WO2013065623A1 - 新規なグルコース脱水素酵素 - Google Patents

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WO2013065623A1
WO2013065623A1 PCT/JP2012/077848 JP2012077848W WO2013065623A1 WO 2013065623 A1 WO2013065623 A1 WO 2013065623A1 JP 2012077848 W JP2012077848 W JP 2012077848W WO 2013065623 A1 WO2013065623 A1 WO 2013065623A1
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glucose
fgdh
present
glucose dehydrogenase
flavin
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PCT/JP2012/077848
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French (fr)
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洋輔 角田
洋志 相場
裕 川南
理恵 平尾
悠 歌島
岸本　高英
柳谷　周作
Original Assignee
東洋紡株式会社
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Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
    • C12Q1/006—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes for glucose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase

Definitions

  • the present invention relates to glucose dehydrogenase. More specifically, the present invention relates to a flavin-binding glucose dehydrogenase, a DNA encoding the same, a bacterium producing the enzyme, a method for producing the enzyme, a glucose measuring method using the enzyme, and the like.
  • SMBG Self-Monitoring of Blood Glucose
  • a biosensor has an electrode and an enzyme reaction layer formed on an insulating substrate.
  • Examples of enzymes used here include glucose dehydrogenase (GDH) and glucose oxidase (GO). It has been pointed out that the method using GO (EC 1.1.3.4) is easily affected by dissolved oxygen in the measurement sample, and the dissolved oxygen affects the measurement result. On the other hand, pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase (PQQ-GDH) (EC 1.1.5.2 (formerly EC1.1.99.17)) is not affected by dissolved oxygen even in GDH, but maltose and Since it also acts on sugars other than glucose such as lactose, it is not suitable for accurate blood glucose level measurement.
  • GDH glucose dehydrogenase
  • GO glucose oxidase
  • PQQ-GDH pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase
  • Flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase (hereinafter also referred to as “FADGDH”) is not affected by dissolved oxygen and hardly acts on maltose.
  • Patent Documents 1 to 6 and Non-Patent Documents 1 to 6 are known to be derived from Aspergillus terreus or Aspergillus oryzae, or modified from them. However, since these enzymes have a relatively high reactivity with xylose (Patent Document 1), there is room for improvement when measuring blood glucose in those who are undergoing a xylose tolerance test.
  • Patent Document 6 flavin-binding GDH (Patent Document 6) having a relatively low activity on xylose and modified GDH (Patent Document 7) having the advantages of GO and GDH have been developed, but there is still room for improvement. is there.
  • an object of the present invention is to provide a new glucose dehydrogenase excellent in substrate characteristics, affinity for a substrate, thermal stability, and the like.
  • the present inventors have conducted day and night studies and screened many microorganisms that have not been reported to produce glucose dehydrogenase so far. It was found to have enzyme activity. As a result of isolating and purifying the enzyme and examining its properties, the present inventors have found that it is flavin-binding glucose dehydrogenation, has excellent substrate specificity, high affinity for D-glucose, and excellent stability. I found out that it has sex. Furthermore, the present inventors determined the amino acid sequence and gene sequence of the isolated enzyme, and found that these sequences are novel enzymes different from those of FADGDH reported so far.
  • Item 1 A flavin-binding glucose dehydrogenase comprising the polypeptide of any one of (a) to (c) below: (A) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, (B) a polypeptide having a glucose dehydrogenase activity, comprising an amino acid sequence obtained by substitution, deletion, insertion, addition and / or inversion of one or several amino acid residues in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 , (C) A polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having glucose dehydrogenase activity.
  • DNA encoding (F) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, a polyamino acid sequence comprising one or several amino acid residues substituted, deleted, inserted, added, or inverted, and having glucose dehydrogenase activity DNA encoding a peptide.
  • Item 3 A vector incorporating the DNA of Item 2.
  • Item 4 A transformant comprising the vector according to Item 3.
  • Item 5 Item 6.
  • Item 6 A method for measuring a glucose concentration, comprising causing the flavin-binding glucose dehydrogenase according to Item 1 to act on glucose.
  • Item 8 A glucose assay kit comprising the flavin-binding glucose dehydrogenase according to Item 1.
  • Item 9 A glucose sensor comprising the flavin-binding glucose dehydrogenase according to Item 1.
  • Term A. A flavin-binding glucose dehydrogenase having the following characteristics (1) to (4): (1) Molecular weight: The molecular weight of the polypeptide portion of the enzyme measured by SDS-polyacrylamide electrophoresis is about 81 kDa. (2) Km value: Km value for D-glucose of about 20 mM or less (3) Temperature stability: Stable at 50 ° C. or less (4) pH stability: Stable term in the range of pH 3.0-10.
  • the flavin-binding glucose dehydrogenase according to Item A further comprising the following property (5): (5) Substrate specificity: C.
  • the reactivity of D-xylose is 1.2% or less when the reactivity to D-glucose is 100%.
  • the flavin-binding glucose dehydrogenase according to Item A or B further comprising the following property (6): (6) Optimal activity temperature: 37 ° C-55 ° C Term D.
  • the flavin-binding glucose dehydrogenase according to any one of Items A to D further comprising the following property (8): (8) Origin: Item F. derived from a microorganism classified into the genus Mucor. Item 10. The method for producing a flavin-binding glucose dehydrogenase according to any one of Items A to E, comprising culturing a microorganism classified into the genus Mucor and recovering glucose dehydrogenase.
  • Term G A method for measuring a glucose concentration, comprising causing the flavin-binding glucose dehydrogenase according to any one of Items A to E to act on glucose.
  • Term H A glucose assay kit comprising the flavin-binding glucose dehydrogenase according to any one of Items A to E.
  • Term I A glucose sensor comprising the flavin-binding glucose dehydrogenase according to any one of Items A to E.
  • the flavin-binding glucose dehydrogenase of the present invention (hereinafter sometimes referred to as “FGDH”) has glucose dehydrogenase activity and has a high affinity for D-glucose (that is, for D-glucose). (Km value is significantly lower), which makes it possible to measure the D-glucose concentration in the sample in a shorter time with a smaller amount of enzyme.
  • FGDH of the present invention since the FGDH of the present invention has a significantly low reactivity to D-xylose, it is possible to accurately measure the amount or concentration of glucose even when D-glucose and D-xylose coexist in the sample. To.
  • the FGDH of the present invention is excellent in thermal stability, it can be immobilized on the sensor strip under relatively high temperature conditions.
  • the FGDH of the present invention is stable over a wide range of pH, it is suitable for use under a wide range of conditions. Because of these characteristics, the FGDH of the present invention makes it possible to accurately measure the glucose concentration in any sample containing D-glucose (for example, blood or food (such as seasonings or beverages)).
  • the DNA of the present invention encodes the FGDH of the present invention, the FGDH of the present invention can be efficiently produced using genetic engineering techniques.
  • the absorption-spectrum measurement result about NBRC6754 origin FGDH is shown.
  • the influence of pH on the activity of NBRC6754-derived FGDH is shown.
  • the influence of the temperature with respect to the activity of NBRC6754-derived FGDH is shown.
  • the result of having measured the pH stability of NBRC6754-derived FGDH is shown.
  • the result of having measured the temperature stability of NBRC6754-derived FGDH is shown.
  • the relationship between the reaction rate of NBRC6754-derived FGDH and a substrate concentration is shown.
  • Flavin-binding glucose dehydrogenase 1-1 Flavin-binding glucose dehydrogenase 1-1.
  • Glucose dehydrogenase activity Flavin-binding glucose dehydrogenase is an enzyme having physicochemical properties that catalyzes a reaction in which glucose hydroxyl group is oxidized to produce glucono- ⁇ -lactone in the presence of an electron acceptor.
  • this physicochemical property is referred to as glucose dehydrogenase activity, and unless otherwise specified, “enzyme activity” or “activity” means the enzyme activity.
  • the electron acceptor is not particularly limited as long as it is capable of transferring electrons in a reaction catalyzed by FGDH.
  • DCPIP 2,6-dichlorophenolindophenol
  • PMS phenazine methosulfate
  • ferricyan compound 2-methoxy-5-methylphenadium methyl sulfate
  • ferricyan compound 2-methoxy-5-methylphenadium methyl sulfate
  • Glucose dehydrogenase activity can be measured by a known method. For example, using DCPIP as an electron acceptor, the activity can be measured using the change in absorbance of the sample at a wavelength of 600 nm before and after the reaction as an index. More specifically, the activity can be measured using the following reagents and measurement conditions.
  • ⁇ Measurement conditions Prewarm 3 mL of reaction reagent at 37 ° C. for 5 minutes. After adding 0.1 mL of FGDH solution and mixing gently, the absorbance change at 600 nm was recorded for 5 minutes using a spectrophotometer controlled at 37 ° C. with water as a control, and from the linear part (ie, the reaction rate became constant). Measure the change in absorbance per minute ( ⁇ ODTEST). In the blind test, a solvent for dissolving FGDH is added to the reaction reagent instead of the FGDH solution, and the change in absorbance per minute ( ⁇ ODBLANK) is measured in the same manner. From these values, FGDH activity is determined according to the following equation. Here, 1 unit (U) in FGDH activity is the amount of enzyme that reduces 1 micromole of DCPIP per minute in the presence of 200 mM D-glucose.
  • Activity (U / mL) ⁇ ( ⁇ OD TEST ⁇ OD BLANK ) ⁇ 3.1 ⁇ dilution ratio ⁇ / ⁇ 16.3 ⁇ 0.1 ⁇ 1.0 ⁇
  • 3.1 is the amount of the reaction reagent + enzyme solution (mL)
  • 16.3 is the molar molecular extinction coefficient (cm 2 / micromole) under the conditions for this activity measurement
  • 0.1 is the solution of the enzyme solution.
  • 1.0 indicates the optical path length (cm) of the cell.
  • enzyme activity is measured according to the measurement method described above.
  • FGDH of the present invention is a flavin-binding GDH that requires flavin as a prosthetic group.
  • FGDH of the present invention is preferably isolated FGDH or purified FGDH. Further, the FGDH of the present invention may be present in a state dissolved in a solution suitable for the above storage or in a lyophilized state (for example, in powder form). “Isolated” when used in relation to the enzyme (FGDH) of the present invention substantially includes components other than the enzyme (for example, contaminating proteins derived from host cells, other components, culture fluid, etc.). No) states. Specifically, for example, the isolated enzyme of the present invention has a contaminant protein content of less than about 20% by weight, preferably less than about 10%, more preferably less than about 5%, even more preferably. Is less than about 1%. On the other hand, the FGDH of the present invention may be present in a solution (eg, buffer) suitable for storage or measurement of enzyme activity.
  • a solution eg, buffer
  • the FGDH of the present invention is preferably composed of any of the following polypeptides (a) to (c).
  • A a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1;
  • B a polypeptide having a glucose dehydrogenase activity, comprising an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are substituted, deleted, inserted, added and / or inverted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 ;
  • C A polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having glucose dehydrogenase activity.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is an amino acid sequence of FGDH derived from Mucor himalis f. Silvaticus NBRC6754 and satisfies all the following characteristics 1-3 to 1-10.
  • the polypeptide of (b) above has substitution, deletion, insertion, addition and / or substitution of one or several amino acid residues in the amino acid shown in SEQ ID NO: 1 as long as it retains glucose dehydrogenase activity.
  • a polypeptide consisting of an inverted amino acid sequence hereinafter sometimes collectively referred to as “mutation”).
  • “several” means that the glucose dehydrogenase activity and preferably the characteristics of 1-3 to 1-10 (especially 1-3, 1-4, 1-7, and 1-8) described later are maintained.
  • the number of amino acid residues to be mutated is, for example, 2 to 127, preferably 2 to 96, more preferably 2 to 64, still more preferably 2 to 32, and even more.
  • the number is preferably 2 to 20, more preferably 2 to 15, even more preferably 2 to 10, and particularly preferably 2 to 5.
  • the type of substitution is not particularly limited, but “conservative amino acid substitution” is preferable from the viewpoint of not significantly affecting the FGDH phenotype. “Conservative amino acid substitution” refers to substitution of an amino acid residue with an amino acid residue having a side chain of similar properties.
  • the amino acid residue is a basic side chain (for example, lysine, arginine, histidine), an acidic side chain (for example, aspartic acid, glutamic acid), an uncharged polar side chain (for example, glycine, asparagine, glutamine, serine, Threonine, tyrosine, cysteine), non-polar side chains (eg, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), ⁇ -branched side chains (eg, threonine, valine, isoleucine), aromatic side chains ( For example, tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine) are classified into several families. Therefore, it is preferable to substitute between amino acid residues in the same family.
  • “conservative amino acid substitution” means substitution of amino acids within the same family exemplified above.
  • One or several mutations include restriction enzyme treatment, treatment with exonuclease, DNA ligase, etc., position-directed mutagenesis (Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13, Cold Spring Harbor Press, New Random York) Mutation is introduced into DNA encoding FGDH of the present invention described below using known methods such as introduction methods (Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13, Cold Spring Harbor Press, New York). Is possible. Variant FGDH can also be obtained by other methods such as ultraviolet irradiation. Variants FGDH include naturally occurring variants (for example, single nucleotide polymorphisms) based on individual differences in microorganisms that retain FGDH, and differences in species and genera.
  • the mutation is present at a site that does not affect the active site or substrate binding site of FGDH.
  • the polypeptide of the above (c) is compared with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 as long as it retains glucose dehydrogenase activity, and preferably as long as it retains the following properties 1-3 to 1-10.
  • the identity between the amino acid sequence of FGDH of the present invention and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is 85% or more, more preferably 88% or more, still more preferably 90% or more, and still more preferably 93% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more, and most preferably 99% or more.
  • Such a polypeptide comprising an amino acid sequence having a certain identity or more can be prepared based on the known genetic engineering techniques as described above.
  • Identities of amino acid sequences can be calculated using analysis tools that are commercially available or available through telecommunication lines (Internet), such as the National Biotechnology Information Center (NCBI) homology algorithm BLAST. (Basic local alignment search tool) http: // www. ncbi. nlm. nih. It is possible to calculate by using default (initial setting) parameters in gov / BLAST /.
  • NCBI National Biotechnology Information Center
  • the FGDH of the present invention is excellent in substrate specificity.
  • the FGDH of the present invention has a significantly low reactivity to at least D-xylose, based on the reactivity to D-glucose. More specifically, the FGDH of the present invention preferably has a reactivity to D-xylose of 1.2% or less when the reactivity to D-glucose at the same concentration is 100%.
  • FGDH of the present invention preferably has low reactivity to D-galactose and maltose in addition to low reactivity to D-xylose.
  • the reactivity of FGDH of the present invention to D-galactose is usually 5% or less, preferably 3% or less, more preferably 2% or less, more preferably 100% of the reactivity to D-glucose at the same concentration. Preferably it is 1.5% or less, Most preferably, it is 1.2% or less.
  • the reactivity of FGDH of the present invention to maltose is usually 5% or less, preferably 3% or less, more preferably 2% or less, assuming that the reactivity to D-glucose of the same concentration is 100%. Preferably it is 1.7% or less.
  • the lower limit of the reactivity to D-xylose, D-galactose and maltose based on the reactivity of FGDH of the present invention to D-glucose is not particularly limited, but the lower limit is close to 0% or 0%. Can be a value.
  • the reactivity of FGDH to each saccharide is as described in 1-1.
  • the determination can be performed by replacing D-glucose with another sugar (for example, D-xylose, D-galactose, or maltose) and comparing the activity in the case of D-glucose. it can.
  • the concentration of each saccharide in the case of comparison is based on 50 mM.
  • the FGDH of the present invention having excellent substrate specificity as described above is preferable as an enzyme for accurately measuring the amount of glucose in a sample. That is, according to the FGDH of the present invention, even when impurities such as maltose, D-galactose, and D-xylose are present in the sample, it is possible to accurately measure the amount of target D-glucose. . Therefore, the FGDH of the present invention is suitable for applications in which the presence of such contaminants is expected or concerned (typically, measurement of the amount of glucose in blood), and various applications including such applications. And is highly versatile.
  • the FGDH of the present invention preferably has a high affinity for D-glucose, which is the original substrate. Due to the high affinity, even when the concentration of D-glucose in the sample is low, the above-described catalytic reaction can proceed, and more accurate measurement of D-glucose concentration, measurement in a shorter time, This is because it contributes to measurement with a smaller amount of enzyme.
  • the affinity of FGDH for D-glucose is indicated by the Km value.
  • the Km value is a value obtained from the so-called Michaelis-Menten equation. Specifically, the above 1-1.
  • the D-glucose concentration is varied to measure the activity at each concentration, and a line weaver bark plot is created.
  • the Km value for D-glucose of FGDH of the present invention is preferably 20 mM or less, more preferably 19 mM or less, still more preferably 18 mM or less, still more preferably 17 mM or less, and particularly preferably 16.3 mM or less. is there.
  • the FGDH of the present invention preferably exhibits the highest activity at pH 7.5 (Tris HCl buffer).
  • pH 7.0 to 8.0 TrisHCl buffer
  • pH 6.5 to 7.5 potassium phosphate buffer
  • pH pH 6.5 pH 6.5
  • FGDH of the present invention has pH 7 .5 (Tris HCl buffer) is preferably 100% and preferably exhibits a relative activity of 80% or more. That is, the optimum active pH of FGDH of the present invention is 6.5 to 8, preferably 7.5.
  • Optimum activity temperature The optimum activity temperature of the FGDH of the present invention is preferably 37 ° C to 55 ° C.
  • “37 ° C. to 55 ° C.” means that the optimum activation temperature is typically around 37 ° C. to 55 ° C. and further has a certain acceptable width.
  • the optimum activity temperature is determined by measuring the enzyme activity in a PIPES-NaOH buffer (pH 6.5) at an enzyme concentration of 0.1 U / mL, as shown in the Examples described later.
  • pH stability in the present specification, when the residual enzyme activity after treating a 2 U / mL enzyme at 25 ° C. for 16 hours under a specific pH condition is 95% or more compared to the enzyme activity before the treatment In addition, the enzyme is judged to be stable at the pH condition.
  • the FGDH of the present invention is preferably stable at least over the entire pH range of 3.0 to 10.
  • Temperature stability As used herein, the residual enzyme activity after treating 2 U / mL of enzyme in a suitable buffer solution (for example, potassium acetate buffer (pH 5.0)) for 15 minutes under a specific temperature condition, When no substantial decrease is observed in comparison with the enzyme activity before the treatment (that is, about 90% or more is maintained), the enzyme is judged to be stable at the temperature condition.
  • a suitable buffer solution for example, potassium acetate buffer (pH 5.0)
  • the FGDH of the present invention is preferably stable in a temperature range of at least 0 ° C. to 50 ° C.
  • the FGDH of the present invention preferably has at least one of the features shown in 1-3 to 1-8, more preferably two or more, and still more preferably the three characteristics. Further, more preferably four or more, more preferably five or more, still more preferably six or more, particularly preferably all of them.
  • the FGDH of the present invention may have the characteristics of 1-3 to 1-8 in any combination, but has the characteristics of 1-3, 1-4, 1-7, and 1-8. Is preferred.
  • the molecular weight of the polypeptide moiety constituting the FGDH of the present invention is preferably about 81 kDa as measured by SDS-PAGE.
  • the “about 81 kDa” means that a range in which a person skilled in the art normally determines that there is a band at a position of 81 kDa when molecular weight is measured by SDS-PAGE is included.
  • Polypeptide moiety means FGDH in a state where sugar chains are not substantially bound. When the FGDH of the present invention produced by a microorganism is a glycan-linked type, the glycan is removed by treating it with heat treatment or saccharide hydrolase (that is, a “polypeptide moiety”).
  • the means for removing the sugar chain from the sugar chain-bound FGDH is not particularly limited.
  • the sugar chain-bound FGDH was denatured by heating at 100 ° C. for 10 minutes. Thereafter, it can be carried out by treatment with N-glycosidase F (Roche Diagnostics) at 37 ° C. for 6 hours.
  • the FGDH of the present invention When the FGDH of the present invention is bound to a sugar chain, its molecular weight is not particularly limited as long as it does not negatively affect glucose dehydrogenase activity, substrate specificity, affinity for D-glucose, and the like.
  • the molecular weight of the FGDH of the present invention in a state where sugar chains are bound is preferably 85,000 to 107,000 Da as measured by SDS-PAGE.
  • Glycan-linked FGDH is preferable from the viewpoint of making the enzyme more stable and from the viewpoint of enhancing water solubility and facilitating solubility in water.
  • the molecular weight measurement by SDS-PAGE can be performed using a commercially available molecular weight marker using a general method and apparatus.
  • the origin of the FGDH of the present invention is not particularly limited as long as it has the properties described above.
  • the FGDH of the present invention can be derived from, for example, a microorganism belonging to the genus Mucor. Although it does not restrict
  • NBRC NITE Biological Resource Center
  • Examples of other organisms from which the FGDH of the present invention is derived include microorganisms present in water systems such as soil, rivers, and lakes or in the ocean, microorganisms that are resident on the surface or inside various animals and plants, and the like. Microorganisms that grow in a low temperature environment, a high temperature environment such as a volcano, an oxygen-free, high-pressure, no-light environment such as the deep sea, and a special environment such as an oil field may be used as the isolation source.
  • the FGDH of the present invention includes not only FGDH directly isolated from microorganisms, but also those obtained by modifying the isolated FGDH by amino acid sequence or the like by a protein engineering method or by genetic engineering techniques. .
  • the above-mentioned characteristics are provided by modifying an enzyme obtained from a microorganism classified into the genus Mucobiidae, more specifically, a microorganism classified into the genus Mucor, Absidia, and Actinomucor. It may be modified as described above. More specifically, Mucor guilliermondii, Mucor prainiii, Mucor javanicus, Mucor circinolides, and Mucor heimalis f. The thing derived from the microorganisms which belong to silvaticus may be modified.
  • DNA encoding flavin-binding glucose dehydrogenase The DNA of the present invention is a DNA encoding the above-mentioned 1 FGDH, specifically, any one of the following (A) to (F).
  • D DNA containing a DNA that hybridizes under stringent conditions to a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and that encodes a polypeptide having glucose dehydrogenase activity;
  • DNA encoding (F) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, a polyamino acid sequence comprising one or several amino acid residues substituted, deleted, inserted, added, or inverted, and having glucose dehydrogenase activity DNA encoding a peptide.
  • DNA encoding a protein refers to DNA from which the protein is obtained when it is expressed, that is, DNA having a base sequence corresponding to the amino acid sequence of the protein. Therefore, DNAs that differ due to codon degeneracy are also included.
  • the protein having the amino acid sequence encoded by the DNA of the present invention has glucose dehydrogenase activity and preferably at least one of the above properties 1-2 to 1-10 (particularly, the above 1-3, 1-3). 1-7 and 1-8), the homology with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 is 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 88% or more, and still more preferably 90%. More preferably, the nucleotide sequence is 93% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more, and most preferably 99% or more.
  • the homology of the base sequence can be calculated using an analysis tool that is commercially available or available through a telecommunication line (Internet), and is calculated using software such as FASTA, BLAST, PSI-BLAST, SSEARCH, etc.
  • the Specifically, main initial conditions generally used for BLAST search are as follows. That is, in Advanced BLAST 2.1, by using blastn as a program and searching with various parameters set to default values, the homology value (%) of nucleotide sequences can be calculated.
  • the DNA of the present invention is complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 as long as the protein encoded by it has glucose dehydrogenation activity, and preferably has at least one of the above properties 1-2 to 1-10 It may be a DNA that hybridizes under stringent conditions to a typical base sequence.
  • stringent conditions refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. Such stringent conditions are known to those skilled in the art, and include, for example, Molecular Cloning (Third Edition, Cold Spring Harbor Press, New York, Current Protocols in Molecular. 1987).
  • Specific stringent conditions include, for example, a hybridization solution (50% formamide, 10 ⁇ SSC (0.15M NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.0), 5 ⁇ Denhardt solution, 1% SDS, 10% Incubate at about 42 ° C. to about 50 ° C. with dextran sulfate, 10 ⁇ g / ml denatured salmon sperm DNA, 50 mM phosphate buffer (pH 7.5), and then with 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS And washing at about 65 ° C to about 70 ° C.
  • a hybridization solution 50% formamide, 10 ⁇ SSC (0.15M NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.0
  • 5 ⁇ Denhardt solution 1% SDS
  • 10% Incubate at about 42 ° C. to about 50 ° C. with dextran sulfate, 10 ⁇ g / ml denatured salmon sperm DNA, 50 mM phosphate buffer (
  • stringent conditions for example, 50% formamide, 5 ⁇ SSC (0.15M NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.0) as a hybridization solution, 1 ⁇ Denhardt solution, 1% SDS, 10% dextran sulfate, Examples include conditions using 10 ⁇ g / ml denatured salmon sperm DNA, 50 mM phosphate buffer (pH 7.5)).
  • DNA that hybridizes under such conditions may include those in which a stop codon has occurred in the middle or those that have lost activity due to mutations in the active center, but these are incorporated into commercially available active expression vectors. It can be easily removed by expressing it in a suitable host and measuring the enzyme activity by a known method.
  • “several” has the same meaning as described in 1-2 above. That is, “several” means that the glucose dehydrogenase activity and preferably the characteristics of 1-3 to 1-10 (particularly 1-3, 1-4, 1-7, and 1-8) described later are maintained. As many as, for example, a number corresponding to less than about 20% of the total DNA, preferably a number corresponding to less than about 15%, more preferably a number corresponding to less than about 10%, even more preferred. Is a number corresponding to less than about 5%, most preferably a number corresponding to less than about 1%.
  • the number of bases to be mutated is, for example, 2 to 382, preferably 2 to 286, more preferably 2 to 290, still more preferably 2 to 95, and still more preferably. It is 2 to 19, more preferably 2 to 15, even more preferably 2 to 10, and particularly preferably 2 to 5.
  • the DNA encoding FGDH of the present invention is DNA that is present in an isolated state.
  • isolated DNA refers to a state separated from other components such as nucleic acids and proteins that coexist in the natural state.
  • nucleic acid components such as a nucleic acid sequence adjacent in the natural state (for example, a promoter region sequence and a terminator sequence) may be included.
  • an “isolated” state in the case of chromosomal DNA is preferably substantially free of other DNA components that coexist in the natural state.
  • the “isolated” state in the case of DNA prepared by genetic engineering techniques such as cDNA molecules is preferably substantially free of cell components, culture medium, and the like.
  • the “isolated” state in the case of DNA prepared by chemical synthesis is preferably substantially free of precursors (raw materials) such as dNTPs, chemical substances used in the synthesis process, and the like.
  • precursors raw materials
  • dNTPs chemical substances used in the synthesis process
  • DNA DNA in an isolated state.
  • the DNA of the present invention also includes DNA (cDNA) complementary to the above DNAs (A) to (F).
  • the DNA of the present invention can be produced and obtained by chemical DNA synthesis based on the sequence information (particularly SEQ ID NO: 2) disclosed in this specification or the attached sequence listing. (Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989); Secondary Biochemistry Experiment Course “Gene Research Methodology” I, II, III ", edited by Japanese Biochemical Society (1986), etc.).
  • a chemical DNA synthesis method a solid phase synthesis method by a phosphoramidite method can be exemplified. An automatic synthesizer can be used for this synthesis method.
  • a cDNA library is prepared according to a conventional method from an appropriate source microorganism in which the FGDH of the present invention is expressed, and the DNA sequence of the present invention (for example, it can be carried out by selecting a desired clone using an appropriate probe or antibody peculiar to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 [Proc. Natl. Acad. Sci. , USA. 78, 6613 (1981); Science 122, 778 (1983), etc.].
  • the source microorganism for preparing the cDNA library is not particularly limited as long as it is a microorganism that expresses the FGDH of the present invention, but is preferably a microorganism classified into the genus Mucor.
  • Mucor species suitable as a source microorganism are Mucor guilliermondii, Mucor cilcinelloides, Mucor heimalis, and the like. More specific origin microorganism strains include Mucor guilliermondii NBRC 9403, Mucor cilcinelloides NBRC 4554, Mucor heimalis NBRC 6754, and the like. Among these, Mucor himalis f. Silvaticus NBRC6754 is preferable.
  • the separation of total RNA from the above microorganisms, the separation and purification of mRNA, the acquisition of cDNA and its cloning, etc. can all be carried out according to conventional methods.
  • the method for screening the DNA of the present invention from a cDNA library is not particularly limited, and can be performed according to a usual method.
  • a method for selecting a corresponding cDNA clone by immunoscreening using the polypeptide-specific antibody, a plaque high using a probe that selectively binds to a target nucleotide sequence Hybridization, colony hybridization, etc., and combinations thereof can be selected as appropriate.
  • a PCR method [Science 130, 1350 (1985)] or a modified method of DNA or RNA can be preferably used.
  • the RACE method Rapid amplification of cDNA ends; experimental medicine, 12 (6), 35 (1994)]
  • 5′-RACE method [M . A. Frohman, et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 8, 8998 (1988)] and the like are suitable.
  • Primers used when adopting the PCR method can also be designed and synthesized as appropriate based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • isolation and purification of the amplified DNA or RNA fragment can be performed according to a conventional method as described above, and can be performed using, for example, gel electrophoresis, hybridization, or the like.
  • the FGDH of the present invention can be easily produced in large quantities and stably.
  • Vector The vector of the present invention comprises the above-mentioned 2. This is a vector in which a DNA encoding FGDH of the present invention described in 1. is incorporated.
  • the “vector” is a nucleic acid molecule (carrier) capable of transporting a nucleic acid molecule inserted therein into a target such as a cell, and can replicate the DNA of the present invention in an appropriate host cell.
  • the type and structure are not particularly limited as long as it can be expressed. That is, the vector of the present invention is an expression vector.
  • an appropriate vector is selected in consideration of the type of host cell.
  • the vector examples include a plasmid vector, a cosmid vector, a phage vector, a virus vector (an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, a retrovirus vector, a herpes virus vector, etc.) and the like. It is also possible to use a vector suitable for using a filamentous fungus as a host or a vector suitable for self-cloning.
  • Escherichia coli When Escherichia coli is used as a host, for example, M13 phage or a modified product thereof, ⁇ phage or a modified product thereof, pBR322 or a modified product thereof (pB325, pAT153, pUC8, etc.) can be used.
  • yeast When yeast is used as a host, pYepSec1, pMFa, pYES2, etc. can be used.
  • insect cells When insect cells are used as hosts, for example, pAc and pVL can be used.
  • mammalian cells When mammalian cells are used as hosts, for example, pCDM8 and pMT2PC can be used, but the present invention is not limited thereto. .
  • the expression vector usually contains a promoter sequence necessary for the expression of the inserted nucleic acid and an enhancer sequence for promoting the expression.
  • An expression vector containing a selectable marker can also be used. When such an expression vector is used, the presence or absence of the expression vector (and the degree thereof) can be confirmed using a selection marker. Insertion of the DNA of the present invention into a vector, insertion of a selectable marker gene (if necessary), insertion of a promoter (if necessary), etc. are performed using standard recombinant DNA techniques (for example, Molecular Cloning, Third Edition, 1.84). , Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, which is a well-known method using restriction enzymes and DNA ligase).
  • Transformant relates to a transformant in which the DNA of the present invention is introduced into a host cell.
  • the means for introducing the DNA of the present invention into the host is not particularly limited. And introduced into a host in a state of being incorporated into a vector described in 1.
  • the host cell is not particularly limited as long as it can express the DNA of the present invention and produce FGDH.
  • prokaryotic cells such as Escherichia coli and Bacillus subtilis
  • eukaryotic cells such as yeast, mold, insect cells, and mammalian cells can be used.
  • Escherichia coli Escherichia coli C600, Escherichia coli HB101, Escherichia coli DH5 ⁇ and the like are used, and examples of the vector include pBR322, pUC19, pBluescript, and the like.
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida utilis, Pichia pastoris, and the like, and examples of the vector include pAUR101, pAUR224, and pYE32.
  • the host is a filamentous fungal cell, for example, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Mucor himalis and the like can be exemplified. It is also preferable to use as a host a microorganism belonging to the genus Mucor from which the FGDH of the present invention has been isolated. That is, in the transformant, exogenous DNA is usually present in the host cell, but a transformant obtained by so-called self-cloning using a microorganism from which the DNA is derived as a host is also a preferred embodiment.
  • the transformant of the present invention is preferably 3. It is prepared by transfection or transformation using the expression vector shown in 1. Transformation may be transient or stable.
  • Transformation may be transient or stable.
  • calcium phosphate coprecipitation method electroporation (Potter, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 7161-7165 (1984)), lipofection (Felner) , PL et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7417 (1984)), microinjection (Graessmann, M. & Graessmann, A., Proc. Natl. Acad.Sci.U.S.A.
  • the transformant of the present invention has the ability to produce the FGDH of the present invention, it can be used to efficiently produce the FGDH of the present invention.
  • the FGDH of the present invention is produced by culturing a microorganism having the ability to produce the FGDH of the present invention.
  • the microorganism used for the culture is not particularly limited as long as it has the ability to produce the FGDH of the present invention.
  • the transformant shown in can be suitably used.
  • Mucor guilliermondii Specific microorganisms classified into the genus Mucor include Mucor guilliermondii, Mucor praini, Mucor javanicus, Mucor circinolides, and Mucor heimalis f. Silvaticus is an example.
  • Microorganisms classified into the above genus Mucor are, for example, strains stored in NBRC (NITE Biologic Resource Center) (Independent Administrative Institution, Product Evaluation Technology Infrastructure, Biotechnology Headquarters, Biogenetic Resource Division). We can receive the sale by going through the procedure.
  • NBRC NITE Biologic Resource Center
  • the culture method and culture conditions are not particularly limited as long as the FGDH of the present invention is produced. That is, on the condition that FGDH is produced, a method and conditions suitable for the growth of the microorganism to be used can be appropriately set.
  • examples of the culture conditions include a culture medium, a culture temperature, and a culture time.
  • the medium is not particularly limited as long as the microorganism to be used can grow.
  • carbon sources such as glucose, sucrose, gentiobiose, soluble starch, glycerin, dextrin, molasses, organic acids, ammonium sulfate, ammonium carbonate, ammonium phosphate, ammonium acetate, peptone, yeast extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate
  • nitrogen sources such as bran and meat extract, and those added with inorganic salts such as potassium salt, magnesium salt, sodium salt, phosphate, manganese salt, iron salt and zinc salt can be used.
  • Vitamins, amino acids and the like may be added to the medium in order to promote the growth of the microorganisms used.
  • the culture conditions may be selected in consideration of the nutritional physiological properties of the microorganism. In many cases, it is advantageous to use liquid culture and industrially perform aeration and agitation culture. However, when productivity is considered, it may be advantageous to carry out by solid culture.
  • the pH of the medium is only required to be suitable for the growth of the microorganism to be cultured.
  • it is adjusted to about 3 to 8, preferably about 5 to 7, and the culture temperature is usually about 10 to 50 ° C., preferably about 25 to 35.
  • Culturing is carried out under aerobic conditions at about 0 ° C. for about 1 to 15 days, preferably about 3 to 7 days.
  • a shaking culture method or an aerobic deep culture method using a jar fermenter can be used as the culture method.
  • FGDH FGDH
  • the culture supernatant is filtered, centrifuged, etc. to remove insoluble matters, then concentrated with an ultrafiltration membrane, salting out such as ammonium sulfate precipitation, dialysis
  • the present enzyme can be obtained by performing separation and purification by appropriately combining various types of chromatography.
  • Flavin-binding glucose dehydrogenase produced by microorganisms belonging to the genus Mucor is basically a secreted protein.
  • the microbial cells are crushed by pressure treatment, ultrasonic treatment, mechanical method, or a method using an enzyme such as lysozyme, and if necessary, such as EDTA.
  • the present enzyme can be obtained by adding a chelating agent and a surfactant to solubilize GDH, separating and collecting it as an aqueous solution, separating and purifying it. After the bacterial cells are collected from the culture solution in advance by filtration, centrifugation, or the like, the series of steps (crushing, separating, and purifying the bacterial cells) may be performed.
  • Purification includes, for example, vacuum concentration, membrane concentration, salting-out treatment such as ammonium sulfate and sodium sulfate, precipitation treatment with a hydrophilic organic solvent such as methanol, ethanol, acetone, etc., heat treatment, isoelectric point treatment, adsorbent Alternatively, gel filtration using a gel filter, etc., adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like can be performed in appropriate combination.
  • glucose dehydrogenase activity When collecting (extracting, purifying, etc.) a protein having glucose dehydrogenase activity from the culture solution, one or more of glucose dehydrogenase activity, maltose activity, thermal stability, etc. are used as an index. May be.
  • fractionation is performed using FGDH activity as an indicator, and the process proceeds to the next step.
  • FGDH activity as an indicator
  • the FGDH of the present invention When the FGDH of the present invention is used as a purified preparation, for example, it is preferable to purify it in a state where the specific activity is 100 to 200 (U / mg), preferably 160 to 180 (U / mg). Depending on the host in which FGDH is expressed, it can be purified to a higher specific activity state.
  • the final form may be liquid or solid (including powder).
  • this enzyme is obtained as a recombinant protein.
  • a DNA encoding this enzyme and other appropriate DNA are inserted into the same vector and a recombinant protein is produced using the vector, the peptide consists of a recombinant protein linked to any peptide or protein.
  • This enzyme can be obtained.
  • modification may be performed so that addition of sugar chain and / or lipid, or processing of N-terminal or C-terminal may occur. By the modification as described above, extraction of recombinant protein, simplification of purification, addition of biological function, and the like are possible.
  • the amount or concentration of glucose in various samples can be measured using the FGDH of the present invention.
  • the mode is not particularly limited.
  • the glucose concentration can be measured by adding the FGDH of the present invention to a sample, or by adding and mixing.
  • the sample containing glucose is not particularly limited, and examples thereof include blood, beverages, and foods.
  • Measurement of the glucose concentration in the form of a sensor to be described later can be carried out, for example, as follows. Put buffer in constant temperature cell and maintain at constant temperature.
  • As the mediator potassium ferricyanide, phenazine methosulfate, or the like can be used.
  • As the working electrode an electrode on which FGDH of the present invention is immobilized is used, and a counter electrode (for example, a platinum electrode) and a reference electrode (for example, an Ag / AgCl electrode) are used.
  • a sample containing glucose is added and the increase in current is measured.
  • the glucose concentration in the sample can be calculated according to a calibration curve prepared with a standard concentration glucose solution.
  • the glucose assay kit of the present invention contains the FGDH of the present invention in an amount sufficient for at least one assay.
  • the kit includes the FGDH of the present invention, plus buffers necessary for the assay, mediator, glucose standard solution for creating a calibration curve, and directions for use.
  • the FGDH of the present invention can be provided in various forms, for example, as a lyophilized reagent or as a solution in a suitable storage solution.
  • the present invention also features a glucose sensor that uses the FGDH of the present invention.
  • a carbon electrode, a gold electrode, a platinum electrode or the like is used, and the enzyme of the present invention is immobilized on this electrode.
  • the immobilization method include a method using a crosslinking reagent, a method of encapsulating in a polymer matrix, a method of coating with a dialysis membrane, a method of using a photocrosslinkable polymer, a conductive polymer, a redox polymer, etc. It may be fixed in a polymer or adsorbed and fixed on an electrode together with an electron mediator typified by a derivative, or a combination thereof may be used.
  • FGDH of the present invention Since the FGDH of the present invention is excellent in thermal stability, it can be immobilized under relatively high temperature conditions. Typically, FGDH of the present invention is immobilized on a carbon electrode using glutaraldehyde, and then treated with a reagent having an amine group to block glutaraldehyde.
  • the measurement of glucose concentration can be performed as follows. Put buffer in constant temperature cell and maintain at constant temperature.
  • As the mediator potassium ferricyanide, phenazine methosulfate, or the like can be used.
  • As the working electrode an electrode on which FGDH of the present invention is immobilized is used, and a counter electrode (for example, a platinum electrode) and a reference electrode (for example, an Ag / AgCl electrode) are used.
  • a sample containing glucose is added and the increase in current is measured.
  • the glucose concentration in the sample can be calculated according to a calibration curve prepared with a standard concentration glucose solution.
  • the “product” is a product that constitutes a part or all of one set used by a user for the purpose of carrying out the application, and the flavin-binding glucose dehydrogenase of the present invention is used. It means to include.
  • Example 1 Restoration of Strains
  • a strain belonging to the genus Mucor was obtained from National Institute of Technology and Evaluation. Since the obtained strain was an L-dried preparation, the ampoule was opened, 100 ⁇ L of reconstituted water was injected, the dried cells were suspended, and the suspension was dropped into the reconstitution medium for 3 days at 25 ° C. The strain was restored by stationary culture for 7 days.
  • As the restoration water sterilized water (distilled water treated at 120 ° C. for 20 minutes in an autoclave) is used, and as the restoration medium, DP medium (dextrin 2.0%, polypeptone 1.0%, KH 2 PO 4 . 0%, agarose 1.5%).
  • Example 2 Recovery of Culture Supernatant A medium containing 2 g of wheat germ and 2 mL of water was sterilized by autoclaving at 120 ° C. for 20 minutes, and each strain of the genus Mucor restored in Example 1 was inoculated with one platinum ear. The culture was stationary at 25 ° C. for 3 to 7 days. After the culture, 4 mL of 50 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) containing 2 mM EDTA was added, and the mixture was sufficiently suspended by vortexing.
  • 50 mM potassium phosphate buffer pH 6.0
  • Example 3 Confirmation of Glucose Dehydrogenase Activity Glucose dehydrogenase activity in the crude enzyme solution obtained in Example 2 was determined according to 1-1. It was measured using the FGDH activity measuring method shown in 1. The results are shown in Table 1.
  • Example 4 Purification of FGDH derived from Mucor himalis f. Silvaticus NBRC6754 50 mL of DP liquid medium was placed in a 500 mL Sakaguchi flask, sterilized by autoclaving, and used as a medium for preculture. Mucor Himalis f. Silvaticus NBRC6754 pre-reconstituted with DP plate medium was inoculated into a preculture medium with one platinum ear, and cultured with shaking at 25 ° C. and 180 rpm for 3 days to obtain a seed culture solution.
  • 6.0 L of production medium (yeast extract 2.0%, glucose 1%, pH 6.0) was placed in a 10 L jar fermenter and sterilized by an autoclave to obtain a main culture medium.
  • 50 mL of the seed culture solution was inoculated into the main culture medium and cultured for 3 days under the conditions of a culture temperature of 25 ° C., a stirring speed of 600 rpm, an aeration rate of 2.0 L / min, and a tube pressure of 0.2 MPa. Thereafter, the culture solution was filtered with a filter cloth, and the cells were collected. The obtained bacterial cells were suspended in 50 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0).
  • the suspension was fed to a French press (manufactured by Niro Soavi) at a flow rate of 160 mL / min and crushed at 1000 to 1300 bar. Subsequently, ammonium sulfate (manufactured by Sumitomo Chemical Co., Ltd.) was gradually added to the crushed liquid so as to become 0.2 saturation, and after stirring at room temperature for 30 minutes, excess precipitate was removed using a filter aid. . Next, it was concentrated using a UF membrane (Millipore Corp.) having a molecular weight cut off of 10,000, and the concentrated solution was desalted using Sephadex G-25 gel.
  • ammonium sulfate was gradually added to the desalted solution to 0.5 saturation, and 400 mL of SP Sepharose FastFlow previously equilibrated with 50 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) containing 0.5 saturated ammonium sulfate. It was applied to a column (manufactured by GE Healthcare) and eluted with a linear gradient of 50 mM phosphate buffer (pH 6.0).
  • the eluted GDH fraction was concentrated with a hollow fiber membrane (manufactured by Spectrum Laboratories) having a molecular weight cut-off of 10,000 and then applied to a DEAE Sepharose Fast Flow (manufactured by GE Healthcare) column to obtain a purified enzyme.
  • the obtained purified enzyme was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (Past Gel 10-15%, manufactured by Pastsystem GE Healthcare).
  • phosphorylase b 97,400 dalton
  • bovine serum albumin 66,267 dalton
  • aldolase 42,400 dalton
  • carbonic anhydrase 30,000 dalton
  • trypsin inhibitor protein molecular weight marker
  • Example 5 Confirmation that the enzyme is a flavin-binding enzyme
  • the enzyme purified in Example 4 was dialyzed against 10 mM acetate buffer (pH 5.0), and the absorption spectrum at 250-800 nm was measured using a spectrophotometer U-3210 (Hitachi High Technologies). ). As a result, two peaks having local maximums were confirmed at wavelengths around 340 to 350 nm and around 420 to 430 nm (FIG. 1). Such a shape of the absorption spectrum strongly suggested that the GDH of the present invention is a flavin-binding protein.
  • Example 6 Molecular Weight of Isolated FGDH Peptide Part FGDH purified in Example 4 was denatured by heating at 100 ° C. for 10 minutes, and then 5 U of N-glycosidase F (Roche Diagnostics) At 37 ° C. for 1 hour to decompose the sugar chain added to the protein. Thereafter, measurement was performed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis in the same manner as in Example 4. The same molecular weight marker as in Example 4 was used. As a result, the molecular weight of the purified FGDH polypeptide portion was found to be about 81,000 daltons.
  • Example 7 Substrate Specificity 1-1. Investigate the substrate specificity of the purified enzyme by comparing the activity when using D-glucose as a substrate with the apparent activity when using the target sugar, according to the FGDH activity measurement method shown in did. Maltose, D-galactose, and D-xylose were used as sugars for comparison. The substrate concentration was 50 mM. The results are shown in Table 2.
  • the substrate specificity of the FGDH of the present invention is that the apparent activity against maltose, D-galactose and D-xylose is 2% or less when the activity value against D-glucose is 100%.
  • the FGDH of the present invention was shown to be excellent in substrate specificity.
  • Example 8 Optimum active pH The optimum pH was examined using the FGDH enzyme solution (0.5 U / mL) obtained in Example 4. 100 mM potassium acetate buffer (pH 5.0-5.5, plotted with ⁇ in the figure), 100 mM MES-NaOH buffer (pH 5.5-6.5, plotted with ⁇ in the figure), 100 mM potassium phosphate buffer Solution (pH 6.0-8.0, plotted with ⁇ in the figure), 100 mM Tris-HCl buffer solution (pH 7.5-9.0, plotted with ⁇ mark in the figure), and at each pH, the temperature was 37 ° C. Enzymatic reactions were carried out and the relative activities were compared. The results are shown in FIG.
  • the optimum activity pH of FGDH of the present invention showed the highest activity value at pH 7.4.
  • the relative activity of about 80% or more of the maximum activity value was exhibited between about pH 6.5 and pH 8.0, it can be suitably used in this pH range.
  • Example 9 Optimal activity temperature Using the FGDH enzyme solution (0.1 U / mL) obtained in Example 4, the optimal activity temperature was investigated.
  • the buffer solution used was 42 mM PIPES-NaOH buffer (pH 6.5), and the activity at 30 ° C., 37 ° C., 40 ° C., 45 ° C., 50 ° C., 55 ° C. and 60 ° C. was determined. The results are shown in FIG.
  • the FGDH of the present invention showed the highest activity value in the range of 45 ° C. to 50 ° C., and the temperature range showing the relative activity of 80% or more with respect to the maximum activity value was 37 ° C. to 55 ° C. . From the above, it was shown that the optimum activity temperature of flavin-binding FGDH is 37 ° C to 55 ° C.
  • Example 10 pH stability Using the FGDH enzyme solution (2 U / mL) obtained in Example 4, pH stability was examined. 100 mM glycine-HCl buffer (pH 2.5-pH 3.5: plotted with ⁇ in the figure) 100 mM acetate-potassium buffer (pH 3.0-pH 5.5: plotted with ⁇ in the figure), 100 mM MES-NaOH buffer Solution (pH 5.5-pH 6.5: plotted with ⁇ mark), 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0-pH 8.0: plotted with ⁇ mark), 100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.
  • 100 mM glycine-HCl buffer pH 2.5-pH 3.5: plotted with ⁇ in the figure
  • 100 mM acetate-potassium buffer pH 3.0-pH 5.5: plotted with ⁇ in the figure
  • 100 mM MES-NaOH buffer Solution pH 5.5-pH 6.5: plotted with ⁇ mark
  • the residual activity rate was 90% or more in the range of pH 3.0 to pH 10.0. From this, it was shown that the stable pH range is pH 3.0 to 10.0.
  • Example 11 Temperature stability Using the FGDH enzyme solution (2 U / mL) obtained in Example 4, temperature stability was examined. The FGDH enzyme solution was treated with each temperature (4 ° C, 30 ° C, 40 ° C, 50 ° C, 55 ° C, 60 ° C, 65 ° C, 70 ° C) for 15 minutes using 100 mM potassium acetate buffer (pH 5.0). Thereafter, the residual rate of apparent activity was measured. The results are shown in FIG.
  • the FGDH of the present invention had a residual rate of 91% after the treatment at 50 ° C., and had a higher residual activity at 50 ° C. or less. From this, it was shown that FGDH is stable at 50 ° C. or lower.
  • Example 12 Measurement of Km Value
  • the activity was measured by changing the concentration of D-glucose as a substrate, and the Lineweaver-burk plot was calculated from the substrate concentration and reaction rate graph (FIG. 6). The Km value was calculated. As a result, it was found that the Km value for D-glucose of FGDH of the present invention was 16.3 mM.
  • Example 13 Isolation of DNA Encoding FGDH (1) Extraction of Chromosomal DNA After culturing Mucor himalis NBRC6754 in a Sakaguchi flask containing 50 ml of YG medium (Yeast Extract 1%, Glucose 2%) at 25 ° C. overnight. The culture solution was filtered using a Buchner funnel and a Nutsche suction bottle to obtain bacterial cells. Among them, about 0.3 g of the microbial cells were frozen in liquid nitrogen, the mycelia were crushed using a mortar, and an extraction buffer (1% hexamethylmethyl bromide, 0.7 M NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM.
  • YG medium Yeast Extract 1%, Glucose 26%
  • Chromosomal DNA precipitated by this treatment was centrifuged (20,000 g, 10 minutes, 4 ° C.), and the resulting precipitate was washed with 70% ethanol and vacuum dried.
  • the chromosomal DNA thus obtained was dissolved again in 4 ml of TE, and 200 ⁇ l of 10 mg / ml RNase A (Sigma Aldrich Japan Co., Ltd.) was added, followed by incubation at 37 ° C. for 30 minutes. Subsequently, after adding 40 ⁇ l of 20 mg / ml Proteinase K, recombinant, PCR Grade (Roche Diagnostics) solution and incubating at 37 ° C.
  • chromosomal DNA was washed with 70% ethanol, vacuum-dried, and finally dissolved in 400 ⁇ l of TE solution to obtain a chromosomal DNA solution having a concentration of about 1 mg / ml.
  • the amplified DNA fragment was purified and a cloning kit Target Clone-Plus (manufactured by Toyobo) And was cloned into the vector pTA2 and transformed into Escherichia coli DH5 ⁇ competent cell (manufactured by Toyobo) to obtain a transformant.
  • the transformant was cultured in LB medium, the plasmid was extracted, and the base sequence analysis of the region corresponding to the enzyme gene was performed.
  • the sequence reaction was performed using BigDye TM Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.) according to the instruction manual of the product.
  • An ABI PRISM 310 sequencer (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.) was used for the analysis.
  • the sequence analysis of the amplified fragment was performed in the same manner as described above, and the upstream base sequence including the sequence presumed to be the start codon was clarified.
  • the genomic DNA obtained in (1) above was treated with the restriction enzyme ScaI using the above-described inverse PCR primers (SEQ ID NOs: 8 and 9). Then, inverse PCR was performed in the same manner as described above using the ligated template as a template. Thereby, the sequence analysis of the amplified fragment was performed in the same manner as described above, and the upstream base sequence including the sequence presumed to be a stop codon was clarified.
  • N-terminus Determination of N-terminus and C-terminus
  • the determination of N-terminus is based on the sequence obtained in (4) from the viewpoints of homology of amino acid sequence, length of base sequence, etc. by making full use of known information. A multifaceted comparison was made to determine the start codon. The determination of the C terminal was also judged in the same manner.
  • ReverseTra-Ace manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • ReverseTra-Ace manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • reverse transcription was performed, and cDNA was synthesized.
  • 3UTR R1 SEQ ID NO: 11
  • PCR was performed under the recommended conditions using DNA polymerase KOD-Plus (manufactured by Toyobo) using the cDNA synthesized above as a template.
  • the primer SEQ ID NOs: 10 and 11 prepared in (6) above was used.
  • Example 14 Expression of Saccharomyces cerevisiae from FGDH derived from Mucor himalis NBRC6754 and confirmation of enzyme activity (1) Construction of expression vector To amplify the Mucor himalis derived FGDH gene (SEQ ID NO: 2), which was revealed in Example 13. PCR was performed under the recommended conditions using DNA polymerase KOD-Plus (manufactured by Toyobo) using the cDNA prepared in Example 13 (7) as a template. Primers (SEQ ID NOs: 13 and 14) to which restriction enzyme sites were added were used as primers.
  • the PCR product amplified by the PCR was operated using a cloning kit Target Clone-Plus (manufactured by Toyobo) according to the protocol to transform Escherichia coli DH5 ⁇ competent cell (manufactured by Toyobo).
  • the transformant was obtained.
  • the transformant was inoculated into a liquid medium (1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl; pH 7.3) containing ampicillin (50 mg / ml; manufactured by Nacalai Tesque) at 30 ° C.
  • a plasmid was prepared from cells obtained by overnight shaking culture by a conventional method.
  • the plasmid is treated with restriction enzymes SacI and NotI, a DNA fragment containing the gene region is obtained, mixed with the vector pYES3 (Invitrogen) similarly treated with restriction enzymes SacI and NotI, and an equal amount of ligation reagent (mixed solution) Ligation was carried out by adding Toyobo Lagation High) and incubating.
  • the ligated DNA was transformed into Escherichia coli DH5 ⁇ competent cells (Toyobo Competent High DH5 ⁇ ) according to the protocol attached to the product, and the transformants were obtained.
  • the transformant was cultured in LB medium, and the plasmid was extracted. In this way, pYESMhGDH designed to enable mass expression in Saccharomyces cerevisiae was obtained.
  • the FGDH of the present invention is excellent in substrate specificity, and enables the glucose amount to be measured more accurately. Therefore, it can be said that the FGDH of the present invention is suitable for blood glucose level measurement and the like.

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Abstract

新規なグルコース脱水素酵素及びその製造法、並びにその用途を提供することを課題とする。 【解決手段】下記の特性（１）～（４）を備えるフラビン結合型グルコース脱水素酵素。 （１）分子量：　ＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動で測定した酵素のポリペプチド部 分の分子量が約８１ｋＤａ （２）Ｋｍ値：　Ｄ－グルコースに対するＫｍ値が約２０ｍＭ以下 （３）温度安定性：５０℃以下で安定 （４）ｐＨ安定性：　ｐＨ３．０～１０の範囲で安定

Description

新規なグルコース脱水素酵素
　本発明はグルコース脱水素酵素に関する。詳しくは、本発明はフラビン結合型グルコース脱水素酵素、それをコードするＤＮＡ、及び当該酵素の生産菌、当該酵素の製造方法、当該酵素を使用したグルコース測定方法等に関する。
　血糖自己測定（ＳＭＢＧ：Ｓｅｌｆ－Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ　ｏｆ　Ｂｌｏｏｄ　Ｇｌｕｃｏｓｅ）は糖尿病患者が自己の血糖値を管理し、治療に活用するために重要である。近年、ＳＭＢＧのために、電気化学的バイオセンサを用いた簡易型の自己血糖測定器が広く用いられている。バイオセンサは、絶縁性の基板上に電極、酵素反応層を形成したものである。
　ここで用いられる酵素としては、グルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）等が挙げられる。ＧＯ（ＥＣ　１．１．３．４）を用いた方法は、測定サンプル中の溶存酸素の影響を受けやすく、溶存酸素が測定結果に影響を及ぼすといった問題点が指摘されている。一方でＧＤＨでもピロロキノリンキノン依存型グルコース脱水素酵素（ＰＱＱ－ＧＤＨ）（ＥＣ１．１．５．２（旧ＥＣ１．１．９９．１７））は、溶存酸素の影響を受けないが、マルトースやラクトースといったグルコース以外の糖類にも作用するため正確な血糖値の測定には適していない。
　フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコース脱水素酵素（以下、「ＦＡＤＧＤＨ」とも表す。）は、溶存酸素の影響を受けず、マルトースにもほとんど作用しない。特許文献１～６や非特許文献１～６には、アスペルギルス・テレウスやアスペルギルス・オリゼ由来のもの、あるいは、それらを改変したもの等が知られている。しかし、これらの酵素は、キシロースに対する反応性が比較的高いため（特許文献１）、キシロース負荷試験を受けている者の血糖を測定する場合には改善の余地がある。近年、一方、キシロースに対する作用性が比較的低いフラビン結合型ＧＤＨ（特許文献６）や、ＧＯとＧＤＨの長所を併せ持つ改変型ＧＤＨ（特許文献７）等が開発されているが依然として改善の余地がある。
ＷＯ２００４／０５８９５８ ＷＯ２００６／１０１２３９ 特開２００７－２８９１４８ 特開２００８－２３７２１０ ＷＯ２００８／０５９７７７ ＷＯ２０１０／１４０４３１ ＷＯ２０１１／０６８０５０
Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ．１９６７　Ｊｕｌ　１１；１３９（２）：２６５－７６ Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ．１９６７　Ｊｕｌ　１１；１３９（２）：２７７－９３ Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ．１４６（２）：３１７－２７ Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ．１４６（２）：３２８－３５ Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　（１９６７）２４２：３６６５－３６７２ Ａｐｐｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　（１９９６）５６：３０１－３１０
　上記のような現状の下、本発明者等は、ＳＭＢＧにおける使用により適した、新規なグルコース脱水素酵素を開発すべく日夜検討を重ね、優れた基質特異性に加えて、Ｄ－グルコースに対する高い親和性を有し、安定性に優れた酵素を利用することで、測定時間を短縮し、且つ、少量の酵素量で正確な血糖値の測定が可能になるという課題を見出した。よって、本発明は、基質特性、基質への親和性、及び熱安定性等に優れた新たなグルコース脱水素酵素を提供することを目的とする。
　上記課題を解決するために、本発明者らは、日夜検討を重ね、これまでにグルコース脱水素酵素を生産することが報告されていない多くの微生物についてスクリーニングした結果、新たな微生物がグルコース脱水素酵素活性を有することを見出した。そして、本発明者等は、当該酵素を単離精製し、その特性を調べた結果、フラビン結合型のグルコース脱水素であり、優れた基質特異性、高いＤ－グルコースに対する親和性及び優れた安定性を備えていることを見出した。更に、本発明者等は、単離した酵素のアミノ酸配列及び遺伝子配列を決定し、それらの配列がこれまでに報告されているＦＡＤＧＤＨのものとは異なる新規な酵素であることを突き止めた。
　本発明は、係る知見に基づき、更なる研究と改良を重ねた結果完成したものであり、代表的な本発明は、以下の通りである。
項１
下記の（ａ）～（ｃ）のいずれかのポリペプチドからなるフラビン結合型グルコース脱水素酵素；
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位したアミノ酸配列からなり、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド。
項２
以下の（Ａ）～（Ｅ）のいずれかのＤＮＡ：
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列をからなるＤＮＡ、
（Ｃ）配列番号２に示される塩基配列との相同性が８０％以上である塩基配列からなり、且つ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、且つ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ｅ）配列番号２に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位されている塩基配列であり、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ｆ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位したアミノ酸配列からなり、且つ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
項３
項２に記載のＤＮＡを組み込んだベクター。
項４
項３に記載のベクターを含む形質転換体。
項５
項４に記載の形質転換体を培養することを含む、項１に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。
項６
項１に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素をグルコースに作用させることを含む、グルコース濃度の測定方法。
項８
項１に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキット。
項９
項１に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコースセンサ。
項Ａ．
下記の特性（１）～（４）を備えるフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
（１）分子量：　ＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動で測定した酵素のポリペプチド部分の分子量が約８１ｋＤａ
（２）Ｋｍ値：　Ｄ－グルコースに対するＫｍ値が約２０ｍＭ以下
（３）温度安定性：　５０℃以下で安定
（４）ｐＨ安定性：　ｐＨ３．０～１０の範囲で安定
項Ｂ．
更に下記の特性（５）を備える、項Ａに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
（５）基質特異性：　Ｄ－グルコースに対する反応性を１００％としたときのＤ－キシロースに対する反応性が１．２％以下である
項Ｃ．
更に下記の特性（６）を備える、項Ａ又はＢに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
（６）至適活性温度：　３７℃～５５℃
項Ｄ．
更に下記の特性（７）を備える、項Ａ～Ｃのいずれかに記載のフラビン結合多型グルコース脱水素酵素。
（７）至適活性ｐＨ：　７．４
項Ｅ．
更に下記の特性（８）を備える、項Ａ～Ｄのいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
（８）由来：　ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属に分類される微生物に由来する
項Ｆ．
ムコール属に分類される微生物を培養すること、及び
グルコース脱水素酵素を回収すること
を含む、項Ａ～Ｅのいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。
項Ｇ．
項Ａ～Ｅのいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素をグルコースに作用させることを含む、グルコース濃度の測定方法。
項Ｈ．
項Ａ～Ｅのいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキット。
項Ｉ．
項Ａ～Ｅのいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコースセンサ。
　本発明のフラビン結合型グルコース脱水素酵素（以下、「ＦＧＤＨ」と称する場合もある。）は、グルコース脱水素酵素活性を有し、Ｄ－グルコースとの親和性が高い（即ち、Ｄ－グルコースに対するＫｍ値が有意に低い）ため、より少ない酵素量で試料中のＤ－グルコース濃度をより短時間で測定することを可能にする。また、本発明のＦＧＤＨは、Ｄ－キシロースに対する反応性が有意に低いため、試料中にＤ－グルコースとＤ－キシロースが共存する場合であってもグルコース量又は濃度を正確に測定することを可能にする。更に、本発明のＦＧＤＨは、熱安定性に優れるため、センサストリップへの固定化を比較的高い温度条件下で実施することができる。加えて、本発明のＦＧＤＨは、広い範囲のｐＨ領域に対して安定であるため、幅広い条件下での使用に適している。これらの特性を備えるため、本発明のＦＧＤＨは、Ｄ－グルコースを含むあらゆる試料（例えば、血液や食品（調味料や飲料等））におけるグルコース濃度を正確に測定することを可能にする。更に本発明のＤＮＡは、本発明のFGDHをコードするため、遺伝子工学的手法を用いて、効率的に本発明のＦＧＤＨを製造することを可能にする。
ＮＢＲＣ６７５４由来ＦＧＤＨについての吸収スペクトル測定結果を示す。 ＮＢＲＣ６７５４由来ＦＧＤＨの活性に対するｐＨの影響を示す。 ＮＢＲＣ６７５４由来ＦＧＤＨの活性に対する温度の影響を示す。 ＮＢＲＣ６７５４由来ＦＧＤＨのｐＨ安定性を測定した結果を示す。 ＮＢＲＣ６７５４由来ＦＧＤＨの温度安定性を測定した結果を示す。 ＮＢＲＣ６７５４由来ＦＧＤＨの反応速度と基質濃度との関係を示す。
以下、本発明を詳細に説明する。
１．フラビン結合型グルコース脱水素酵素
１－１．グルコース脱水素酵素活性
　フラビン結合型グルコース脱水素酵素とは、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ－δ－ラクトンを生成する反応を触媒する理化学的性質を有する酵素である。本書においては、この理化学的性質をグルコースデヒドロゲナーゼ活性といい、特に断りが無い限り、「酵素活性」又は「活性」とは、当該酵素活性を意味する。前記電子受容体は、ＦＧＤＨが触媒する反応において、電子の授受を担うことが可能である限り特に制限されないが、例えば、２，６－ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、１－メトキシ－５－メチルフェナジウムメチルサルフェート、及びフェリシアン化合物等を使用することができる。
　グルコースデヒドロゲナーゼ活性は、公知の方法で測定することができる。例えば、ＤＣＰＩＰを電子受容体として用い、反応前後における６００ｎｍの波長における試料の吸光度の変化を指標に活性を測定することができる。より具体的には、下記の試薬及び測定条件を用いて活性を測定することができる。
　グルコースデヒドロゲナーゼ活性の測定方法
＜試薬＞
５０ｍＭ　ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ６．５（０．１％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含む）
２４ｍＭ　ＰＭＳ溶液
２．０ｍＭ　２，６－ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
１Ｍ　Ｄ－グルコース溶液
上記ＰＩＰＥＳ緩衝液２０．５ｍＬ、ＤＣＰＩＰ溶液１．０ｍＬ、ＰＭＳ溶液２．０ｍＬ、Ｄ―グルコース溶液５．９ｍＬを混合して反応試薬とする。
＜測定条件＞
　反応試薬３ｍＬを３７℃で５分間予備加温する。ＦＧＤＨ溶液０．１ｍＬを添加しゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、６００ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から（即ち、反応速度が一定になってから）１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＦＧＤＨ溶液の代わりにＦＧＤＨを溶解する溶媒を反応試薬に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から次の式に従ってＦＧＤＨ活性を求める。ここでＦＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度２００ｍＭのＤ－グルコース存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量である。
 活性（Ｕ／ｍＬ）＝
｛－（ΔＯＤＴＥＳＴ－ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×３．１×希釈倍率｝／｛１６．３×０．１×１．０｝
 なお、式中の３．１は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍＬ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。本書においては、別段の表示しない限り、酵素活性は上記の測定方法に従って、測定される。
　本発明のＦＧＤＨは、フラビンを補欠分子族として要求するフラビン結合型のＧＤＨである。
　本発明のＦＧＤＨは、単離されたＦＧＤＨ又は精製されたＦＧＤＨであることが好ましい。また、本発明のＦＧＤＨは、上記保存に適した溶液中に溶解した状態又は凍結乾燥された状態（例えば、粉末状）で存在してもよい。本発明の酵素（ＦＧＤＨ）に関して使用する場合の「単離された」とは、当該酵素以外の成分（例えば、宿主細胞に由来する夾雑タンパク質、他の成分、培養液等）を実質的に含まない）状態をいう。具体的には例えば、本発明の単離された酵素は、夾雑タンパク質の含有量が重量換算で全体の約２０％未満、好ましくは約１０％未満、更に好ましくは約５％未満、より一層好ましくは約１％未満である。一方で、本発明のＦＧＤＨは、保存又は酵素活性の測定に適した溶液（例えば、バッファー）中に存在してもよい。
１－２．ポリペプチド
　本発明のＦＧＤＨは、下記（ａ）～（ｃ）のいずれかのポリペプチドで構成されることが好ましい。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位したアミノ酸配列からなり、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド。
　配列番号１で示されるアミノ酸配列とは、実施例５に示される通り、Ｍｕｃｏｒ　ｈｉｅｍａｌｉｓ　f.　ｓｉｌｖａｔｉｃｕｓ　ＮＢＲＣ６７５４に由来するＦＧＤＨのアミノ酸配列であり、下記１－３～１－１０の特性を全て満たす。
　上記（ｂ）のポリペプチドは、グルコース脱水素酵素活性を保持する限度で、配列番号１に示されるアミノ酸において、１若しくは数個のアミノ酸配残基が置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位（以下、これらを纏めて「変異」とする場合がある。）されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。ここで「数個」とは、グルコース脱水素酵素活性及び好ましくは後述する１－３～１－１０（特に１－３、１－４、１－７、及び１－８）の特性が維持される限り制限されないが、例えば、全アミノ酸の約２０％未満に相当する数であり、好ましくは約１５％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約１０％未満に相当する数であり、より一層好ましくは約５％未満に相当する数であり、最も好ましくは約１％未満に相当する数である。より具体的には、変異されるアミノ酸残基の個数は、例えば、２～１２７個、好ましくは２～９６個、より好ましくは２～６４個、更に好ましくは２～３２個であり、より更に好ましくは２～２０個、一層好ましくは２～１５個、より一層好ましくは２～１０個、特に好ましくは２～５個である。
　当該変異がアミノ酸の置換である場合、置換の種類は、特に制限されないが、ＦＧＤＨの表現型に顕著な影響を与えないという観点から「保存的アミノ酸置換」が好ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、いくつかのファミリーに分類されている。よって、同一のファミリー内のアミノ酸残基間で置換されることが好ましい。本書において「保存的アミノ酸置換」とは、上記に例示した同一のファミリー内でアミノ酸を置換することを意味する。
　一又は数個の変異は、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやＤＮＡリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ｔｈｉｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｈａｐｔｅｒ　１３　，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）やランダム突然変異導入法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ｔｈｉｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｈａｐｔｅｒ　１３　，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）等の公知の手法を利用して後述する本発明のＦＧＤＨをコードするＤＮＡに変異を導入することによって実施することが可能である。また、紫外線照射等の他の方法によってもバリアントＦＧＤＨを得ることができる。バリアントＦＧＤＨには、ＦＧＤＨを保持する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合の天然に生じるバリアント（例えば、一塩基多型）も含まれる。
　また、ＦＧＤＨの活性を維持するという観点からは、ＦＧＤＨの活性部位又は基質結合部位に影響を与えない部位において上記変異が存在することが好ましい。
　上記（ｃ）のポリペプチドは、グルコース脱水素酵素活性を保持することを限度で、好ましくは下記１－３～１－１０の特性を保持する限度で、配列番号１に示されるアミノ酸配列と比較した同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。好ましくは、本発明のＦＧＤＨが有するアミノ酸配列と配列番号１に示されるアミノ酸配列との同一性は、８５％以上であり、より好ましくは８８％以上、更に好ましくは９０％以上、より更に好ましくは９３％以上、一層好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。このような一定以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは、上述するような公知の遺伝子工学的手法に基づいて作成することができる。
　アミノ酸配列の同一性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、例えば、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ。（Ｂａｓｉｃ　ｌｏｃａｌ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｓｅａｒｃｈ　ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、算出することができる。
１－３．基質特異性
　本発明のＦＧＤＨは、基質特異性に優れている。特に、本発明のＦＧＤＨは、Ｄ－グルコースに対する反応性を基準とした場合に、少なくともＤ－キシロースに対する反応性が有意に低い。より具体的に、本発明のＦＧＤＨは、同一濃度のＤ－グルコースに対する反応性を１００％とした場合に、Ｄ－キシロースに対する反応性が１．２％以下であることが好ましい。
　本発明のＦＧＤＨは、Ｄ－キシロースに対する反応性が低いことに加えて、Ｄ－ガラクトース及びマルトースに対する反応性も低いことが好ましい。本発明のＦＧＤＨのＤ－ガラクトースに対する反応性は、同一濃度のＤ－グルコースに対する反応性を１００％として、通常５％以下であり、好ましくは３％以下であり、より好ましくは２％以下、更に好ましくは１．５％以下、特に好ましくは１．２％以下である。
　本発明のＦＧＤＨのマルトースに対する反応性は、同一濃度のＤ－グルコースに対する反応性を１００％として、通常５％以下であり、好ましくは３％以下であり、より好ましくは２％以下であり、更に好ましくは１．７％以下である。
　上記本発明のＦＧＤＨのＤ－グルコースに対する反応性を基準としたＤ－キシロース、Ｄ－ガラクトース及びマルトースに対する反応性の下限値は、特に制限されないが、０％又は０％に限りなく近い値を下限値とすることができる。
　ＦＧＤＨの各糖類に対する反応性は、上記１－１．に示すグルコースデヒドロゲナーゼ活性の測定方法において、Ｄ－グルコースを他の糖（例えば、Ｄ－キシロース、Ｄ－ガラクトース、又はマルトース）に置き換えて、Ｄ－グルコースの場合の活性を比較することにより求めることができる。但し、比較する場合の各糖類の濃度は５０ｍMを基準とする。
　以上のような優れた基質特異性を有する本発明のＦＧＤＨは、試料中のグルコース量を正確に測定するための酵素として好ましい。即ち、本発明のＦＧＤＨによれば試料中にマルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロース等の夾雑物が存在する場合であっても目的のＤ－グルコースの量を正確に測定することが可能である。従って、本発明のＦＧＤＨは、試料中にこのような夾雑物の存在が予想又は懸念される用途（典型的には血液中のグルコース量の測定）に適しており、当該用途も含め様々な用途に適用可能であり、汎用性が高い。
１－４．Ｄ－グルコースに対する親和性
　本発明のＦＧＤＨは、本来の基質であるＤ－グルコースに対する親和性が高いことが好ましい。親和性が高いことにより、試料中のＤ－グルコースの濃度が低い場合であっても、上述する触媒反応を進めることができ、より正確なＤ－グルコース濃度の測定、より短時間での測定、及びより少ない酵素量での測定に資するからである。ＦＧＤＨのＤ－グルコースに対する親和性は、Ｋｍ値によって示される。Ｋｍ値は、いわゆるミカエリス・メンテン式から求められる値であり、具体的には、上記１－１．に示す活性測定方法においてＤ－グルコースの濃度を変化させて各濃度における活性を測定し、ラインウィーバー・バーク・プロットを作成することによって求めることができる。
　酵素の反応速度論から判断して、Ｋｍ値が低いほど、酵素は基質に対する親和性が高く、基質濃度が低い場合でも基質との複合体を形成することができ、より早い速度で触媒反応を進めることができる。本発明のＦＧＤＨのＤ－グルコースに対するＫｍ値は、２０ｍＭ以下であることが好ましく、より好ましくは１９ｍＭ以下、更に好ましくは１８ｍＭ以下、より更に好ましくは１７ｍＭ以下であり、特に好ましくは１６．３ｍＭ以下である。
１－５．至適活性ｐＨ
　本発明のＦＧＤＨは、実施例に示す通り、ｐＨ７．５（Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ緩衝液）において最も高い活性を示すことが好ましい。また、ｐＨ７．０～８．０（ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液）、ｐＨ６．５～７．５（リン酸カリウム緩衝液）、及びｐＨｐＨ６．５（ＭＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液）において、本発明のＦＧＤＨは、ｐＨ７．５（Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ緩衝液）における活性を１００％として、８０％以上の相対活性を示すことが好ましい。即ち、本発明のＦＧＤＨの至適活性ｐＨは６．５～８であり、好ましくはｐＨ７．５である。
１－６．至適活性温度
　本発明のＦＧＤＨの至適活性温度は、３７℃～５５℃であることが好ましい。ここで「３７℃～５５℃」とは、典型的に至適活性温度が３７℃～５５℃付近であり、更にある程度の許容可能な幅を有することを意味する。本明細書において、至適活性温度は、後述する実施例に示す通り、酵素濃度０．１Ｕ／ｍＬでＰＩＰＥＳ－ＮａＯＨバッファー（ｐＨ６．５）中における酵素活性を測定することにより求められる。
１－７．ｐＨ安定性
　本明細書において、特定のｐＨ条件の下、２Ｕ／ｍＬの酵素を２５℃で１６時間処理した後の残存酵素活性が、処理前の酵素活性と比較して９５％以上である場合に、当該酵素は、当該ｐＨ条件において安定であると判断する。本発明のＦＧＤＨは、少なくともｐＨ３．０～１０の範囲全体で安定であることが好ましい。
１－８．温度安定性
　本明細書において、特定の温度条件の下、適当な緩衝液中（例えば、酢酸カリウムバッファー（ｐＨ５．０））で２Ｕ／ｍＬの酵素を１５分間処理した後の残存酵素活性が、処理前の酵素活性と比較して実質的な低下が認められない（即ち、約９０％以上を維持する）とき、当該酵素は当該温度条件において安定であると判断する。本発明のＦＧＤＨは、少なくとも０℃～５０℃の温度範囲において安定であることが好ましい。
　本発明のＦＧＤＨは、上記１－３～１－８で示される特徴のうち少なくとも１つ以上を備えていることが好ましく、より好ましくはその２つ以上を備え、更に好ましくはその３つの特性を更に備え、より更に好ましくはその４つ以上を備え、一層好ましくはその５つ以上を備え、より一層好ましくはその６つ以上を備え、特に好ましくはその全てを備える。本発明のＦＧＤＨは、上記１－３～１－８の特性を如何なる組合せで備えていても良いが、上記１－３、１－４、１－７及び１－８の特性を備えていることが好ましい。
１－９．分子量
　本発明のＦＧＤＨを構成するポリペプチド部分の分子量は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで測定した場合に約８１ｋＤａであることが好ましい。「約８１ｋＤａ」とは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分子量を測定した際に、当業者が、通常８１ｋＤａの位置にバンドがあると判断する範囲を含むことを意味する。「ポリペプチド部分」とは、実質的に糖鎖が結合していない状態のＦＧＤＨを意味する。微生物によって生産された本発明のＦＧＤＨが糖鎖結合型である場合は、それを熱処理や糖加水分解酵素によって処理することにより、糖鎖を除去した状態（即ち、「ポリペプチド部分」）にすることができる。実質的に糖鎖が結合していない状態とは、熱処理や糖加水分解酵素によって処理された糖鎖結合型ＦＧＤＨに不可避的に残存する糖鎖の存在を許容する。よって、ＦＧＤＨが本来的に糖鎖結合型でない場合は、それ自体が「ポリペプチド部分」に相当する。
　糖鎖結合型ＦＧＤＨから糖鎖を除去する手段は、特に制限されないが、例えば、後述する実施例に示すように、糖鎖結合型のＦＧＤＨを１００℃で１０分間加熱処理をして変性させた後、Ｎ－グリコシダーゼＦ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を用いて３７℃で６時間処理することにより実施することができる。
　本発明のＦＧＤＨが糖鎖に結合している場合、その分子量は、グルコース脱水素酵素活性、基質特異性、及びＤ－グルコースに対する親和性等にネガティブに影響しない限り特に制限されない。例えば、糖鎖が結合した状態の本発明ＦＧＤＨの分子量は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでの測定において、８５，０００～１０７，０００Ｄａであることが好ましい。糖鎖結合型のＦＧＤＨは、酵素をより安定にするという観点及び水溶性を高め、水に溶け易くするという観点から好ましい。
　ＳＤＳ－ＰＡＧＥでの分子量の測定は、一般的な手法及び装置を用い、市販される分子量マーカーを用いて行うことができる。
１－１０．由来
　本発明のＦＧＤＨは、上述する特性を備える限り、その由来は特に制限されない。本発明のＦＧＤＨは、例えば、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属に帰属する微生物であるに由来し得る。ムコール属に属する微生物としては、特に制限されないが、例えば、Ｍｕｃｏｒ　ｈｉｅｍａｌｉｓ　ｆ．　ｓｉｌｖａｔｉｃｕｓを例示することができる。より具体的には、Ｍｕｃｏｒ　ｈｉｅｍａｌｉｓ　ｆ．　ｓｉｌｖａｔｉｃｕｓ　ＮＢＲＣ６７５４を例示することができる。Ｍｕｃｏｒ　ｈｉｅｍａｌｉｓ　ｆ．　ｓｉｌｖａｔｉｃｕｓ　ＮＢＲＣ６７５４は、ＮＢＲＣ（ＮＩＴＥ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｃｅｎｔｅｒ）（独立行政法人製品評価技術基盤機構　バイオテクノロジー本部　生物遺伝資源部門）に保管された菌株であり、所定の手続を経ることによってその分譲を受けることができる。
　本発明のＦＧＤＨが由来する他の生物としては、例えば、土壌や河川・湖沼等の水系又は海洋に存在する微生物や各種動植物の表面又は内部に常在する微生物等を挙げることができる。低温環境、火山等の高温環境、深海等の無酸素・高圧・無光環境、油田等特殊な環境に生育する微生物を単離源としてもよい。
　本発明のＦＧＤＨには、微生物から直接単離されるＦＧＤＨだけでなく、単離されたＦＧＤＨを蛋白質工学的な方法によりアミノ酸配列等を改変したものや、遺伝子工学的手法により改変したものも含まれる。例えば、ケカビ科に分類される微生物、より具体的にはムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、Ａｂｓｉｄｉａ属、及びＡｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ属に分類される微生物等から取得した酵素に改変を加えることによって上述する上述する特性を備えるように改変したものであってもよい。更に具体的には、Ｍｕｃｏｒ　ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｍｕｃｏｒ　ｐｒａｉｎｉｉ、Ｍｕｃｏｒ　ｊａｖａｎｉｃｕｓ、Ｍｕｃｏｒ　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ及び、Ｍｕｃｏｒ　ｈｉｅｍａｌｉｓ　ｆ．　ｓｉｌｖａｔｉｃｕｓに帰属する微生物に由来するものを改変したものをであっても良い。
２．フラビン結合型グルコース脱水素酵素をコードするＤＮＡ
　本発明のＤＮＡは、上記１のＦＧＤＨをコードするＤＮＡであり、具体的には以下の（Ａ）～（Ｆ）のいずれかである。
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列をからなるＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号２に示される塩基配列との相同性が８０％以上である塩基配列をからなり、且つ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを含み、且つグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｅ）配列番号２に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位されている塩基配列であり、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｆ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位したアミノ酸配列からなり、且つ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
　本書において「タンパク質をコードするＤＮＡ」とは、それを発現させた場合に当該タンパク質が得られるＤＮＡ、即ち、当該タンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するＤＮＡのことをいう。従って、コドンの縮重によって相違するＤＮＡも含まれる。
　本発明のＤＮＡは、それがコードするアミノ酸配列を有するタンパク質が、グルコース脱水素酵素活性及び好ましくは上記１－２～１－１０の特性の少なくとも１つ（特に、上記１－３、１－３、１－７及び１－８の特性）を備える限り、配列番号２に示される塩基配列との相同性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは８８％以上、更に好ましくは９０％以上、より更に好ましくは９３％以上、一層好ましくは９５%以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である塩基配列を有する。
　塩基配列の相同性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ、ＳＳＥＡＲＣＨ等のソフトウェアを用いて計算される。具体的には、ＢＬＡＳＴ検索に一般的に用いられる主な初期条件は、以下の通りである。即ち、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＢＬＡＳＴ　２．１において、プログラムにｂｌａｓｔｎを用い、各種パラメータはデフォルト値に設定して検索を行うことにより、ヌクレオチド配列の相同性の値（%）を算出することができる。
　本発明のＤＮＡは、それがコードするタンパク質がグルコース脱水素活性を有し、好ましくは上記１－２～１－１０の特性の少なくとも１つを備える限り、配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであっても良い。ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｔｈｉｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）やＣｕｒｒｅｎｔ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ　Ｍ．　Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，　１９８７）を参照して設定することができる。
　具体的なストリンジェントな条件としては、例えば、ハイブリダイゼーション液（５０％ホルムアミド、１０×ＳＳＣ（０．１５Ｍ　ＮａＣｌ，　１５ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔｅ，　ｐＨ　７．０）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１％　ＳＤＳ、１０％　デキストラン硫酸、１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５））を用いて約４２℃～約５０℃でインキュベーションし、その後０．１×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳを用いて約６５℃～約７０℃で洗浄する条件を挙げることができる。更に好ましいストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液として５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．１５Ｍ　ＮａＣｌ，　１５ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔｅ，　ｐＨ　７．０）、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫酸、１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５））を用いる条件を挙げることができる。
　このような条件でハイブリダイズするＤＮＡの中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれ得るが、それらについては、市販の活性発現ベクターに組み込み、適当な宿主で発現させて、酵素活性を公知の手法で測定することによって容易に取り除くことができる。
　上記（Ｅ）及び（Ｆ）のＤＮＡに関し、「数個」とは上記１－２に説明したものと同義である。即ち、「数個」とは、グルコース脱水素酵素活性及び好ましくは後述する１－３～１－１０（特に１－３、１－４、１－７、及び１－８）の特性が維持される限りにおいて、例えば、全ＤＮＡの約２０％未満に相当する数であり、好ましくは約１５％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約１０％未満に相当する数であり、より一層好ましくは約５％未満に相当する数であり、最も好ましくは約１％未満に相当する数である。より具体的には、変異される塩基の個数は、例えば、２～３８２個、好ましくは２～２８６個、より好ましくは２～２９０個、更に好ましくは２～９５個であり、より更に好ましくは２～１９個、一層好ましくは２～１５個、より一層好ましくは２～１０個、特に好ましくは２～５個である。
　好適な一実施形態において、本発明のＦＧＤＨをコードするＤＮＡは、単離された状態で存在するＤＮＡである。ここで「単離されたＤＮＡ」とは、天然状態において共存するその他の核酸やタンパク質等の成分から分離された状態であることをいう。但し、天然状態において隣接する核酸配列（例えばプロモーター領域の配列やターミネーター配列等）等一部の他の核酸成分を含んでいてもよい。例えば、染色体ＤＮＡの場合の「単離された」状態とは、好ましくは、天然状態において共存する他のＤＮＡ成分を実質的に含まない。一方、ｃＤＮＡ分子等の遺伝子工学的手法によって調製されるＤＮＡの場合の「単離された」状態では、好ましくは、細胞成分や培養液等を実質的に含まない。同様に、化学合成によって調製されるＤＮＡの場合の「単離された」状態では、好ましくは、ｄＮＴＰ等の前駆体（原材料）や合成過程で使用される化学物質等を実質的に含まない。尚、それと異なる意味を表すことが明らかでない限り、本明細書において単に「ＤＮＡ」と記載した場合には単離された状態のＤＮＡを意味する。本発明のＤＮＡには、上記（Ａ）～（Ｆ）のＤＮＡと相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）も含まれる。
　本発明のＤＮＡは、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報（特に、配列番号２）を基に、化学的ＤＮＡ合成法により製造、取得することができるが、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法等を用いることによって容易に調製することができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｄ　Ｅｄ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９）；続生化学実験講座「遺伝子研究法Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ」、日本生化学会編（１９８６）等参照）。化学的ＤＮＡ合成法としては、フォスフォアミダイト法による固相合成法を例示することができる。この合成法には自動合成機を利用することができる。
　標準的な遺伝子工学的手法としては、具体的には、本発明のＦＧＤＨが発現される適当な起源微生物より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーから、本発明のＤＮＡ配列（例えば、配列番号２の塩基配列）に特有の適当なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択することにより実施できる〔Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ．，　７８，　６６１３　（１９８１）；Ｓｃｉｅｎｃｅ１２２，　７７８　（１９８３）等〕。
　ｃＤＮＡライブラリーを調製するための起源微生物は、本発明ＦＧＤＨを発現する微生物であれば特に制限れないが、好ましくは、ムコール属に分類される微生物である。起源微生物として好適なムコール属種は、Ｍｕｃｏｒ　ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｍｕｃｏｒ　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ、Ｍｕｃｏｒ　ｈｉｅｍａｌｉｓ等である。より具体的な起源微生物菌株としては、Ｍｕｃｏｒ　ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ　ＮＢＲＣ９４０３、Ｍｕｃｏｒ　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ　ＮＢＲＣ４５５４、Ｍｕｃｏｒ　ｈｉｅｍａｌｉｓ　ＮＢＲＣ６７５４等が挙げられる。これらの中でもＭｕｃｏｒ　ｈｉｅｍａｌｉｓ　f.　ｓｉｌｖａｔｉｃｕｓ　ＮＢＲＣ６７５４が好ましい。
　上記の微生物からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニング等は、いずれも常法に従って実施することができる。本発明のＤＮＡをｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法も、特に制限されず、通常の方法に従うことができる。例えば、ｃＤＮＡによって産生されるポリペプチドに対して、該ポリペプチド特異抗体を使用した免疫的スクリーニングにより対応するｃＤＮＡクローンを選択する方法、目的のヌクレオチド配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等やこれらの組合せ等を適宜選択して実施することができる。
　ＤＮＡの取得に際しては、ＰＣＲ法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ１３０，１３５０（１９８５）〕又はその変法によるＤＮＡ若しくはＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。殊に、ライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ法〔Ｒａｐｉｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　ｅｎｄｓ；実験医学、１２（６），３５（１９９４）〕、特に５’－ＲＡＣＥ法〔Ｍ．Ａ．Ｆｒｏｈｍａｎ，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，８，８９９８（１９８８）〕等の採用が好適である。
　ＰＣＲ法の採用に際して使用されるプライマーも配列番号２の塩基配列に基づいて適宜設計して合成することができる。尚、増幅させたＤＮＡ若しくはＲＮＡ断片の単離精製は、前記の通り常法に従うことができ、例えば、ゲル電気泳動法、ハイブリダイゼーション法等を用いて行うことができる。
　本発明のＤＮＡを使用することにより、本発明のＦＧＤＨを容易に大量に、安定して製造することができる。
３．ベクター
　本発明のベクターは、上記２．で説明する本発明のＦＧＤＨをコードするＤＮＡが組み込まれたベクターである。ここで「ベクター」とは、それに挿入された核酸分子を細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子（キャリアー）であり、適当な宿主細胞内で本発明のＤＮＡを複製可能であり、且つ、その発現が可能である限り、その種類や構造は特に限定されない。即ち、本発明のベクターは発現ベクターである。ベクターの種類は、宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。ベクターの具体例としては、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等）等を挙げることができる。また、糸状菌を宿主とする場合に適したベクターや、セルフクローニングに適したベクターを使用することも可能である。
　大腸菌を宿主とする場合は、例えば、Ｍ１３ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、ｐＢＲ３２２又はその改変体（ｐＢ３２５、ｐＡＴ１５３、ｐＵＣ８等）等）を使用することができる。酵母を宿主とする場合は、ｐＹｅｐＳｅｃ１、ｐＭＦａ、ｐＹＥＳ２等を使用することができる。昆虫細胞を宿主とする場合は、例えば、ｐＡｃ、ｐＶＬ等が使用でき、哺乳類細胞を宿主とする場合は、例えば、ｐＣＤＭ８、ｐＭＴ２ＰＣ等を使用することができるが、これらに限定される訳ではない。
　発現ベクターは通常、挿入された核酸の発現に必要なプロモーター配列や発現を促進させるエンハンサー配列等を含む。選択マーカーを含む発現ベクターを使用することもできる。かかる発現ベクターを用いた場合には選択マーカーを利用して発現ベクターの導入の有無（及びその程度）を確認することができる。本発明のＤＮＡのベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入（必要な場合）、プロモーターの挿入（必要な場合）等は標準的な組換えＤＮＡ技術（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔｈｉｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，１．８４，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋを参照することができる、制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いた周知の方法）を用いて行うことができる。
４．形質転換体
　本発明は、宿主細胞に本発明のＤＮＡが導入された形質転換体に関する。本発明のＤＮＡの宿主への導入手段は特に制限されないが、例えば、上記３．で説明するベクターに組み込まれた状態で宿主に導入される。宿主細胞は、本発明のＤＮＡを発現してＦＧＤＨを生産することが可能である限り、特に制限されない。具体的には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、カビ、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。宿主が大腸菌の場合、エシェリヒア・コリＣ６００、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＤＨ５α等が用いられ、ベクターとしてはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等が例として挙げられる。宿主が酵母の場合は、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、キャンデイダ・ウチリス、ピキア・パストリス等が例として挙げられ、ベクターとしてはｐＡＵＲ１０１、ｐＡＵＲ２２４、ｐＹＥ３２等が挙げられる。宿主が糸状菌細胞である場合は、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ、Ｍｕｃｏｒ　ｈｉｅｍａｌｉｓ等を例示することができる。また、本発明のＦＧＤＨが単離されたムコール属に帰属する微生物を宿主とすることも好ましい。即ち、形質転換体では、通常、外来性のＤＮＡが宿主細胞中に存在するが、ＤＮＡが由来する微生物を宿主とするいわゆるセルフクローニングによって得られる形質転換体も好適な実施形態である。
　本発明の形質転換体は、好ましくは、上記３．に示される発現ベクターを用いたトランスフェクション乃至はトランスフォーメーションによって調製される。形質転換は、一過性であっても安定的な形質転換であってもよい。トランスフェクション、トランスフォーメーションはリン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポーレーション（Ｐｏｔｔｅｒ，Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１，７１６１－７１６５（１９８４））、リポフェクション（Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４，７４１３－７４１７（１９８４））、マイクロインジェクション（Ｇｒａｅｓｓｍａｎｎ，　Ｍ．　＆　Ｇｒａｅｓｓｍａｎｎ，Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．７３，３６６－３７０（１９７６））、Ｈａｎａｈａｎの方法（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６，５５７－５８０（１９８３））、酢酸リチウム法（Ｓｃｈｉｅｓｔｌ，Ｒ．Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６，３３９－３４６（１９８９））、プロトプラスト－ポリエチレングリコール法（Ｙｅｌｔｏｎ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１，１４７０－１４７４（１９８４））等を利用して実施することができる。
　本発明の形質転換体は、本発明のＦＧＤＨを産生する能力を有するため、それを用いて効率的に本発明のＦＧＤＨを製造することが可能となる。
５．フラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法
　本発明のＦＧＤＨは、本発明のＦＧＤＨの生産能を有する微生物を培養することで製造される。培養に供される微生物は、本発明のＦＧＤＨを産生する能力を有する限り特に制限されず、例えば、上記１．に示すムコール属に帰属する野生型の微生物及び上記４．に示す形質転換体を好適に利用することができる。
　具体的なムコール属に分類される微生物としては、Ｍｕｃｏｒ　ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｍｕｃｏｒ　ｐｒａｉｎｉｉ、Ｍｕｃｏｒ　ｊａｖａｎｉｃｕｓ、Ｍｕｃｏｒ　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ及び、Ｍｕｃｏｒ　ｈｉｅｍａｌｉｓ　ｆ．　ｓｉｌｖａｔｉｃｕｓが挙げられる。
　上記のムコール（Ｍｕｃｏｒ）属に分類される微生物は、例えば、ＮＢＲＣ（ＮＩＴＥ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｃｅｎｔｅｒ）（独立行政法人製品評価技術基盤機構　バイオテクノロジー本部　生物遺伝資源部門）に保管された菌株であり、所定の手続を経ることによってその分譲を受けることができる。
　培養方法及び培養条件は、本発明のＦＧＤＨが生産される限り特に限定されない。即ち、ＦＧＤＨが生産されることを条件として、使用する微生物の生育に適合した方法及び条件を適宜設定できる。以下に、培養条件として、培地、培養温度、及び培養時間を例示する。
　培地としては、使用する微生物が生育可能な培地であれば、特に制限されない。例えば、グルコース、シュクロース、ゲンチオビオース、可溶性デンプン、グリセリン、デキストリン、糖蜜、有機酸等の炭素源、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、ふすま、肉エキス等の窒素源、カリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩等の無機塩を添加したものを用いることができる。使用する微生物の生育を促進するためにビタミン、アミノ酸等を培地に添加してもよい。
　ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属に分類される微生物を培養して本発明のＦＧＤＨを得る場合は、その微生物の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよい。多くの場合は液体培養で行い、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。ただし、生産性を考えた場合に、固体培養で行った方が有利な場合もある。
　培地のｐＨは、培養する微生物の生育に適していればよく、例えば約３～８、好ましくは約５～７程度に調整し、培養温度は通常約１０～５０℃、好ましくは約２５～３５℃程度で、１～１５日間、好ましくは３～７日間程度好気的条件下で培養する。培養法としては例えば振盪培養法、ジャーファーメンターによる好気的深部培養法が利用できる。
　上記のような条件で培養した後、培養液又は菌体よりＦＧＤＨを回収することが好ましい。ＦＧＤＨを菌体外に分泌する微生物を用いる場合は、例えば培養上清をろ過、遠心処理等することによって不溶物を除去した後、限外ろ過膜による濃縮、硫安沈殿等の塩析、透析、各種クロマトグラフィー等を適宜組み合わせて分離、精製を行うことにより本酵素を得ることができる。ムコール属に属する微生物が産生するフラビン結合型グルコース脱水素酵素は基本的に分泌型のタンパク質である。
　他方、菌体内から回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音波処理、機械的手法、又はリゾチーム等の酵素を利用した手法等によって破砕した後、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤及び界面活性剤を添加してＧＤＨを可溶化し、水溶液として分離採取し、分離、精製を行うことにより本酵素を得ることができる。ろ過、遠心処理等によって予め培養液から菌体を回収した後、上記一連の工程（菌体の破砕、分離、精製）を行ってもよい。
　精製は、例えば、減圧濃縮、膜濃縮等の濃縮、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等の塩析処理、親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトン等による沈殿処理、加熱処理、等電点処理、吸着剤あるいはゲルろ過剤等によるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等を適宜組み合わせて実施することができる。
　カラムクロマトグラフィーを用いる場合は、例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ゲル（ＧＥヘルスケア　バイオサイエンス社製）等によるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ－６Ｂ（ＧＥヘルスケア　バイオサイエンス社製）、オクチルセファロースＣＬ－６Ｂ（ＧＥヘルスケア　バイオサイエンス社製）等を用いることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
　なお、培養液からのグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質の採取（抽出、精製等）にあたっては、グルコース脱水素酵素活性、マルトース作用性、熱安定性等のうちいずれか１つ以上を指標に行ってもよい。
　各精製工程では原則としてＦＧＤＨ活性を指標として分画を行い、次のステップへと進む。但し、予備試験等によって、適切な条件を予め設定可能な場合にはこの限りでない。
　本発明のＦＧＤＨを精製標品とする場合は、例えば、比活性が１００～２００（Ｕ／ｍｇ）、好ましくは比活性が１６０～１８０（Ｕ／ｍｇ）の状態に精製することが好ましい。ＦＧＤＨを発現させる宿主によっては、より高い比活性の状態に精製することもできる。また、最終的な形態は液体状であっても固体状（粉体状を含む）であってもよい。
　組換えタンパク質として本酵素を得ることにすれば種々の修飾が可能である。例えば、本酵素をコードするＤＮＡと他の適当なＤＮＡとを同じベクターに挿入し、当該ベクターを用いて組換えタンパク質の生産を行えば、任意のペプチドないしタンパク質が連結された組換えタンパク質からなる本酵素を得ることができる。また、糖鎖及び／又は脂質の付加や、あるいはＮ末端若しくはＣ末端のプロセッシングが生ずるような修飾を施してもよい。以上のような修飾により、組換えタンパク質の抽出、精製の簡便化、又は生物学的機能の付加等が可能である。
６．グルコースの測定方法
　グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースの測定方法を既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い、本発明のＦＧＤＨを用いて、各種試料中のグルコースの量又は濃度を測定することができる。本発明のＦＧＤＨを用いてグルコースの濃度又は量を測定する限り、その態様は特に制限されないが、例えば、本発明のＦＧＤＨを試料中のグルコースに作用させ、グルコースの脱水素反応に伴う電子受容体（例えば、ＤＣＰＩＰ）の構造変化を吸光度で測定することにより実施することができる。より具体的には、上記１－１．に示す方法に従って、実施することができる。本発明に従って、グルコース濃度の測定は、試料に本発明のＦＧＤＨを添加すること、又は添加して混合することにより実施することができる。グルコースを含有する試料は、特に制限されないが、例えば、血液、飲料、食品等を挙げることができる。
　後述するセンサの形態でのグルコース濃度の測定は、例えば、以下のようにして実施することができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェート等を用いることができる。作用電極として本発明のＦＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）及び参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
７．グルコースアッセイキット
　本発明のグルコースアッセイキットは、本発明のＦＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明のＦＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、及び使用の指針を含む。本発明のＦＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、又は適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
８．グルコースセンサ
　本発明はまた、本発明のＦＧＤＨを用いるグルコースセンサを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極等を用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマー等を用いる方法があり、フェロセン又はその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、これらを組み合わせて用いてもよい。本発明のＦＧＤＨは、熱安定性に優れるため、比較的高温度条件下で固定化を実施することができる。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のＦＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
　グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェート等を用いることができる。作用電極として本発明のＦＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）及び参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
　なお、本明細書において「プロダクト」とは、使用者が当該用途を実行する目的で用いる１セットのうち一部又は全部を構成する製品であって、本発明のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むものを意味する。
　以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例１　菌株の復元
　独立行政法人製品評価技術基盤機構から、ムコール属に帰属する菌株を入手した。入手した菌株は、Ｌ－乾燥標品であったため、アンプルを開封し、復元水１００μＬを注入し、乾燥菌体を懸濁した後、懸濁液を復元培地に滴下し、２５℃で３日間から７日間、静置培養することで菌株を復元させた。復元水としては、滅菌水（オートクレーブで１２０℃、２０分間処理した蒸留水）を使用し、復元培地としては、ＤＰ培地（デキストリン２．０％、ポリペプトン１．０％、ＫＨ２ＰＯ４１．０％、アガロース１．５％）を使用した。
実施例２　培養上清の回収
　小麦胚芽２ｇ、水２ｍＬを含む培地をオートクレーブで１２０℃、２０分間滅菌した固体培地に、実施例１で復元させたＭｕｃｏｒ属の各菌株を一白金耳植菌し、２５℃で３日間から７日間静置培養した。培養後、２ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を４ｍＬ添加し、ボルテックスで十分に懸濁した。懸濁液に少量のガラスビーズを加えた後、ビーズショッカー（安井器械（株）製）で３，０００ｒｐｍ、３分間×２回の条件で破砕し、４℃、２，０００×ｇ、５分間の条件で遠心分離して、回収した上清を粗酵素液とした。
実施例３　グルコース脱水素酵素活性の確認
　実施例２で得た粗酵素液中のグルコース脱水素酵素活性を、上記１－１．に示したＦＧＤＨ活性測定方法を用いて測定した。その結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示す通り、Ｍｕｃｏｒ　ｈｉｅｍａｌｉｓ　f.　ｓｉｌｖａｔｉｃｕｓ　ＮＢＲＣ６７５４由来の粗酵素液にＧＤＨ活性が存在することが確認された。
実施例４　Ｍｕｃｏｒ　ｈｉｅｍａｌｉｓ　f.　ｓｉｌｖａｔｉｃｕｓ　ＮＢＲＣ６７５４由来ＦＧＤＨの精製
　５０ｍＬのＤＰ液体培地を５００ｍＬ坂口フラスコに入れ、オートクレーブで滅菌し、前培養用の培地とした。予めＤＰプレート培地で復元したＭｕｃｏｒ　ｈｉｅｍａｌｉｓ　f.　ｓｉｌｖａｔｉｃｕｓ　ＮＢＲＣ６７５４を前培養培地に一白金耳植菌し、２５℃、１８０ｒｐｍで３日間振とう培養し、種培養液とした。
　次に、６．０Ｌの生産培地（イーストイクストラクト２．０％、グルコース１％、ｐＨ６．０）を１０Ｌ容ジャーファーメンターに入れ、オートクレーブで滅菌し、本培養培地とした。５０ｍＬの種培養液を本培養培地に植菌し、培養温度２５℃、攪拌速度６００ｒｐｍ、通気量２．０Ｌ／分、管内圧０．２ＭＰａの条件で３日間培養した。その後、培養液をろ布でろ過し、菌体を回収した。得られた菌体を５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁した。
　懸濁液をフレンチプレス（Ｎｉｒｏ　Ｓｏａｖｉ製）に流速１６０ｍＬ／分で送液し、１０００～１３００ｂａｒで破砕した。続いて、破砕液に硫酸アンモニウム（住友化学（株）製）を０．２飽和になるように徐々に添加して、室温で３０分間攪拌した後、ろ過助剤を用いて余分な沈殿を除去した。次に分画分子量１０，０００のＵＦ膜（ミリポア（株）製）を用いて濃縮し、濃縮液をＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２５のゲルを用いて脱塩した。その後、脱塩液に０．５飽和になるように硫酸アンモニウムを徐々に添加し、予め０．５飽和の硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した４００ｍＬのＳＰセファロースＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）カラムにかけ、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）のリニアグラジエントで溶出させた。そして、溶出されたＧＤＨ画分を分画分子量１０，０００の中空糸膜（スペクトラムラボラトリーズ製）で濃縮後、ＤＥＡＥセファロースＦａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）カラムにかけ、精製酵素を得た。得られた精製酵素をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（Ｐｈａｓｔ　Ｇｅｌ　１０－１５％　Ｐｈａｓｔｓｙｓｔｅｍ　ＧＥヘルスケア製）に供した。この際、タンパク質分子量マーカーとしてフォスフォリラーゼｂ（９７，４００ダルトン）、ウシ血清アルブミン（６６，２６７ダルトン）、アルドラーゼ（４２，４００ダルトン）、カルボニックアンヒドラーゼ（３０，０００ダルトン）、トリプシンインヒビター（２０，１００ダルトン）を用いた。
　その結果、単一のバンドが得られたことから、ＦＧＤＨが十分に精製されていることが分かる。また分子量マーカーと比較した移動度から、ＦＧＤＨの分子量は８５，０００～１０７，０００ダルトンであることが判明した。
実施例５　フラビン結合型酵素であることの確認
　実施例４で精製した酵素を１０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で透析し、２５０－８００ｎｍにおける吸収スペクトルを分光光度計Ｕ－３２１０（日立ハイテクノロジーズ社製）により測定した。その結果、波長３４０～３５０ｎｍ付近及び波長４２０～４３０ｎｍ付近に極大を示す２つのピークが確認された（図１）。このような吸収スペクトルの形状から、本発明のＧＤＨがフラビン結合型タンパク質であることが強く示唆された。
実施例６　単離されたＦＧＤＨのペプチド部分の分子量
　実施例４で精製したＦＧＤＨを１００℃、１０分間、加熱処理して変性させた後、５ＵのＮ－グリコシダーゼＦ（ロシュ・ダイアグノスティクス製）で３７℃、１時間処理し、タンパク質に付加している糖鎖を分解した。その後、実施例４と同様の方法でＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定を行った。分子量マーカーは、実施例４と同じものを使用した。その結果、精製したＦＧＤＨのポリペプチド部分の分子量は約８１，０００ダルトンであることが判明した。
実施例７　基質特異性
　上記１－１．に示したＦＧＤＨの活性測定法に従い、基質としてＤ－グルコースを用いたときの活性と、比較対象の糖を用いたときの見かけの活性とを比較することにより、精製酵素の基質特異性を調査した。比較対象の糖としてはマルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロースをそれぞれ使用した。基質濃度は５０ｍＭとした。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２の結果から、本発明のＦＧＤＨの基質特異性は、Ｄ－グルコースに対する活性値を１００％とした場合、マルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロースに対する見かけの活性は、いずれも２％以下であり、本発明のＦＧＤＨは基質特異性に優れていることが示された。
実施例８　至適活性ｐＨ
　実施例４で得られたＦＧＤＨ酵素液（０．５Ｕ／ｍＬ）を用いて、至適ｐＨを調べた。１００ｍＭ 酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．０－５．５、図中■印でプロット）、１００ｍＭ ＭＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ５．５－６．５、図中□印でプロット）、１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０－８．０、図中▲でプロット）、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５－９．０、図中△印でプロット）を用い、それぞれのｐＨにおいて、温度３７℃にて酵素反応を行い、相対活性を比較した。結果を図２に示す。
　その結果、本発明のＦＧＤＨの至適活性ｐＨは、ｐＨ７．４において最も高い活性値を示した。また、凡そｐＨ６．５～ｐＨ８．０の間においては、最大活性値の８０％以上の相対活性を示したことから、このｐＨ域では好適に使用できると考えられる。
実施例９　至適活性温度
　実施例４で得られたＦＧＤＨ酵素液（０．１Ｕ／ｍＬ）を用いて、至適活性温度を調べた。緩衝溶液には４２ｍＭ　ＰＩＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）を用い、３０℃、３７℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃における活性を求めた。結果を図３に示す。
　その結果、本発明のＦＧＤＨは、４５℃～５０℃の範囲で最も高い活性値を示し、最大の活性値に対して８０％以上の相対活性を示す温度範囲は３７℃～５５℃であった。以上のことから、フラビン結合型ＦＧＤＨの至適活性温度は３７℃～５５℃であることが示された。
実施例１０　ｐＨ安定性
　実施例４で得られたＦＧＤＨ酵素液（２Ｕ／ｍＬ）を用いて、ｐＨ安定性を調べた。１００ｍＭ　グリシン－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．５－ｐＨ３．５：図中■印でプロット）１００ｍＭ　酢酸－カリウム緩衝液（ｐＨ３．０－ｐＨ５．５：図中□印でプロット）、１００ｍＭ　ＭＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ５．５－ｐＨ６．５：図中▲印でプロット）、１００ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０－ｐＨ８．０：図中△印でプロット）、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５－ｐＨ９．０：図中●印でプロット）、１００ｍＭ　グリシン－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０－ｐＨ１０．５：図中○印でプロット）を用い、２５℃、１６時間処理した後の活性の残存率を測定した。結果を図４に示す。
　その結果、活性の残存率はｐＨ３．０～ｐＨ１０．０の範囲で９０％以上であった。このことから、安定ｐＨ域はｐＨ３．０～１０．０であることが示された。
実施例１１　温度安定性
実施例４で得られたＦＧＤＨ酵素液（２Ｕ／ｍＬ）を用いて、温度安定性を調べた。１００ｍＭ酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を用いて、ＦＧＤＨ酵素液を各温度（４℃、３０℃、４０℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃）で１５分間処理した後、見かけの活性の残存率を測定した。結果を図５に示す。
　その結果、本発明のＦＧＤＨは５０℃での処理後９１％の残存率を有しており、５０℃以下ではより高い残存活性を有していた。このことから、ＦＧＤＨは、５０℃以下で安定であることが示された。
実施例１２　Ｋｍ値の測定
　上述したＦＧＤＨの活性測定法において、基質であるＤ－グルコースの濃度を変化させて活性測定を行い、基質濃度と反応速度のグラフ（図６）からＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ－ｂｕｒｋ　ｐｌｏｔを作成し、Ｋｍ値を算出した。その結果、本発明のＦＧＤＨのＤ－グルコースに対するＫｍ値は、１６．３ｍＭであることが判明した。
実施例１３　ＦＧＤＨをコードするＤＮＡの単離
（１）染色体ＤＮＡの抽出
　Ｍｕｃｏｒ ｈｉｅｍａｌｉｓ ＮＢＲＣ６７５４をＹＧ培地（Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ　１％、Ｇｌｕｃｏｓｅ　２％）５０ｍｌを入れた坂口フラスコを用いて２５℃一晩培養した後、ブフナー漏斗及びヌッチェ吸引瓶を用いて培養液をろ過し、菌体を得た。そのうち、約０．３ｇの菌体を液体窒素中で凍結させ、乳鉢を用いて菌糸を粉砕し、Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（１％　ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ、０．７Ｍ　ＮａＣｌ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、１％　メルカプトエタノール）１２ｍｌに懸濁した。室温で３０分回転撹拌を続けた後、等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）溶液を加えて攪拌、遠心分離（１，５００ｇ、５分、室温）して上清を得た。得られた上清に等量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）溶液を加えて攪拌し、その後遠心分離（１，５００ｇ、５分、室温）を行った。その結果得られた上清に等量のイソプロパノールを穏やかに加えた。この処理によって析出した染色体ＤＮＡを遠心分離（２０，０００ｇ、１０分、４℃）して得られた沈殿を７０％エタノールで洗浄し、真空乾燥した。このようにして得られた染色体ＤＮＡを再び４ｍｌのＴＥに溶解し、１０ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ　Ａ（シグマアルドリッチジャパン株式会社）を２００μｌ加えた後、３７℃、３０分間インキュベートした。次いで、２０ｍｇ／ｍｌ　のＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，ＰＣＲ　Ｇｒａｄｅ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）溶液４０μｌを加えて３７℃、３０分間インキュベートした後、等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）溶液を加えた。攪拌後、遠心分離（１，５００ｇ、５分、室温）し、上清を得た。この洗浄操作を２回繰り返した後、得られた上清に等量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）溶液を加えて攪拌し、その後遠心分離（１，５００ｇ、５分、室温）を行った。その結果得られた上清に対して、その１／１０容量の３Ｍ　ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．８）と２．５倍容量のエタノールを加えて遠心処理（２０，０００ｇ、２０分、４℃）を行うことにより回収した。回収された染色体ＤＮＡを７０％エタノールで洗浄した後、真空乾燥させ、最後に４００μｌのＴＥ溶液に溶解して濃度約１ｍｇ／ｍｌの染色体ＤＮＡ溶液を得た。
（２）合成プライマーの設計
　配列番号３に示すＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来ＧＤＨのアミノ酸配列（特許４２９２４８６の配列表において配列番号４で示されるアミノ酸配列）やその他公知のアミノ配列を参考にして、比較的アミノ酸配列が保存されていると判断できる領域に基づいて、ミックス塩基を含有する縮重プライマー、ｄｅｇｅＦ３０、ｄｅｇｅＲ１３（配列番号４、５）を合成した。
（３）ＰＣＲ法によるＦＧＤＨ遺伝子部分配列の取得
　上記（１）で調製した染色体ＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ－Ｐｌｕｓ（東洋紡製）を用いて推奨する条件のもとでＰＣＲを行った。プライマーには、上記（２）で作製したプライマー（配列番号４、５）を使用した。そのＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動に供したところ、約１３００ｂｐ程度の長さに相当するバンドが確認されたので、この増幅されたＤＮＡ断片を精製し、クローニングキットＴａｒｇｅｔ　Ｃｌｏｎｅ－Ｐｌｕｓ（東洋紡製）を用いて、そのプロトコールに従って操作を行い、ベクターｐＴＡ２にクローニングし、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡製）に形質転換し、形質転換体を取得した。該形質転換体をＬＢ培地で培養し、プラスミドを抽出し、当該酵素遺伝子に相当する領域の塩基配列解析を実施した。シークエンス反応はＢｉｇＤｙｅＴＭ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）を用い、製品の使用説明書に従ってシークエンス反応を行った。解析にはＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３１０シークエンサー（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）を使用した。当該酵素遺伝子の塩基配列解析を実施するためには、上記で使用したプライマー（配列番号４、５）、Ｐ７（配列番号６）及びＰ８（配列番号７）を使用した。その塩基配列解析の結果、約１３００ｂｐのＦＧＤＨの部分配列を取得した。
（４）ＦＧＤＨ遺伝子全長配列の取得
　上記ようにして得られた、塩基配列に基づき、開始コドンを含むＮ末端方向の遺伝子配列取得のために、遺伝子の外側方向に向けた２種類のインバースＰＣＲ用プライマー（配列番号８、９）を新たに設計した。このインバースＰＣＲ用プライマーを用い、上記（１）で得た染色体ＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩで処理し、ライゲーションを行ったものを鋳型としてＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ－Ｐｌｕｓ（東洋紡製）を用いて推奨する条件のもとで、Ｉｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲを行った。これにより、増幅される断片の配列解析を、上記記載と同様にして行い、開始コドンと推測される配列を含む上流の塩基配列を明らかにした。また、終止コドンを含むＣ末端方向の遺伝子配列取得のためにも、上記記載のインバースＰＣＲ用プライマー（配列番号８、９）を用い、上記（１）で得たゲノムＤＮＡを制限酵素ＳｃａＩで処理し、ライゲーションを行ったものを鋳型として、上記記載、同様の方法でＩｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲを行った。これにより、増幅される断片の配列解析を、上記記載と同様にして行い、終止コドンと推測される配列を含む上流の塩基配列を明らかにした。
（５）Ｎ末端及びＣ末端の決定
　Ｎ末端の決定は、公知の情報を最大限に活用し、アミノ酸配列の相同性、塩基配列の長さ等の観点から（４）で得られた配列と多角的な比較を行い、開始コドンを判断した。
また、Ｃ末端の決定も同様の方法にて判断した。
（６）Ｍｕｃｏｒ　ｈｉｅｍａｌｉｓ　f.　ｓｉｌｖａｔｉｃｕｓ　ＮＢＲＣ６７５４由来のＧＤＨ遺伝子全長を増幅させるためのプライマー設計
　（５）での判断結果に基づき、開始コドンの上流にアニーリングするプライマー、５ＵＴＲ　Ｆ１（配列番号１０）及び終止コドンの下流にアニーリングするプライマー、３ＵＴＲ　Ｒ１（配列番号１１）を設計した。
（７）ｃＤＮＡ配列の決定
　Ｍｕｃｏｒ ｈｉｅｍａｌｉｓ ＮＢＲＣ６７５４をＹＧ培地（Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ　１％、Ｇｌｕｃｏｓｅ　２％）５０ｍｌを入れた坂口フラスコを用いて２５℃一晩培養した後、ブフナー漏斗及びヌッチェ吸引瓶を用いて培養液をろ過し、菌体を得た。そのうち、約０．３ｇの菌体を液体窒素中で凍結させ、乳鉢を用いて菌糸を粉砕した。続いて、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いて、本キットのプロトコールに従って、粉砕した菌体からｍＲＮＡを得た。これをテンプレートにＲｅｖｅｒＴｒａ－Ａｃｅ（東洋紡社製）を用いて、そのプロトコールに従って操作を行い、逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。逆転写のプライマーには、（６）で作製した３ＵＴＲ　Ｒ１（配列番号１１）を用いた。続いて、上記で合成したｃＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ－Ｐｌｕｓ（東洋紡製）を用いて推奨する条件のもとでＰＣＲを行った。プライマーには、上記（６）で作製したプライマー（配列番号１０、１１）を使用した。そのＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動に供したところ、約２０５０ｂｐ程度の長さに相当するバンドが確認されたので、この増幅されたＤＮＡ断片の配列解析を、上記記載と同様にして行った。なお、ここでのｃＤＮＡ配列解析には、３クローンの異なるプラスミド由来の塩基配列を解析した。なお、塩基配列の解析には、上記記載のプライマーに加えて、配列解析用プライマー（配列番号１２）も使用した。このようにして、配列番号２に示すＭｕｃｏｒ ｈｉｅｍａｌｉｓ ＮＢＲＣ６７５４由来のＦＧＤＨのｃＤＮＡ配列を決定した。また、当該ｃＤＮＡ配列がコードする当該酵素遺伝子のアミノ酸配列を配列番号１に示した。
（８）公知のＧＤＨとのアミノ酸配列比較
　上記（７）で明らかにしたアミノ酸配列と公知のアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨ、アスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤＧＤＨとの同一性は各々３３％及び３４％であった。アミノ酸配列解析は、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　ｌｏｃａｌ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｓｅａｒｃｈ　ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、算出した。
実施例１４　Ｍｕｃｏｒ ｈｉｅｍａｌｉｓ ＮＢＲＣ６７５４由来のＦＧＤＨのサッカロミセス・セレビシエでの発現及び酵素活性の確認
　（１）発現ベクターの構築
実施例１３で明らかにしたＭｕｃｏｒ ｈｉｅｍａｌｉｓ 由来ＦＧＤＨ遺伝子（配列番号２）を増幅させるため、実施例１３（７）で調製したｃＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ－Ｐｌｕｓ（東洋紡製）を用いて推奨する条件のもとＰＣＲを行った。プライマーには、制限酵素サイトを付加したプライマー（配列番号１３、１４）を使用した。該ＰＣＲで増幅されたＰＣＲ産物をクローニングキットＴａｒｇｅｔ　Ｃｌｏｎｅ－Ｐｌｕｓ（東洋紡製）を用いて、そのプロトコールに従って操作を行い、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡製）を形質転換し、該形質転換体を取得した。該形質転換体をアンピシリン（５０ｍｇ／ｍｌ；ナカライテスク社製）を含んだ液体培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ；ｐＨ７．３）に接種し、３０℃で一晩振とう培養して得られた菌体から、常法によりプラスミドを調製した。該プラスミドを制限酵素ＳａｃＩ及びＮｏｔＩで処理し、遺伝子領域を含むＤＮＡ断片を取得し、同じく制限酵素ＳａｃＩ及びＮｏｔＩで処理したベクターｐＹＥＳ３（インビトロジェン社）と混合し、混合液と等量のライゲーション試薬（東洋紡製ラーゲーションハイ）を加えてインキュベーションすることにより、ライゲーションを実施した。このように、ライゲーションしたＤＮＡをエシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績製コンピテントハイＤＨ５α）に当製品に添付のプロトコールに従ってそれぞれ形質転換し、該形質転換体を取得した。該形質転換体をＬＢ培地で培養し、プラスミドを抽出した。このようにして、サッカロミセス・セレビシエでの大量発現を可能とするように設計されたｐＹＥＳＭｈＧＤＨを取得した。
（２）形質転換
　続いて、サッカロミセス・セレビシエＩＮＶＳｃ１（インビトロジェン社）への形質転換を行い、生育してきたコロニーの発現確認を行った。実験操作は、ｐＹＥＳ３のマニュアルを参考にした。
（３）培養
　形質転換体は１０Ｌ容ジャーファーメンター（ＢＭＳ１０－ＰＩ／バイオット）を使用して培養した。３％ 酵母エキス、１％ ポリペプトン、３％　ガラクトースを含む培地にて、培地液量７．０Ｌ、攪拌数５００ｒｐｍ、温度２５℃、通気量１．０ｖｖｍの条件で培養した。この培養液を粗酵素液として、ＧＤＨ活性を確認したところ、本発明のＧＤＨが発現されていることが確認された。
　この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
　本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報等の内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。また、本明細書は、ＪＰ２０１１－２３９５０３及び２０１１－２３９５２６に優先権を主張し、これらの明細書の全文が援用によってここに取り込まれる。
　本発明のＦＧＤＨは基質特異性に優れ、グルコース量をより正確に測定することを可能にする。従って本発明のＦＧＤＨは血糖値の測定等に好適といえる。

Claims (9)

  1. 下記の特性（１）～（４）を備えるフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
    （１）分子量：　ＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動で測定した酵素のポリペプチド部
    分の分子量が約８１ｋＤａ
    （２）Ｋｍ値：　Ｄ－グルコースに対するＫｍ値が約２０ｍＭ以下
    （３）温度安定性：５０℃以下で安定
    （４）ｐＨ安定性：　ｐＨ３．０～１０の範囲で安定
  2. 更に下記の特性（５）を備える、請求項１に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
    （５）基質特異性：　Ｄ－グルコースに対する反応性を１００％としたときのＤ－キシロースに対する反応性が１．２％以下である
  3. 更に下記の特性（６）を備える、請求項１又は２に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
    （６）至適活性温度：　３７℃～５５℃
  4. 更に下記の特性（７）を備える、請求項１～３のいずれかに記載のフラビン結合多型グルコース脱水素酵素。
    （７）至適活性ｐＨ：　７．４
  5. 更に下記の特性（８）を備える、請求項１～４のいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
    （８）由来：　ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属に分類される微生物に由来する
  6. ムコール属に分類される微生物を培養すること、及び
    グルコース脱水素酵素を回収すること
    を含む、請求項１～５のいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。
  7. 請求項１～５のいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素をグルコースに作用させることを含む、グルコース濃度の測定方法。
  8. 請求項１～５のいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキット。
  9. 請求項１～５のいずれかに記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコースセンサ。
     
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