な滲出液（exudate) の産生が認められた。

(コロニーの微視的観察）

.小型分生子（microconidia) と大型分生子 (macroconidia) の両方が観察された。

'小型分生子は、フィロア型（phialidic) で Acremoniiun属様の分生子柄

(conidiophore) の構造であった。分生子柄はほぼ単生で時折り 2軸に分枝し、気中菌糸の全般にかけて生じた。 1〜 2細胞性で粘性を持つており、柄先端より塊状となった。形状は楕円形（ellipsoidal) から紡錘形 (fusiform) で、表面は平滑（smooth) からやや粗面（slightly rough) であった。

·

3〜 6細胞性で三日月型

(luniform) で、表面は平滑、脚胞 (footceE) を有した。気中菌糸部に中厚からゃゃ細く、短いものが多く観察された。また、細胞壁が脆弱で、大半の大型分生子は表面が欠損していた。

Arx (1974) 、 Domish (1993)及び Malloch (1981)に記載されている分類体系に基づいて、上記の結果を考察し、本菌体は属に帰属すると推定された。同様の开乡態を示すものに Q indiOcai oi2、 Candelabrellaヽ

らる、本菌体は大型分生子が三日月型であること、気中菌糸が輪（ring) を形成しないこと、また、小型分生子を形成すること、等からこれらとは区別され、 "Gene of Hyphomycetes"

(Carmichael et al.， 1980)に記載の J¾sarj'i«H属の定義に合致するものである。この菌株は「 Fasarium sp. G L 2— 1株 j との表記の下、受託番号 F E RM BP-8451で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。

種の同定 (リボゾームの塩基配列の角 ¾()

上記 GL 2— 1株の 18 Sリボソーム DNA ( 18 S r DNA) 配列を調べることにより同定を試みた。

上記 (2) に記載の培養方法に従って GL 2— 1株を GV培地で培養し、得られた菌糸体から常法により DN Aを調製した。その後、この DNAを铸型として、 P C Rで r D N Aの内部転写スぺーサー（Internal transcribed spacer) 配列を増幅し、塩基配列を解析した（MycopathologiaVol.140 P35〜491997参照）。その結果、配列番号 1に示す塩基配列が確認された。この塩基配列をホモ口ジー検索したところ、フサリウムプロリフェラタムと 100%のホモロジ一があることが判明した。

実施例 2 GL 2— 1株を用いる FAOの生産と同定

(1) F AOの部分精製

1) 培養と無細胞抽出液の調製

実施例 1で同定した GL 2— 1株を、実施例： I (2) に記載の GV褐変化塔地 10 Omlを用いて、同様の培地組成、培養条件下で培養した。

培養後、培養液をフィルターでろ過して菌糸体を回収し得られた菌糸体 0. 6 gに lmM DTTを含む 0. 1M T r i s -HC 1緩衝液 (pH8.0) を加えて懸濁し、続いてミニビードビータ（ガラスビーズ 0.5mm) により菌糸体を破砕後、遠心分離（4°C、 10, 000 X g, 1 Omin) し、上清を無細胞抽出液とした。 2) 硫安分画

1 ) で得た無細胞抽出液を、硫酸ァンモニゥム濃度 30〜 80 %飽和画分を 1 mMの DTTを含む 5 OmM Tr i s— HC 1緩衝液 (pH8. O) に溶角早し、同緩衝液でー晚透析した。

3 ) Resource Qカラムクロマトグラフィー

以下の条件で透析後の硫安画分のク口マトグラフィーを行った。

分析条件

カラム（容量） ResourceQカラム（1ml) (アマシャムバイオシステムズ社製）

流速 1 m 1 / m 1 n

緩衝液 A 5 OmM Tris— HC 1緩衝液（p H 8.0)+ 1 mM DTT 緩衝液 B 緩衝液 A+lM Na C l

溶出条件

0~5m i n ：緩衝液 B 0%

5— 35m i n ：緩衝液 B 0〜50%

35〜4 Om i n ：緩衝液 B 50〜100%

Resource Qカラムクロマトグラフィーにおけるタンパク（OD=280η m) と活性の溶出パターンを図 1に示す。 F Vを £質とした F AO活性で活性をモニターしたところ、 2つの画分（Ql、 Q2) に反応性が認められた。活性の測定は実施例 1 (3) に記載の方法に準じて行った。これらの画分に含有される F AOを本明細書中、 FAO_Q l、 FAO— Q2と呼る。

表 1 精製段階による活性の変化

比活性

工程 total unit(U) 収率（％)

(U/mg)

無細胞抽出液 0.5 0.019 100

30〜 80 %硫

0.3 0.0199 60

安分画透析後

Q 1 0.22 0.3 44

Resource Q

Q2 0.03 0.067 6

(2) F AO— Q 1及び F AO— Q 2の基質特異性の比較上記の（1) 、 3) で分離した 2つの画分に含有される酵素（FAO— Q1,

FAO-Q2) の基質特異性を調べた。酵素液として、上記 2つの画分を用い、実施例 1 (3) に記載の方法に従って、 FAO活性を測定した。基質として、 F

V、 FVH、 FVHL、 FVL、 FVLS、 FZ.Lを用いた。結果を表 2に示す。

¾ _ 2 FAO— Ql、 FAO— Q 2の基質特異性

相対活性 (%)

FAO-Q FAO-Q 2

F V 00 00

F VH n.d. 2.4

F VHL n.d. 0.6

F VL 1.1 0.6

F VL S n.d. 3.3

F Z L 108 n.d.

F V：フルクトシルバリン、 F VH：フルクトシルバリン一ヒスチジン、 FVH L ：フルクトシルバリン一ヒスチジン一ロイシン、 FVL：フルクトシノレバリン一口イシン、 F VL S ：フルクトシルバリン一ロイシンーセリン、 FZL :フルクトシノレ N— α Zリジン

n.d.: 検出せず

表 2から、 F AO— Q 1は FV及び F Z Lの両方に同程度の活性を有し、かつ FVLにも活性を示すこと、 FAO— Q2は FVには活性があるが FZ Lには活性を示さず、 FVH、 F VHLという N—末端パリンが糖化されたペプチドにも活性を示すことが明らかである。

(3) Kmfltの測定

FV又は FZ Lを基質として、実施例 1 (3) に記載の方法に従い、 FAO— Q 1及び F AO— Q 2の存在下で測定し、 F V又は FZ Lに対する Km値（ミカェリス定数)を求めた。結果を表 3に示す。

表 3 FAO—Q 1及び F AO— Q 2の F V若しくは F Z Lに対する Km値

F AO-Q F AO— Q 2

F V 0. 62 0. 64

F Z L 0. 56 n. d.

n.d. 検出せず

FVに対する Km値は、 FAO— Q F A O— Q 2でほぼ同程度であつた。一方、 FAO— Qlの FZ Lに対する Km値は FVに対する Km値より小さく同酵素は、 F Vに比べて F Z Lに対する親和性が高いことが分った。

1) SDS電気泳動法による測定

常法に従って S D S電気泳動法（ゲル濃度： L 0 ~ 15 wZ V %のグラジェントゲル使用）により分子量の測定を行った。分子量既知の標準蛋白質としてアマシャムバイオシステムズ社製の分子量マーカー（ホスホリラーゼ b ： 97kDa、牛血清アルブミン： 68 kDa、オボァゾレブミン： 45 kDa、カルボニックァンヒドラーゼ： 32 kDa、トリプシンインヒビター： 20. l kD a、 a-ラクトアルブミン： 14. 4 kD a) を使用して測定したところ、 FAO— Q1の分子量は約 39 kDaであり、 F AO— Q 2の分子量は約 49 k Daであった。

2) ゲル濾過法による測定

常法に従ってゲル滤過法による分子量の測定を行った。カラムサイズが 1 X 30 c mのス—パーデックス 200 (アマシャムバイオシステムズ社製）を用い、分子量既知の標準蛋白質として、ロシュ 'ダイァグノスティックス（株）社製の分子量マーカー（アルドラーゼ 150 kDa、牛血清アルブミン 68 k

Da、オボアルブミン 45 kDa、キモトリプシノーゲン A 25 kDa、チトクローム C 12. 5 kDa) を使用して検量線を作成レ、本発明酵素の分子量を算出した。結果を図 2に示す。これより、 F AO— Q 1の分子量は約 39. 4 kDaであり、 FAO— Q2の分子量は約 58 kDaであることが判明した。 (5) 部分アミノ酸の

N末端アミノ酸配列を決定するため、精製した F AO— Q 2酵素を蒸留水に対して透析した後、蛋白量として約 40 n gを N末端配列分析用の試料とした。 N 末端酉己列はプロテインシーケンサー■モデル 476 A (アプライドバイオシステムズ ¾¾、米国）を用い、 N末端から 10残基まで分析した。 N末端から得られた F A O— Q 2の配列は、配列表における配列番号 2に示すァミノ酸配列であることが判明した。一方 FAO— Q 1は、 N末端がプロックされており、この方法では決定できなかった。

実施例 3 FAO c DNAのクロ一ユング

GL 2— 1株のゲノム DNAを調製し、それを錄型と.して PC R法で F AO c DNAを得た。

(1) GL 2— 1株のゲノム DNAの調製

以下の工程に従い、 GL 2— 1株からゲノム DNAを得た。

1. 菌株を 15011の13 P培地（1%デキストン (Dextone) 、 1%ぺプトン

(Peptone), 0.5% NaCI、 pH7.4) で 30 °Cにて 2 - 3日間液体培養する。

2. ガラスフィルター（3GL) で集菌し、菌体（湿重量 0.3g) を得る。

3. 得られた菌体を液体窒素が入つた乳鉢と乳棒で破碎し、さらに乳鉢などで粉状にした後、コーユング管に集める。

4. 氷冷した 2 ml TEバッファー（10mMTris-HCl(pH8.0)、 ImMEDTA)を加え、軽くボルテックスする。

5. 2 mlの 50 mM EDTA、 0.5% SD S溶液を加え、数回 fe#J撹拌し、 3 7 °Cで 30分間インキュベートする。

6. 遠心分離（3,000 rpm、 10分問）する。

7. 上清をフエノールークロロホルムによる処連（3回）に供する（但し、撹拌は転倒撹拌による。）。

8. 2- 5容のエタノールを加え、数回撹拌する。この段階で糸状の DN A が確認でぎる。

9. 軽く遠心（3,000 ipm、 5分間）して沈降させるが、糸状にならない場合は通常のエタノール沈殿法に従い遠心する。

10. 沈殿を 400_μ1の TEバッファ一（l0mMTris-HCl(pH8.0)、 ImM EDTA)

(以下同様）に溶かし、エツペンドルフチューブに移し、 5μ1の ENase(10 mg/ml) を加え、 3 C、 30分間インキュベートする。

11. フエノールークロロホルムによる処理を 2回行った後、 2.5容エタノーノレを加え、十分に撹拌する。

12. 糸状の DNAをつまようじで新しいチューブに移す（余分なエタノールを除く）。

13. 50-100 μΐの TEに溶解する。（緩やかにピペッティングし、ボルテックスはしない。） _D

14. DNAを定量する。をァガロース電気泳動にかけてバンドを ¾ftf忍した。

(2) P CRによる c DNAの取得

1 ) 部分配列（約 200 b pフラグメント）の取得

既に明らかになつている糸状菌由来の FAODの全アミノ酸配列を用いて相同性が高い領域を検索し、その情報を基に以下のプライマーを設計した。

プライマー：

Forward primer (順方向）： 5'-GGBTTY TCWTSGARCCNRAYGA- 3' (配列番号 7)

Reverse primer (逆方向）： 5'-G RCVGYRYMCCAGCAVAT-3' (配列番号 8)

上記ゲノム DN Aを铸型に用い、 Taqポリメラーゼ（=TaKaRaExTaq( (宝酒造社製） ) を用いる標準的な反応液組成で PC Rを行った。

PCR反応の条件：

ブライマー（配列番号 7) : 0.2 ζΜ

プライマー（配列番号 8) : 0.2μΜ

lOExTaqPCRバッファー（宝酒造社製）： 10μ\

塩化マグネシゥム： 2.5 mM

Taqポリメラーゼ（宝酒造ネ ±¾) ： 2.5 U

D.D. W. (二重脱ィォン水)を加えて全量を 100 1とする。

94 、 1分間を 1サイクル； 94で、 1分間、 50¾ 1分間、 72 ^t 、 1分間を 3 5サイクル； 7 2°C、 3分間を 1サイクル。

P CR終了後、ァガロースゲル電気泳動に反応液 1 を供したところ、 200 b pに目的の断片と思われるバンドが #| された。そこでこのバンドを切り出して、インビトロジェン社製の TOPO TA Cloning Kitにて、該キットに添付の指示書に従って処理し、 E.coliJMl09を形質転換した。この形質転換株を任意に

20株選択し、プラスミド抽出を行った。それぞれのプラスミドに対し制限酵素処理を行い、適当なサイズの DN Aが挿入されているプラスミドを選択し、配列を決定した。酉己列決定は、 BigDye Terminator Cycle Sequence Kitと、シ一ケンサ一として ABIPRISM3100 Genetic Analyzerを用いて行った。その結果、 2つのアイソザィム（FAO— Q1と FA〇一 Q2) に相当するであろう 2種類の塩基（ポリヌクレオチド）が得られた。決定した塩基配列より予想されるアミノ酸配列に、精製酵素から決定したアミノ酸配列が確認された。このことより、上記 PC Rで増幅した DN A断片には、 FAO— Q1をコードする遺伝子の一部、 FAO—Q 2をコードする遺伝子の一部が存在することがわかつた。

2) 上流及び下流の部分配列、及び全長 DN Aの取得

上記 1 ) で得た 2種類の 200 b pフラグメントから上流及び下流に位置する DNAI己列を、 TaKaRaLA PGR in vitro Cloning Kitを使用し、： (¾浙した。得られた FAO— Q1と FAO— Q2の塩基配列をそれぞれ配列番号 3及び配列番号 5に、これらによってコードされている推定のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号 4及び 6に示す _D 産業上の利用分野

本癸明によって新規な FAOがされ、これらはアマドリ化合物の分析方法の発展に寄与することが期待される。特に、本発明の F AOのうち、糖化アミノ酸のみならず糖化べプチドに対しても活性を有する酵素を用いることにより、糖化タンパクの分解が不完全な場合であっても糖化タンパクをより正確に測定することが可能となる。その結果、糖尿病における血糖値コントロールに重要な Hb Al eを正確に測定することができ、延いては糖尿病患者の治療や合併症の予防に貢献しうる。また、本発明の新規なフルクトシルァミンォキシダーゼをコードする DNAは、遺伝子組換え技術を用いる酵素の効率的な大量生産を可能にし、マドリ化合物の分析法の開発を促進すると期待される。

Claims

請求の範囲

1. フサリウムプロリフェラタム ( sarium proliferatum) 由来のフノレクトシルァミンォキシダーゼ。

2. フサリウムプロリフェラタム Fusarium proliferatum 由来の酵素であつて、次に示す理化学的特徴を有するフルクトシルアミンォキシダーゼ。

① フルクトシルバリンに対する活性が、フルクトシルリジンに対する活性とほぼ同等か若しくはそれよりも高い。

② 酵素反応における至適 pHが 7. 5である。

③ 酵素の安定性に好適な跟度が約 30〜 40でである。

④ SDS— PAGEによる分子量が約 39 kDaであって、ゲル濾過法による分子量が約 39. 4 k Daである。

3. 配列番号 4のァミノ酸配列を有する請求項 2に記載のフルクトシルァミンォキシダーゼ。

4 ·フサリウムプロリフエラタム由来の酵素であって、次に示す理化学的特徴を有するフクトシノレアミンォキシダーゼ。

① フルクトシルリジンに対して検出可能な活性がなく、フルクトシルバリンに対する活性がある。

② 酵素反応における至適 pHが 7である。

③ 酵素の安定性に好適な温度が約 30〜 4 Οΐである。

5. 配列番号 6のァミノ酸配列を有する請求項 3に記載のフルクトシルァミンォキシダ一ゼ。

6. 請求項 1〜5のいずれかに記載のフルクトシルァミンォキシダーゼを生産することを特徴とする、フサリゥムプロリフェラタム（FERMBP— 8451) 。

7. 請求項 1〜 5のいずれかに記載のフルクトシ/レアミンォキシダーゼをコードする DNA₀

8. 配列番号 3又は配列番号 5に記載のヌクレオチド配列からなる請求項 7記載の D NA。

9 . 請求項 7又は 8に記載の D N Aで形質転換された宿主細胞。

1 0 . 請求項 6又は 9に記載の微生物又は宿主細胞を培地に培養し、培養物からフルクトシルァミンォキシダーゼを回収することを特徴とする、フルクトシルァミンォキシダーゼの製造方法。

1 1 . 請求項 1 ~ 5のいずれかに記載のフルクトシルァミンォキシダーゼを用いることを特徴とする、試料中に含まれるアマドリ化合物を測定する方法。